Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

גיליון מבוסס אור מיקרוסקופ פלואורסצנטי של חיים או קבוע מוכתמת Published: April 28, 2017 doi: 10.3791/55629
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Physical Biology, Buchmann Institute for Molecular Life Sciences (BMLS), 2Cluster of Excellence Frankfurt, Macromolecular Complexes, 3Goethe-Universität Frankfurt am Main – Campus Riedberg

Summary

הדמית morphogenesis של עוברי חרק עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי מבוסס אור גיליון הפכה מדינה של האמנות. פרוטוקול זה מתאר ומשווה שלוש טכניקות הרכבה מתאימות עובר Tribolium castaneum, מציג שני קווים מהונדסים רומן מחוייט גם מתאים הדמיה חיה, דן בקרות איכות חיוניות ומציין מגבלות ניסוי נוכחיות.

Abstract

Castaneum Tribolium חיפושית הקמח האדום הפך אורגניזם מודל חרקים חשוב בגנטיקה התפתחותית ביולוגיה התפתחותית אבולוציונית. התצפית של עוברי Tribolium עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי מבוסס אור גיליון יש יתרונות רבים על פני widefield הקונבנציונלי מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal. בשל המאפיינים הייחודיים של מיקרוסקופ גיליון מבוסס אור, שלוש תמונות ממדיות של דגימות חיות יכולות להיות מוקלטות עם יחס אות לרעש גבוה באופן משמעותי הלבנת תמונה וכן צילום רעיל לאורך כיוונים מרובים לאורך תקופות שנמשכות מספר ימים. עם יותר מארבע שנים של פיתוח מתודולוגיות ועלייה רציפה של נתונים, הפעם נראה מתאים להקים נהלי עבודה סטנדרטיים עבור השימוש בטכנולוגית גיליון אור בקהילת Tribolium כמו גם בקהילת החרקים רחבים. פרוטוקול זה מתאר שלוש טכניקות הרכבה מתאימות Fאו למטרות שונות, מציגות שתי שורות מחוייטת רומן מהונדסות Tribolium מתאימים הדמיה חי לטווח ארוך, מציעה חמישה צבעי ניאון לתייג מבנים תאיים של עוברים קבועים ומספקות מידע על עיבוד פוסט נתונים להערכה בזמן של הנתונים שנרשמו. תוצאות נציג להתרכז הדמיה חיה לטווח ארוך, חתך אופטי ואת התצפית של אותו העובר לאורך כיוונים מרובים. מערכי נתוני בהתאמה ניתנים כמשאב להורדה. לבסוף, הפרוטוקול דן בקרות איכות עבור מבחני הדמיה חיים, מגבלות נוכחיות ואת תחולת ההנחיות המתוארות כדי מינים של חרקים אחרים.

פרוטוקול זה מיועד בעיקר עבור ביולוגים התפתחותיים המבקשים פתרונות הדמיה כי להכות ציוד מעבדה סטנדרטי. זה מקדם את הניסיון המתמשך כדי לסגור את הפער בין / קהילות מעבדות חוקיות מבחינה הטכנית, אשר לפתח ולשכלל microsלהעתיק מתודולוגית, ואת מעבדות מדעי חיים / קהילות, אשר דורשות פתרונות "plug-and-play" אל אתגרים טכניים. יתר על כן, הוא תומך בגישה אקסיומטית שזזה השאלות הביולוגיות למרכז תשומת לב.

Introduction

חיפושית קמח אדום Tribolium castaneum, אשר שייך למש' הגדולה של חיפושיות אפלוליות (Tenebrionidae), יש היסטוריה ארוכה בתחום מדעי החקלאות וחיים והוא האורגניזם השני הכי טוב לומד מודל חרקי המודל אחרי זבוב הפרות תסיסנית. במהלך ארבעת העשורים האחרונים, זה הפך אורגניזם מודל החרק חזק ופופולרי בגנטיקה התפתחותית, בביולוגיה התפתחותית אבולוציונית, במהלך עשרים השנים האחרונות, ב morphogenesis העוברי עבור מגוון רחב של סיבות:

תסיסנית Tribolium שניהם שייכים Holometabola, אך נפרדו כ -300 מיליון שנים לפני 1, 2, 3, 4. בעוד ההתפתחות העוברית של תסיסנית נחשבה בכינויו נגזר מאוד, Tribolium מציגה מצב אבות יותר של development שנמצא שיעור גבוה יותר משמעותית של מיני חרקים 5, 6, 7, 8, 9. ראשית, Tribolium מציג פיתוח הראש הלא involuted, כלומר איברי הפה המחושים שלה לצוץ כבר במהלך העובר 10, 11, 12, 13, 14, 15. שנית, Tribolium מלווה את העקרונות של פיתוח קצר נבט, כלומר קטעי בטן מתווספים ברצף מאזור הגידול האחורי במהלך התארכות germband 16, 17, 18, 19. שלישית, Tribolium מפתחת מדרדרת מאוחרשתי ממברנות חוץ עוברי כלומר את amnion, אשר מכסה את העובר רק ventrally, ואת serosa, שעוטף את העובר לחלוטין 20, 21, 22. ממברנות שניהם ממלאים המוךפו"גנטי שהולך מכריע 23 כמו גם תפקיד המגן נגד מיקרואורגניזמים 24, 25 ו 26 התייבשות. רביעית, הרגליים מתפתחות בעוברים פועלים באופן תקין לחלוטין בשלב בחיים הזחל לשמש primordia עבור הרגליים הבוגרת במהלך המטמורפוזה גלמי 27, 28, 29, 30, 31.

בשל דרישות הגודל צנוע הקטנות שלהם, טיפוח Tribolium במעבדה הוא פשוט למדי. תרבויות של wild-type (WT) זנים או קווי מהונדס מכילים בדרך כלל סביב 100-300 מבוגרים יכולים להישמר בתוך בקבוקי זכוכית חד ליטר (טביעת 80 ס"מ 2) מילא שלושה כדי בארבעה סנטימטרים גבוה (כ 50 גרם) עם מדיום הגידול הכולל של חיטה דגנים מלאים קמח בתוספת שמרים יבשים פעילים. צינור לאספקת מים אין צורך. זה מאפשר גם מעבדות קטנות כדי לשמור על עשרות תרבויות חיפושית בתוך אינקובטורים חרקים קטנים או בינוניים זמינים מסחרית. בשלבי התפתחותיים מאוחרים יותר Tribolium (זחלים אחרי בערך instar הרביעיים, גלמים ומבוגרים) מופרדים בקלות מן מדיום הגידול ידי סינון. עובר מסונכרן מתקבלים על ידי דוגרי מבוגרים לתקופות קצרות על מדיום הטלה. עבור פיתוח מהיר, תרבויות חיפושית נשמרות 32 ° C (כארבעה שבועות לכל דור), תוך שמירה על מניות מבוצעת בדרך כלל ב- C ° 22-25 (כעשרה שבועות לכל דור).

במשך העשור האחרון, tec סטנדרטי רבhniques הותאמו בהדרגה אופטימיזציה עבור Tribolium, כפי שמסוכם הספרים אורגניזמים מודל Emerging 32. חשיבות רבה הם מתקדמים בשיטות גנטיות כגון 33 עובריים, 34 זחל, 35 או 36 הורית, 37 RNA מציאת גן מבוסס הפרעה, טרנספורמציה germline גם עם 38 piggyBac, 39 או מערכת מינוס 40 transposase ו קריספר / בגנום מבוסס Cas9 הנדסה 41. יתר על כן, הגנום Tribolium כבר רצף לפני כעשור 42, והיום הוא בסיבוב השלישי של הגנום הרכבה לשחרר 43, אשר מאפשר זיהוי יעיל הגנום כולו וניתוח שיטתי של גנים 44 45, 46. בנוסף, את הגנומים של ארבעה מינים קשים כנפיים התפוצצו בפניו אחרים זמינים עבור גישות גנטיות השוואתיות 47, 48, 49, 50. בשיתוף עם הגנום הרצף, שני ניתוחים גנטיים גדולים בוצעו, כלומר מסך mutagenesis insertional 51 ו RNA השיטתית הפרעה מבוססת מציאת גן מסך 52, 53.

דימות פלואורסצנטי חיה עם widefield, confocal או מיקרוסקופ מבוסס גיליון אור (LSFM) מאפשרת לבחון את המורפולוגיה העוברית של Tribolium כפונקציה של זמן (כלומר morphogenesis) בהקשר רב-ממדים (לוח 1). בשנת widefield הקרינה confocal מיקרוסקופ, את Excitאור ation והפליטה מונחה דרך העדשה האובייקטיבית. בשתי הגישות, הדגימה כולו מוארת לכל מטוס דו ממדי רשם. לפיכך, הדגימות חשופות לרמות אנרגיה גבוהות מאוד. בשנת LSFM, רק fluorophores במישור המוקד נרגש בשל ביטול צימוד של תאורה וזיהוי באמצעות שתי עדשות אובייקטיביות סודר בניצב (איור 1). LSFM מגיע בשני מימושים הקאנוני - למיקרוסקופ תאורת המטוס הבודד (SPIM) ואור הליזר הדיגיטלי סרוק מיקרוסקופ פלואורסצנטי מבוסס הגיליון (DSLM, איור 2) - ומציע מספר יתרונות מכריעים על פני גישות מסורתיות: (i) יכולת חתך אופטית פנימית, (ii) רזולוציה צירית טוב, (iii) ברמה מופחתת מאוד של הלבנת צילום, (iv) צילום רעילות נמוכה מאוד, (נ) יחס אות לרעש גבוה, (vi) מהירות רכישה גבוהה יחסית, (vii) הדמיה לאורך כיוונים מרובים (viii) חדיר לרקמות עמוקות יותר בשל השימוש של עדשות אובייקטיביות תאורת מספרי צמצם נמוכה 54, 55, 56.

LSFM כבר יושם בהצלחת Tribolium לתעד כמעט המורפוגנזה העוברי כולו 57 ו לנתח את העקרונות של קרע קרום חוץ עוברי בתחילת גב סגר 23. כדי להעלות את האטרקטיביות של LSFM בקהילת Tribolium ועבור מדע חרקים בכלל, זה הוא בעל חשיבות רבה להקמת נהלי עבודה ועל מנת לשפר את השיטות, פרוטוקולים בברכה של משאבים לרמה שבה מיקרוסקופ הופך קל -השתמש כלי סטנדרטי במעבדות הביולוגיה ההתפתחותית, ואת השאלות ביולוגי להישאר במרכז תשומת הלב.

פרוטוקול זה מתחיל עם יסודות של Tribolium </ em> טיפוח, תחזוקה כלומר, רבייה ואיסוף עובר. הבא, שתי אסטרטגיות ניסיוני מומחשות: (i) הדמית חיה של קווים מהונדסים מחוייט (ii) הדמיה של עוברים קבועים כי הוכתמו צבעי ניאון (לוח 2). כתוצאה מכך, שלוש טכניקות הרכבה עם מטרות שונות מעט מוסברים בפירוט (איור 3 ולוח 3): (i) בעמודה agarose, (ii) בחצי הכדור agarose ו (iii) בעל קורי עכביש הרומן. הפרוטוקול ואז מסביר את הליך רכישת נתונים עם LSFM. שיטות הדמיה ושיקולים מרכזיים מתוארות. לבסוף, חזר עובר מוסבר והצעות לעיבוד נתונים בסיסיים מסופקות. בתוצאות הנציג, נתוני הדמיה חיים משני רומן מחוייט הקווים המהונדסים 58-כחולת גליה מוצגים ואת מערכי נתוני הדמית בהתאמה ניתנים כמשאב להורדה. בנוסף, תמונהנתונים של עוברים קבועים כי הוכתמו במגוון צבעי קרינה מוצגים. הדיון מתמקד בקרת איכות, מגבלות נוכחיות של גישת ההדמיה חי ואת ההסתגלות של פרוטוקול מינים אחרים.

