Summary
Methoden, die die Charakterisierung und Isolierung von Stammzellpopulationen aus biologischen Proben ermöglichen, sind entscheidend für den Fortschritt der Stammzell-zielgerichteten Behandlungen bei Krebs und darüber hinaus. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Krebs-Stammzell-Isolierung mit dem Farbstoff-ausgelösten Seiten-Population Phänotyp.
Abstract
Krebs ist eine Stammzell-getriebene Krankheit und Tilgung dieser Zellen hat sich zu einem wichtigen therapeutischen Ziel. Die Entschlüsselung von Schwachstellen von Krebsstammzellen (CSC) und die Identifizierung geeigneter molekularer Targets beruht auf Methoden, die ihre spezifische Diskriminierung in heterogenen Proben wie Zelllinien und ex vivo- Tumorgewebe ermöglichen. Durchflusszytometrie / FACS ist eine leistungsstarke Technologie zur multiparametrischen Sezierung biologischer Proben auf Einzelzellenebene und ist bis heute die Methode der Wahl, um lebende Zellen für nachgeschaltete Analysen wiederherzustellen. Oberflächenmarker wie CD44 und CD133 sowie der Nachweis der enzymatischen Aldehyddehydrogenase wurden häufig verwendet, um CSCs aus Tumorproben durch FACS zu definieren und zu sortieren. Ein komplementärer Ansatz, der hier im methodischen Detail dargestellt ist, nutzt die funktionelle Farbstoff-Extrusion durch ABC-Arzneimitteltransporter, die eine ausgeprägte Population von fluoreszenzdämmenden Zellen identifiziert, die üblicherweise als Seitenpopulation (SP) bezeichnet werden. SPKrebszellen weisen kanonische Stammzellcharakteristiken auf und können unter Verwendung von Mitteln, die den Farbstoff-Extrudier-Arzneimitteltransporter hemmen (am häufigsten ABCB1 / P-Glykoprotein / MDR1 / CD243 und ABCG2 / Bcrp1 / CD338), abrogiert und funktionell bestätigt werden. Darüber hinaus ist der SP-Assay mit anderen durchflusszytometrischen Auswertungen, wie Färbung von Oberflächenantigenen, Aldehyddehydrogenase-Nachweis und toter Zelldiskriminierung ( z. B. mit 7-AAD oder Propidiumiodid (PI)) kompatibel. So beschreiben wir eine wertvolle und weitgehend anwendbare Methode zur CSC-Identifikation, Isolierung und Subcharakterisierung mechanistisch auf der Grundlage eines funktionalen und nicht eines phänotypischen Parameters. Obwohl wir ursprünglich mit Hoechst 33342 als auslösenden Farbstoff durchgeführt wurden, konzentrieren wir uns hier auf den neueren violetten Farbstoff-basierten SP-Phänotyp, der auf jedem Durchflusszytometer, das mit einer violetten Laserquelle ausgestattet ist, auflösbar ist.
Introduction
Die Wirksamkeit der primären Krebstherapien hat sich im Laufe des letzten Jahrzehnts durch die überzeugenden Fortschritte im genetischen und molekularen Verständnis der Erkrankung und das Aufkommen von zielgerichteten Medikamenten wie therapeutischen Antikörpern und kleinen Molekülinhibitoren deutlich verbessert. Im Gegensatz dazu sind metastatische und wiederkehrende Erkrankungen immer noch typisch, und Morbidität und Mortalität bleiben in diesen klinischen Einstellungen hoch. CSCs stellen eine deutliche Subpopulation innerhalb von Tumoren dar und sind mit kanonischen Stammzelleneigenschaften wie Klonogenität / Tumorigenität, Multi-Arzneimittelresistenz und asymmetrischer Zellteilung 1 , 2 ausgestattet. So führen CSCs nicht nur metastatische Progression und Tumor Heterogenität, sondern auch bestehen während der Behandlung zu prädisponieren den Patienten zum Rückfall. Therapeutische CSC-Eliminierung ist daher ein wichtiges medizinisches Bedürfnis, die Wiederkehr von Krankheiten zu verhindern und eine langfristige Heilung von Krebs zu ermöglichen 3
