Her har multispektral billeddannelsesflowcytometri med en analytisk funktion, der sammenligner lyse detaljerbilleder af 3 autofagmarkører og kvantificerer deres co-lokalisering sammen med LC3-spottælling, anvendt til at måle autophagy på en objektiv, kvantitativ og statistisk robust måde.
Autophagy er en katabolisk vej, hvor normale eller dysfunktionelle cellulære komponenter, som akkumuleres under vækst og differentiering, nedbrydes via lysosomet og genbruges. Under autofag lipideres cytoplasmisk LC3-protein og rekrutteres til de autofagosomale membraner. Autofagosomet smelter derefter sammen med lysosomet for at danne autolysosomet, hvor nedbrydningen af autophagosom vesikel og dens indhold forekommer. Det ubiquitin-associerede protein p62, der binder til LC3, anvendes også til at overvåge autofagisk flux. Celler, der gennemgår autofagi, bør demonstrere co-lokalisering af p62-, LC3- og lysosomale markører. Immunofluorescensmikroskopi er blevet brugt til visuelt at identificere LC3 puncta, p62 og / eller lysosomer pr. Cellebasis. En objektiv og statistisk streng vurdering kan imidlertid være vanskelig at opnå. For at overvinde disse problemer blev multispektral billeddannelses-flowcytometri anvendt sammen med en analytisk funktion, der sammenligner den lyse deHale billeder fra tre autophagy markører (LC3, p62 og lysosomal LAMP1) og kvantificerer deres co-lokalisering i kombination med LC3 spot tælling for at måle autophagy på en objektiv, kvantitativ og statistisk robust måde.
Makroautofagi, herefter kaldet autofagi, er en katabolisk vej, hvor beskadigede eller dysfunktionelle komponenter, langlivede proteiner og organeller nedbrydes via lysosomet og genbruges 1 . Autophagy er en dynamisk, multistep-proces, der involverer dannelsen af et autophagosom; Fusionen af autophagosomet med lysosomet, der danner autolysosomet; Og nedbrydning af indholdet af autolysosomet 2 . Den afgørende biologiske markør, der anvendes til at identificere autofagi hos pattedyrsystemer, er den mikrotubulærassocierede protein 1A / 1B-lette kæde 3 (LC3), som udgør autofagosomal membranen. Under autophagy konjugeres cytosolisk LC3-1 til phosphatidylethanolamin til dannelse af LC3-II; LC3-II inkorporeres derefter i den autophagosomale membran 3 . En anden almindeligt anvendt markør for autofagisk flux er autophagy receptor-sekvestosom 1 (SQSTM1, p62), som fysisk liNks autophagic fragt til autophagic membranen 4 , 5 .
Metoder, der traditionelt har været brugt til at måle autophagy, er Western blots og fluorescensmikroskopi 7 . Men ingen af disse metoder anses for at være "guldstandarden" 2 , 6 da der er udfordringer forbundet med begge disse teknikker. Western blots giver kun et gennemsnit, fordi de bruger en homogenatprøve, så observatører ikke kan se, hvad der sker i individuelle celler. På den anden side giver fluorescensmikroskopi observatørinformation på enhedsniveau, men det mangler gennemstrømningsmuligheder, hvilket gør det vanskeligt at opnå objektive og statistisk strenge vurderinger. I de seneste år har måling af LC3 og p62 ved multispektral billedflowcytometri (MIFC, se Materialetabellen ) været ved at vinde popuLighed på grund af dets kvantitative magt, høje gennemstrømningsmuligheder, multiplekspotentiale og evne til at billede hver celle. En af de mest anvendte metoder til måling af autofagi ved hjælp af MIFC, sammen med dets ledsageranalysesoftware (se Materialetabellen ), er gennem stedet tælling af LC3 puncta eller autophagosomer 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 . En stigning i autofagosomer betyder dog ikke nødvendigvis, at der er en stigning i autofagi, da det også kunne repræsentere en blokade i processen 2 . LC3-II omsætning er en nyttig parameter til måling af autofagisk flux ved analyse af celler i nærvær ogFravær af en lysosomal nedbrydningsinhibitor, såsom chloroquin. Chlorokin inhiberer fusionen af autophagosomet til lysosomet og derved tillader kvantificering af autofagosomdannelsen som et mål for graden af autofag ved at standse autofagisk flux, inden den lysosomale nedbrydning kan forekomme 18 . Derudover nedbrydes p62 primært af autofagi, og hvis den lysosomale nedbrydning af autophagosomet og dens indhold er blokeret, forventes en akkumulering af p62 17 , 19 .