הפרוטוקול נכתב עבור מיקרוסקופים פלואורסצנטי מבוסס אור גיליון המצוידות בתא מדגם מנגנון מהדק rotatable עבור מחזיקי מדגם סטנדרטיים 54, 59, 60, שהן בדרך כלל אלמנטים בצורת גליל עשויים מתכת, פלסטיק או זכוכית בקוטר בטווח המילימטר. הפרוטוקול מתאים גם הוא מימושים הקאנוני, כלומר SPIM ו DSLM, כמו גם עבור setups עם לפחות שתי זרועות תאורה וזיהוי 61, 62, 63. התוצאות נציג להראות נתונים בשני ערוצי ספקטרלי, ירוק (illumination עם לייזר 488 ננומטר, זיהוי באמצעות 525/50 bandpass מסנן) ואדום (תאורה עם לייזר 561 ננומטר, זיהוי באמצעות 607/70 bandpass מסנן), אבל הפרוטוקול ניתן להרחיב לערוצים ספקטרלי שלוש או ארבע.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

בעלי 1. של תרבויות Tribolium

הערה: תנאים סטנדרטיים מוגדרים טמפרטורת דגירה של 25 מעלות צלזיוס ו 70% לחות יחסית בתוך 12 h בהיר / 12 h מחזור כהה. לקבלת מידע נוסף על בעלי Tribolium, הנחיות מתאימות זמינות 64. פרוטוקול זה דורש שנייה בתקשורת קמח מבוסס שונה, אשר ניתן להכין בכמויות קילו ומאוחסן במשך כמה חודשים.

  1. לפני העבודה עם קמח שמרים יבשים פעילים, לאחסן את החבילות שלא נפתחו ב -20 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות ולאחר מכן לתת להם להתחמם לטמפרטורת חדר. נוהל זה מבטל פתוגנים פוטנציאליים.
  2. Pass קמח חיטה מלא שמרים יבשים פעילים דרך מסנן עם גודל רשת 710 מיקרומטר, אז להכין מדיום גידול ידי להשלים את קמח דגן מלא מנופה עם 5% (w / w) מנופה שמרים יבשים פעילים.
  3. Pass 405 קמח חיטה משובח שמרים יבשים פעילים דרך מסננת עם 250 & #181; גודל רשת מטר, ואז להכין ההטלה בינוני ידי להשלים את קמח חיטה משובח 405 מנופה עם 5% (w / w) מנופה שמרים יבשים פעילים.
  4. תעביר את תרבות Tribolium בהתאמה דרך מסננת עם גודל 800 רשת מיקרומטר. מחק את מדיום גידול השאריות. מעביר את הזחלים, גלמים ומבוגרים בכלי זכוכית גדולים.
  5. אם אין תרבות צאצאים קיימת, להעביר סביב 80 זחלים ו / או גלמי בקבוק זכוכית חדש להקים תרבות צאצאים חדשה. אם אין זחלים ו / או גלמים נוכחים, לקחת סביב 40 ​​מבוגרים במקום. להוסיף 50 גרם של מדיום גידול דגירה בתנאים סטנדרטיים.
  6. אסוף סביב 300 מבוגרים (500-700 מ"ג) ב אחר בקבוק זכוכית חדש להקים את תרבות ההדמיה. להוסיף 50 גרם של מדיום גידול דגירה בתנאים סטנדרטיים. אפשר תרבות ההדמיה להסתפק לפחות 24 h במדיום הגידול הטרי לפני האיסוף עובר.
  7. החלף את מדיום הגידול של תרבות ההדמיה לפחות כל שני אנחנוEKS, אשר יכול להיעשות בשיתוף עם אוסף עובר (ראה 3.2). אחרי חודשים-שלושה, להחליף את תרבות ההדמיה לחלוטין על ידי מבוגרים חדשים מתרבות הצאצאים.
  8. אם קו מהונדס הלא הומוזיגוטיים משמש, לאצור תרבויות הצאצאים לעתים קרובות על ידי הסרת חיות הלא מהונדסות. באופן אידיאלי, ליצור קווי הומוזיגוטים אם את גן בהתאמה אינו קטלני או גורם לעקרות כאשר נוכח משני הכרומוזומים. יש תרבויות הומוזיגוטים בדרך כלל ברמת קרינה ממוצעת גבוהה ואת תנאי ניסוי הכוללים צרים, מאז רק גנוטיפ אחד קיים.

הגדרת מיקרוסקופ 2. כיול

הערה: עובר Tribolium יש אורך קדמי-אחורי של כ 600-660 מיקרומטר בקוטר אלכסוני של כ 300-330 מיקרומטר. רוב מצלמות CCD המודרניות יש גודל שבב חיישן של כ 9 מ"מ x 7 מ"מ, כלומר בקוטר של 11.4 מיקרומטר, ובמרחק פיקסל פיקסל של 6.45 מיקרומטר.בשילוב עם עדשה אובייקטיבית 10X הגדלה, העובר יכול להיות הדמית טוטו עם מגרש פיקסל של 0.645 מיקרון. רוב מצלמות sCMOS המודרני יש גודל שבב חיישן גדול יותר של כ 16 מ"מ x 14 מ"מ, כלומר בקוטר של 21.3 מיקרומטר, ובמרחק פיקסל פיקסל של 6.5 מיקרומטר. בשילוב עם עדשה אובייקטיבית 20X הגדלה, העובר יכול להיות הדמית טוטו עם מגרש פיקסל של 0.325 מיקרון.

  1. צרף את עדשות תאורה ואובייקטיביות לגילוי המיקרוסקופ. ודא כי לייזרים ומסנני קרינה להתאים את ספיגת fluorophore ואת ספקטרום פליטה היטב.
  2. צרף בתא מדגם המיקרוסקופ. ממלא את החדר מדגם עם pH PBS 7.4 או כל חיץ הדמיה מתאים אחר.
  3. הפעל לכייל את המיקרוסקופ. כיול מקיף שגרות והנחיות תקלות עבור מיקרוסקופים מבוססי גיליון אור שהותקנו (לייתר דיוק ליישום DSLM) פורסם יח"צeviously 65. עבור מכשירים מסחריים, בצע את הוראות היצרן בזהירות רבה. טיפול לא נכון עלול לרוקן את תא מדגם של המדיום לבין לגרום הרס המכשיר וכן את הדגימה.

אוסף 3. עוברים מהונדסים או WT

  1. Pass מושבת ההדמיה דרך מסנן עם גודל רשת 800 מיקרומטר. אסוף חיפושיות מבוגרות בתוך בקבוק זכוכית חדש ולהוסיף 10 גרם של מדיום הטלה. דגירת תרבות ההטלה עבור 1 ש 'ב 25 מעלות צלזיוס ולחות יחסית 70% לאור.
  2. תעביר את תרבות ההטלה דרך מסנן עם גודל רשת 800 מיקרומטר להפריד מבוגרים ממדיום ההטלה, אשר מכיל סביב 30-100 עובר. העבר למבוגרי בקבוק זכוכית חדש ולהוסיף גם את g הישן או 50 של מדיום גידול טרי.
  3. אם תצפית צריכה להתחיל בשלב blastoderm האחיד (DS0002 במערך למשל), לדגור מדיום ההטלה עבור 15 שעות ב 25 ° C ו- 70% לחות יחסית. To להתחיל בתחילת הכחשה germband (DS0001 מערכי נתונים לדוגמה ו DS0003), לדגור העוברים במשך 23 שעות ב 32 ° C ו- 70% לחות יחסית. אם שלבי התפתחותיים אחרים הם רצויים, עיין בספרות בהתאמה 64, 65 ו להתאים זמן דגירה ו / או טמפרטורה לפי צורך.

4. עובר Dechorionation

הערה: הסיסי היא השכבה החיצונית של קליפת הביצה מורכבת חלבוני סוכרים. זה מאוד קל סופג אך לא הכרחי להתפתחות תקינה ולכן יכול להסירו כימי.

  1. לעבור את המדיום ההטלה דרך מסננת עם גודל רשת 300 מיקרומטר. אסוף את העוברים בתוך תא מסנן עם גודל רשת 100 מיקרומטר וזורקים מדיום שאריות ההטלה.
  2. הכן צלחת 6-היטב כדלקמן: למלא את A1, A2, A3 ובארות B3 עם 10 מ"ל PBS pH 7.4 ואת בארות B1 ו- B2 עם 9 מ"ל PBS. אז בזהירות להוסיף1 חומצת נתרן מ"ל ל B1 ו- B2. שים את התקדמות בצעדים 4.3 כדי 4.8 תחת מיקרוסקופ סטריאו. תת-כלורי זהירות נתרן הוא מאכל.
  3. הכנס את תא מסננת לתוך A1 היטב (pH 7.4 PBS) וכן לשטוף את העוברים למשך דקה אחת תחת תסיסה עדינה. חלקיקי קמח גדולים צריכים לנתק מן העוברים.
  4. עבר מסננת התא כדי באר B1 (חומצת נתרן pH PBS 7.4) ולנער את הצלחת נמרצות במשך 30 s. חלקיקי הקמח הנותרים צריכים לנתק לחלוטין את העוברים.
  5. עבר מסננת התא אל A2 היטב (pH 7.4 PBS) וכן לשטוף את העוברים על 1 דק 'תחת תסיסה עדינה.
  6. עבור dechorionation, להעביר את מסננת תא לבאר B2 (חומצת נתרן pH PBS 7.4). לנער את הצלחת במרץ עד הנקרע הסיסי ומנתק מעובר. הסיסי נראה כמו קרום דק, חצי שקוף עם קצוות שנטרפו, ואילו עובר Dechorionated יש צללית רגילה.
  7. ה Transferדואר מסננת התא A3 היטב (pH 7.4 PBS) וכן לשטוף את העוברים על 1 דק 'תחת תסיסה עדינה. אם כל שברים סיסיים עדיין מחוברים אל העוברים לאחר הכביסה, חזור על שלב 4.6.
  8. אחסן את עוברי באר B3 (pH 7.4 PBS). חפץ במשך כמה שעות לא לפגוע בעוברים, אך יש לזכור כי ההתפתחות ממשיכה.
  9. עבור קווי מהונדס הלא הומוזיגוטיים, להסיר כל העוברים הלא פלורסנט במידת האפשר. קיבעון והכתים של WT או עובר מהונדס, המשך לסעיף 5. הדמית חיה של עוברים מהונדסים, המשך לסעיף 6.

5. Permeabilization ממברנה Vitelline, קיבוע, מכתים

הערה: קרום vitelline הוא השכבה הפנימית של קליפת הביצה. שהיא בלתי ניתנת לחדירה עבור צבעי ניאון ולכן יש permeabilized כימי לפני המכתים.

  1. מלאו בקבוקון הנצנץ עם פתרון קיבעון / permeabilization (1.5 מ"ל 4% (w / v) paraformaldehyde ב pH PBS 6.9nd 1.5 מ"ל n-heptane). העבר עוברים עם מכחול כדי צלוחיות. בקבוקונים מכסים ברדיד אלומיניום כדי להגן fluorophores מן האור דגירה במשך 30 דקות על פלטפורמת נדנדה ב 50 סיבובים לדקה. paraformaldehyde הזהירות רעילה ומאכל, n-heptane הוא דליק ורעיל.
  2. הסר פתרון קיבוע ולטפל עוברים שלוש פעמים במשך 15 דקות ב 3 מ"ל 0.1% (v / v) טריטון X-100 ב PBS pH 7.4, ובהמשך פעם עבור 15 דק 'ב 3 מ"ל 1% (v / v) טריטון X-100 ב pH PBS 7.4 על פלטפורמת נדנדה ב 50 סיבובים לדקה. זהירות טריטון X-100 הוא מאכל.
  3. הסר פתרון permeabilization ולהוסיף 0.5 פתרון מכתים מ"ל בקבוקון. פתרונות מכתימים למופת ניתנות בטבלה 2. עוברים כתמים לילה בשעה 4 ° C על פלטפורמת נדנדה ב 50 סיבובים לדקה. עבור הצבעים מוצעים בטבלה 2, הכביסה אינה הכרחית.

