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JoVE Journal Developmental Biology
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Developmental Biology

光片为主的生活的荧光显微镜或固定和染色 Published: April 28, 2017 doi: 10.3791/55629
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Physical Biology, Buchmann Institute for Molecular Life Sciences (BMLS), 2Cluster of Excellence Frankfurt, Macromolecular Complexes, 3Goethe-Universität Frankfurt am Main – Campus Riedberg

Summary

成像昆虫胚胎与基于光的片材的荧光显微镜的形态已成为现有技术的状态。该协议概述并比较适合赤拟谷盗胚胎三个安装技术中，引入了两个新的定制的转基因系非常适合于实时成像，讨论必需的质量控制和指示当前实验的限制。

Abstract

在赤拟谷盗赤拟谷盗已成为发育遗传学及进化发育生物学的一个重要昆虫的模式生物。 赤胚胎与基于光的片材的荧光显微镜观察具有优于常规宽场和共聚焦荧光显微镜多个优点。由于基于光的片材显微镜的独特性质，活标本的三维图像可以记录具有高信号噪声比和比上几个周期显著降低光致漂白，以及沿多个方向的光毒性天。随着四年多的发展方法和数据的不断增加，时间似乎是适当的建立光片技术在赤社区的使用以及在昆虫社会大众的标准作业程序。这个协议描述了适合˚F三个安装技术或不同的目的，提出了两种新的定制的转基因赤线适合于长期实时成像，表明5个的荧光染料来标记固定胚胎的细胞内结构以及用于记录数据的及时评估提供了关于数据的后处理的信息。代表性的结果集中在长期实时成像，光学切片并沿多个方向相同的胚胎的观察。相应的数据集提供的可下载资源。最后，协议讨论了用于实时成像测定，电流限制和所概述的程序到其它昆虫物种的适用性的质量控制。

该协议主要针对谁寻求成像解决方案，超越标准的实验室设备发育生物学家。它促进了连续尝试关闭技术上导向的实验室/社区，其发展和完善万分之一之间的差距复制方法论，生命科学实验室/社区，这需要技术上的挑战“插件和播放的解决方案。此外，它支持移动的生物学问题成为人们关注的焦点的公理化方法。

Introduction

在赤拟谷盗赤拟谷盗 ，属于大家族暗中甲虫（拟步甲科），具有农业和生命科学领域内历史悠久，是果后的第二个最好的研究模型昆虫的模式生物飞行果蝇 。在过去的四个十年里，它成为发育遗传学的强大和受欢迎的昆虫的模式生物，在进化发育生物学，并在过去的二十年中，在各种原因的胚胎形态：

果蝇和赤同属Holometabola，但约300万年前的1，2，3，4分歧。而果蝇胚胎发育通常被认为是高度衍生， 赤示出devel的更祖模式即在昆虫物种5，6，7，8，9的一个相当大的比例发现opment。首先， 赤呈现出非渐开头的发展， 即，其口器和天线胚胎发生10，11，12，13，14，15中已出现。其次， 赤如下短胚芽发展， 即腹部段germband伸长16，17，18，19在从后部生长区依次加入的原理。第三， 赤开发和后来降级两个额外的胚胎外膜即羊膜，它涵盖了胚胎只腹侧，和浆膜，其完全包住胚胎20，21，22。两种膜起到至关重要的形态发生23以及抗微生物24，25和26干燥保护作用。第四，embryonically显影腿是在幼虫生命阶段完全功能和蛹变态27，28，29，30，31时用作原基为成人腿。

由于其体积小，适度的要求，在实验室赤的培养是相当简单的。野生型培养物（WT）菌株或转基因品系通常由周围100-300成人和可以保持一升玻璃瓶（足迹80厘米2）往三四十厘米高（约50克）与由全谷物小麦的生长培养基内面粉补充有非活性干酵母。供水是没有必要的。这样，即使小型实验室，以保持小型或中型商用虫孵化器内的几十个甲虫文化。 赤的后面发育阶段（幼虫后约4龄，蛹和成虫）很容易从生长培养基通过筛分分离。同步胚胎，恒温产蛋介质上短期内得到成年人。对于快速发展，甲虫培养物保持在32℃（每代约四周），而贮存保持在22-25℃通常执行（每一代约十周）。

在过去的十年中，许多标准TEChniques已经逐渐适应和赤优化，总结在新兴的模式生物书32。非常重要的是先进遗传方法例如胚胎33，幼虫34,35或亲本36，37基于RNA干扰的基因敲除，与任一piggyBac转 38，39或米诺斯 40转座系统和CRISPR /基于Cas9基因组种系转化工程41。此外， 赤基因组被测序大约十年前42，并且现在是在第三轮基因组的装配释放43，其允许高效且全基因组鉴定和基因44的系统的分析45，46。另外，四个其它鞘翅目物种的基因组可用于比较遗传方法47，48,49，50。与测序基因组关联，两次大规模的遗传分析已经执行， 即 ，插入诱变屏幕51和基于干扰系统的RNA基因敲除画面52，53。

与宽视场，共焦或基于光的片材显微镜（LSFM）荧光实时成像允许观察赤的胚胎形态作为时间多维上下文（ 表1）的函数（ 即 ，形态发生）。在宽视场和共聚焦荧光显微镜，该EXCIT通货膨胀和发射光通过相同的物镜引导。在这两种方法中，整个试样被照亮每记录二维平面。因此，试样承受非常高的能量水平。在LSFM，只有在焦平面中的荧光团是兴奋由于通过使用两个垂直布置的物镜（ 图1）照明和探测的去耦。 LSFM有两种法服实现-该单个平面照明显微镜（SPIM）和数字扫描的激光基于片材的荧光显微镜（DSLM， 图2） -和在传统的方法提供了几个重要的优点：（ⅰ）固有光学切片能力， （ⅱ）良好的轴向分辨率，（ⅲ）强烈降低光致漂白的水平，（ⅳ）非常低的光毒性，（v）的高信噪比，（ⅵ）相对高的采集速度，（ⅶ）成像沿多个方向和（viⅱ）更深的组织穿透由于低数值孔径照射物镜54，55，56的使用。