Die Identifizierung von Schwachstellen und die Aufklärung von Strategien zur Beseitigung von CSCs hängt stark von Methoden ab, die ihre Reinigung aus biologischen Proben für die anschließende Expressionsprofilierung und / oder funktionelle Untersuchung ermöglichen. Im Gegenzug beruhen solche Verfahren auf Oberflächen-, intrazellulären oder funktionellen Markern, die für diese Zellen spezifisch sind. CSC-spezifische Oberflächenmarker umfassen, sind aber nicht beschränkt auf CD44, CD133, CD24 und CD90 und wurden verwendet, um CSC-Populationen in einer Vielzahl von Tumorentitäten einschließlich Brustkrebs und Darmkrebs zu identifizieren 4 . Eine weitere Markierung, Aldehyddehydrogenase (ALDH), zeigt die intrazelluläre Lokalisierung und kann funktionell detektiert werden, wobei ein jeweiliges Substrat bereitgestellt wird, dessen enzymatische Umwandlung Licht erzeugt. Mit diesem Test wurden auch CSC-Populationen in diversen Tumorentitäten identifiziert. Eine ergänzende Methode, die gemeinhin als SP-Analyse bezeichnet und hier in m dargestellt wird Ethodologische Details, nutzt den aktiven Farbstoffausfluss durch ABC-Arzneimitteltransporter, um kleine Populationen von fluoreszenzdämmenden Stammzellen 6 , 7 , 8 zu identifizieren. Um dies zu erreichen, wird eine gegebene Probe in Gegenwart eines lipophilen DNA-bindenden Fluorophors inkubiert, der alle durch passive Diffusion in alle Zellen eindringt und nukleare und mitochondriale DNA zur Bindung zielt. Nicht-CSCs ohne ABC-Arzneimitteltransporter-Expression akkumulieren den Farbstoff, was zu einer hellen Fluoreszenz führt, während CSCs aktiv den Farbstoff extrudieren, der die Fluoreszenz reduziert. Die pharmakologische Hemmung der Arzneimitteltransporteraktivität unterbricht und verarbeitet den SP-Phänotyp funktionell und sollte für Kontrollzwecke verwendet werden. CSC-Populationen, die SP-Charakteristiken aufweisen, wurden unter anderem in Eierstockkrebs 9 , 10 , Prostatakrebs 11 ,> 12, Brustkrebs 13 , Lungenkrebs 14 , Endometriumkrebs 15 , Gliom 16 , 17 und Knochensarkom 18 . Wichtig ist, dass der SP-Assay sowohl mit Krebszelllinien als auch mit primärem Tumorgewebe kompatibel ist, obwohl das primäre Material zusätzliche Herausforderungen wie die Anforderung an eine spezifische Tumorzelldiskriminierungsstrategie darstellt (bestimmte Wirtszellpopulationen können auch SP-Merkmale aufweisen) 19 , 20 .
Die beiden am meisten etablierten SP-verleihenden Arzneimitteltransporter sind ABCB1 / P-Glykoprotein / MDR1 / CD243 und ABCG2 / Bcrp1 / CD338 8 , 9 , 21 ; Jedoch können auch andere Arzneimitteltransporter eine molekulare Determinante des SP-Phänotyps sein ( zB ABCB5) 22 . ABCB1Kann mit Verapamil effizient blockiert werden, während die Aktivität von ABCG2 mit Fumitremorgin C (FTC) 6 , 19 spezifisch aufgehoben werden kann. Eine besondere Stärke der SP-Analyse ist, dass sie mit anderen Färbungen ( z. B. Oberflächenmarkierungen und ALDH) kombiniert werden kann und dass es die lebende Zellwiederherstellung ermöglicht, so dass sie mit nachgeschalteten funktionellen Untersuchungen kompatibel ist. Darüber hinaus ist die SP-Erkennung aufgrund der hohen Konservierung von ABC-Arzneimitteltransportern unter den CSC-Populationen 9 , 23 weitgehend anwendbar.
Ursprünglich wurde die SP-Detektion unter Verwendung von Hoechst 33342 als Triggerfarbstoff 24 durchgeführt. Dieser Farbstoff erreicht eine ausgezeichnete Auflösung, erfordert jedoch eine Ultraviolettlaseranregung; Daher ist ihre Anwendbarkeit natürlich auf High-End-Durchflusszytometrie-Instrumente beschränkt. Das Aufkommen von DyeCycle Violet (DCV) 25 hat neue Avenu eröffnetEs für die SP-Analyse und erweitert die Anwendbarkeit dieser Methode auf Standard-Durchflusszytometrie-Instrumente ohne Ultraviolett-Laserquelle (eine violette Laserquelle genügt, um DCV-SP-Zellen zu lösen). Wichtig ist, dass Hoechst 33342 und DCV gemeinsame Pumpenspezifitäten aufweisen, was darauf hinweist, dass entweder Farbstoff die gleichen Zellpopulationen identifizieren sollte.