6. הכנת הרכבת Agarose

  1. להוסיף 1 גרם נמוך להמסagarose כדי 100 המ"ל PBS pH 7.4 ואת לחמם את התערובת במשך 2-3 דקות במיקרוגל ב 800 W. אם חלקיקי agarose קטנים עדיין קיימים, לחזור על תהליך החימום 30 מרווחי שניות עד החלקיקים להתמוסס לחלוטין. את agarose הרכבה אינו צריך להיות מוכן טרי כל הזמן, הקרושה agarose ניתן מחדש מעובה ידי חימום כמתואר לעיל. תהליך זה ניתן לחזור 5-6 פעמים לפני המים מדי התאדו.
  2. אפשר agarose להתקרר כ 40-45 מעלות צלזיוס, אז למלא שני צינורות התגובה 1.5 מ"ל עם agarose מחוממת לשמור צינורות אלה על 35 מעלות צלזיוס thermoblock.

7. עובר ההתקנה להכניסו קאמרי לדוגמא

  1. אפשרות 1: טור Agarose (איור 3A -C, העמודה הראשונה; טבלה 3, עמודה שנייה)
    1. ממלאים מזרק 1.0 מ"ל עם מים מזוקקים וצרף אותו לאחד הפתחים נימי זכוכית באמצעות צינור גומי קטן.מלא את מחצית הדרך נימי עם מים מזוקקים.
    2. פיק לעובר עם מכחול ולמקם אותו בצד הפנימי של פתיחת נימי זכוכית האחרת. המשך במהירות לשלב הבא עוד לפני שהעובר מתייבש.
    3. היצמד הנימים לתוך agarose נוזל לאט למשוך כמה μL של agarose הנוזלי לצד העובר לתוך הנימים. ואז במהירות להגדיל את כוח הציור כך עובר נגרר יחד עם agarose. בסופו של דבר, כמה μL של agarose צריך להיות מעל ומתחת העובר. הגדר את נימי בצד לכמה דקות ולתת agarose לחזק.
    4. קצר את הנימים עם חותך זכוכית יהלום באורך של כ 5 מ"מ. שבר הנותרים צריך להיות מלא לחלוטין עם agarose ואת העובר צריך להיות בתוך הרבעון השני.
    5. הכנס את גליל הפלדה עם הסיכה לתוך תא המדגם, ואז לתקוע את שבר נימים על גבי הפינים. טור agarose צריך לבלוט כמה מילימטרים FROM שבר נימים עם החלק המכיל את העובר.
  2. אפשרות 2: בחצי הכדור Agarose (איור 3A -C, העמודה השנייה; טבלה 3, בטור השלישי)
    1. צייר 200 μL של agarose נוזל לתוך מזרק 1.0 מ"ל, ואז להשתמש בו כדי למלא את צינור פלדה מלמעלה עם agarose עד שנוצר בחצי הכדור בפתיחת התחתונה. קוטר בחצי הכדור צריך להיות שווה לקוטר צינור. חכה כמה דקות עד agarose יש הקרושה.
    2. פיק לעובר עם מכחול ולסדר אותה על קצה המכחול כך הקצה הקדמי הופך לנגיש. טובלים את חצי הכדור agarose לתוך agarose נוזלי כדי לכסות אותו עם סרט דק.
    3. מניחים את העובר עם סופו הקדמי זקופה על מוט של חצי הכדור agarose. סובב את צינור פלדה סביב ולתקן את המיקום של העובר עם מברשת. במידת הצורך, לייצב את העובר על ידי הוספת 2 μL agarose לגבול העובר / חצי כדור. אִידֵאָלִיly, פחות ממחצית משטח העובר צריך להיות מכוסה agarose ואת המורדות צריכות להיות כמו תלולות ככל האפשר.
    4. הכנס את צינור פלדה עם חצי הכדור ואת העובר לאט לתוך תא מדגם.
  3. אפשרות 3: בעל Cobweb (איור 3A -C, העמודה השלישית; טבלה 3, בטור הרביעי)
    1. פיק לעובר עם מכחול ושומרים בצד.
    2. מכסה את החור המחורר של בעל קורי העכביש עם 5-8 agarose הנוזל μL, ולאחר מכן להסיר את רוב agarose עד סרט agarose רזה רק נשאר.
    3. מניחים את העובר על הסרט agarose ולהתאים את מעמדה. בזהירות להזיז את העובר במרכז ציר x של החור המחורר, וליישר הציר הקדמי אחורית המוארך שלה עם הציר המוארך של החור המחורר.
    4. הכנס את מחזיק קורי עכביש עם העובר רכוב לאט לתוך תא מדגם. מקם את מחזיק קורי עכביש, כך שהוא לא יפריע עירור ופליטהאור, כלומר 45 מעלות ביחס x ו- z הציר.

8. אור גיליון מבוסס מיקרוסקופ פלואורסצנטי

  1. החלט יחד כמה כיוונים (ו שלאורכו אוריינטציות) העובר צריך להיות צילמו. ארבעה כיוונים (לאורך האוריינטציות 0 °, 90 °, 180 ° 270) בדרך כלל לספק תחלופה טובה בין הכיסוי לבין עומס אנרגיה.
  2. הגדרת מספר הערוצים פלואורסצנטי. הפרמטרים העיקריים עבור כל ערוץ הם קו לייזר, מסנן הקרינה, כוח לייזר וזמן החשיפה. הדמית חיה ארוך טווח, חשוב כי עומס האנרגיה המשולב אינו עולה על המכסה של העובר. זמן חשיפה של 25-50 ms מבטיחה הדמיה מהר, בעוד כוח לייזר בין 100 לבין 300 μW לא אמור להשפיע על הכדאיות של העובר. לקבלת דוגמיות קבוע, זמן חשיפה וכוח לייזר יכול להיות מוכפל לפחות.
  3. מבחני הדמיה חיים, להגדיר את הזמן לשגות. את complete העובר של Tribolium לוקח בערך שבעה ימים בטמפרטורת החדר (23 ± 1 ° C) וקצת פחות משלושה ימים 32-35 ° 64 צלזיוס. הגדר את המרווח הזמני על פי האירועים המוךפו"גנטי שהולך כי יש לשים לב. עבור מרווח זמני קצר, לשקול הורדת זמן חשיפה וכוח הליזר (ראה 8.2).
  4. מקם את העובר במצב אור ההולכה לאורך צירי X ו- Y למרכז שדה הראייה בלי לחשוף אותו לייזר. סובב את העובר על ידי 360 ° ב 90 ° בצעדים לבדוק את העובר לכל נזק שעלול להתרחש במהלך תהליך ההרכבה.
  5. סובב את העובר כראוי סביב ציר ה- Y כדי ליישר את הצירים עובריים עם מיקרוסקופ גרזנים, למשל ציר לרוחב עם ציר ה- x, כלומר הציר dorsoventral עם ציר z. בעת השימוש בטכניקה בעל קורי עכביש, יישור לא יתאפשר.
  6. במצב פלואורסצנטי, להגדיר את Z- מחסנית FOr לכל כיוון. להוסיף 25-50 מיקרומטר כמו חיץ מרחבית מול ומאחורי העובר. כולל החיץ, Z-הערימה הטיפוסית מכסה סביב 350-400 מיקרומטר עבור עובר Tribolium. גם להגדיר את המרווח z, שאמור להיות ארבע פעמים את המרווח לרוחב, כלומר המרווח לאורך צירי X ו- Y 66.
  7. אם שניים או יותר עוברים הם צילמו במקביל, מחדש ב 8.4 עם העובר הבא.
  8. עבור הדמיה לטווח ארוכה, להבטיח כי קאמרי המדגם מלא pH מספיק PBS 7.4 או חיץ הדמיה אחר. כמו כן לכסות את הפתח קאמרי מדגם.
  9. התחילו את תהליך ההדמיה. הדמיה חיה לטווח ארוך, לפקח על הרכישה הנכונה לאורך כל הכיוונים בכל הערוצים לכל העוברים. מדי פעם לבדוק במהלך הימים הקרובים כי הם עוברים חיים במצב המתאים.

9. אחזור העובר בקרת איכות

  1. לאחר הדמיה השלימה, להסיר את בעל מדגם עםהעובר מתא המדגם. עוברים רק מבחני הדמיה חיה צריך להישלף. יכול להיות מושלך עוברי קבוע מוכתם.
  2. אם assay הדמית חיה בוצע, להעביר את העובר כדי מגלשת אובייקט. עבור טכניקה טור agarose, לחלץ את העוברים מן הסובבים agarose עם אזמל, מיקרו-סכין או סכין גילוח. עבור טכניקה בחצי הכדור agarose, להעביר חצי הכדור עם הצד השטוח לשקופית האובייקט. הסרת עובר אינה הכרחית. עבור טכניקה בעל קורי עכביש, לרדת העוברים בעדינות מהסרט agarose עם מכחול. דגירת שקופיות האובייקט בכלי זכוכית קטן באווירת לחות רוויה בתנאים סטנדרטיים עד הזחלים הבוקעים.
  3. לאחר הבקיעה, להעביר את זחלי בארות בודדות של צלחת 24-היטב ולהוסיף 500 מ"ג של מדיום גידול היטב כל אחד. דגירה בתנאים סטנדרטיים. השווה את זמן פיתוח הכולל ומורפולוגיה של הזחלים צלמו כדי WT הלא צלם larv מהונדסAE (ראה דיון). מבחני מאפיינות פיתוח WT, אין סטיות מורפולוגיים ברורות אידיאליות צריכות להיות מורגשות.
  4. לאחר הזחלים לפתח למבוגרים בריאים, לספק להם שותפים WT המתאים מאותו זן רקע. לאחר שבועות, לבדוק לייצור צאצאים. שקול גם לבדוק את הפוריות של הצאצאים ידי הזדווגות אותם השאר pares. רק כאשר עובר צלמו להתפתח מבוגרים פורים המייצרים צאצאים פוריים, הליך ההדמיה יכול להיחשב בלתי-פולשנית.

10. תמונה עיבוד נתונים

הערה: עיבוד נתוני תמונה, עיבוד תמונת הקוד הפתוח ותוכנת ImageJ 67 או הנגזרות שלו פיג'י 68 מומלצים. שתי הגרסאות וכן תיעוד מקיף נמצאים בבית www.imagej.net. תבנית הקובץ הסטנדרטית של נתוני LSFM היא פורמט קובץ תמונה המתויג (TIFF). האפשרות מיכל הפנימית מאפשרת STOהזעם של ערימות התמונה כגון איי-z או סדרת זמן של תחזיות מקסימלית z בתוך קובץ יחיד שניתן לפתוח ב ImageJ או בן פיג'י באמצעות גרירה ושחרור.