LSFM已经在赤已成功地应用于记录几乎整个胚胎的形态发生57和分析外胚膜破裂的原则，在背封23的开端。为了提高LSFM的吸引力在赤社区和一般昆虫科学，这是非常重要的，建立标准作业程序，改进方法，协议和资源的水平池在显微镜变成了一个易于在发育生物学实验室-use标准工具和生物学问题留在人们关注的焦点。

该协议开始于赤的基本</ em>的培养， 即维修，繁殖和胚胎收集。接着，两个实验策略中示出：（ⅰ）的定制的转基因品系实时成像和（ii）该染色用荧光染料（ 表2）固定的胚胎的成像。 （i）所述琼脂糖柱，（ii）所述琼脂糖半球和（iii）所述新的蛛网持有人：随后，具有稍微不同的目的三个安装技术详细（ 图3和表3）进行说明。该协议然后解释与LSFM获取数据的步骤。影像学技术和关键因素进行了概述。最后，胚胎检索解释并提供了基本的数据处理建议。在代表性结果，从活体成像数据的两个新的定制和胶质-蓝58个的转基因株系被示出和各个成像数据集作为可下载资源提供。此外，图像该染色用各种荧光染料的固定胚胎的数据表示。讨论集中在质量控制方面，实时成像方式的电流限制和协议的其他物种的适应性。

该协议是针对配有样品室和用于标准化样品架54，59，60，这是典型的直径由金属，塑料或玻璃筒形元件可旋转的夹持机构基于光的片材荧光显微镜写入在毫米范围内。该协议也适用于这两种法服实施方式中， 即 SPIM和DSLM，以及用于与两个或更多照明和检测臂61，62，63设置。代表结果表明在两个光谱信道的数据，绿色（ILlumination用488nm的激光，检测通过五十零分之五百二十五通过七十零分之六百零七带通滤波器的带通滤波器）和红色（照明用561纳米的激光，检测），但是协议可以扩展到三个或四个光谱信道。

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Protocol

1. 赤培养的畜牧

注意：标准条件定义为在25℃和70％相对湿度在12个小时亮/ 12小时黑暗周期的培养温度。有关赤畜牧业的更多信息，相应的指南可64。此协议需要两个不同的面粉媒体​​，可在千克数量制备和储存数月。

  1. 之前用面粉和非活性干酵母工作，存储未开启的包装，在-20℃下放置24个小时，然后让它们升温至室温。这个过程消除了潜在的病原体。
  2. 通过与710微米筛孔尺寸的筛子通过全谷物小麦粉和非活性干酵母，然后用5％的补充过筛全粒面粉（重量/重量）过筛非活性干酵母制备生长培养基中。
  3. 经过405精面粉和非活性干酵母通过筛250＃181;米筛目大小，然后用5％的补充过筛405细小麦粉（重量/重量）过筛非活性干酵母制备产蛋平台。
  4. 通过相应的赤文化通过 用筛 800 微米网目尺寸。丢弃剩余的生长培养基。转移幼虫，蛹和成虫一个大玻璃盘。
  5. 如果没有后代的文化存在，大约80幼虫和/或蛹转移到一个新的玻璃瓶，建立一个新的子代的文化。如果没有幼虫和/或蛹存在，约有40名成人代替。添加50克生长培养基中并在标准条件下温育。
  6. 收集在另一个新玻璃瓶大约300成年人（500-700毫克）以建立所述成像培养。添加50克生长培养基中并在标准条件下温育。允许成像培养在胚胎收集前的新鲜生长培养基静置至少24个小时。
  7. 更换成像文化至少每两个我们的生长培养基EKS，它可与胚胎收集结合来完成（见3.2）。两三个月后，从子代文化的新成人完全更换成像文化。
  8. 如果使用非纯合转基因线，通过消除非转基因动物策划后代培养频繁。理想情况下，产生纯合系如果相应转基因是不致死或导致不育时存在两个染色体上。纯合的培养物通常具有较高的平均荧光水平和整体实验条件更窄，因为只有一个基因型存在。

2.显微镜的设置和校准

注： 赤胚胎具有约600-660微米的前-后长度和大约300-330微米的直径的横向。大多数现代CCD照相机具有约9毫米×7mm的传感器芯片尺寸， 即直径为11.4微米，6.45微米的像素的像素距离。当用10倍放大倍率的物镜相结合，胚胎可以全盘被成像为0.645微米的像素间距。大多数现代SCMOS相机具有约16毫米×14mm的较大的传感器芯片尺寸， 即直径为21.3微米，6.5微米的像素的像素距离。当用20X放大率的物镜相结合，胚胎可以全盘被成像用的0.325微米的像素间距。

  1. 附加照明和检测物镜的显微镜。确保激光器和荧光过滤器相匹配的荧光团的吸收和发射光谱很好。
  2. 样品室连接到显微镜。填充pH7.4的PBS或任何其他合适的成像缓冲器中的样品室中。
  3. 开机和校准显微镜。综合校准程序和故障排除指南定制基于光片显微镜（更具体的实施DSLM）已经出版公关eviously 65。对于商用设备，按照制造商的说明书非常谨慎。误操作可能消耗介质的样品室，并导致破坏到仪器以及试样。

3.转基因或胚胎WT收集

  1. 通过用800微米筛目尺寸的筛通过成像菌落。收集成虫在一个新的玻璃瓶，加入10 G蛋铺设介质。孵育产蛋培养在25℃下在光1个小时，70％相对湿度。
  2. 通过产蛋培养通过用800微米的筛目尺寸的筛子从产蛋培养基，其含有30-100左右分离胚胎成人。大人转移到一个新的玻璃瓶，并添加老任或50克鲜生长培养基。
  3. 如果观察应在均一胚阶段（例如数据集DS0002）开始，孵育15个小时产蛋介质在25℃和70％相对湿度。 ŤO起动在germband缩回（例如数据集DS0001和DS0003）的开始，在32℃和70％相对湿度下孵育胚胎23小时。如果其他发育阶段期望，请参见相应的文献64，65和适应孵育时间和/或温度是必要的。