Hier stellen wir Ihnen ein detailliertes experimentelles Protokoll der DCV-basierten SP-Analyse zur schnellen und einfachen Reproduktion in unabhängigen Labors zur Verfügung. So sehen wir unseren Artikel als Ressource für CSC-Forscher, die zur Optimierung und Standardisierung dieser nützlichen zellbiologischen Methode beitragen sollen.
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Protocol
Dieses Protokoll ist in voller Übereinstimmung mit den Standards Institutional Ethical Review Board Richtlinien. Wenn menschliches oder tierisches Gewebe mit dem hier dargestellten Protokoll untersucht wird, sind die Forscher verpflichtet, die Zustimmung des jeweiligen Prüfungsausschusses ihrer Einrichtung oder ihres Landes zuzulassen.
Achtung: Für dieses Protokoll gelten die üblichen Vorsichtsmaßnahmen für den sicheren Umgang mit biologischen Proben. Dazu gehören das Tragen von Handschuhen und ein Laborkittel, und die Arbeit unter einem Biosicherheitskabinett, wann immer möglich.
1. Vorbereitung der Zellen
- Krebszelllinien
- Kultur eine jeweilige menschliche oder murine Krebszelllinie bei 37 ° C in 10-30 ml eines geeigneten Mediums ( z. B. RPMI 1640, ergänzt mit 10% ( v / v ) FBS, 2 mM L-Glutamin und 1x Penicillin / Streptomycin) und Ernte Die Zellen bei Sub-Konfluenz ( dh 70-90%) unter Verwendung von Verdau mit 0,05% Trypsin-EDTA oder einem anderen De-AttVermittlungsverfahren. Bestimmen Sie die Zellzahl und überprüfen Sie die Lebensfähigkeit mit einer Zählkammer und Trypan-Blau-Färbung. Der Anteil der lebensfähigen Zellen sollte 85% übersteigen.
HINWEIS: Beispiele für menschliche Krebszelllinien, die SP-Kompartimente beherbergen, umfassen MCF7 / HTB-22 und SKBR3 / HTB-30 (Brustkrebs), A2780 und SKOV-3 / HTB-77 (Eierstockkrebs) und A549 (Lungenkrebs) 26 .
- Kultur eine jeweilige menschliche oder murine Krebszelllinie bei 37 ° C in 10-30 ml eines geeigneten Mediums ( z. B. RPMI 1640, ergänzt mit 10% ( v / v ) FBS, 2 mM L-Glutamin und 1x Penicillin / Streptomycin) und Ernte Die Zellen bei Sub-Konfluenz ( dh 70-90%) unter Verwendung von Verdau mit 0,05% Trypsin-EDTA oder einem anderen De-AttVermittlungsverfahren. Bestimmen Sie die Zellzahl und überprüfen Sie die Lebensfähigkeit mit einer Zählkammer und Trypan-Blau-Färbung. Der Anteil der lebensfähigen Zellen sollte 85% übersteigen.
- Ex vivo -Tumorgewebe
- Nehmen Sie eine frische chirurgische Tumorprobe oder alternativ, ernten Sie Tumorgewebe aus einem transplantierbaren oder gentechnisch veränderten Maus-Tumormodell. Nehmen Sie 200-1000 mg Gewebe und erzeugen Sie eine Einzelzellsuspension durch mechanische Disaggregation ( z. B. unter Verwendung von Scheren oder Skalpell) und enzymatische Verdauung ( z. B. unter Verwendung eines Collagenase / Dispase / DNase-Cocktails).
- Filtriere die Probe durch ein 70 μm-Cut-off-Sieb. Bestimmen Sie die Zellzahl und überprüfen Sie die Lebensfähigkeit mit einer Zählkammer und Trypan blUe färbung
HINWEIS: Verdauungscocktails enthalten häufig 200 μg / ml Kollagenase P, 0,8 U / mL Dispase und 25 μg / mL DNase I und Inkubationszeiten liegen typischerweise im Bereich von 20 - 50 min. Idealerweise wird die Gewebe-Disaggregation nach einem für das zu untersuchende Gewebe 27 , 28 , 29 optimierten Protokoll durchgeführt.
2. Testproben
- Anpassung der Zellkonzentration auf 1 x 10 6 Zellen / ml im frischen Kulturmedium (ein nährstoffhaltiges Vehikel ist wichtig, da die Farbstoff-Extrusion ein aktiver Energieverbrauch ist). Schließlich 1 ml Probe auf ein gewöhnliches Durchflusszytometrie / FACS-Rundbodenrohr (mit der Bezeichnung "Test") übertragen.