  1. במידת הצורך, לסובב את Z- ערימות כדי ליישר את ציר אחורי-הקדמי של העובר עם ציר y (תמונה → Transform → סובב). שימו לב לפרמטרים סיבוב צריך להגדיר בנפרד עבור כל כיוון, אבל לא עבור זמן לשגות ערוצי פלואורסצנטי.
  2. חתוך את Z- ערימות לאורך צירי X, y- ו-צירים z כך רקע מינימלי בלבד (20 - 40 פיקסלים לאורך x ו- y-צירים, 5 - 10 מטוסים לאורך ציר z) נשארת (עבור x - ו-צירי y, להשתמש בכלי הבחירה המלבניים, אז תמונת → יבול; עבור תמונת Z- ציר, שימוש → כלי ערימות → → Keeper Slice). שימו לב לפרמטרים חיתוך צריך להיות מוגדר בנפרד עבור כל כיוון, אבל לא עבור נקודות זמן ואת ערוצי פלואורסצנטי.
  3. חישוב ההיטל המרבי z לכל z-ערימה(תמונה → פרויקט ערימות → Z, לבחור עוצמת מקס). חישובי הקרנת עצמה הם הליכי פישוט נתונים המסירים ממד אחד מרחבית.
  4. לקבלת נתונים הדמיה חיה ארוכת טווח, שקול להשתמש ImageJ או סקריפט פיג'י שמבצע עיבוד צעדים 10.1 כדי 10.3 לכל הכיוונים, בכל נקודות הזמן וכל ערוצי פלואורסצנטי 65. באופן אידיאלי, לשרשר כל תחזיות מקסימלית z לכל ערוץ וכיוון ולשמור אותם כסדרה הזמן בתוך מכולה אחת TIFF. לחלופין, 69 BigDataViewer התוספת עבור פיג'י ניתן להשתמש כדי לנווט בין מערכי נתונים טרה-גדולים.
  5. בהתאם לאופני הקו ודימות המהונדסים, התאמות עוצמות דינמיות של ערימות הזמן עשויות להיות רצויות בשל הלבנת תמונה / או תנודות ביטוי fluorophore. או את ImageJ- או פיג'י מהותי פונקציה תיקון Bleach (תמונה → התאם → תיקון Bleach, בוחרים בהתאמה היסטוגרמה) או dedicaתוכנת 65 טד מוצעת.
  6. אם עובר נרשם ו / או לאורך כיוונים מרובים בערוצים פלואורסצנטי מרובים, שילוב אופקי של הכיוונים (תמונה → ערימות → כלי → שלב) ולמזג ערוץ (→ תמונת הצבע Merge → ערוצים) מומלצים.
  7. רישום ואיחוי של Z- ערימות רכשו יחד כיוונים מרובים 70, בסופו של דבר בשילוב עם פישוט 71, מאפשרים החישוב של תמונות תלת-מימדית מעולות של איכות אחידה ורזולוציה איזוטרופיים. שניהם התוספות הן קוד פתוח מותקנת מראש בפיג'י, אבל הם דורשים נוכחות של ציוני (מיקרוספרות פלורסנט, למשל חרוזים) סביב הדגימה.
  8. מסגרות תוכנה בקוד פתוח עבור חילוץ נתונים כמותיים בקנה מידה גדולה וניתוח זמינות גם, למשל עבור פילוח ומעקב של גרעיני תאים 72 או cell צורת הכרת 73.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פרוטוקול זה מתאר מסגרת ניסיונית עבור דימות פלואורסצנטי של חיים או קבוע מוכתם עובר Tribolium עם LSFM. בשל הרמות הנמוכות של הלבנת תמונה-רעילות צילום, תוצאה ישירה של יכולת החתך האופטית שלה, LSFM הוא גם מתאים במיוחד עבור הדמית חיה ארוך טווח.

AGOC הרומן {ATub'H2B-mEmerald} קו מהונדס # 1 מבטא חלבון היתוך histone2B-mEmerald תחת שליטה של האמרגן אלפא-טובולין 1 74. זה מראה דפוס ביטוי משפר דמוית מלכוד 51, מאז אות הקרינה מתקבלת בעיקר serosa, צק החלמון וכמה צבירי תאים עצביים. שימוש בקו הזה, 66 שעות של התפתחות עוברית בטמפרטורת חדר (23 ± 1 ° C) נרשמו, מכסי הכחשת germband וסגירת הגבי (סרט משלים 1). זֶהקו יכול לשמש כדי לחזות אשכול עצביות בתוך נספחי הראש (איור 4A) ואת הדינמיקה של גירת serosa במהלך סגר הגבי (איור 4 ב). AGOC רומן {ATub'H2B-mEmerald} הקו # 4 נושא אותו transgene כקו # 4, אך במיקום הגנומי שונה. זה לא מראה על דפוס Enhancer מלכודת ברור, אבל אות הקרינה היא spatiotemporally לגילוי ubiquitously כפי שתואר לעיל עבור האמרגן הזה 74. קו זה היה צלם את מעבר gastrulation כדי germband התארכות כדי להדגים את יכולת החתך האופטית בשתי רמות עומק (איור 4C). תכונה נוספת, במיוחד עבור הדמיה חיה, היא רכישת Z- ערימות לאורך כיוונים מרובים באמצעות סיבוב מדגם, המהווה תקן הגדרות LSFM משמשות בביולוגיה התפתחותית. לדוגמה, בקו 58 גליה-כחול, מדגם רוטציה כלOWS התצפית של ארגון מחדש תאי גליה יחד סביב העצב בחוט הגחון וכן את דינמיקת ההתפשטות באונת הראש שמאלה, אשר ניתן לראות כמו שצריך רק המאתר הגבה, באותו העובר (איור 4D, משלים סרט 2). מערכי נתוני הדמית החיה הקשורים במחקר זה ניתנים כמשאב להורדה, מידע מטא וגישה נמצאים בטבלת משלים 1.

מאז הבחירה של קווי מהונדס הדמיה לחיות עדיין מוגבלת, צבעי ניאון קטנים ניתן להשתמש בתווית במיוחד מבנים תאיים. Sytox גרין נקשר לתא גרעינים ניתן דמיין בערוץ הירוק, בעוד YOYO-1 ו Bobo-3 יודיד לאגד את המעטפה הגרעינית ניתן דמיין בערוץ הירוק או אדום, בהתאמה (איור 5 א). צבעים אלה יכולים לשמש כדי להדגיש struct העוברי מסויםures, כגון צלקת serosa (איור 5 ב, עמודה ראשונה), תאי serosa הגחון האחוריים (איור 5, עמודה שנייה) או רקמת serosa-germband-amnion-שכבה תלת עולה במהלך סגירת חלון serosa (איור 5 ב, ג ל גיס חמישי). מכתים Dual-צבע מאפשר הדמיה של שני מבנים תאיים באותו העובר, למשל המעטפה הגרעין יחד עם שלד התא אקטין, אשר יכול להיות מוכתם אלקסה פלואוריד מצומדות צבעי Phalloidin. לדוגמה, YOYO-1 יודיד ניתן לשלב עם Phalloidin 546 (איור 5 ג), ואילו Bobo-3 ניתן לשלב עם Phalloidin 488 (איור 5D).

זה גם נוח לתקן להכתים עוברים מהונדסים שכבר לבטא חלבון פלואורסצנטי מסוים, שכן הליך הקיבעון מסביר גורם לדיכוי fluorescenc המהותיהאות e שולית בלבד. לדוגמא, עובר מן AGOC {ATub'H2B-mEmerald} קו מהונדס # 4, שבו הגרעינים מזוהים בערוץ הירוק, יכול להיות מוכתם Phalloidin 546 כך cytoskeleton יקטין הופך לגלוי בערוץ האדום (איור 6 ).

איור 1
איור 1: השוואה בין widefield הקונבנציונלי, סריקת ליזר Confocal ו מבוסס גיליון אור מיקרוסקופ פלואורסצנטי. מיקרוסקופ פלואורסצנטי EPI-widefield קונבנציונלי משתמשת מנורות קשת / אדי כספית קסנון עם מסננים מתאימים או אור הספק גבוה דיודות פולטות כמקורות אור. עבור כל תמונה דו-ממדית רכש, הדגימה כולו מוארת עם קונוס אור הלא-עקיפה המוגבלת. מיקרוסקופ פלואורסצנטי סריקת לייזר confocal, קרן לייזר גאוס-מוגבל עקיפה הוא SC anned דרך דגימת הקרינה מזוהית בצורה מבולבלת, נקודה אחר נקודה. בדומה מיקרוסקופ פלואורסצנטי EPI-קונבנציונאלי widefield, הדגימה כולו מואר לכל תמונה דו-ממדית רכשה. מיקרוסקופ פלואורסצנטי מבוססי אור גיליון, קרן לייזר גאוס-מוגבל עקיפה מאירה את הדגימה בניצב לציר זיהוי. קרינה מזוהית או מטוס אחר מטוס או קו אחר קו. במהלך רכישת תמונה דו-ממדית, רק נפח קטן המרוכז במישור המוקד של מטרת זיהוי חווה את ההשפעות של אור העירור. נפח הנותרים של הדגימה הוא לא מואר, לא תורמים מחוץ מוקד טשטוש, אינו סובל אפקטים לתמונה רעיל ואינו מאבד fluorophores בשל הלבנת התמונה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

EP-together.within-page = "1"> איור 2
איור 2: עיקרון מיקרוסקופ פלואורסצנטי מבוסס גיליון אור. בשנת LSFM, תאורה וזיהוי שמחולקים לשני נתיבים אופטיים לפחות. לפחות זרוע תאורה אחד משמשת ליצירת גיליון האור (ציאן), בעוד לפחות זרוע איתור אחד מצוידת במסנן מתאים ומצלמה לגילוי המקביל של אותות הקרינה (ירוק). יש LSFM שני מימושים הקאנוני, למיקרוסקופ תאורת מטוס הבודד (או סלקטיבי) (רקע הכחול) ואת מיקרוסקופ גיליון אור הליזר הדיגיטלי הסרוק (רקע אדום). על ידי הזזת הדגימה ואת יחסי גיליון אור זה לזה, תלת ממד תמונות נרכשות. מידע לאורך כיוונים מרובים נאסף על ידי החלפת הדגימה סביב ציר y, אשר מכוון באופן מועדף יחד הכביד.ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55629/55629fig2large.jpg" target = '_ blank'> אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: שלוש טכניקות שם שונות המשמשות ההקלטה של ההתפתחות העוברית של Tribolium עם אור גיליון קרינה מבוססת מיקרוסקופי. (א) בטור agarose מתייחס גליל פלדה עם סיכה קטנה שדוחפת את הטור agarose, שבו העובר מוטבע, מתוך נימי זכוכית. ההמיספרה agarose הוא רכוב על צינור פלדה. העובר מחובר מוט של חצי הכדור עם כמות קטנה של agarose. בעל קורי העכביש הוא יריעת מתכת עם חור מחורר רכוב על גבי גליל הפלדה. העובר מודבק סרט agarose דק החובקת tשהכניס חור. (ב) ערכות של שלוש טכניקות ההרכבה בתוך מיקרוסקופ גיליון אור. (ג) השלוש טכניקות ההרכבה מיושמות בתוך DSLM. (ד) תמונות למופת מעוברים של הקו מהונדס-כחול גליה מוקלט עם שלוש טכניקות הרכבה. עובר, אשר בתחילת הכחשת germband, מוצגים עם הקצה האחורי שלהם המכוונים כלפי עליון כדי להתאים את תמונות אור ההולכה. FM, מצב קרינה; ZA, הקרנה מרבית z עם התאמה עוצמת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4: הדמיה חיה של עוברים Tribolium. (א </ Strong>) עובר של AGOC {ATub'H2B-mEmerald} קו # 1 על מעבר הכחשת germband לסגירת הגבי. קו זה מציג דפוס ביטוי Enhancer מלכודת. אות הקרינה נמצאת בעיקר serosa, צק החלמון וכמה צבירי תאים עצביים. העובר מוצג על פני תקופה של 15 שעות עם הפסקה של 5 h. תמונות הפרטים מציגות אשכולות תא נספחי הראש. בתחילה, האשכולות עדיין מכוסים על ידי תאי serosal (עמודה ראשונה), על קרע serosa, התאים פעלו יחד עם התנועה הסיבובית של הראש. (ב) העובר Same לראות במהלך סגר הגבה עבור 1:30 שעות עם הפסקה של 00:30 h. התמונות הפרטים מציגות את ההגירה של serosa מקרע מעל שק החלמון. (ג) שורה עליונה: עובר של AGOC {ATub'H2B-mEmerald} קו # 4 על המעבר gastrulation כדי germband התארכות. תיכון בשורה תחתונה: מטוסים יחידים מוצגים שני מעמקי פני תקופה של 10:30 שעות עם הפסקה של 01:30ח. (ד) העובר על הקו הכחול, גליה במהלך הכחשה germband המוצג על פני תקופה של 50:30 שעות עם הפסקה של 07:30 h. תמונות הפרטים מציגות ארגון מחדש המוךפו"גנטי שהולך של תאי גליה באונה השמאלית הראש. ZA, הקרנה מרבית z עם התאמה עוצמת; רשות יחיד מטוס עם התאמה עוצמת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5: קיבוע, מכתים, Iimaging של WT עוברים במהלך Germband התארכות. עוברי (א) מוכתם או Sytox גרין, כלומר כתם גרעיני מטושטש, או YOYO-1 יודיד או Bobo-3 יודיד, כלומר שני כתמי מעטפת גרעין. (ב) יודיד מוכתם YOYO-1 אמבריo. פרטים להראות את הצלקת serosa (עמודה ראשונה), המעטפה הגרעין של התאים serosa גדול הגחון האחורי (עמודה שנייה) או הארגון רקמות תלת שכבתית של serosa, את amnion ואת רקמות עובריות בפועל (שלישי גיס חמישי). (ג) מכתים Dual-צבע עם YOYO-1 יודיד ו Phalloidin 546. (ד) מכתים Dual-צבע עם Phalloidin 488 ו Bobo-3 יודיד. ZA, הקרנה מרבית z עם התאמה עוצמת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6
איור 6: תמונות של Fixed ומוכתמת טרנסגניים העוברים מן AGOC קו {H2B-mEmerald 'ATub} # 1. קו מהונדס זה מבטא mEmerald-labelאד histone2B (H2B) תחת שליטה של האמרגן 1 טובולין אלפא, אשר מסמנת את הגרעינים / הכרומטין ubiquitously ברחבי ההתפתחות העוברית כולו. העובר היה מוכתם נוסף עם פלואוריד אלקסה 546 Phalloidin, אשר תוויות שלד התא / F- יקטין יקטין. ZA, הקרנה מרבית z עם התאמה עוצמת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

