مضان المجهر المعيشة أو الثابتة والملون على أساس ورقة الخفيفة<em> خنفساء الدقيق الحمراء</em> الأجنة

Summary

أصبح تصوير التشكل للأجنة الحشرات مع ضوء على أساس ورقة مضان المجهر الدولة من الفن. ويحدد هذا البروتوكول ويقارن ثلاث تقنيات التركيب المناسبة للأجنة خنفساء الدقيق الحمراء، ويدخل اثنين من رواية خطوط المعدلة وراثيا حسب الطلب مناسبة تماما لتصوير العيش، ويناقش ضوابط الجودة الأساسية ويشير إلى القيود التجريبية الحالية.

Abstract

أصبح الدقيق الحمراء خنفساء خنفساء الدقيق الحمراء هام كائن نموذج حشرة في علم الوراثة التنموية والبيولوجيا التطورية التطوري. مراقبة الأجنة خنفساء مع خفيفة على أساس ورقة مضان المجهر لها مزايا متعددة على widefield التقليدية ومتحد البؤر المجهري مضان. نظرا لخصائص فريدة من نوعها المجهر القائم على ورقة خفيفة، وثلاث صور ثلاثية الأبعاد من العينات الحية يمكن تسجيلها مع نسب عالية إشارة إلى الضجيج وانخفاض كبير في الصورة تبيض وكذلك صور سمية على طول عدة اتجاهات على مدى فترات تدوم عدة أيام. مع أكثر من أربع سنوات من التطوير المنهجي وزيادة مستمرة من البيانات، والوقت يبدو مناسبا لوضع إجراءات التشغيل القياسية لاستخدام التكنولوجيا ورقة الخفيفة في المجتمع خنفساء وكذلك في المجتمع الحشرات بشكل عام. يصف هذا البروتوكول ثلاث تقنيات التركيب مناسبة وأو لأغراض مختلفة، تقدم خطين خنفساء المعدلة وراثيا جديدة مصنوعة خصيصا مناسبا للتصوير الحية على المدى الطويل، وتشير خمسة الأصباغ الفلورية لتسمية هياكل داخل الخلايا من الأجنة ثابتة وتوفر معلومات عن ما بعد معالجة البيانات للتقييم في الوقت المناسب من البيانات المسجلة. تركز ممثل النتائج على التصوير الحي على المدى الطويل، باجتزاء البصرية ومراقبة من نفس الجنين على طول عدة اتجاهات. يتم توفير قواعد البيانات منها كمورد للتحميل. وأخيرا، يناقش بروتوكول مراقبة الجودة لفحوصات التصوير الحية، والقيود الحالية وتطبيق الإجراءات المحددة لأنواع الحشرات الأخرى.

ويهدف هذا البروتوكول في المقام الأول لعلماء البيولوجيا التطورية الذين يسعون حلول التصوير التي يتفوق المعدات المختبرية القياسية. وهي تشجع محاولة مستمرة لإغلاق الفجوة بين المختبرات / المجتمعات الموجه من الناحية الفنية، والذي تطوير وصقل مايكرويننسخ منهجيا، ومختبرات علوم الحياة / المجتمعات، والتي تتطلب حلولا "التوصيل والتشغيل" للتحديات التقنية. وعلاوة على ذلك، فإنه يدعم هذا النهج البديهي أن يتحرك الأسئلة البيولوجية في مركز الاهتمام.

Introduction

الطحين خنفساء خنفساء الدقيق الحمراء الأحمر، الذي ينتمي إلى عائلة كبيرة من الخنافس darkling (Tenebrionidae)، لديها تاريخ طويل في مجال العلوم الزراعية والحياة وهو ثاني أفضل درس كائن نموذج نموذج حشرة بعد ذبابة الفاكهة ذبابة الفاكهة. خلال العقود الأربعة الماضية، أصبحت قوية وشعبية نموذج حشرة كائن في علم الوراثة التنموية في البيولوجيا التطورية التطوري، وخلال السنوات العشرين الماضية، في التشكل الجنيني لمجموعة متنوعة من الأسباب:

ذبابة الفاكهة وخنفساء على حد سواء تنتمي إلى كاملات الانسلاخ، ولكن تباينت ما يقرب من 300 مليون سنة مضت ^{1، 2، 3، 4.} في حين أن التطور الجنيني ذبابة الفاكهة يعتبر عادة على النحو المستمد للغاية، خنفساء يظهر الوضع القابل للأجداد جمعةopment التي وجدت في نسبة كبيرة من أنواع الحشرات ^{5، 6، 7، 8، 9.} أولا، خنفساء يسلك تنمية رأس غير ملتف، أي فمها وهوائيات تظهر بالفعل خلال مرحلة التطور الجنيني ^{10، 11، 12، 13، 14، 15.} ثانيا، خنفساء يتبع مبادئ التنمية قصيرة من الجراثيم، أي تضاف شرائح البطن بالتتابع من منطقة النمو الخلفي خلال germband استطالة ^{16 و 17 و 18 و 19.} ثالثا، خنفساء تطور ويحط في وقت لاحقاثنين من الأغشية الجنينية، أي خارج السلى، والذي يغطي الجنين فقط البطني، والمصلية، الذي يغلف الجنين تماما ^{20 و 21 و 22.} كل من الأغشية تلعب مخلق حاسما ²³ وكذلك دور وقائي ضد الكائنات الدقيقة ^{24 و 25} و ²⁶ جفاف. رابعا، والساقين embryonically النامية تعمل بكامل طاقتها خلال مرحلة الحياة اليرقات وبمثابة براعم للأرجل الكبار خلال التحول العذراء ^{27، 28، 29، 30، 31.}

نظرا لحجم ومطالبهم متواضعة صغيرة، وزراعة خنفساء في المختبر هي اضحة إلى حد ما. ثقافات البرية من نوع (WT) سلالات أو خطوط المعدلة وراثيا تتكون عادة من حوالي 100-300 البالغين ويمكن أن تظل داخل زجاجات سعة لتر واحد من الزجاج (البصمة 80 سم ²⁾ شغل 3-4 سم عالية (حوالي 50 غ) مع متوسط النمو التي تتكون من القمح والحبوب الكاملة الطحين تستكمل مع الخميرة الجافة الخاملة. A إمدادات المياه ليست ضرورية. وهذا يسمح حتى معامل صغيرة للحفاظ على العشرات من الثقافات خنفساء داخل حاضنات الحشرات الصغيرة أو متوسطة الحجم متوفرة تجاريا. يتم فصل مراحل تطور لاحقة من خنفساء (اليرقات بعد حوالي رابع الطور، الشرانق والكبار) بسهولة من وسط النمو عن طريق النخل. ويتم الحصول على أجنة متزامنة التي يحتضنها البالغين لفترات قصيرة على وسط وضع البيض. لتحقيق تنمية سريعة، يتم الاحتفاظ الثقافات خنفساء في 32 ° C (حوالي أربعة أسابيع في الجيل)، في حين يتم تنفيذ حفظ الأوراق المالية عادة في 22-25 درجة مئوية (حوالي عشرة أسابيع في جيل).

خلال العقد الماضي، العديد من تك القياسيةوقد تم تكييف hniques تدريجيا والأمثل للخنفساء، على النحو الموجز في كتب الناشئة نموذج الكائنات ^32. من أهمية كبيرة ومتقدمة أساليب وراثية مثل الجنينية ^33، اليرقات ^{34، 35} أو الوالدين ^{36 و 37} RNA القائم على التدخل إسقاط الموروثة، والتحول سلالة الجرثومية سواء مع piggyBac ^{38، 39} أو نظام ترانسبوزاز مينوس ⁴⁰ و كريسبر / الجينوم أساس Cas9- الهندسة ^41. وعلاوة على ذلك، تم التسلسل الجينوم خنفساء قبل نحو عقد من الزمن ^42، والآن في الجولة الثالثة من الجينوم الافراج عن التجمع ^43، والذي يسمح تحديد كفاءة والجينوم على نطاق والتحليل المنهجي للجينات ⁴⁴ </sتصل> أو عناصر وراثية أخرى ^{45 و 46.} بالإضافة إلى ذلك، تتوفر للنهج الوراثية النسبية ^{47، 48، 49، 50} جينومات أربعة أنواع coleopteran أخرى. بالتعاون مع تسلسل الجينوم، تم إجراء تحليلين الوراثية على نطاق واسع، أي شاشة الطفرات إقحامي ⁵¹ و جين ضربة قاضية شاشة أساس التدخل RNA منهجي ^{52 و 53.}

مضان التصوير الحي مع widefield، متحد البؤر أو ضوء المجهر القائم على ورقة (LSFM) يسمح لمراقبة التشكل الجنيني للخنفساء بوصفها وظيفة من الزمن (أي التشكل) في سياق متعدد الأبعاد (الجدول 1). في widefield ومضان المجهري متحد البؤر، وكسكيتويسترشد أوجه وانبعاث الضوء من خلال العدسة نفسها موضوعية. في كلا النهجين، يضيء العينة كامل لكل طائرة ثنائية الأبعاد المسجلة. وبالتالي، يتم إخضاع العينات إلى مستويات طاقة عالية جدا. في LSFM، إلا أن fluorophores في المستوى البؤري متحمسون بسبب فصل الإضاءة والكشف باستخدام اثنين من العدسات موضوعية مرتبة عموديا (الشكل 1). LSFM يأتي في اثنين من تطبيقات شريعي – في طائرة واحدة إضاءة المجهر (SPIM) والرقمية الممسوحة ضوئيا ضوء الليزر على أساس ورقة مضان المجهر (DSLM، الشكل 2) – وتقدم العديد من المزايا الهامة على الأساليب التقليدية: (ط) الجوهرية القدرة باجتزاء البصرية، (ب) قرار محوري جيد، (ج) انخفاض بقوة مستوى الصورة تبيض، (د) منخفضة جدا صور سمية، (ت) ارتفاع نسبة الإشارة إلى الضوضاء، (السادس) عالية نسبيا سرعة الاستحواذ، (السابع) التصوير على طول عدة اتجاهات و (السادسب) اختراق الأنسجة أعمق بسبب استخدام منخفضة العددية فتحة إضاءة العدسات الهدف ^{54 و 55 و 56.}

وقد تم بالفعل تطبيق LSFM بنجاح في خنفساء لتوثيق ما يقرب من التشكل الجنيني كامل ⁵⁷ وتحليل مبادئ تمزق الغشاء خارج الجنينية في بداية إغلاق الظهرية ^23. لزيادة جاذبية LSFM في المجتمع خنفساء وللعلوم الحشرات بشكل عام، فإنه من الأهمية بمكان وضع إجراءات التشغيل القياسية وتحسين الطرق والبروتوكولات ومجموعة الموارد إلى المستوى الذي يصبح المجهر وسهولة -استخدام أداة قياسية في مختبرات البيولوجيا التنموية، والأسئلة البيولوجية البقاء في مركز الاهتمام.

يبدأ هذا البروتوكول مع أساسيات خنفساء </ م> زراعة، أي صيانة، والاستنساخ وجمع الأجنة. بعد ذلك، موضحة استراتيجيتين التجريبية: (ط) التصوير المباشر لخطوط المعدلة وراثيا حسب الطلب و (ب) تصوير الأجنة الثابتة التي كانت ملطخة الأصباغ الفلورية (الجدول 2). وفي وقت لاحق، وشرح ثلاث تقنيات المتصاعدة مع أغراض مختلفة قليلا في التفاصيل (الشكل 3 والجدول 3): (ط) عمود الاغاروز، (ب) نصف الكرة الاغاروز و (ج) صاحب بيت العنكبوت رواية. بروتوكول ثم يشرح الإجراء الحصول على البيانات مع LSFM. وترد طرائق التصوير والاعتبارات الرئيسية. وأخيرا، أوضح استرجاع الجنين ويتم تقديم اقتراحات لمعالجة البيانات الأساسية. في نتائج تمثيلية، بيانات التصوير على الهواء مباشرة من اثنين من الرواية وترد ⁵⁸ خطوط المعدلة وراثيا الدبقية الأزرق ويتم توفير قواعد البيانات التصوير منها كمورد للتحميل حسب الطلب. بالإضافة إلى ذلك، صورةوتعرض البيانات للأجنة الثابتة التي كانت ملطخة مع مجموعة متنوعة من الأصباغ مضان. وتركز النقاش على مراقبة الجودة، والقيود الحالية للنهج التصوير الحي والتكيف البروتوكول إلى الأنواع الأخرى.

هو مكتوب على بروتوكول لالمجاهر مضان القائم على ورقة الخفيفة التي تكون مجهزة مع غرفة العينة وآلية المشبك للتدوير لحاملي موحد عينة ^{54، 59، 60،} والتي عادة ما تكون العناصر على شكل اسطوانة مصنوعة من المعدن والبلاستيك أو الزجاج مع قطر في نطاق ملليمتر. البروتوكول هو أيضا مناسبة لكلا تطبيقات شريعي، أي SPIM وDSLM، فضلا عن الاجهزة مع اثنين أو أكثر إضاءة والكشف عن الأسلحة ^{61 و 62 و 63.} نتائج تمثيلية تظهر البيانات في قناتين الطيفية، الأخضر (ايلlumination مع ليزر 488 نانومتر، والكشف من خلال 525/50 ممر الموجة فلتر) والأحمر (الإضاءة مع ليزر 561 نانومتر، والكشف من خلال 607/70 ممر الموجة مرشح)، ولكن بروتوكول يمكن توسيعها إلى ثلاث أو أربع قنوات الطيفية.

Protocol

1. تربية الثقافات خنفساء ملاحظة: يتم تحديد الشروط القياسية باعتباره درجة حرارة الحضانة من 25 درجة مئوية، والرطوبة النسبية 70٪ في 12 ساعة مشرق / 12 ساعة دورة الظلام. لمزيد من المعلومات حول خنفساء تربية، تتوفر 64 الم…

Representative Results

يصف هذا البروتوكول في إطار تجريبي للتصوير مضان المعيشة أو ثابتة وملطخة الأجنة خنفساء مع LSFM. ويرجع ذلك إلى انخفاض مستويات الصورة تبيض والصور سمية، وهي نتيجة مباشرة لقدرتها باجتزاء البصرية، LSFM بشكل خاص مناسبة تماما لتصوير حي على المدى الطويل. …

Discussion

رقابة جودة

في فحوصات التصوير الحية، يجب أن تكون إجراءات إعداد وتسجيل غير الغازية، أي لا الميكانيكية والتعامل مع المواد الكيميائية (جمع، dechorionation و التركيب على حامل العينة) ولا تحميل الطاقة المتكاملة خلال الملاحظة أ…

Materials

full grain wheat flour	Demeter e.V.	1.13E+08	US: whole wheat flour, UK: whole meal flour
405 fine wheat flour	Demeter e.V.	1.13E+08	US: pastry flour, UK: soft flour
inactive dry yeast	Flystuff / Genesee Scientific	62-106
phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	10010-023
sodium hypochlorite, ~12% active Cl	Sigma Aldrich	425044-250ML	Caution: sodium hypochlorite is corrosive
low-melt agarose	Carl Roth	6351.2
6-well plate	Orange Scientific	4430500
24-well plate	Orange Scientific	4430300
glass capillaries, internal Ø 0.46 mm	Brand GmbH + Co KG	7087 09
SYTOX Green	Thermo Fisher Scientific	57020	Staining solution preparation is explained in Table 2
YOYO-1 Iodide	Thermo Fisher Scientific	Y3601	Staining solution preparation is explained in Table 2
BOBO-3 Iodide	Thermo Fisher Scientific	B3586	Staining solution preparation is explained in Table 2
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A12379	Staining solution preparation is explained in Table 2
Alexa Fluor 546 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A22283	Staining solution preparation is explained in Table 2
sieve, 800 µm mesh size	VWR International	200.025.222-051
sieve, 710 µm mesh size	VWR International	200.025.222-050	for growth medium preparation (step 1.1)
sieve, 300 µm mesh size	VWR International	200.025.222-040
sieve, 250 µm mesh size	VWR International	200.025.222-038	for egg laying medium preparation (step 1.2)
glass dish, Ø 100 mm × 20 mm	Sigma Aldrich	CLS70165102
cell strainer, 100 µm mesh size	BD Biosciences	352360
paint brush, head Ø 2 mm	VWR International	149-2121
syringe, 1.0 ml	B. Braun Medical AG	9166017V
scintillation vials	Sigma Aldrich	M1152-1000EA
paraformaldehyde	Sigma Aldrich	158127	Caution: paraformaldehyde is toxic and corrosive
n-heptane ≥ 99%	Carl Roth	8654.1	Caution: n-heptane is flammable and toxic
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100-100ML	Caution: Trition X-100 is corrosive