HINWEIS: Für optimale Ergebnisse kann es notwendig sein, dass die Zellkonzentration titriert wird (z. B. 5 x 10 5 -1 x 10 6 -2,5 x 10 6 Zellen / ml), aber eine niedrigere Zellkonzentration allgemeinErgibt eine höhere Auflösung 19 . Nur für die Sortierung von Applikationen, bei denen eine maximale Anzahl von SP-Zellen wiederhergestellt werden soll, empfiehlt es sich, die Zellkonzentration auf bis zu 1 x 10 7 Zellen / ml zu erhöhen. - 10 μM DCV zu der Probe geben und gut vermischen, entweder durch sanftes Vortexen oder Resuspendieren für 3-5x. Gehen Sie zu den Hemmungssteuerungen vor.
HINWEIS: Optimale Ergebnisse können von der Titration des auslösenden Farbstoffs abhängen (z. B. 2,5; 5; 10; 20 μM), aber eine höhere Farbstoffkonzentration ergibt im Allgemeinen eine höhere Auflösung 19 .
3. Inhibition Controls
- Übertragen Sie 250 μl der farbstoffhaltigen Zellsuspension auf eine neue Durchflusszytometrie / FACS-Rundbodenröhre (mit der Bezeichnung "Kontrolle"). 50 μM Verapamil oder 20 μM FTC zugeben und gut durch Pipettieren vermischen.
HINWEIS: Verapamil und FTC sind die bekanntesten Inhibitoren für die SP-Analyse, haben aber unterschiedliche Efflux-Pumpen-spezifischeY: Verapamil hemmt mehrere ABC-Arzneimitteltransporter einschließlich ABCB1 und ABCB5, während FTC für ABCG2 6 , 19 spezifisch ist . Wenn der SP-Status einer einzelnen Probe unbekannt ist, empfiehlt es sich daher, sowohl Verapamil als auch FTC in separaten Röhren zu verwenden.
4. Färbung
- Kappe sowohl die "Test" und "Kontrolle" Rohre und inkubieren sie bei 37 ° C im Dunkeln für 90 min, mit sanften Agitation alle 15 min. Die meisten der Farbstoff-Extrusion in SP-Zellen treten innerhalb der ersten 45 min auf, aber die Farbstoffakkumulation in Nicht-SP-Zellen (die zur Auflösung beitragen) ist nur maximal nach 75-90 min 19 .
- Nach Beendigung der Färbung die Zellen in 3-4 mL eiskaltem PBS waschen und das Pellet in einem Volumen von 100 μl (PBS) resuspendieren. Halten Sie die Zellen im Dunkeln und kühlen auf Eis, und fahren Sie mit der Färbung der zusätzlichen Marker. Alternativ können Sie auch Durchflusszytometrie ana durchführenLyse
5. Kalkulation für andere Marker
- Fügen Sie eine gewünschte Gruppe von Fluorochrom-konjugierten Antikörpern zu den DCV-gefärbten Zellen hinzu, mischen Sie gut und inkubieren Sie die Zellen bei 4 ° C im Dunkeln für 20-30 min. Waschen Sie die Zellen in 3 - 4 mL eiskaltem PBS und gehen Sie auf tote Zelle Diskriminierung.
HINWEIS: Antibody-Formate, die mit DCV leicht kompatibel sind und praktisch keine Kompensation erfordern, umfassen PerCP oder PerCP-Cy5.5, PE-Cy7, APC, Alexa Fluor 647, APC-Cy7, APC-H7, BV711, Alexa Fluor 750 und BV786 . Formate, die mit DCV kompatibel sind, aber eine Kompensation erfordern, umfassen FITC, Alexa Fluor 488, PE und BV650. Formate, die praktisch nicht mit DCV kompatibel sind, sind BV421, V450 und V500. - Addieren Sie 7-AAD (oder PI) zu den DCV-gefärbten Zellen in der vom jeweiligen Hersteller empfohlenen Konzentration und inkubieren Sie die Proben für 5 - 10 min im Dunkeln. Filtriere die Proben durch 70 & mgr; m abgeschnittene Siebe und fuhr fort, um die zytometrische Analyse durchzuführen.
6. Durchflusszytometrische Analyse
HINWEIS: Es empfiehlt sich, das jeweilige Durchflusszytometrie-Instrument während des Färbevorgangs bereits einzuschalten, so dass alles so eingestellt ist, wie die Proben fertig sind. Dazu gehören auch Standard-Wartungsprozeduren wie System Performance Tracking und Tank Nachfüllen.