קרִיטֶרִיוֹן סוג מיקרוסקופ פלואורסצנטי
שדה רחב קונבנציונלי סריקת לייזר confocal גיליון מבוסס אור
התקנת עדשה אובייקטיבית אחד עדשה אובייקטיבית, בינוני-גבוה NA שתי בניצב מסודר עדשות אובייקטיביות, תאורה: הנמוך NA, זיהוי: גבוה NA
מקור אור תאורה מסנן מקור אור לבן מתאים (למשל מנורות קצרת קשת כספית)
או מבוסס LED עם מסנני ניקוי 		לייזר עם מסנן ניקיון
(דיודה למשל או לייזרים DPPS) 		לייזר עם מסנן ניקיון
(דיודה למשל או לייזרים DPPS)
תאורה לכל תמונה דו-ממדית מדגם כולו מדגם כולו
(בדרך כלל דו-ממד סריקת קרן גאוסיאנית) 		מישור מוקד בלבד
(DSLM: סריקת קרן גאוסיאנית-ממדי אחד)
איתור מַקְבִּיל
(בדרך כלל מצלמת CCD או sCMOS) 		סִדרָתִי
(צינור מכפיל) 		מַקְבִּיל
(בדרך כלל CCD או SCMOS מצלמה)
מהירות הדמיה מהר (אלפית לכל תמונה) איטיות (שניות לכל תמונה) מהר (אלפית לכל תמונה)
מחוץ לפוקוס פלואורסצנטי אין אפליה חסם כמעט לחלוטין על ידי החריר
(יעילות דחייה תלויה בקוטר) 		כמעט אפסי
(רק בשל פיזור)
ממדים מרחביים 2
(X / y) 		3
(X / y / z) 		3
(X / y / z)
מעלות נוספות של חופש 2
(זמן, ערוץ קרינה) 		2
(זמן, ערוץ קרינה) 		3
(זמן, ערוץ פלואורסצנטי, כיוון)
רזולוציה לרוחב r
(0.6 λ / NA) 		0.66 r
(0.4λ / NA) 		r
(0.6 λ / NA)
יכולת חתך אופטית לא כן
(אפליה במסלול זיהוי) 		כן
(אפליה במסלול התאורה 75)
זמינות ומחיר בעיקר מסחרית, בעלות נמוכה בעיקר מסחריים, יקר מסחרי, יקר
שהותקן, 54,59,60,75 מתונה
פרסומי הדמית חית מכסים עוברים Tribolium שישה 44,76,77,78,79,80 שבע 23,77,79,81,82,81
(confocal דיסק מסתובב) 83,84,85 		ארבעה 23,57,65,86

טבלה 1 - מאפייני לזרוחטכניקות NCE מיקרוסקופיות המשמשות Tribolium לחיות הדמיה.

צֶבַע הַכתָמָה מְהִילָה
Sytox גרין גרעינים (מטושטש) 1: 10,000 (1: 100 ב DDH 2 O ו 1: 100 ב 1% (w / v) BSA ב PBS)
יודיד YOYO-1 מעטפת גרעין 1: 10,000 (1: 100 ב DDH 2 O ו 1: 100 ב 1% (w / v) BSA ב PBS)
יודיד Bobo-3 מעטפת גרעין 1: 10,000 (1: 100 ב DDH 2 O ו 1: 100 ב 1% (w / v) BSA ב PBS)
פלואוריד אלקסה 488 Phalloidin cytoskeleton אקטין 1: 100 (ב 1% (w / v) BSA ב PBS)
פלואוריד אלקסה 546 Phalloidin cytoskeleton אקטין

טבלה 2 - מכתים פתרונות.

טור agarose
(אופציה 1) 		המיספרה
(אופציה 2) 		בעל קורי עכביש
(אופציה 3)
רציונל העובר מוטבע טור agarose כי נדחף החוצה של נימים בסוף העובר האחורי מודבק מוט של חצי כדור הארץ agarose העובר מודבק סרט דק agarose פורש חור מחורר
בעל מדגם גליל פלדה עם סיכה צינור פלדה גליל פלדה עם
חור מחורר
ללא הגבלה (כל) ללא הגבלה (כל) ארבעה (0 °, 90 °, 180 °, 270 °)
רמת המיומנות הנדרשת לְמַתֵן גָבוֹהַ נָמוּך
agarose סביב העובר גָבוֹהַ נָמוּך לְמַתֵן
מספר העוברים בכל הפעלה עד שלושה אחד עד שש
חזר העובר ערמומי קַל קַל
ציוד חד פעמי נימי זכוכית - -
מומלץ הדמיה חי לטווח קצר, עובר מוכתם הדמיה לטווח ארוך חייה הדמיה לטווח ארוך חי, עוברים מוכתם
<אזכור strong> שלושה 23,87,88 שני 57,65 בפרסום זה

טבלה 3 - הרכבת יתרונות שיטות וחסרונות.

אינדוקציה פנוטיפ לקויה רציונל שלב הפניה (מתודולוגית)
התערבות RNA עוברית RNA דו-גדילי המוזרק עובר בשלב blastoderm סינסיציאלי לדפוק למטה אחד או גנים ספציפיים יותר להזריק עוברים לאחר שלב 4.8. שני 33,81
התערבות RNA הורית RNA דו-גדילי מוזרק רוחבי לתוך FEMA le גלמים בין מגזרי בטן 3 ו 4, אשר מובילים גן עקום למטה ב הצאצאים לקחת הגלמים משלבים 1.5. שני 36,37
רצסיבי קווים מוטנטים קטלניים עובריים הטלת תרבויות שנושאות תשואת הטרוזיגוטיים מוטציה קטלנית עוברית רצסיבי על צאצאי מוטציה הומוזיגוטי 25% לחצות קו מוטציה לתוך קו הדמיה במהלך שלב 1.5. שלושה 39,51,89
יישום של גורמים חיצוניים גורמים ביו או רעילים מסוימים מוחלים extrinsically אל העוברים על ידי הוסיף חיץ ההדמיה להוסיף גורם חיץ הדמיה במהלך שלב 2.2. שני 83,85

טבלה 4 - LSFM הדמית חיה של פנוטיפים לקויים

= "1"> שולחן משלים 1 - Metadata ופרמטר עבור לטווח ארוך חי-הדמיה מערכי נתונים DS0001-0003. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

הסרט משלים 1 - הדמיה חיה של עובר Tribolium מן AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 1 קו מהונדס.
קו זה מציג דפוס ביטוי Enhancer מלכודת. אות הקרינה נמצאת בעיקר serosa, צק החלמון ואת קבוצת משנה של תאים עצביים. העובר מוצג לאורך ארבע אוריינטציות מ 00:00 שעות כדי 66:00 h עם מרווח של 00:30 h בין נקודות הזמן. הסרט מתחיל בתחילת הכחשת germband ומסתיים פעם סגר גב הושלם. קצב פריימים הוא חמישה פריימים לשניים. ZA,הקרנה מרבית z עם התאמה עוצמת. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

הסרט משלים 2 - הדמיה חיה של עובר Tribolium מהקו טרנסגניים כחול-גליה.
העובר מוצג לאורך ארבע אוריינטציות מ 00:00 שעות כדי 66:00 h עם מרווח של 00:30 h בין נקודות הזמן. הסרט מתחיל בתחילת הכחשת germband ומסתיים פעם סגר גב הושלם. קצב פריימים הוא חמישה פריימים לשניים. ZA, הקרנה מרבית z עם התאמה עוצמת. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בקרת איכות

מבחני הדמיה חיים, הליך כנת הקלטה חייב להיות בלתי-פולשנית, כלומר לא את הטיפול המכאני וכימי (האוסף, dechorionation, הרכבה על בעל המדגם) ולא את עומס האנרגיה המשולב במהלך התצפית צריך לפגוע בכדאיויות של הדגימה. עבור מחקרים המאפיינות פיתוח WT, מומלץ נתונים לשימוש רק מניסויים שבו העובר שורד את תהליך ההקלטה, מאוחזר בהצלחה מתפתח לכדי מבוגרים בריאים. המבוגר לא צריך להראות שום סטיות מורפולוגיים, צריך להיות פורה והצאצאים שלה צריכים גם להיות פוריים. ישנן שלוש סיבות עיקריות שיעורי הישרדות נמוכים, במיוחד מבחני הדמיה חי לטווח ארוך:

ראשית, פני השטח העובר סוקרה בהרחבה עם agarose במהלך שלב 7, אשר כנראה מעכבת חילוף יונים גז מכווץ את העובר mechanבאופן לא בולט. עוברים מושפעות, במיוחד כאשר צילמו במהלך העובר מוקדם, בדרך כלל לפתח להתבלט במשך מספר שעות, לעצור לפתע ולאבד אותות הקרינה שלהם במהירות. עם קצת ניסיון, השבר משטח כי הוא מוטבע agarose ידי שימוש בטכניקה בחצי הכדור יכול להישמר מתחת שליש, ואילו עם הטכניקה בעל קורי עכביש, במחצית רוב השטח מכוסה בשכבה agarose מאוד רזה. שנית, את עומס האנרגיה המשולב להחיל את העובר עולה על הסובלנות. הערכים שניתנו שלב 8.2 לשמש ככלל אצבע, אבל הקריטריונים הבאים צריך להיחשב: (i) עוברים במהלך ההתפתחות העוברית המוקדמת לא לסבול הקרנת לייזר וכן בעוברים במהלך ההתפתחות העוברית מאוחר, (ii) אם כי אנרגיה משולבת עומס יכול להיות זהה, כוח הליזר גבוה עם זמן חשיפה או נמוך או במרווחים זמניים כבר נראה מלחיץ יותר כוח הליזר נמוך עם זמן חשיפה גבוהה או במרווחים קצרים זמנייםאורכי גל גבוהים יותר, (iii) הם בדרך כלל טוב יותר נסבלים (iv) עבור קווים מהונדסים, מגבלת הסובלנות שנראית קו ספציפי, ואילו כוח ביטוי fluorophore נראה ביחס הפוך סובלנות הקרנת ליזר. בנוסף, העיצוב של חלבון ההיתוך ו / או הלוקליזציה התאית גם לשחק תפקיד. שלישית, העובר ניזוק במהלך תהליך ההרכבה. הגורם החשוב ביותר כאן הוא כי זמן הדגירה של שטיפה בתמיסת סודיום היפוכלוריט הוא קצר ככל צורך להסיר סיסית לחלוטין. פעמי דגירה כבר עשויות לפגוע בעוברים. טיפול צריך גם לקחת כדי לא לנקב או לסחוט את העוברים עם המברשת כדי לשמור על הרכבת agarose בטמפרטורת סביבה. עובר פגום ניתן לזהות במהלך שלב 8.4 לפני תהליך ההדמיה בפועל מתחיל, כך שיכולים להיות מוחלפים עוברים פגומים עם אלה קיימא.