Autophagy er en multistep-proces, og måling af LC3 eller P62 alene giver ikke et komplet billede af, hvad der sker i cellerne. Nylige publikationer har understreget behovet for at undersøge den samtidige dannelse af autolysosom 2 , 17 , 20 , 21 . MIFC erentydigt stand til at måle dannelsen af autolysosome ved billeddannelse af co-lokalisering af autophagosome til lysosomet 15 – 17, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26. Derudover er co-lokalisering af p62 og LC3 ved anvendelse af MIFC også blevet undersøgt for at måle autofagisk flux 5 . I den refererede analysesoftware kaldes "funktionen", der måler co-lokalisering, "Bright Detail Similarity R3" (BDS) og blev specifikt designet til at sammenligne de små, lyse billedet detaljer af to billeder. BDS er den log-transformerede Pearsons korrelationskoefficient for de lokaliserede lyse pletter med en radius på 3 pixels eller mindre; Med andre ord beregner BDS graden af oForsinkelse af pixels fra to forskellige fluorescerende kanaler. De lyse pletter er enten korrelerede ( dvs. samme rumlige placering) eller ukorrelerede ( dvs. forskellige rumlige steder). Korrelationskoefficienten varierer derfor mellem 0 (ukorreleret) og 1 (perfekt korrelation). Koefficienten er log-transformeret for at øge området til mellem nul og uendelig 26 , 27 . BDS alene kan ikke være tilstrækkeligt; Rajan et al. Fandt ud af, at brugen af kun BDS kunne føre til falsk-positive eller falsk-negative resultater 21 . BDS evaluerer co-lokalisering af to markører af autofagi, men betragter ikke antallet af autofagosomer. For at tage højde for antallet af autophagosomer, rajan et al. Inkluderet spot-tælling af LC3 puncta 21 . Rajan et al. Foreslået at anvende et bivariat scatter plot af LC3 spot count versus BDS. Ved hjælp af denne bivariate plot, to populationer werE først identificeret: en med celler, der har et højt niveau af LC3 pletter og et med celler, der har et lavt niveau af LC3 pletter. High-LC3-spotpopulationen blev yderligere klassificeret i to populationer: celler med lav co-lokalisering ( dvs. akkumulering af autophagosomer) og celler med høj co-lokalisering ( dvs. akkumulering af autolysosomer). Dette bivariate plot tillader en at skelne mellem celler med meget få autophagosomer og celler med en akkumulering af autophagosomer og / eller autolysosomer 21 .
Indtil nu var den samtidige co-lokalisering af LC3, p62 og LAMP1 (lysosomal markør) ikke mulig ved anvendelse af en enkelt "Feature Type" i MIFC Companion Analysis Software (se Materialetabellen ). En ny funktion, der for nylig blev introduceret i version 6.1, kaldes dog Bright Detail Colocalization 3 (BDC3). BDC3 sammenligner de lyse detaljer billeder fra hver af de tre billeder (i dette tilfælde, LC3, p62 og LAMP1) og kvantificerer co-lokalisering af de tre prober ( dvs. LC3, p62 og LAMP1). BDC3-funktionen beregner Pearsons korrelationskoefficient, der er ændret til at omfatte tre billeder. Da lyspunkterne i de tre billeder enten er korrelerede eller ikke-korrelerede, varierer korrelationskoefficienten mellem 0 (ukorreleret) og 1 (perfekt korrelation). Koefficienten er log-transformeret til at øge det dynamiske interval mellem 0 og uendelig. Ved at slukke BDS-funktionen med BDC3-funktionen, analyseres analysemetoden, der er fremlagt af Rajan et al. Kan nu inkorporere de tre mest anvendte markører til måling af autofagi i et system på samme tid. Evnen til at lokalisere disse tre markører af autofagi i et enkelt assay kunne føre til ny viden om induktion og regulering af autofagi. Den følgende protokol beskriver trinene til at inducere autophagy i Jurkat-celler; Mærke cellerne med LC3-, p62- og LAMP1-antistoffer; Erhverve data på en multispEktral billeddannelses flow cytometer; Og analysere dataene til vurdering af autofagisk flux.
Ved udførelsen af denne analyse er der et par ting at overveje. Det er vigtigt at have passende kontrolprøver. Til dette eksperiment blev to forskellige kontroller brugt: Kontrol og kontrol + chlorokin. Kontrolprøven blev brugt til at indstille tærsklen for regionerne. Det repræsenterer det basale niveau af autofagi uden at stoppe lysosomal nedbrydning og er kontrollen for den sårede prøve. Kontrolprøven er imidlertid ikke en passende kontrol til at sammenligne med resultaterne fra Starved + Chloroquine-prøven, fordi chlorquin selv påvirker kontrolprøven. Derfor var det nødvendigt at have en Control + Chloroquine prøve.
Før du udfører en analyse for autofagi, er det vigtigt kun at analysere / gate på enkelte celler, der er i fokus ( dvs. gradient RMS større end 60), da resultaterne kan blive påvirket, hvis der er mere end en celle eller billederne er Ude af fokus. Det er afgørende at autophagosomEs og lysosomer er i fokus for korrekt spot tælling og BDC3 analyse. Apoptotiske celler skal fjernes forud for autophagy analyse, da de kan ske resultater og ikke medtages. Der bør være passende farvning for alle tre markører ( dvs. LC3, p62 og LAMP1). F.eks. Er alle tre markører intracellulære og skal have et punkteringssignal; Hvis signalet ikke punkterer, eller hvis det er på overfladen af cellen, ville farvningen ikke være passende, og eksperimentet / farvningen skal omdannes. For at BDC3 skal være præcis, er det desuden vigtigt at gate på celler, der er lyse for alle tre fluorescerende markører af interesse. Gating på positive begivenheder er nødvendig for at forhindre måling af BDC3 på ikke-specifik binding, billeddannende artefakter og / eller støj. Dette er afgørende, da BDC3 potentielt kan forstærke artefakter, der ikke er sande signaler. Da BDC3 kun kan udføres på lyse positive hændelser, er mange celler måske ikke inkluderet i den endelige analyse; Dette er isærI sandhed rigtig for kontrolceller, der ikke har nogen akkumulering af LC3, p62 og / eller LAMP1. En begrænsning af dette assay er således, at BDC3 kun undersøger celler, der er positive for alle tre markører, hvilket måske ikke er passende for alle autofagiske forsøg.
Ligesom BDS, som tidligere er blevet rapporteret 15 , 16 , 17 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 tager BDC3 alene ikke hensyn til antallet af autofagiske organeller, der co-lokaliserer, hvilket i høj grad resulterer Af variabilitet i antallet af autofagosomer. Derfor er den bivariate tilgang fremlagt af Rajan et al. Blev ansat. Ser man på de bivariate tomter, kan man spørge omCellerne skal være positive for LC3, p62 og LAMP1; Hvorfor er der så mange celler, der har 0 pletter? Dette skyldes, at LC3-signalet kan være lyst nok til co-lokalisering, men det kan muligvis ikke opfylde tærsklen fastsat af topmasken (Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4)), der er nødvendig for at den kan betragtes som en få øje på.
Protokollen, der blev præsenteret her, brugte MIFC til at tælle LC3 puncta og co-lokalisering af tre autophagy markører til måling af autophagic flux. Under basale betingelser (Kontrolprøve) var antallet af autofagosomer lavt, og få celler blev fundet med "High Spots." Med tilsætningen af chloroquin, som hæmmer autophagosom / lysosomfusion, var der en stigning i antallet af LC3 pletter. Da lysosomet ikke kan nedbryde autofagosomet og p62, som befinder sig i autophagosomet, fører det til en stigning i co-lokalisering af LC3-, p62- og LAMP1-autolysosomakkumuleringen. Denne virkning blev amplificeret under næringsstofstivelseIon, som inducerer autofagi. Imidlertid var der ingen signifikant stigning i antallet af autofagosomer uden tilsætning af chloroquin, sandsynligvis på grund af en stigning i autofagisk omsætning. Når celler blev sultet i nærværelse af chloroquin, var der en forøgelse af co-lokalisering og antal autofagosomer, hvilket understøtter konklusionen om, at sulten øger autofagisk flux. EBSS er kendt for at være en stærk inducer for autophagy. Det forventes derfor, at stigningen ville være stor. Hvis en anden metode, såsom lægemiddelinduktion, anvendes til at inducere autofagi, kan forskellen mellem kontrol og behandlede prøver være subtilere.
Denne særlige protokol blev designet til at måle autophagy i humane cellelinier, men analysen kunne tilpasses til andre arter ved at skifte til antistoffer for den pågældende art. Desuden kan analysemetoden anvendes til en hvilken som helst intracellulær anvendelse, der kræver co-lokaliseringAf tre prober / markører.
The authors have nothing to disclose.
Jeg vil gerne takke mine kolleger ved MilliporeSigma, Philip J. Morrissey og Sherree L. Friend, for deres støtte og vejledning gennem årene. Jeg vil også gerne takke Vidya Venkatachalam og Bryan R. Davidson for deres hjælp med BDC3 funktion i IDEAS softwaren, Ryan P. Jessup om hjælp redigering dette manuskript, Raymond Kong for at få hjælp på dagen for skydning, og en særlig tak Til makeup kunstner Cynthia Xamonthiene.
15 mL centrifuge tube | Falcon | 352096 | |
50 mL centrifuge tube | Falcon | 352070 | |
AF647 labeled Donkey anti-Mouse – IgG | Invitrogen | A-31571 | Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647. Concntration 2mg/mL. https://www.thermofisher.com/antibody/product/Donkey-anti-Mouse-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-31571 |
anti-human CD107a-PE (LAMP1) | BioLegend | 328607 | Clone H4A3. Concentration 400 µg/mL. http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html |
anti-human CD45- AF488 | BioLegend | 304017 | Clone HI30. http://www.biolegend.com/alexa-fluor-488-anti-human-cd45-antibody-2738.html |
anti-human CD45- PE | BioLegend | 304008 | Clone HI30. http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd45-antibody-708.html |
anti-human CD45-AF647 | BioLegend | 304018 | Clone HI30. http://www.biolegend.com/alexa-fluor-647-anti-human-cd45-antibody-2739.html |
Anti-LC3 (Human) mAb clone 4E12 | MBL International Corporation | M152-3 | Clone 4E+12. Concentration 2 mg/mL. https://www.mblintl.com/products/m152-3 |
Anti-SQSTM1 / p62 antibody [EPR4844] – Autophagosome Marker (Alexa Fluor 488) | abcam | ab185015 | Clone EPR4844. Concentration 0.5 mg/mL. http://www.abcam.com/sqstm1-p62-antibody-epr4844-autophagosome-marker-alexa-fluor-488-ab185015.html |
Chloroquine diphosphate Salt | Sigma-Aldrich | C6628-25G | |
Cleanser – Coulter Clenz | Beckman Coulter | 8546931 | Fill container with 200 mL of Cleanser. https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/ |
DAPI Stain 5mg/mL | MilliporeSigma | 508741 | http://www.emdmillipore.com/US/en/product/DAPI-Stain—CAS-28718-90-3—Calbiochem,EMD_BIO-508741 |
Debubbler – 70% Isopropanol | MilliporeSigma | 1.3704 | Fill container with 200 mL of Debubbler. http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 10X | MilliporeSigma | BSS-2010-B | Ca++Mg++ Free |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X | MilliporeSigma | BSS-1006-B | PBS Ca++Mg++ Free |
Earle's Balanced Salt Solution 1X | Gibco | 14155 | |
Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 | |
Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure | Polysciences, Inc. | 04018 | This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed. Irritating to the eyes, respiratory systems and skin. May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes. Potential cancer hazard. http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/ |
Hanks' Balanced Salt Solution 1X | Gibco | 14175 | |
Jurkat, Clone E6-1 (ATCC TIB-152) | ATCC | TIB-152 | https://www.atcc.org/products/all/TIB-152.aspx |
MEM Non-Essential Amino Acids 100X | HyClone | SH30238.01 | |
MIFC – ImageStreamX Mark II | MilliporeSigma | 100220 | A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405nm, 488nm, and 642nm lasers was used. http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006 |
MIFC analysis software – IDEAS 6.2 | MilliporeSigma | 100220 | The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII). IDEAS version 6.2 |
MIFC software – INSPIRE | MilliporeSigma | 100220 | This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII). INSPIRE version 200.1.388.0 |
PE anti-human CD107a (LAMP-1) Antibody clone H4A3 | BioLegend | 328608 | http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html |
Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100X | HyClone | SV30082.1 | |
Rinse – Ultrapure water or deionized water | NA | NA | You can use any ultrapure water or deionized water. Fill container with 900 mL of Rinse. |
RPMI-1640 Medium 1X | HyClone | SH30027.01 | |
Sheath – PBS | MilliporeSigma | BSS-1006-B | This is the same as Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X Ca++MG++ free. Fill container with 900mL of Sheath. |
Siliconized polypropylene microcentrifuge tubes | Fisherbrand | 02-681-320 | Fisherbran Siliconized Low-Retention Microcentrifuge Tubes 1.5 mL. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-siliconized-low-retention-microcentrifuge-tubes-8/p-193936 |
Sodium Pyruvate solution (100mM) | HyClone | SH30239.01 | |
Sterilizer – 0.4-0.7% Hypochlorite | VWR | JT9416-1 | This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water. Fill container with 200 mL of Sterilzer. |
System Calibration Reagent – SpeedBead | MilliporeSigma | 400041 | Each tube holds ~10 mL. https://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/support-training/XDqb.qB.wQMAAAFLBDUp.zHu,nav |
T75 flask | Falcon | 353136 | |
TRITON X-100, PROTEIN GRADE Detergent, 10% Solution, Sterile-Filtered | MilliporeSigma | 648463-50ML | http://www.emdmillipore.com/US/en/product/TRITON-X-100,-PROTEIN-GRADE-Detergent,-10%25-Solution,-Sterile-Filtered—CAS-9002-93-1—Calbiochem,EMD_BIO-648463 |
Water, Cell Culture Grade | HyClone | SH30529.03 |