4.胚胎Dechorionation

注：绒毛膜是蛋壳的外层和由蛋白质和多糖的。强烈吸收光的，但对正常发育不是必需的，因此可以化学方法除去。

  1. 通过用300微米筛目尺寸的筛通过产蛋平台。收集在100微米筛孔尺寸的细胞过滤的胚胎，并丢弃剩余的产蛋平台。
  2. 准备一个6孔板如下：填充A1，A2，A3和B3的井用10mL pH 7.4的PBS和B1和B2井用9mL PBS。然后小心地加入1mL的次氯酸钠到B1和B2。观察的步骤4.3到立体声显微镜下4.8的进展。次氯酸钠小心钠有腐蚀性。
  3. 插入细胞滤网进入A1以及（PBS pH 7.4）中和洗胚胎在温和搅拌下一分钟。较大的面粉颗粒应该从胚胎中分离。
  4. 转移细胞滤网给B1阱（次氯酸钠在pH 7.4的PBS）中并剧烈摇动板30秒。剩下的面粉颗粒应该从胚胎完全分离。
  5. 转移细胞过滤到A2以及（PBS pH 7.4）中和洗胚胎在温和搅拌下1分钟。
  6. 对于dechorionation，转移细胞滤网到B2阱（次氯酸钠的PBS，pH 7.4）中。大力摇晃板，直至绒毛膜破裂，并从胚胎中分离。绒毛膜看起来像一个薄的半透明膜具有撕裂边缘，而dechorionated胚胎有一个普通的剪影。
  7. 转让日È细胞过滤到A3以及（PBS pH 7.4）中和洗胚胎在温和搅拌下1分钟。如果任何绒毛膜片段洗涤后仍附着于胚，重复步骤4.6。
  8. 存储在B3以及（PBS pH 7.4）中的胚胎。存储了好几个小时不伤害胚胎，但请记住，继续发展。
  9. 对于非纯合转基因系，除去任何非荧光胚胎如果可能的话。用于固定和WT或转基因胚胎的染色，继续执行步骤5。对于转基因胚胎的实时成像，则继续步骤6。

5.卵黄膜透化，固定，染色和

注：卵黄膜是蛋壳的内层。它是不受用于荧光染料，因而有染色前被化学透。

  1. 填充固定/透化溶液（1.5mL 4％（在PBS pH值6.9重量/体积）的多聚甲醛的闪烁小瓶ND 1.5毫升正庚烷）。移植胚胎用画笔小瓶。用铝箔盖的小瓶，以保护从光的荧光基团并以每分钟50转温育30分钟在摇动平台上。注意多聚甲醛是有毒的，腐蚀性的，正庚烷是易燃和有毒。
  2. 除去固定液和治疗胚胎三次在3mL 0.1％（V / V）的Triton X-100的PBS，pH 7.4 15分钟，随后一次15分钟在3mL 1％（V / V）的Triton X-100中以每分钟50转在摇摆平台上PBS pH 7.4中。小心的Triton X-100是腐蚀性的。
  3. 除去透化溶液，并添加0.5毫升的染色溶液的小瓶中。在表2中提供了示例性染色溶液。染色的胚胎在4℃下过夜，以每分钟50转在摇动平台上。对于表2中提出的染料，清洗是没有必要的。

6.制备安装琼脂糖的

  1. 添加1克低熔点琼脂糖至100mL pH 7.4的PBS和热，以便在800 W.微波炉2-3分钟将该混合物如果小琼脂糖颗粒仍然存在，重复加热过程在30秒的时间间隔，直到颗粒完全溶解。安装琼脂糖不需要每次要新鲜制备的，该琼脂糖固化可以通过加热上述再液化。这个过程可以了太多的水已经蒸发之前重复5-6次。
  2. 允许琼脂糖冷却至大约40-45℃，然后填充两个1.5毫升反应管与加热的琼脂糖和保持这些管在35℃下在热块。

7.胚安装和插入到样品室

  1. 选项1：琼脂糖柱（ 图3A-C，第一列;表3中，第二列）
    1. 填充1.0毫升的注射器用蒸馏水和使用小型橡胶软管将其附加到玻璃毛细管开口中的一个。填充毛细管中途用蒸馏水。
    2. 挑胚胎与漆刷，将其放在其他的玻璃毛细管开口的内侧。快速地进行下一步的胚胎干燥前。
    3. 坚持毛细管进入液体琼脂糖慢慢吸取液体琼脂糖几微升旁边的胚胎移植到毛细管。然后迅速增加牵引力，使胚胎拖动随着琼脂糖。最后，琼脂糖的几μL应该高于和胚胎的下方。将毛细管静置几分钟，让琼脂糖巩固。
    4. 缩短用金刚石玻璃刀毛细管至约5毫米的长度。剩余的片段应完全充满琼脂糖和胚胎应该是第二四分位数内。
    5. 插入钢瓶与销到样品室，然后贴在销的顶端毛细管片段。琼脂糖柱应该伸出几毫米˚FROM与包含胚胎部分毛细管片段。
  2. 选项2：琼脂糖半球（ 图3A-C，第二列;表3中，第三列）
    1. 吸取液体琼脂糖的200μL成1.0毫升的注射器，然后用它来填充从琼脂糖顶部的钢管，直到在底部开口半球形式。半球直径应等于管子的直径。直到琼脂糖已经凝固等待几分钟。
    2. 挑胚胎用画笔并重新排列其上的刷子的前端，以使前端变得可访问。浸琼脂糖半球成液体琼脂糖用薄膜来覆盖它。
    3. 将其前端胚胎直立琼脂糖半球的极点。打开钢管周围并更正刷胚胎的位置。如果必要的话，加入2μL琼脂糖胚胎/半球边境稳定的胚胎。理想LY，不到一半的胚胎表面的应该在琼脂糖覆盖和侧面应尽可能地陡。
    4. 插入钢管半球和胚胎慢慢进入样品室。
  3. 选项3：蛛网保持器（ 图3A-C，第三列;表3中，第四列）
    1. 挑画笔胚胎，并把它放在一边。
    2. 覆盖5-8μL液体琼脂糖蛛网保持器的长孔，然后除去大部分的琼脂糖的直到只有一个薄膜琼脂糖保持。
    3. 放置胚胎到琼脂糖膜并调整其位置。小心地将胚胎移动到长孔的x轴中心，并与所述长孔的细长轴对准其细长前后轴线。
    4. 插入与所安装的胚胎的蛛网保持器慢慢到样品室。因此，它不与激发和发射干扰蛛网挡位置光， 即 45°相对于x轴和z轴。