על ידי ביצוע הנחיות אלו, בדרך כלל סביב 85-90% של אמבריOS לשרוד את הליך הדמית חית צוהר. בסביבות 90% מן העוברים בקעו להתפתח מבוגרים בריאים ופוריים. יחס ההישרדות שנראה עצמאי הדמית טמפרטורת הרכבת טכניקות (כאשר עמודת agarose משמשת לתקופות הדמיה של לא יותר מחצי יום), אבל יורד מעט עם רמות גבוהות של וקרינת ליזר. בתור שליטה נוספת, במיוחד במהלך האפיון הראשוני של קווים מהונדסים מחוייטת עבור דימות פלואורסצנטי החייה או במסגרת הקמת שלב כמו מבשר על רצף ניסיוני מקיף, מומלץ לרוץ WT הלא צלם עוברים מהונדסים במקביל צלם עובר, אשר מודגרת באותה הטמפרטורה כמו עובר ההדמיה, ולהשוות 65 התפתחות זמן המורפולוגיה שלהם.

יתר על כן, מחקרים המאפיינות פנוטיפים לקוי (לוח 4) באמצעות הדמית חיה צריכים גם להפעיל ג שאינם מושפעיםעובר ontrol במקביל. מומלץ להשאיר את הטיפול של שניהם עוברים הדומה ככל האפשר, אבל זה צריך להיחשב בנפרד עבור כל אסטרטגיה ניסיון:

עקום למטה באמצעות התערבות RNA.

עבור התערבות RNA עוברית 33, 81, עובר הנובעות מתרבה באותו ההטלה צריך להיות מוזרק או עם RNA פונקציונלי או לשלוט פעמים תקועות. עוברים מוזרק בצורה שונה אז צריך להיות צילמו בו זמנית באותו LSFM באמצעות אחת בעמודה agarose או הטכניקה בעל קורי עכביש. עבור התערבות RNA הורית 36, 37, בתרבות ההדמיה יש לפצל לשתי תת תרבות. גלמי נקבה תת-תרבות אחת צריכים להיות מוזרקים עם RNA דו-גדילים התפקודיים, בעוד תת אחרים צריך להיות מוזרק עם RNA דו-גדילים מלאים. coll העוברשיקוף צריך להתבצע במקביל, ושניהם הניסיונות ואת העובר המלא ניתן הדמיה בו זמנית באותו מיקרוסקופ באמצעות טור agarose או הטכניקה בעל קורי עכביש.

קווים מוטנטים קטלניים עובריים רצסיבית.

כאשר עובד עם מוטציות קטלניות עובריות רצסיבי 39, 89, 91, 92, 93, תרבות הטלה של מוטציות הטרוזיגוטיים, אשר בדרך כלל בולטים phenotypically, תשואות תיאורטית 25% צאצאי מוטציה הומוזיגוטים (אבל לפעמים פחות בשל טיפול מעשי מנפיקה 89) ו 75% של צאצאי phenotypically בולטים (50% מוטציות הטרוזיגוטיים ו 25% WTS). מומלץ להשתמש בטכניקת בעל קורי העכביש לעלות כמה עובר מן כזה תרבות הטלה. מוטציות הומוזיגוטים יכול להיות שאניdentified לאורך כל תקופת ההדמיה ידי הביטוי של פנוטיפ, בעוד העוברים מתפתחים בצורה התקינה לשמש שולטת. הגנוטיפ של דגימות צילמו ניתן לקבוע פעם הדמיה ובקרת איכות הושלמו.

יישום של גורמים חיצוניים.

אם ההשפעה של גורמים חיצוניים בתוך חיץ ההדמיה 83, 85, למשל חומרים ביו או רעילים, על פיתוח נחקר, הדמיה במקביל יחד עם עובר שליטה באותו LSFM היא בדרך כלל לא אפשרית. לכן, הדמיה צריכה להתבצע ברצף. באופן אופטימלי, הפעם בין הניסויים הבאים ממוזער ואת העוברים נובעים מאותה תרבות ההדמיה. לחלופין, שני נבנה ובשפת LSFMs פעל יכול לשמש. במקרה זה, עובר מאותה תקופת ההטלה אמור לשמש, אבל זה הוא בעל חשיבות רבה ש- THכיול הדואר של שניהם מיקרוסקופ מתנהל בזהירות כך תכונות הדמייה ניתנים להשוואה. באמצעות טכניקה בעל קורי עכביש, עוברים מרובים עבור כל מצב ניתן הדמיה בבת אחת. בעזרת טכניקת טור agarose, בגורמים החיצוניים עלולים להתעכב מלהגיע העוברים.

המגבלות הנוכחיות של הגישה הדמיה חיה LSFM

LSFM הוא כלי רב עצמה כדי לנתח morphogenesis העוברי הלא פולשני בממדים רחבים בגוונים מרובים. נהלי תפעול רגילים, כפי שהוצע בפרוטוקול זה, יתמכו בתהליך להקים טכנולוגית גיליון אור ככלי סטנדרטי בביולוגיה התפתחותית. עם זאת, הגישה מוגבלת על ידי מספר הגורמים על רמות ניסיוניות וארגוניות מגוונות:

בתחילה, פותח LSFM לנתח אחד דגימה בכל פעם. כל הנוכחי מתקרב כי תמונה שתיים או יותר עובר בו זמנית ב מיקרוסקופ אותו "הערמה" y הדגימה לאורך ציר ה- Y בעמודה agarose או לכתובות בעל קורי עכביש סוגיה זו רק במידה מסוימת. Multi-היטב plate- ואת ההגדרות מבוססות coverslip זמינות 94, 95, 96. עם זאת, הם סובלים איכות תמונה מופחתת להקריב חלק מהיתרונות החיוניים מן LSFM, כגון הדמיה לאורך כיוונים מרובים. נכון לעכשיו, האפשרות הטובה ביותר היא לעבוד עם מיקרוסקופים מרובים במקביל, אשר הופך סביר ריאלי כאשר רכיבים יקרים, כגון לייזר, הינם משותפים 60.

עם EFA-nGFP 57, 65, 84, 86 FNL, 58 חכמות, 86, את AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 1, את AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 4 ואת גליה-כחול= "Xref"> 58, רק שש מחוייט מהונדס קווי מתאים הדמיה לטווח ארוך חייה זמין כעת. בנוסף, HC079 (amnion), G12424 (serosa) ו G04609 (לב) קווי Enhancer מלכודת 51 אופיינו עם LSFM 23. לחלופין, עוברת פלורסנט יכול גם להיוצר על ידי mRNA 81 או לצבוע הזרקה 79, גישות אלה הן יחסית פשוטות, אבל גם סובלים ממגבלות 86. כמה יותר סטנדרטים עדיין נדרשים כגון cytoskeletal-, organelle- ואת קרום שכותרתו קווים או קווים המבטאים fluorophores תחת מקדמי שאינו נמצא בכל מקום מסוים להתבונן רק איברים או רקמות מסוימות. באופן אידיאלי, קווים אלה זמינים גם עם חלבוני ניאון שונים.

אתגר נוסף הוא נפח הנתונים המופקים על ידי LSFM. בשל רכישת מידע בשלושה ממדים מרחביים ולפחות שלושה פומעלות rther של חופש (זמן, כיוון, ערוץ פלואורסצנטי), בגודל של מערכי נתונים הדמיה חיה יכול להגיע ג'יגה-בייט לכמה טרה בקלות. גם לאחר חיתוך תלת-ממד דחיסה מבוססת ZIP של מכולות TIFF, השלושה המערכים הנתונים למופת קשורים למחקר יש בגדלים של 31.6, 12.6 ו 45.1 ג'יגה-בייט, כלומר 89.3 Gigabyte בסך הכל. כאשר עובדים עם LSFM, יש צורך לקיים את התשתית המתאימה לאחסון נתונים ועיבוד 88, 97.

איכות התמונה הגבוהה ביותר מתקבלת על פני השטח של העובר, אך עם הגדלת עומק, אות הקרינה הופכת יותר ויותר מטושטש. לדוגמה, את הקצה האחורי של germband מתכסה ידי לקפל שק החלמון במהלך gastrulation ולא ניתן לפתור כראוי (איור 4C, הראשון גיס חמישי). הדמיה לאורך כיוונים מרובים פותרת בעיה זו לפחות חלקially - מידע באיכות גבוהה מפני השטח מסביב העובר נגיש, אבל באזורים הפנימיים נשארים מעורפלים. נכון לעכשיו, אין פתרונות מניחים זמינים, אבל בטווח הארוך, חלבוני ניאון אדומים 98, גישות גנטיות 99 או הגדרות מיקרוסקופ עם אופטיקה אדפטיבית 100 יכולים להיחשב.

הסתגלות עבור מינים אחרים

עד עכשיו, LSFM נוצל כדי לתעד את ההתפתחות העוברית של שלושה מינים של חרקים, כלומר זבוב הפירות תסיסנית 61, 62, 101, בהפזונם לטוס Megaselia abdita 102 לבין 57 castaneum Tribolium חיפושית הקמח אדום. המסגרת הניסיונית, נהלי עבודה וטכניקות הרכבה המתואר כאן shoulאהיה להתאמה בקלות מינים של חרקים אחרים. פרוטוקולי טרנספורמציה germline עבור חרקים רבים ששייכים הזמנות שונות זמינים 103, כוללים מינים בעלי חשיבות כלכלית ו / או רפואית, כגון דבורת הדבש 104, מספר lepidopterans 105, 106 או מיני יתושים מרובים 107, 108, 109. עם קווים מתאימים מהונדסים מתאימים הדמית חית פלואורסצנטי, morphogenesis העוברי של חרקים ניתן לאפיין תוך התחשבות השושלות אבולוציוני שלהם ו / או נישות אקולוגיות. כמיליון מינים של חרקים תוארו וכן עוד עשרים מיליון חרקים מינים ככל הנראה קיימים 110, המכסים יותר מ -400 מיליון שנים של אבולוציה 2. רק בגישה ההשוואתית תפיק מידע כי provi בתורותובנות des אשר לא ניתן להשיג על ידי לימוד עקרונות התפתחותיים של זן יחיד בלבד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים אין לחשוף.