- Erfassen Sie die Zellen auf dem Durchflusszytometer und geben Sie sie auf eine bivariate FSC / SSC-Punkt-Darstellung (Abbildung 1B). Ausschliessen von Dubletts und Aggregaten durch Vergleich der verschiedenen Signale von FSC ( dh Höhe, Breite, Fläche) (Abbildung 1C).
- Wenn ein toter Zellmarker eingeschlossen worden ist, Gate auf die lebensfähige Zellfraktion ( z. B. 7-AAD-negativ) ( Abbildung 1D ). Visualisieren Sie die lebensfähigen Singulettzellen auf einem bivariaten Punktdiagramm für "blaue" und "rote" DCV-Emission. Zu diesem Zweck den "blauen" Fluoreszenzkanal auf der y-Achse ( zB 450/50) und den 'Roter "Fluoreszenzkanal auf der x-Achse ( zB 525/50).
- Schalten Sie beide Kanäle in den Linearmodus und stellen Sie die Detektorspannungen entsprechend so ein, dass sich der SP an der Seite des Plots im unteren linken Quadranten befindet. Umgekehrt lokalisiert das Nicht-SP den oberen rechten Quadranten des Plots, der die Zellzyklusverteilung (G1 und G2) reflektiert. Tor schalten und die Erfassung stoppen (Abbildung 1E ).
HINWEIS: DCV-definierte SP-Zellen können mit Durchflusszytometern erkannt werden, die mit einer violetten Laseranregungsquelle ( dh einer 405 nm Laserlinie) ausgestattet sind. Es ist eine spezifische SP-Analyse, dass die emittierte Fluoreszenz im linearen Modus gemessen wird und in zwei getrennten Kanälen, die auf einem Bivariate-Punkt-Diagramm angezeigt werden. Die "blaue" Emission von DCV wird bei etwa 450 nm gemessen ( z. B. bei einem 450/40 Standardfilter) und die "rote" Emission von DCV wird bei etwa 510 - 585 nm gemessen ( zB mit einem 510/50, a 525/50 oder ein 585/15 Filter) 19 . Aufgrund der besonderen Chemie des Assays ist die Trennung zwischen SP und Nicht-SP-Zellen im "roten" Fluoreszenzkanal 19 im allgemeinen höher.
- Laden Sie die Sperrregelung (en) und erwerben Sie die Daten. Die SP-Zellen sind nun verschwunden oder sind im Wesentlichen reduziert (Abbildung 1F ). Falls nötig, verfeinere das SP-Tor auf Basis dieser Daten.
- Um die Oberflächenmarker-Expression durch SP-Zellen zu untersuchen, lassen Sie die "rote" Fluoreszenz von DCV auf der x-Achse und zeigen einen entsprechenden Fluoreszenzkanal auf der y-Achse im logarithmischen Modus ( zB APC) an. Stellen Sie die Detektorspannungen entsprechend ein und gleiten Sie den Bruchteil der SP-Zellen, die für den untersuchten Marker (s) positiv sind (Abbildung 1G ). Die Koexpression eines bestimmten Markers durch SP-Zellen ergibt ein entsprechendes Signal im oberen linken Quadranten des Plots 30 .
- Notieren Sie dieDaten und / oder sortiere die SP-Zellen.
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Representative Results
Vorausgesetzt ist eine repräsentative SP-Analyse von A2780-Zellen, eine menschliche Eierstockkrebs-Zelllinie, die zuvor gezeigt wurde, um eine SP-Bilanzierung von weniger als 1% der Zellen 9 zu beherbergen. Die Zellen wurden bei 37 ° C in RPMI 1640, ergänzt mit 10% ( v / v ) FBS, 2 mM L-Glutamin und 1x Penicillin / Streptomycin, gezüchtet und bei 85% Konfluenz unter Verwendung einer Behandlung mit 0,05% Trypsin-EDTA geerntet. Die Zellen wurden in PBS gewaschen und durch 70 & mgr; m abgeschnittene Siebe filtriert. Die Zellzahl wurde unter Verwendung einer Zählkammer und einer Trypan-Blau-Färbung bestimmt und 1 x 10 & sup6; Zellen / ml (frisches Medium) wurden mit 10 & mgr; M DCV für 90 min bei 37 ° C im Dunkeln gefärbt. Parallel dazu wurde ein Aliquot in Gegenwart von 20 μM FTC unter genau den gleichen Bedingungen inkubiert. Die Zellen wurden in 4 ml PBS gewaschen und ein APC-konjugierter Antikörper gegen ABCG2 wurde dem "Test" -Rohr in einer vor-titrierten Konzentration zugesetzt. Nach incubatiFür 25 min bei 4 ° C wurden die Zellen in PBS gewaschen und 7-AAD wurde zur Markierung von toten Zellen zugegeben. Die Proben wurden auf Eis gekühlt und auf einem FACS-Instrument analysiert. Die abgebildete Gating-Strategie ist mehr oder weniger universell einsetzbar auf andere Proben, obwohl hoch heterogenes Material, wie Proben von Gewebeproben, eine Vordefinierung der Zielzellfraktion unter Verwendung spezifischer Oberflächenmarker ( z. B. EpCAM, CD45, CD31) erfordern. Die dargestellten Ergebnisse sollen als Referenz für die DCV-basierte SP-Detektion in anderen Labors dienen. Daher sollten die relativen Lokalisierungen der untersuchten Zellpopulationen grob vergleichbar sein, aber sicher nicht identisch zu denen, die von anderen Forschern mit unabhängigen biologischen Proben erhalten wurden.
Abbildung 1: Workflow und repräsentative Ergebnisse. (A) Hauptflussdiagramm zur SP-Detektion mit DCV-StaininG. Kalkulation für zusätzliche Marker ist optional, aber tote Zelle Diskriminierung ist sehr empfehlenswert. ( BG ) Repräsentative SP-Analyse von A2780 menschlichen Eierstockkrebszellen, die auf einem FACS-Instrument durchgeführt wurden. Die Zellen werden nach FSC / SSC-Merkmalen (B) gegossen, und Dubletten und Aggregate werden durch Vergleich der verschiedenen Parameter von FSC ( zB Höhe und Breite) ( C ) ausgeschlossen. Danach werden tote Zellen durch Gating auf der 7-AAD-negativen (oder PI-negativen) Zellfraktion ( D ) unterschieden. Lebendige Einzelzellen werden dann auf einem linearen bivariaten Punktdiagramm für die blaue und rote DCV-Emission angezeigt und das SP (und das entsprechende Nicht-SP) wird ( E ) gated. Die gleiche Analyse erfolgt nun mit einer entsprechenden Inhibitionsregelung (in diesem Fall wurde FTC verwendet), und dies sollte zu einem nahezu vollständigen Verschwinden von Zellen innerhalb des SP-Gatters ( F ) führen. Schließlich kann das identifizierte SP genauer charakterisiert werden, zB durch deteRmining der ABC-Arzneimitteltransporter (s), die für die Farbstoff-Extrusion verantwortlich sein könnten und somit den SP-Phänotyp (in diesem Fall ABCG2 im Einklang mit der FTC-Empfindlichkeit) verleihen. ( G ). FTC, fumitremorgin C; ALDH, Aldehyddehydrogenase. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Der Fortschritt in der klinischen Behandlung von Krebs hängt auch von der Entwicklung von Behandlungsmodalitäten ab, die auf CSCs abzielen. Methoden, die eine zuverlässige Isolierung von CSCs aus biologischen Proben ermöglichen, beschleunigen die Identifizierung geeigneter Ziele und sind daher in diesem Bestreben von entscheidender Bedeutung. SP-Analyse ist eine etablierte und wertvolle Technik zur Identifizierung von CSC-Populationen, die ABC-Drogen-Transporter ausdrücken und die Implementierung von DCV hat seine Anwendbarkeit auf Standard-Durchflusszytometrie-Instrumente erweitert. Mechanistisch verfolgt die SP-Diskriminierung den aktiven Farbstoff-Efflux durch ABC-Arzneimitteltransporter, um CSCs auf der Basis einer niedrigen Fluoreszenz zu detektieren, was eine charakteristische Lokalisierung an der Seite des Plots unten links zum entsprechenden Nicht-SP ergibt. Wichtig ist, dass die DCV-basierte SP-Detektion eine robuste und unkomplizierte Methode ist, wobei die kritischsten Schritte (i) die Herstellung von Zellen (ii) der Färbeprozess (iii) die Auswahl eines geeigneten Inhibitors sindItor und (iv) die Durchflusszytometrieanalyse. Da die Färbeextrusion ein aktiver energieverbrauchender Prozess ist, ist es besonders wichtig, mit einer guten Zelllebensfähigkeit zu beginnen; Nur lebensfähige (Drug-Transporter-exprimierende) Zellen können eine SP produzieren. Darüber hinaus ist es oft sinnvoll, das Verhältnis zwischen der Farbstoffkonzentration und der Zelldichte zu optimieren und dadurch die Trennung von SP-Zellen zu verstärken (dies wiederum erfordert eine Titration von sowohl DCV als auch Zellen). Eine allgemeine Regel ist, dass sowohl eine höhere Farbstoffkonzentration als auch eine niedrigere Zellkonzentration zu einer verbesserten Trennung führen. Schlüssel zu einem erfolgreichen DCV-Experiment ist die funktionelle Validierung des SP mit pharmakologischen Inhibitoren der ABC-Arzneimitteltransporter-Aktivität. Wie bereits erwähnt, gehören Verapamil und FTC zu den etabliertesten Inhibitoren für die SP-Analyse und haben unterschiedliche Pumpenspezifitäten (FTC ist spezifisch für ABCG2, während Verapamil mehrere Pumpen hemmt). Bei Proben mit unbekanntem SP-Status empfiehlt es sich daher, beide zu verwendenInhibitoren in getrennten Röhrchen. Eine weitere Option ist die Verwendung des Pan-ABC-Arzneimitteltransporter-Inhibitor-Reserpins 4 . Allerdings sollten die Forscher sich bewusst sein, dass die Autofluoreszenz dieser Verbindung potentiell das DCV-Signal 19 stören kann. Sobald die Zellen auf die blaue und rote DCV-Emission analysiert sind, sollten die Detektorspannungen so eingestellt werden, dass beide Populationen ( dh SP und Non-SP) bei maximaler Trennung sichtbar sind. Wenn das Bild seltsam aussieht, könnte die logarithmische Skalierung der Grund sein, warum (in diesem Fall beide Kanäle wieder in den linearen Modus umschalten).
Es ist auch wichtig zu beachten, dass der DCV-basierte SP-Assay weder spezifisch für Krebs ist, noch wurde er ursprünglich für die Anwendung in der Onkologie entwickelt. Stattdessen ist es für ABC-Arzneimitteltransporter spezifisch und erleichtert so auch die Detektion und Isolierung von physiologischen (Gewebe-) Stammzellen wie Lineage - Sca-1 + c-kit +Hämatopoetische Stammzellen 25 . Darüber hinaus können differenzierte Zelltypen, die dedizierte Barrieren an entscheidenden Körperstellen festlegen, auch SP-Merkmale aufweisen 20 . Die Anwendung der DCV-basierten SP-Detektion auf Primärgewebe erfordert daher eine spezifische Diskriminierung der Zielzellpopulation unter Verwendung geeigneter Marker.
Angesichts der hohen Konservierung von Arzneimittel-Efflux-Pumpen unter den CSC-Populationen 9 , 23 ist eine DCV-basierte SP-Detektion weitgehend anwendbar, eine Tatsache, die auch durch ihre erfolgreiche Verwendung über Tumorentitäten, einschließlich Entitäten unterschiedlicher Keimschicht Herkunft 9 , 17 , 18 Weitere Vorteile sind, dass (i) Zellen mit direkten Implikationen in der Arzneimittelresistenz identifiziert werden (besonders wichtig für die Bekämpfung von klinisch relevanten Krebszellen-Untermengen, die die Krankheit wiedergebenR) und dass (ii) die Erkennung eines funktionalen, anstatt eines statischen Parameters eine weitere Assay-Spezifität verleihen und die Auflösung 19 , 31 , 32 verbessern könnte. Von der konzeptionellen / technologischen Seite unterscheidet sich die DCV-basierte SP-Detektion deutlich von den Antikörper-vermittelten Oberflächenfärbungen: (i) Die Zielstruktur zeigt die intrazelluläre Lokalisation und stellt Nukleinsäure, nicht Protein dar. (Ii) Der Assay erkennt die Proteinaktivität, nicht die bloße Anwesenheit oder Dichte. (Iii) Die Zielzellen sind durch niedrige Fluoreszenz definiert, nicht durch ein positives Signal. (Iv) Als DNA-bindender Farbstoff ist DCV empfindlich gegenüber geringen Variationen der Zell- oder Farbstoffkonzentration während der Färbung 19 . (V) DCV-Fluoreszenz wird im linearen Modus gemessen, nicht logarithmisch. (Vi) DCV-Fluoreszenz ( dh die Fluoreszenz, die von einem einzelnen Fluorophor erzeugt wird) wird in zwei getrennten Kanälen gemessen, nOt in einem einzigen Wellenlängenbereich. Trotz dieser Besonderheiten ist die DCV-basierte SP-Analyse einfach durchzuführen und offenbar erweitert die Durchflusszytometrische Toolbox für CSC-Forschung.
Die DCV-basierte SP-Analyse bietet auch viele Möglichkeiten zur Kalkulation für andere Marker, wobei sie sowohl mit herkömmlichen Antikörper-vermittelten Oberflächenfärbungen (zahlreiche Formate möglich) als auch mit dem kommerziellen Assay, der die ALDH-enzymatische Aktivität nachweist, kompatibel ist. Allerdings konzentrierten wir uns hier auf die Oberflächenfärbung und der Leser wird auf die veröffentlichte Literatur 4 verwiesen, um methodische Details zur Codetektion der ALDH-Aktivität zu sehen. In jedem Fall sollte DCV-getriggerte SP-Analyse mit toter Zelldiskriminierung kombiniert werden und offensichtliche Reagenzien für diesen Zweck sind 7-AAD und PI.
Es ist zu beachten, dass DCV-definierte SP-Zellen (und Nicht-SP-Kontrollzellen) unter Verwendung der Sortieranwendung von entsprechenden Durchflusszytometern lebensspaliert werden können. Weil der SP-Assay eine funktionale pa erkenntRameter, dass nur lebensfähige Zellen produzieren können, kann die Lebensfähigkeit der gewonnenen SP-Zellen allgemein erwartet werden, hoch zu sein (manchmal ungefähr 100%). Sollte es dennoch Probleme mit der Nachsortierfähigkeit geben, so können verschiedene technische Parameter wie die Größe der Sortierdüse, die Art des Puffermittels und die Temperatur während der Sortierung überprüft werden (mit einer 70 μm Düse hatten wir nie Probleme Lebensfähigkeit, aber eine größere Düse könnte noch für sehr empfindliche Zellen helfen). Die gewonnenen Zellen können nachgeschalteten Analysen wie qRT-PCR, Western-Blotting und globaler Expressionsprofilierung ( z. B. unter Verwendung von Gen-Array oder der neueren RNASeq-Technologie) unterzogen werden. Darüber hinaus können isolierte SP-Zellen für funktionelle Stammzell-Eigenschaften ( z. B. Einzelzell-Klonogenität und serielle Transplantation) untersucht oder subkultiviert werden, um Zelllinien von angereicherten oder sogar reinen SP-Zellen zu etablieren, die für Monate 9 stabil sein könnten. In unsererStudieren wir normale mittlere und konventionelle 2D-Plastikkolben zu Subkultur-DCV-definierten CSCs 9 , aber Stammzellen-selektive Modalitäten wie Anchorage-unabhängige / 3D-Kulturbedingungen und spezialisierte Medien sind ebenfalls möglich. Wir schlagen vor, dass die günstigsten Bedingungen für die In-vitro- Erweiterung eines bestimmten SP-Fachs auf individueller Basis überprüft werden müssen.
Zusammenfassend zeigen wir hier den detaillierten experimentellen Arbeitsablauf der CSC-Identifizierung / Isolation mittels DCV-basierter SP-Analyse. Unsere Arbeit soll CSC-Forschern dabei unterstützen, diese nützliche Methode in ihren eigenen Labors umzusetzen und zu etablieren, die die Aufklärung therapeutischer Anti-CSC-Strategien für eine verbesserte klinische Behandlung von Krebs weiter fördern sollen.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären. Es gibt auch keine Nicht-Autor-Beteiligung an der Vorbereitung des Manuskripts.
Acknowledgments
Maximilian Boesch wird von einem Erwin Schrödinger Stipendium des Wissenschaftsfonds FWF (Stimmnummer J-3807) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vybrant DyeCycle Violet | Thermo Fisher Scientific | V35003 | Ready to use |
| Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | Dissolve in ethanol |
| Fumitremorgin C | Sigma-Aldrich | F9054 | Dissolve in DMSO |
| 7-AAD (or propidium iodide - PI) | BioLegend | 420403 | Ready to use |
| Standard cell culture reagents (e.g., medium, FBS, L-glutamine, antibiotics, PBS, trypsin-EDTA, etc.) | Different suppliers | ||
| Sample/cells of interest (e.g., human or murine cancer cell line, human or murine tumor tissue) | Different suppliers | ||
| Flow cytometric instrument (FACS; analyzer or cell sorter) | Different suppliers | Violet laser source required | |
| FACS tubes (round-bottom) | Different suppliers | Tubes with cap recommended | |
| 70 µm cut-off strainers | Different suppliers | Optional but recommended | |
| Digestion enzyme mix (e.g., collagenase/dispase/Dnase) | Different suppliers | Only relevant for tissue dissociation | |
| Flurochrome-conjugated antibodies against surface markers of interest | Different suppliers | Optional | |
| ALDEFLUOR Kit | STEMCELL Technologies | 01700 | Optional |
References
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