基片8的光荧光显微

  1. 沿胚胎应多少方向（和沿其方位）被成像决定。四个方向（沿取向0°，90°，180°和270°）典型地提供了良好的折衷覆盖和能量负载之间。
  2. 建立荧光通道的数量。每个信道的主要参数是激光线，荧光滤光器，激光功率和曝光时间。对于长期实时成像，即综合能源负荷不超过胚胎的耐受性是很重要的。 25-50毫秒的曝光时间确保了快速成像，而100和300μW之间的激光功率不应该影响胚胎的生存能力。对于固定的样品，暴露时间和激光功率可以至少加倍。
  3. 对于实时成像检测，配置的时间间隔。样稿赤的勒特胚胎发生在室温（23±1℃），并在32-35°的小不到三天C 64需要大约7天。根据应该观察到的形态发生的事件定义的时间间隔。对于短的时间间隔，考虑降低曝光时间和激光功率（见8.2）。
  4. 而不将其暴露于激光中沿着x轴和y轴进入视场的中心透射光模式胚胎定位。通过在90°360°旋转胚胎以检查可能在安装过​​程中发生的任何损伤胚胎。
  5. 适当地转动胚胎绕y轴与显微镜轴，例如与x轴的横向轴线， 即与z轴的背腹轴对准胚轴。当使用蜘蛛网架技术，对准也许是不可能的。
  6. 在荧光模式，定义的z堆FOr各自方向。添加25-50微米，如前面空间缓冲液和胚胎的后面。包括缓冲，典型的Z-堆叠覆盖周围350-400微米为赤胚胎。还定义的z间隔，这应该是横向间隔的四倍， 即 ，在间隔沿x和y轴66。
  7. 如果两个或多个胚胎在并行成像中，重新启动在8.4与下一个胚胎。
  8. 对于长期成像，确保样品室填充有足够的pH 7.4的PBS或其它成像缓冲器。还覆盖所述样品腔室开口。
  9. 启动成像过程。对于长期活体成像，监测沿在所有胚胎所有频道的所有方向正确采集。偶尔检查在接下来的日子里，该胚胎存活，并在适当的位置。

9.胚胎检索和质量控制

  1. 一旦成像完成时，删除与该样品保持器胚胎从样品室中。从实时成像检测，只有胚胎必须被检索。固定并染色的胚胎可以被丢弃。
  2. 如果进行了活体成像测定法中，将胚胎转移到物体滑动。对于琼脂糖柱技术，提取从用手术刀，微刀或刀片琼脂糖周围胚胎。对于琼脂糖半球技术中，与平面侧到对象幻灯片转移半球。胚胎切除是没有必要的。对于蛛网保持器技术中，轻轻地从用画笔琼脂糖膜卸除胚胎。孵育在标准条件下的饱和湿度的气氛小玻璃皿直到孵化的幼虫的对象滑动。
  3. 孵化后，幼虫转移到24孔平板的各个孔中和500mg生长培养基添加到每个孔中。在标准条件下孵育。成像幼虫的总开发时间和形态比较非成像WT和转基因larvAE（见讨论）。在表征WT发展分析，形态未见明显畸变理想情况下应明显。
  4. 一旦幼虫发育到健康的成年人，为他们提供相同的背景应变的适当WT伙伴。两周后，检查是否有后代生产。也可以考虑通过交配它们间削去检查后代的生育能力。只有当所成像的胚胎发育成产生育子代肥沃的成年人中，成像过程可以被认为是非侵入性的。

10.图像数据处理

注：对于图像数据的处理，开源图像处理软件ImageJ的67或它的衍生物斐济68推荐的。这两个版本以及全面的文档在www.imagej.net被发现。对于LSFM数据的标准文件格式是标记的图像文件格式（TIFF）。内在容器选项允许STO图像栈如Z-堆叠或时间序列能够在ImageJ的或经由FIJI拖和降低而打开的单个文件内ž最大突起的愤怒。

  1. 如果必要，可旋转的z堆栈对准与y轴（图像→变换→旋转）胚胎的前后轴。请注意，旋转参数必须为每个方向单独设置，但不适合的时间间隔和荧光通道。
  2. 裁剪沿z栈x轴，y轴和z轴，使得只有最小的背景（20 - 40个像素沿x轴和y轴，5 - 沿z轴10的平面）保持（用于x - 轴和y轴，使用矩形选择工具，然后图像→作物;对于z轴，使用图像→堆栈→工具→切片守护者）。请注意，裁剪参数为每个方向单独设置，但不适合的时间点和荧光通道。
  3. 计算的Z最大投影每个Z堆叠（图片→栈→Z项目，选择最大强度）。强度投影计算是数据简化程序，除去一个空间维度。
  4. 对于长期实时成像数据，可以考虑使用执行处理步骤为所有方向上，所有时间点和所有荧光通道65 10.1至10.3的ImageJ的或斐济脚本。理想情况下，串连每通道和方向所有的Z最大突起，并将它们保存在一个TIFF容器中的时间序列。可替代地，BigDataViewer 69插件斐济可用于通过太字节大的数据集导航。
  5. 根据不同的转基因系和成像模态，时间堆叠的动态强度的调整可能是理想的，由于光漂白和/或荧光团表达的波动。无论是ImageJ-或斐济固有漂白校正功能（图像→调整→漂白校正，选择直方图匹配）或奉献，泰德软件65建议。
  6. 如果胚胎被记录和/或沿多个方向，并在多个荧光通道，这些方向的水平组合（图像→堆栈→工具→组合）和信道合并（图像→颜色合并→频道）被推荐。
  7. 登记和沿着多个方向70最终与去卷积71组合获得的，Z-栈的融合，使质量均匀的和各向同性的分辨率优良的三维图像的计算。这两个插件都是开源的，预装在斐济，但他们需要的地标标本周围存在（荧光微球， 如珠）。
  8. 用于大规模定量数据提取和分析的开源软件框架也可，例如用于细胞核72或CEL的分割和跟踪升形状识别73。

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Representative Results

这个协议描述了用于生活的荧光成像或固定和染色赤胚胎LSFM实验框架。由于光漂白和光毒性，其光学切片能力的直接结果的低水平，LSFM是特别适合于长期实时成像。

新颖AGOC {ATub'H2B-mEmerald}＃1转基因线下的α-微管蛋白1启动子74的控制表达histone2B-mEmerald融合蛋白。它示出了一个增强子捕获状表达图案51中，由于荧光信号主要从浆膜，卵黄囊和几个神经元细胞簇获得。使用这条线，在室温（23±1℃）的胚胎发育66小时，记录，覆盖germband回缩和背封（补充电影1）。这个线可以被用于可视化的头附件（ 图4A）和浆膜层迁移的背封（ 图4B）中的动态范围内的神经元簇。新颖AGOC {ATub'H2B-mEmerald}＃4线携带相同转基因的＃4线，但是在不同的基因组位置。它不显示明显的增强子捕获模式，但如先前对于该启动子74所描述的荧光信号是无处不在时空检测。这条线是在原肠胚形成从过渡成像以germband伸长在两个深度水平（ 图4C），用于演示光学切片的能力。另一特征，特别适用于活体成像，是通过样品的旋转，这是在发育生物学中使用LSFM设置标准沿着多个方向的z堆栈的采集。例如，在神经胶质蓝色58线，样品旋转所有OWS胶质细胞重组的沿着和围绕腹神经索以及在左头叶增殖动力学，这只能从背部位正确看出，在相同的胚胎（ 图4D， 补充电影2）的观察。与本研究相关的实时成像数据集作为一个可下载的资源，元和获取信息提供了补充表1中找到。

由于转基因系实时成像的选择仍然是有限的，小的荧光染料可用于特异性标记细胞内结构。 SYTOX绿结合细胞核并能在绿色通道中被可视化，而YOYO-1和BOBO-3碘化物结合在核膜和所用的绿色或红色通道，分别（ 图5A）进行可视化。这些染料可以用来突出某些胚胎结构数目字，如浆膜瘢痕（ 图5B中 ，第一列），后腹侧浆膜细胞（ 图5B，第二列）或浆膜窗口闭合期间出现浆膜羊膜germband组织三层（ 图5B中 ，第三至第五列）。双色染色一起允许两个细胞内结构的在相同的胚胎的可视化，例如在核膜与肌动蛋白骨架，其可以与Alexa氟 - 共轭毒伞素的染料染色。例如，YOYO-1碘化物可以用鬼笔环肽546（ 图5C）进行组合，而BOBO-3可以用鬼笔环肽488（ 图5D）进行组合。

这也是方便固定和染色已经表达出一定的荧光蛋白转基因胚胎，因为固定手术淬火内在fluorescencE信号只有轻微。例如，从{AGOC ATub'H2B-mEmerald}＃4的转基因系，其中，在绿色通道中检测的核，胚与鬼笔环肽546，以使肌动蛋白骨架中的红色通道变得可见（ 图6中可以染色）。

图1
图1： 传统的宽视场，共聚焦激光扫描和轻基于表-荧光显微镜的比较。常规宽视场荧光显微术使用氙弧/汞蒸气灯用适当的过滤器或高功率发光二极管作为光源。对于每个采集的二维图像，整个试样用非衍射受限的光锥照射。在共聚焦激光扫描荧光显微镜，受衍射限制的高斯激光束是SC通过试样anned和荧光检测非相干点逐点。类似于常规宽视场落射荧光显微术，全试样被照亮每一个所获取的二维图像。在基于光的片材的荧光显微镜，受衍射限制的高斯激光束垂直地照射样本，以检测轴。检测任一荧光平面由平面或线由行。在采集的二维图像的，只有一小体积中心在检测物镜的焦平面经历的激发光的影响。试样的剩余体积不被照亮，无助于外的焦点模糊，不从光毒性作用遭受不丢由于光漂白的荧光团。 请点击此处查看该图的放大版本。

EP-together.within页= “1”> 图2
图2： 基于片材的光荧光显微镜的原理。在LSFM，照明和检测被分成至少两个光路。至少一个照明臂被用来生成光片（青色），而至少一个检测臂配备有适当的过滤器和用于荧光信号（绿色）的并行检测的照相机。 LSFM具有两个法服实现方式中，单个（或选择性的）平面照明显微镜（蓝色背景）和数字扫描的激光光片显微镜（红色背景）。通过移动样品和相对于彼此的光片，三维图像被获取。沿多个方向信息是通过旋转绕y轴，其优选沿重力定向的标本收集。ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55629/55629fig2large.jpg”目标=‘_空白’>点击此处查看该图的放大版本。

图3
图3： 在 赤 胚胎发育的录制 与基于片材的光荧光显微镜 使用了三种不同的安装技术 。 （A）将琼脂糖柱是指钢筒与推动琼脂糖柱，其中胚被嵌入，出玻璃毛细管的小针。琼脂糖半球安装在钢管。胚胎被附接到半球的琼脂糖少量的极。蛛网支架是金属的与安装在钢筒的顶部上的带槽的孔的片材。胚胎被粘合到跨越吨薄琼脂糖膜他槽孔。的光片显微镜内的三个安装技术（B）方案。 （C）一个DSLM内施加的三个安装技术。 （D）从记录有三个安装技术胶质蓝色转基因系的胚胎的示例性图像。胚胎，其是在germband缩回的开始，示出与其后端朝顶部匹配的传输光图像定向。 FM，荧光模式; ZA，与强度调节Ž最大投影。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4
图4： 赤 胚胎 的实时成像 。 （A </强>）的AGOC {ATub'H2B-mEmerald}＃1线在从germband缩回到背封过渡的胚胎。这条线表现出增强子捕获表达模式。荧光信号主要存在于浆膜，卵黄囊和几个神经元细胞簇。胚胎被示出在一段15个小时与5小时的间隔。细节图像示出了在头部附属物细胞簇。最初，集群仍然由浆膜细胞（第一列）所覆盖，在浆膜破裂，将细胞按照沿着与头的转动运动。 （B）用的0:30 h的间隔背闭合期间示出了用于1:30ħ同胚。详细图像显示在卵黄囊浆膜破裂的迁移。 （C）上排：在原肠胚形成从过渡的AGOC {ATub'H2B-mEmerald}＃4线的胚胎germband伸长率。中，下排：单平面示于两个深度一段10:30 H带的1:30的间隔H。 （D）在一段50:30 H带的07:30 h的间隔示出germband回缩过程中神经胶质蓝线的胚胎。细节图像显示胶质细胞在左侧头叶的形态发生重组。 ZA，与强度调整ž最大投影; PA单个平面与强度调节。 请点击此处查看该图的放大版本。

图5
图5： 固定，染色和Germband伸长期间WT胚Iimaging。与任一SYTOX绿染色（A）胚胎， 即模糊核染色，或YOYO-1碘化物或BOBO-3碘化物， 即，两个核膜污渍。 （B）YOYO-1碘化物染色安柏瑞O操作。详细示出了浆膜瘢痕（第一列），大后腹浆膜细胞的核膜（第二列）或浆膜的三层组织的组织，羊膜和实际胚胎组织（第三到第五列）。 （C）的双色染色与YOYO-1碘化物和546鬼笔环肽（D）的双色染色与鬼笔环肽488和BOBO-3碘化物。 ZA，与强度调节Ž最大投影。 请点击此处查看该图的放大版本。

图6
图6： 从AGOC {ATub'H2B-mEmerald}＃1 线 固定和染色的转基因胚胎的照片 。这种转基因线表示mEmerald标签ED histone2B（H2B）下的α-微管蛋白1启动子，其在整个胚胎发育遍在标志着核/染色质的控制。胚胎与Alexa氟546鬼笔环肽，其标签的肌动蛋白骨架/ F-肌动蛋白进一步染色。 ZA，与强度调节Ž最大投影。 请点击此处查看该图的放大版本。

标准 荧光显微镜型
传统的宽场 共聚焦激光扫描 光片基
物镜设置 一个物镜，中 - 高NA 2个垂直地布置物镜，照度：低NA，检测：高NA
照明光源 白色光源和适当的过滤器（ 例如水银短弧灯）
或基于LED与清理过滤器		激光清理过滤器
（ 例如二极管或DPPS激光器） 		激光清理过滤器
（ 例如二极管或DPPS激光器）
每二维图像照明 全样本全样本
（通常的二维高斯光束扫描） 		仅焦平面
（DSLM：一维高斯光束扫描）
发现 平行
（典型地CCD或SCMOS相机） 		顺序
（光电倍增管） 		平行
（典型地CCD或SCMOS摄像头）
成像速度 快（每图像毫秒） 慢（每图像秒） 快（每图像毫秒）
出焦荧光 无歧视通过针孔堵塞几乎完全
（拒收效率取决于直径） 		几乎不存在
（仅由于散射）
空间尺寸 2
（X / Y） 		3
（X / Y / Z） 		3
（X / Y / Z）
进一步的自由度 2
（时间，荧光通道） 		2
（时间，荧光通道） 		3
（时间，荧光信道，方向）
横向分辨率 [R
（0.6λ/ NA） 		0.66 [R
（0.4λ/ NA） 		[R
（0.6λ/ NA）
光学切片能力 没有是
（在检测通路歧视） 		是
（在照明通路75歧视）
可用性和价格 主要是商业，成本低主要是商业，昂贵商业，昂贵
定制，中度54,59,60,75
实时成像出版物覆盖赤胚胎 6 44,76,77,78,79,80 7 23,77,79,81,82,81
（旋转盘共聚焦）83,84,85 		4 23,57,65,86

表1 - 荧光特性在赤使用NCE显微镜技术实时成像。

染料 染色 稀释
SYTOX绿细胞核（模糊） 1：10,000（1：100在DDH 2 O和1：1％100（W / V）BSA的PBS）
YOYO-1碘化物核膜 1：10,000（1：100在DDH 2 O和1：1％100（W / V）BSA的PBS）
BOBO-3碘化物核膜 1：10,000（1：100在DDH 2 O和1：1％100（W / V）BSA的PBS）
Alexa氟488毒伞素肌动蛋白骨架 1：100（以1％（在PBS W / V）BSA）
Alexa氟546毒伞素肌动蛋白骨架

表2 - 染色溶液。

琼脂糖柱
（选项1） 		半球
（选项2） 		蛛网架
（选项3）
合理 胚胎被嵌入在被推出的毛细管的琼脂糖柱胚胎的后端粘结到极琼脂糖半球胚胎被粘合到薄膜琼脂糖跨越槽孔
样品架 钢圆筒销钢管钢圆筒
槽孔
无限（任意） 无限（任意） 四（0°，90°，180°，270°）
所需的技术水平 中等高低
琼脂糖周围的胚胎 高低中等
每个会话胚胎数 最多三个一多达六个
胚胎检索 狡猾简单简单
一次性设备 玻璃毛细管 - -
推荐 短期实时成像，染色的胚胎长期活体成像长期活体成像，彩色胚胎
<STRONG>引用 3 23,87,88 2 57,65 本出版物

表3 - 安装方法优点和缺点。

反常的表型诱导 合理 步 参考（方法）
胚胎RNA干扰在合胞胚层阶段的双链RNA注射到胚胎击倒的一个或多个特定基因步骤4.8之后注入胚。 2 33,81
父母RNA干扰双链RNA被横向喷射到FEMA腹段3和4之间乐蛹，这导致基因击倒在后代取蛹从步骤1.5。 2 36,37
隐性胚胎致死突变系产蛋文化携带约25％的纯合子突变子代隐性胚胎致死突变杂合体产量越过步骤1.5中突变系到成像行。 3 39,51,89
外在因素的应用某些生物活性或毒性因子通过将其添加到成像缓冲器外在施加到胚胎步骤2.2中添加因子到成象缓存器。 2 83,85

表4 - 反常的表型的LSFM实时成像

附加表1 - 元数据和参数的长期实时成像数据集DS0001-0003。 请点击这里下载该文件。

补充电影1 - 从AGOC {ATub'H2B-mEmerald}＃1转基因株系 一个 赤 胚胎 的实时成像 。
这条线表现出增强子捕获表达模式。荧光信号在浆膜，卵黄囊和神经元细胞的一个子集，主要发现。将胚胎沿着四个方向示出为从00:00小时至66:00 H带的时间点之间00:30 h的间隔。电影开始于germband收缩的开始，一旦背封完成结束。帧速率是每秒5帧。 ZA，ž最大突起与强度调节。 请点击这里下载该文件。

补充电影2 - 从胶质蓝色基因号线 赤 胚胎 的实时成像 。
将胚胎沿着四个方向示出为从00:00小时至66:00 H带的时间点之间00:30 h的间隔。电影开始于germband收缩的开始，一旦背封完成结束。帧速率是每秒5帧。 ZA，与强度调节Ž最大投影。 请点击这里下载该文件。

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Discussion

品质管制

在活体成像试验中，准备和记录程序必须是非侵入性的， 即，既不机械和化学处理（收集，dechorionation，安装到样本保持器），也没有观察时的集成能量负载应该影响样品的可行性。对于研究表征WT发展，它是从其中胚生存的录制过程中，成功地检索并发展成一个健康的成年人实验建议只使用数据。成人不应该表现出任何形态畸变，宜肥沃，且其后代也应该是肥沃。主要有三个原因，低存活率，尤其是在长期的实时成像检测：

首先，将胚胎表面进行了广泛的与琼脂糖步骤7，这可能阻碍了离子和气体交换和收缩胚胎mechan期间覆盖ically。受影响的胚胎，特别是在早期胚胎发育过程中成像，通常不明显开发了好几个小时，突然逮捕并很快失去其荧光信号。有一定经验的，即通过使用半球技术嵌入在琼脂糖表面部分可以保持在低于三分之一，而与所述支架蛛网技术，在表面的最一半是由非常薄的琼脂糖层覆盖。其次，施加到胚胎的集成能量负荷超过容差。在步骤8.2中给出的值作为一个经验法则，但以下条件应考虑：早期胚胎发育过程中（ⅰ）的胚后期胚胎发育过程中不承受激光照射以及胚胎，（II）虽然集成能量负载可能是相同的，无论是低的曝光时间或更长的时间间隔更高的激光功率似乎是低于激光功率更多的压力有高的曝光时间或较短的时间间隔，（ⅲ）更高的波长通常是更好的耐受性和（iv）用于转基因品系，公差极限似乎是特异性的线，而荧光团表达强度似乎是反比于激光照射的耐受性。此外，融合蛋白的设计和/或细胞内的定位也起到一定的作用。第三，胚胎是在安装过程中损坏。这里最关键的因素是，在次氯酸钠溶液孵化时间尽可能短，需要完全去除绒毛。潜伏期较长时间可能损害胚胎。还应注意采取不刺破或挤压用刷子胚胎，并保持在环境温度琼脂糖安装。损坏胚胎可实际成像过程之前步骤8.4中被识别开始，使受损的胚与可行那些来替换。

通过遵循这些准则，通常约为85-90％的安莉芳OS生存的活体成像过程和孵化。阴影胚胎的大约90％发展成健康，肥沃的成年人。存活比率似乎是独立于成像温度和安装技术（当琼脂糖柱被用于不超过半天的成像周期），但是具有升高水平的激光辐照度略有下降。作为一个附加的控制，特别是在定做转基因系荧光实时成像或框架建立相作为前体进行了全面的实验序列中的初始特性时，建议以并行方式运行未成像WT和转基因胚胎于成像胚胎，它是在相同的温度下被成像胚胎温育，并比较它们的开发时间和形态65。

此外，研究表征通过实时成像像差的表型（ 表4）还应该运行未患病ÇONTROL胚胎并联。建议保持尽可能相似双方胚胎的治疗，但是这要单独考虑每个实验策略：

击倒通过RNA干扰。

对于胚胎RNA干扰33，81，从同一个产蛋培养胚胎派生要么可以用功能性或控制的双链RNA注射。的不同注射的胚胎然后应同时在同一LSFM通过使用琼脂糖柱或蛛网保持器技术成像。对于亲代RNA干扰36,37，成像培养应被分成两个亚文化。一个传代培养的雌性蛹应与功能的双链RNA被注入，而另一个传代培养应与对照双链RNA被注入。胚胎科尔挠度应在并行地执行，并且两个实验和对照胚胎可以同时在相同的显微镜通过使用琼脂糖柱或蛛网保持器技术进行成像。

隐性胚胎致死突变品系。

当与隐性胚致死突变体39，89，91，92，93工作，杂合的突变体，其通常是表型上不显眼，产率理论上25％纯合突变体后代的产卵培养物（但有时少由于实际的处理问题89）和表型不明显子代（50％杂合突变体和25％的WT）的75％。建议使用蛛网架技术，从这样的产蛋文化安装几个胚胎。该纯合突变体可以是我通过表型的表现形式在整个成像过程中dentified，而正常发育中的胚用作对照。可以一次成像和质量控制都完成来确定被成像的样品的基因型。

外在因素的应用。

如果外在因素成像缓冲器83，85， 例如生物活性或毒性物质，对开发进行了研究，平行与同一LSFM控制胚胎成像一起内的影响通常是不可能的。因此，成像必须被顺序地执行。最佳地，随后的实验之间的时间最小化，并且胚胎从相同的成像培养派生。可替代地，两个相同构造并且可以使用操作LSFMs。在这种情况下，来自同一个产蛋期的胚胎应该被使用，但它的是TH重视使得成像性能是可比的两个显微镜电子校准小心地进行。通过使用蛛网保持器技术中，为每个条件多个胚胎可以一次成像。随着琼脂糖柱技术，外在因素可能到达胚胎受到阻碍。

在LSFM实时成像方法的当前限制

LSFM是无创分析胚胎形态多宽缩放尺寸的有力工具。标准操作程序，如在该协议提出，将支持过程，以建立光片技术作为在发育生物学的标准工具。然而，该方法是由多个对不同的实验和组织层次因素的限制：

最初，LSFM的开发是为了分析一个标本在同一时间。目前所有的两个或多个胚胎同时接近于图像中的同一显微镜b Y“堆叠”沿琼脂糖柱的y轴或蛛网支架解决了这个问题仅在一定程度上的标本。多井板-和盖玻片基于设置可用94，95，96。然而，它们从图像质量降低遭受和牺牲一些从LSFM基本益处，诸如沿着多个方向成像。目前，最好的选择是与并联的多个显微镜，当昂贵的部件，如激光，被共享60成为合理可行工作。

与EFA-nGFP 57，65，84，FNL 86，聪明58，86，AGOC {ATub'H2B-mEmerald}＃1，AGOC {ATub'H2B-mEmerald}＃4和神经胶质蓝色=“外部参照”> 58，只有六个定做适于长期实时成像的转基因株系目前已经上市。另外，HC079（羊膜），G12424（浆膜）和G04609（心脏）增强子捕获线51已被表征与LSFM 23。可替代地，也可以通过mRNA的81生成或染料注射79荧光胚胎，这些方法是相对简单的，但也从限制86受损。几个更多的标准仍然需要如表达在某些非普遍存在的启动子的荧光团仅观察某些器官或组织cytoskeletal-，organelle-和膜标记的线或线。理想情况下，这些线路也可与不同的荧光蛋白质。

另一个挑战是由LSFM产生的数据量。由于三个空间维度和至少三个福获取信息rther自由度（时间，方向，荧光信道）的，实时成像数据集的大小可以很容易到达许多千兆字节到几万亿字节。即使在立体裁剪和TIFF容器的基于ZIP压缩，与本研究相关的三个示范性的数据集有31.6，12.6和45.1千兆字节， 即 89.3技嘉总大小。当与工作LSFM，有必要具有用于数据存储和处理88，97各自的基础设施。

最高的图像质量是在胚胎的表面而获得的，但随着深度的增加，荧光信号变得越来越模糊。例如，germband的后端变为由卵黄囊倍原肠胚形成过程中覆盖并且不能被正确解析（ 图4C中 ，第一至第五列）。沿着多个方向成像解决至少部分这一问题ially - 从表面周围所有的胚胎高质量的信息是可用的，但内部区域保持模糊。目前，还没有令人满意的解决方案是可用的，但是从长远来看，红外荧光蛋白98，遗传方法99或显微镜设置与自适应光学100可以考虑。

适应其他物种

截至目前，LSFM已被用来记录三种昆虫物种的胚胎发育， 即果蝇果蝇 61，62，101，天窗飞Megaselia abdita 102和赤拟谷盗赤拟谷盗 57。实验框架，这里描述的建议立即进行删除标准作业程序和安装技术d是易于适应其它昆虫物种。属于各种顺序为许多昆虫种系的转化方案是可用的103，包括经济和/或医学重要性物种，如蜜蜂104，若干鳞翅目105,106或多种蚊种107，108,109。与适合于荧光实时成像各自转基因系，昆虫的胚胎形态的特征可在于在考虑它们的进化谱系和/或生态位。大约一百万的昆虫物种已被描述并进一步20000000个昆虫物种最有可能存在110，覆盖400多万多年的演变2。只有比较的方法将生成的信息又provi不能仅仅学习一个单一品种的发展原则获得DES的见解。

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Disclosures

作者什么都没有透露。

作者投稿

FS和EHKS设想的研究。 FS产生转基因AGOC线。基于光的片材荧光成像用FS和SK进行。 FS和EHKS与SK输入写的稿子。

Acknowledgments

我们感谢斯文·普拉斯的技术支持。神经胶质蓝色的转基因品系是从格雷戈尔·布彻（哥廷根，德国）惠赠。这项研究是由卓越法兰克福的集群资助上午主在歌德的布赫曼研究所分子生命科学（BMLS，主管恩里科·施莱夫）部分授予EHKS大分子复合物（CEF-MC，EXC 115，扬声器沃尔克·多茨奇）法兰克福大学是由德意志研究联合会（DFG）为主。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
full grain wheat flour Demeter e.V. 1.13E+08 US: whole wheat flour, UK: whole meal flour
405 fine wheat flour Demeter e.V. 1.13E+08 US: pastry flour, UK: soft flour
inactive dry yeast Flystuff / Genesee Scientific 62-106
Phosphate-buffered Saine (PBS), pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010-023
sodium hypochlorite, ~12% active Cl Sigma Aldrich 425044-250ML Caution: sodium hypochlorite is corrosive
low-melting agarose Carl Roth 6351.2
6-well plate Orange Scientific 4430500
24-well plate Orange Scientific 4430300
glass capillaries, internal Ø 0.46 mm Brand GmbH + Co KG 7087 09
SYTOX Green Thermo Fisher Scientific 57020 Staining solution preparation is explained in Table 2
YOYO-1 Iodide Thermo Fisher Scientific Y3601 Staining solution preparation is explained in Table 2
BOBO-3 Iodide Thermo Fisher Scientific B3586 Staining solution preparation is explained in Table 2
Alexa Fluor 488 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A12379 Staining solution preparation is explained in Table 2
Alexa Fluor 546 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A22283 Staining solution preparation is explained in Table 2
sieve, 800 µm mesh size VWR International 200.025.222-051
sieve, 710 µm mesh size VWR International 200.025.222-050 for growth medium preparation (step 1.1)
sieve, 300 µm mesh size VWR International 200.025.222-040
sieve, 250 µm mesh size VWR International 200.025.222-038 for egg laying medium preparation (step 1.2)
glass dish, Ø 100 mm × 20 mm Sigma Aldrich CLS70165102
cell strainer, 100 µm mesh size BD Biosciences 352360
paint brush, head Ø 2 mm VWR International 149-2121
syringe, 1.0 mL B. Braun Medical AG 9166017V
scintillation vials Sigma Aldrich M1152-1000EA
paraformaldehyde (PFA) Sigma Aldrich 158127 Caution: paraformaldehyde is toxic and corrosive
n-heptane ≥99% Carl Roth 8654.1 Caution: n-heptane is flammable and toxic
Triton X-100 Sigma Aldrich X100-100ML Caution: Trition X-100 is corrosive

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发育生物学，第122，节肢动物，昆虫，鞘翅目，
光片为主的生活的荧光显微镜或固定和染色<em&gt;赤拟谷盗</em&gt;胚胎
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Strobl, F., Klees, S., Stelzer, E.… More

Strobl, F., Klees, S., Stelzer, E. H. K. Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos. J. Vis. Exp. (122), e55629, doi:10.3791/55629 (2017).

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