תרומות מחבר

FS ו EHKS הגה את המחקר. FS שנוצר קווי AGOC המהונדסים. דימות פלואורסצנטי מבוסס אור גיליון בוצעה על ידי FS ו SK. FS ו EHKS כתב היד עם קלט SK.

Acknowledgments

אנו מודים סוון פלאת לקבלת תמיכה טכנית. השורה המהונדסת-כחולת גליה הייתה מתנה מסוג מ הגרגור בוכר (גטינגן, גרמניה). המחקר מומן על ידי האשכול של פרנקפורט המצוינת המיין עבור מכלולי Macromolecular (CEF-MC, EXC 115, הרמקול וולקר Dötsch) העניקו בחלקו EHKS במכון ע"ש בוכמן עבור מדעי חיים מולקולריים (BMLS, מנהל אנריקו Schleiff) בבית גתה Universität פרנקפורט ידי (DFG).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
full grain wheat flour Demeter e.V. 1.13E+08 US: whole wheat flour, UK: whole meal flour
405 fine wheat flour Demeter e.V. 1.13E+08 US: pastry flour, UK: soft flour
inactive dry yeast Flystuff / Genesee Scientific 62-106
Phosphate-buffered Saine (PBS), pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010-023
sodium hypochlorite, ~12% active Cl Sigma Aldrich 425044-250ML Caution: sodium hypochlorite is corrosive
low-melting agarose Carl Roth 6351.2
6-well plate Orange Scientific 4430500
24-well plate Orange Scientific 4430300
glass capillaries, internal Ø 0.46 mm Brand GmbH + Co KG 7087 09
SYTOX Green Thermo Fisher Scientific 57020 Staining solution preparation is explained in Table 2
YOYO-1 Iodide Thermo Fisher Scientific Y3601 Staining solution preparation is explained in Table 2
BOBO-3 Iodide Thermo Fisher Scientific B3586 Staining solution preparation is explained in Table 2
Alexa Fluor 488 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A12379 Staining solution preparation is explained in Table 2
Alexa Fluor 546 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A22283 Staining solution preparation is explained in Table 2
sieve, 800 µm mesh size VWR International 200.025.222-051
sieve, 710 µm mesh size VWR International 200.025.222-050 for growth medium preparation (step 1.1)
sieve, 300 µm mesh size VWR International 200.025.222-040
sieve, 250 µm mesh size VWR International 200.025.222-038 for egg laying medium preparation (step 1.2)
glass dish, Ø 100 mm × 20 mm Sigma Aldrich CLS70165102
cell strainer, 100 µm mesh size BD Biosciences 352360
paint brush, head Ø 2 mm VWR International 149-2121
syringe, 1.0 mL B. Braun Medical AG 9166017V
scintillation vials Sigma Aldrich M1152-1000EA
paraformaldehyde (PFA) Sigma Aldrich 158127 Caution: paraformaldehyde is toxic and corrosive
n-heptane ≥99% Carl Roth 8654.1 Caution: n-heptane is flammable and toxic
Triton X-100 Sigma Aldrich X100-100ML Caution: Trition X-100 is corrosive

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brown, S. J., Denell, R. E., Beeman, R. W. Beetling around the genome. Genet. Res. 82, 155-161 (2003).
  2. Misof, B., et al. Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 346, 763-767 (2014).
  3. Tong, K. J., Duchêne, S., Ho, S. Y. W., Lo, N. INSECT PHYLOGENOMICS. Comment on "Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 349, 487 (2015).
  4. Kjer, K. M., et al. INSECT PHYLOGENOMICS. Response to Comment on "Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 349, 487 (2015).
  5. Klingler, M. Tribolium. Curr Biol. 14, 639-640 (2004).
  6. Savard, J., Marques-Souza, H., Aranda, M., Tautz, D. A segmentation gene in tribolium produces a polycistronic mRNA that codes for multiple conserved peptides. Cell. 126, 559-569 (2006).
  7. Yang, X., Zarinkamar, N., Bao, R., Friedrich, M. Probing the Drosophila retinal determination gene network in Tribolium (I): The early retinal genes dachshund, eyes absent and sine oculis. Dev. Biol. 333, 202-214 (2009).
  8. Peel, A. D. Forward genetics in Tribolium castaneum: opening new avenues of research in arthropod biology. J. Biol. 8, 106 (2009).
  9. Lynch, J. A., El-Sherif, E., Brown, S. J. Comparisons of the embryonic development of Drosophila, Nasonia, and Tribolium. Wiley Interdiscip. Rev. Dev. Biol. 1, 16-39 (2012).
  10. Schröder, R., Jay, D. G., Tautz, D. Elimination of EVE protein by CALI in the short germ band insect Tribolium suggests a conserved pair-rule function for even skipped. Mech. Dev. 80, 191-195 (1999).
  11. Posnien, N., Schinko, J. B., Kittelmann, S., Bucher, G. Genetics, development and composition of the insect head--a beetle's view. Arthropod Struct. Dev. 39, 399-410 (2010).
  12. Posnien, N., Koniszewski, N. D. B., Hein, H. J., Bucher, G. Candidate gene screen in the red flour beetle Tribolium reveals six3 as ancient regulator of anterior median head and central complex development. PLoS Genet. 7, 1002416 (2011).
  13. Angelini, D. R., Smith, F. W., Aspiras, A. C., Kikuchi, M., Jockusch, E. L. Patterning of the adult mandibulate mouthparts in the red flour beetle, Tribolium castaneum. Genetics. 190, 639-654 (2012).
  14. Coulcher, J. F., Telford, M. J. Cap'n'collar differentiates the mandible from the maxilla in the beetle Tribolium castaneum. Evodevo. 3, 25 (2012).
  15. Peel, A. D., et al. Tc-knirps plays different roles in the specification of antennal and mandibular parasegment boundaries and is regulated by a pair-rule gene in the beetle Tribolium castaneum. BMC Dev. Biol. 13, 25 (2013).
  16. Bucher, G., Klingler, M. Divergent segmentation mechanism in the short germ insect Tribolium revealed by giant expression and function. Development. 131, 1729-1740 (2004).
  17. Handel, K., Basal, A., Fan, X., Roth, S. Tribolium castaneum twist: gastrulation and mesoderm formation in a short-germ beetle. Dev. Genes Evol. 215, 13-31 (2005).
  18. Roth, S., Hartenstein, V. Development of Tribolium castaneum. Development Genes and Evolution. 218, 115-118 (2008).
  19. Schröder, R., Beermann, A., Wittkopp, N., Lutz, R. From development to biodiversity--Tribolium castaneum, an insect model organism for short germband development. Dev. Genes Evol. 218, 119-126 (2008).
  20. Sharma, R., Beermann, A., Schröder, R. The dynamic expression of extraembryonic marker genes in the beetle Tribolium castaneum reveals the complexity of serosa and amnion formation in a short germ insect. Gene Expr. Patterns. 13, 362-371 (2013).
  21. Benton, M. A., Pavlopoulos, A. Tribolium embryo morphogenesis: may the force be with you. Bioarchitecture. 4, 16-21 (2014).
  22. Horn, T., Hilbrant, M., Panfilio, K. A. Evolution of epithelial morphogenesis: phenotypic integration across multiple levels of biological organization. Front. Genet. 6, 303 (2015).
  23. Hilbrant, M., Horn, T., Koelzer, S., Panfilio, K. A. The beetle amnion and serosa functionally interact as apposed epithelia. Elife. 5, (2016).
  24. Jacobs, C. G. C. C., vander Zee, M. Immune competence in insect eggs depends on the extraembryonic serosa. Dev. Comp. Immunol. 41, 263-269 (2013).
  25. Jacobs, C. G. C., Spaink, H. P., vander Zee, M. The extraembryonic serosa is a frontier epithelium providing the insect egg with a full-range innate immune response. Elife. 3, (2014).
  26. Jacobs, C. G. C., Rezende, G. L., Lamers, G. E. M., vander Zee, M. The extraembryonic serosa protects the insect egg against desiccation. Proc. Biol. Sci. 280, 20131082 (2013).
  27. Lewis, D. L., DeCamillis, M., Bennett, R. L. Distinct roles of the homeotic genes Ubx and abd-A in beetle embryonic abdominal appendage development. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 4504-4509 (2000).
  28. Beermann, A., et al. The Short antennae gene of Tribolium is required for limb development and encodes the orthologue of the Drosophila Distal-less protein. Development. , 287-297 (2001).
  29. Grossmann, D., Scholten, J., Prpic, N. -M. Separable functions of wingless in distal and ventral patterning of the Tribolium leg. Dev. Genes Evol. 219, 469-479 (2009).
  30. Angelini, D. R., Smith, F. W., Jockusch, E. L. Extent With Modification: Leg Patterning in the Beetle Tribolium castaneum and the Evolution of Serial Homologs. G3. 2, Bethesda. 235-248 (2012).
  31. Grossmann, D., Prpic, N. -M. Egfr signaling regulates distal as well as medial fate in the embryonic leg of Tribolium castaneum. Dev. Biol. 370, 264-272 (2012).
  32. Emerging Model Organisms: A Laboratory Manual, Volume 2. , Cold Spring Harbour Laboratory Press. (2010).
  33. Brown, S. J., Mahaffey, J. P., Lorenzen, M. D., Denell, R. E., Mahaffey, J. W. Using RNAi to investigate orthologous homeotic gene function during development of distantly related insects. Evol. Dev. 1, 11-15 (1999).
  34. Tomoyasu, Y., Denell, R. E. Larval RNAi in Tribolium (Coleoptera) for analyzing adult development. Dev. Genes Evol. 214, 575-578 (2004).
  35. Linz, D. M., Clark-Hachtel, C. M., Borràs-Castells, F., Tomoyasu, Y. Larval RNA interference in the red flour beetle, Tribolium castaneum. J. Vis. Exp. , e52059 (2014).
  36. Bucher, G., Scholten, J., Klingler, M. Parental RNAi in Tribolium (Coleoptera). Curr. Biol. 12, 85-86 (2002).
  37. Posnien, N., et al. RNAi in the red flour beetle (Tribolium). Cold Spring Harb. Protoc. 2009, (2009).
  38. Lorenzen, M. D., et al. piggyBac-mediated germline transformation in the beetle Tribolium castaneum. Insect Mol. Biol. 12, 433-440 (2003).
  39. Berghammer, A. J., Weber, M., Trauner, J., Klingler, M. Red flour beetle (Tribolium) germline transformation and insertional mutagenesis. Cold Spring Harb. Protoc. 2009, (2009).
  40. Pavlopoulos, A., Berghammer, A. J., Averof, M., Klingler, M. Efficient transformation of the beetle Tribolium castaneum using the Minos transposable element: quantitative and qualitative analysis of genomic integration events. Genetics. 167, 737-746 (2004).
  41. Gilles, A. F., Schinko, J. B., Averof, M. Efficient CRISPR-mediated gene targeting and transgene replacement in the beetle Tribolium castaneum. Development. 142, 2832-2839 (2015).
  42. Richards, S., et al. The genome of the model beetle and pest Tribolium castaneum. Nature. 452, 949-955 (2008).
  43. Kim, H. S., et al. BeetleBase in 2010: revisions to provide comprehensive genomic information for Tribolium castaneum. Nucleic Acids Res. 38, 437-442 (2010).
  44. Stappert, D., Frey, N., von Levetzow, C., Roth, S. Genome-wide identification of Tribolium dorsoventral patterning genes. Development. 143, 2443-2454 (2016).
  45. Pavlek, M., Gelfand, Y., Plohl, M., Meštrović, N. Genome-wide analysis of tandem repeats in Tribolium castaneum genome reveals abundant and highly dynamic tandem repeat families with satellite DNA features in euchromatic chromosomal arms. DNA Res. 22, 387-401 (2015).
  46. Vlahović, I., Glunčić, M., Rosandić, M., Ugarković, Đ, Paar, V. Regular higher order repeat structures in beetle Tribolium castaneum genome. Genome Biol. Evol. , (2016).
  47. Keeling, C. I., et al. Draft genome of the mountain pine beetle, Dendroctonus ponderosae Hopkins, a major forest pest. Genome Biol. 14, 27 (2013).
  48. Vega, F. E., et al. Draft genome of the most devastating insect pest of coffee worldwide: the coffee berry borer, Hypothenemus hampei. Sci. Rep. 5, 12525 (2015).
  49. Cunningham, C. B., et al. The Genome and Methylome of a Beetle with Complex Social Behavior, Nicrophorus vespilloides (Coleoptera: Silphidae). Genome Biol. Evol. 7, 3383-3396 (2015).
  50. Meyer, J. M., et al. Draft Genome of the Scarab Beetle Oryctes borbonicus on La Réunion Island. Genome Biol. Evol. 8, 2093-2105 (2016).
  51. Trauner, J., et al. Large-scale insertional mutagenesis of a coleopteran stored grain pest, the red flour beetle Tribolium castaneum, identifies embryonic lethal mutations and enhancer traps. BMC Biol. 7, 73 (2009).
  52. Schmitt-Engel, C., et al. The iBeetle large-scale RNAi screen reveals gene functions for insect development and physiology. Nat. Commun. 6, 7822 (2015).
  53. Dönitz, J., et al. iBeetle-Base: a database for RNAi phenotypes in the red flour beetle Tribolium castaneum. Nucleic Acids Res. 43, 720-725 (2015).
  54. Keller, P. J., Stelzer, E. H. K. Digital scanned laser light sheet fluorescence microscopy. Cold Spring Harb. Protoc. 2010, (2010).
  55. Weber, M., Huisken, J. Light sheet microscopy for real-time developmental biology. Curr. Opin. Genet. Dev. 21, 566-572 (2011).
  56. Stelzer, E. H. K. Light-sheet fluorescence microscopy for quantitative biology. Nat. Methods. 12, 23-26 (2015).
  57. Strobl, F., Stelzer, E. H. K. Non-invasive long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos. Development. , 1-8 (2014).
  58. Koniszewski, N. D. B., et al. The insect central complex as model for heterochronic brain development-background, concepts, and tools. Dev. Genes Evol. , (2016).
  59. Gualda, E. J., et al. OpenSpinMicroscopy: an open-source integrated microscopy platform. Nat. Methods. 10, 599-600 (2013).
  60. Pitrone, P. G., et al. OpenSPIM: an open-access light-sheet microscopy platform. Nat. Methods. 10, 598-599 (2013).
  61. Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview light-sheet microscopy. Nat. Methods. 9, 755-763 (2012).
  62. Krzic, U., Gunther, S., Saunders, T. E., Streichan, S. J., Hufnagel, L. Multiview light-sheet microscope for rapid in toto imaging. Nat. Methods. 9, 730-733 (2012).
  63. Chhetri, R. K., et al. Whole-animal functional and developmental imaging with isotropic spatial resolution. Nat. Methods. 12, 1171-1178 (2015).
  64. Brown, S. J., et al. The red flour beetle, Tribolium castaneum (Coleoptera): a model for studies of development and pest biology. Cold Spring Harb. Protoc. 2009, (2009).
  65. Strobl, F., Schmitz, A., Stelzer, E. H. K. Live imaging of Tribolium castaneum embryonic development using light-sheet-based fluorescence microscopy. Nat. Protoc. 10, 1486-1507 (2015).
  66. Engelbrecht, C. J., Stelzer, E. H. Resolution enhancement in a light-sheet-based microscope (SPIM). Opt. Lett. 31, 1477-1479 (2006).
  67. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
  68. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
  69. Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets. Nat. Methods. 12, 481-483 (2015).
  70. Preibisch, S., Saalfeld, S., Schindelin, J., Tomancak, P. Software for bead-based registration of selective plane illumination microscopy data. Nat. Methods. 7, 418-419 (2010).
  71. Preibisch, S., et al. Efficient Bayesian-based multiview deconvolution. Nat. Methods. 11, 645-648 (2014).
  72. Amat, F., et al. Fast, accurate reconstruction of cell lineages from large-scale fluorescence microscopy data. Nat. Methods. 11, 951-958 (2014).
  73. Stegmaier, J., et al. Real-Time Three-Dimensional Cell Segmentation in Large-Scale Microscopy Data of Developing Embryos. Dev. Cell. 36, 225-240 (2016).
  74. Siebert, K. S., Lorenzen, M. D., Brown, S. J., Park, Y., Beeman, R. W. Tubulin superfamily genes in Tribolium castaneum and the use of a Tubulin promoter to drive transgene expression. Insect Biochem. Mol. Biol. 38, 749-755 (2008).
  75. Greger, K., Swoger, J., Stelzer, E. H. K. Basic building units and properties of a fluorescence single plane illumination microscope. Rev. Sci. Instrum. 78, 23705 (2007).
  76. El-Sherif, E., Averof, M., Brown, S. J. A segmentation clock operating in blastoderm and germband stages of Tribolium development. Development. , (2012).
  77. Panfilio, K. a, Oberhofer, G., Roth, S. High plasticity in epithelial morphogenesis during insect dorsal closure. Biol. Open. 2, 1108-1118 (2013).
  78. Koelzer, S., Kölsch, Y., Panfilio, K. A. Visualizing late insect embryogenesis: extraembryonic and mesodermal enhancer trap expression in the beetle Tribolium castaneum. PLoS One. 9, 103967 (2014).
  79. Nakamoto, A., et al. Changing cell behaviours during beetle embryogenesis correlates with slowing of segmentation. Nat. Commun. 6, 6635 (2015).
  80. Horn, T., Panfilio, K. A. Novel functions for Dorsocross in epithelial morphogenesis in the beetle Tribolium castaneum. Development. 143, 3002-3011 (2016).
  81. Benton, M. A., Akam, M., Pavlopoulos, A. Cell and tissue dynamics during Tribolium embryogenesis revealed by versatile fluorescence labeling approaches. Development. 140, 3210-3220 (2013).
  82. van der Zee, M., et al. Innexin7a forms junctions that stabilize the basal membrane during cellularization of the blastoderm in Tribolium castaneum. Development. 142, 2173-2183 (2015).
  83. Macaya, C. C., Saavedra, P. E., Cepeda, R. E., Nuñez, V. A., Sarrazin, A. F. A Tribolium castaneum whole-embryo culture protocol for studying the molecular mechanisms and morphogenetic movements involved in insect development. Dev. Genes Evol. 226, 53-61 (2016).
  84. Sarrazin, A. F., Peel, A. D., Averof, M. A Segmentation Clock with Two-Segment Periodicity in Insects. Science. 336, 338-341 (2012).
  85. Nollmann, F. I., et al. A photorhabdus natural product inhibits insect juvenile hormone epoxide hydrolase. Chembiochem. 16, 766-771 (2015).
  86. Strobl, F., Stelzer, E. H. Long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos: principles, resources, scientific challenges and the comparative approach. Curr. Opin. Insect Sci. 18, 17-26 (2016).
  87. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Digital scanned laser light-sheet fluorescence microscopy (DSLM) of zebrafish and Drosophila embryonic development. Cold Spring Harb. Protoc. 2011, 1235-1243 (2011).
  88. Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nat. Methods. 12, 30-34 (2015).
  89. Cerny, A. C., Bucher, G., Schröder, R., Klingler, M. Breakdown of abdominal patterning in the Tribolium Krüppel mutant jaws. Development. 132, (2005).
  90. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, 1065-1069 (2008).
  91. Sulston, I. A., Anderson, K. V. Embryonic patterning mutants of Tribolium castaneum. Development. 122, (1996).
  92. Berghammer, A., Bucher, G., Maderspacher, F., Klingler, M. A system to efficiently maintain embryonic lethal mutations in the flour beetle Tribolium castaneum. Dev. Genes Evol. 209, 382-389 (1999).
  93. Brown, S., et al. Implications of the Tribolium Deformed mutant phenotype for the evolution of Hox gene function. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 4510 (2000).
  94. Wu, Y., et al. Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. 108, 17708-17713 (2011).
  95. Kumar, A., et al. Dual-view plane illumination microscopy for rapid and spatially isotropic imaging. Nat. Protoc. 9, 2555 (2014).
  96. McGorty, R., et al. Open-top selective plane illumination microscope for conventionally mounted specimens. Opt. Express. 23, 16142-16153 (2015).
  97. Amat, F., et al. Efficient processing and analysis of large-scale light-sheet microscopy data. Nat. Protoc. 10, 1679-1696 (2015).
  98. Shcherbakova, D. M., Verkhusha, V. V. Near-infrared fluorescent proteins for multicolor in vivo imaging. Nat. Methods. 10, 751-754 (2013).
  99. Supatto, W., McMahon, A., Fraser, S. E., Stathopoulos, A. Quantitative imaging of collective cell migration during Drosophila gastrulation: multiphoton microscopy and computational analysis. Nat. Protoc. 4, 1397-1412 (2009).
  100. Royer, L. A., et al. Adaptive light-sheet microscopy for long-term, high-resolution imaging in living organisms. Nat. Biotechnol. , (2016).
  101. Keller, P. J., et al. Fast, high-contrast imaging of animal development with scanned light sheet-based structured-illumination microscopy. Nat. Methods. 7, 637-642 (2010).
  102. Caroti, F., Urbansky, S., Wosch, M., Lemke, S. Germ line transformation and in vivo labeling of nuclei in Diptera: report on Megaselia abdita (Phoridae) and Chironomus riparius (Chironomidae). Dev. Genes Evol. 225, 179-186 (2015).
  103. Handler, A. M. Use of the piggyBac transposon for germ-line transformation of insects. Insect Biochem. Mol. Biol. 32, 1211-1220 (2002).
  104. Schulte, C., Theilenberg, E., Müller-Borg, M., Gempe, T., Beye, M. Highly efficient integration and expression of piggyBac-derived cassettes in the honeybee (Apis mellifera). Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 9003-9008 (2014).
  105. Tamura, T., et al. Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nat. Biotechnol. 18, 81-84 (2000).
  106. Marcus, J. M., Ramos, D. M., Monteiro, A. Germline transformation of the butterfly Bicyclus anynana. Proc. R. Soc. B Biol. Sci. 271, 263-265 (2004).
  107. Catteruccia, F., et al. Stable germline transformation of the malaria mosquito Anopheles stephensi. Nature. 405, 959-962 (2000).
  108. Grossman, G. L., et al. Germline transformation of the malaria vector, Anopheles gambiae, with the piggyBac transposable element. Insect Mol. Biol. 10, 597-604 (2001).
  109. Labbé, G. M. C., Nimmo, D. D., Alphey, L. piggybac- and PhiC31-mediated genetic transformation of the Asian tiger mosquito Aedes albopictus (Skuse). PLoS Negl. Trop. Dis. 4, 788 (2010).
  110. Patel, N. H. It's a bug's life. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 4442-4444 (2000).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 122 פרוקי רגליים חרקים Coleoptera, Morphogenesis העובר הדמיה חיה הקרינה לטווח ארוך שאינו פולשני מיקרוסקופ פלואורסצנטי מבוססי גיליון אור מיקרוסקופ אור תלת-ממדית LSFM DSLM SPIM
גיליון מבוסס אור מיקרוסקופ פלואורסצנטי של חיים או קבוע מוכתמת<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; עובר
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Strobl, F., Klees, S., Stelzer, E.… More

Strobl, F., Klees, S., Stelzer, E. H. K. Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos. J. Vis. Exp. (122), e55629, doi:10.3791/55629 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter