Ici, la cytométrie de flux d'imagerie multispectrale avec une caractéristique analytique qui compare les images détaillées lumineuses de 3 marqueurs d'autophagie et qui quantifie leur co-localisation, ainsi que le comptage de points LC3, a été utilisée pour mesurer l'autophagie d'une manière objective, quantitative et statistiquement robuste.
L'autophagie est une voie catabolique dans laquelle des composants cellulaires normaux ou dysfonctionnels qui s'accumulent pendant la croissance et la différenciation sont dégradés via le lysosome et sont recyclés. Au cours de l'autophagie, la protéine LC3 cytoplasmique est lipidée et recrutée sur les membranes autophagosomales. L'autophagosome se fusionne alors avec le lysosome pour former l'autolysosome, où se produit la décomposition de la vésicule autophagose et son contenu. La protéine associée à l'ubiquitine p62, qui se lie à LC3, est également utilisée pour surveiller le flux autophagique. Les cellules subissant une autophagie devraient démontrer la co-localisation des marqueurs p62, LC3 et lysosomaux. La microscopie contre l'immunofluorescence a été utilisée pour identifier visuellement les molécules LC3 puncta, p62 et / ou les lysosomes par cellule. Cependant, une évaluation objective et statistiquement rigoureuse peut être difficile à obtenir. Pour surmonter ces problèmes, une cytométrie de flux d'imagerie multispectrale a été utilisée avec une caractéristique analytique qui compare le brillant deImages de queue de trois marqueurs d'autophagie (LC3, p62 et LAMP lysosomale) et quantifie leur co-localisation, en combinaison avec le comptage de points LC3 pour mesurer l'autophagie d'une manière objective, quantitative et statistiquement robuste.
La macroatophagie, appelée ci-après autophagie, est une voie catabolique dans laquelle des composants endommagés ou dysfonctionnels, des protéines à longue durée de vie et des organites sont dégradés via le lysosome et sont recyclés 1 . Autophagy est un processus dynamique et à plusieurs étapes impliquant la formation d'un autophagosome; La fusion de l'autophagone avec le lysosome, formant l'autolysosome; Et la dégradation du contenu de l'autolysosome 2 . Le marqueur biologique crucial utilisé pour identifier l'autophagie dans les systèmes de mammifères est la protéine 1A / 1B-chaîne légère 3 (LC3) associée aux microtubules, qui constitue la membrane autophagosomale. Au cours de l'autophagie, le LC3-1 cytosolique est conjugué à la phosphatidyléthanolamine pour former LC3-II; LC3-II est ensuite incorporé dans la membrane autophagosomale 3 . Un autre marqueur largement utilisé pour le flux autophagique est le récepteur d'autophagie séquestresome 1 (SQSTM1, p62) qui physiquement liNk freins autophagiques à la membrane autophagique 4 , 5 .
Les méthodes traditionnellement utilisées pour mesurer l'autophagie sont Western Blots et microscopie à fluorescence 7 . Cependant, aucune de ces méthodes n'est considérée comme la «norme-or», 2 , 6 car il existe des défis associés à ces deux techniques. Les transferts de Western ne donnent qu'une moyenne parce qu'ils utilisent un échantillon homogénat, de sorte que les observateurs ne peuvent pas voir ce qui se passe dans les cellules individuelles. D'autre part, la microscopie à fluorescence donne une information d'observateur au niveau d'une seule cellule, mais elle manque de capacités de débit, ce qui rend difficile l'obtention d'évaluations objectives et statistiquement rigoureuses. Au cours des dernières années, la mesure de LC3 et p62 par cytométrie de flux d'imagerie multispectrale (MIFC, voir la Table des matériaux ) a été en train de gagner en popuEn raison de son pouvoir quantitatif, de ses capacités élevées, de son potentiel de multiplexage et de sa capacité à imaginer chaque cellule. L'une des méthodes les plus utilisées pour mesurer l'autophagie à l'aide de MIFC, ainsi que son logiciel d'analyse complémentaire (voir la Table des matières ), est le comptage ponctuel de LC3 puncta ou autophagosomes 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 . Cependant, une augmentation des autophagosomes ne signifie pas nécessairement une augmentation de l'autophagie, car elle pourrait également représenter un blocage dans le processus 2 . Le renouvellement du LC3-II est un paramètre utile pour mesurer le flux autophagique en analysant les cellules en présence etAbsence d'inhibiteur de dégradation lysosomale, comme la chloroquine. La chloroquine inhibe la fusion de l'autophagosse au lysosome, permettant ainsi la quantification de la formation d'autophagonesome comme mesure du degré d'autophagie en arrêtant le flux autophagique avant que la dégradation lysosomale puisse se produire 18 . En outre, la p62 est dégradée principalement par autophagie, et si la dégradation lysosomale de l'autophagosome et son contenu est bloquée, une accumulation de p62 est attendue 17 , 19 .
Autophagy est un processus à plusieurs étapes, et la mesure de LC3 ou de p62 seule ne fournit pas une image complète de ce qui se passe dans les cellules. Des publications récentes ont souligné la nécessité d'examiner la formation simultanée de l'autolysosome 2 , 17 , 20 , 21 . MIFC estCapable de mesurer de manière unique la formation de l'autolysosome par imagerie de la co-localisation de l'autophagone au lysosome 15 – 17 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 . En outre, la co-localisation de p62 et LC3 utilisant MIFC a également été explorée pour mesurer le flux autophagique 5 . Dans le logiciel d'analyse référencé, la "fonctionnalité" qui mesure la co-localisation s'appelle "Bright Detail Similarity R3" (BDS) et a été spécialement conçue pour comparer les détails d'image petite et lumineuse de deux images. BDS est le coefficient de corrélation Pearson transformé en log de points lumineux localisés avec un rayon de 3 pixels ou moins; En d'autres termes, BDS calcule le degré deVerlapping pixels à partir de deux canaux fluorescents différents. Les points lumineux sont soit corrélés ( c.-à-d., Même emplacement spatial) ou non corrélés ( c'est-à-dire différents emplacements spatiaux). Par conséquent, le coefficient de corrélation varie entre 0 (non corrélé) et 1 (corrélation parfaite). Le coefficient est log-transformé pour augmenter la portée entre zéro et l'infini 26 , 27 . BDS seul peut ne pas être suffisant; Rajan et al. Ont constaté que l'utilisation uniquement de SDE pourrait entraîner des résultats faussement positifs ou faussement négatifs 21 . BDS évalue la co-localisation de deux marqueurs d'autophagie mais ne considère pas le nombre d'autophagosomes. Pour tenir compte du nombre d'autophagosomes, Rajan et al. Inclus le comptage local de la LC3 puncta 21 . Rajan et al. Proposé en utilisant un diagramme de dispersion bivariée du nombre de points LC3 par rapport aux SDE. À l'aide de ce complot bivarié, deux populationsE identifié pour la première fois: un avec des cellules présentant un niveau élevé de taches de LC3 et une avec des cellules présentant un faible niveau de taches de LC3. La population de points LC3 a été classée en deux populations: les cellules ayant une faible localisation ( c. -à- d. L' accumulation d'autophagosomes) et les cellules ayant une co-localisation élevée ( c. -à- d. L' accumulation d'autolysosomes). Cette parcelle bivariée permet de distinguer les cellules avec très peu d'autophagosomes et de cellules avec une accumulation d'autophagosomes et / ou d'autolysosomes 21 .
Jusqu'à présent, la co-localisation simultanée de LC3, p62 et LAMP1 (marqueur lysosomale) n'était pas possible en utilisant un seul «Type d'entité» dans le logiciel d'analyse complémentaire MIFC (voir la Table des matières ). Cependant, une nouvelle fonctionnalité, récemment introduite dans la version 6.1, s'appelle Bright Detail Colocalization 3 (BDC3). BDC3 compare les images détaillées lumineuses de chacune des trois images (dans ce cas LC3, p62 et LAMP1) et quantifie la co-localisation des trois sondes ( c.-à-d. LC3, p62 et LAMP1). La fonction BDC3 calcule le coefficient de corrélation de Pearson modifié pour s'étendre à trois images. Étant donné que les points lumineux des trois images sont corrélés ou non corrélés, le coefficient de corrélation varie entre 0 (non corrélé) et 1 (corrélation parfaite). Le coefficient est log-transformé pour augmenter la plage dynamique entre 0 et l'infini. En décalant la fonctionnalité BDS avec la fonctionnalité BDC3, la méthode d'analyse présentée par Rajan et al. Peuvent maintenant incorporer les trois marqueurs les plus utilisés pour mesurer l'autophagie dans un même système en même temps. La capacité de co-localiser ces trois marqueurs d'autophagie dans un seul essai pourrait conduire à de nouvelles idées sur l'induction et la régulation de l'autophagie. Le protocole suivant décrit les étapes pour induire l'autophagie dans les cellules Jurkat; Étiqueter les cellules avec des anticorps LC3, p62 et LAMP1; Acquérir des données sur un multispCytomètre de flux d'imagerie ectral; Et analyser les données pour évaluer le flux autophagique.
Lorsque vous effectuez cette analyse, il y a quelques points à considérer. Il est important d'avoir des échantillons de contrôle appropriés. Pour cette expérience, deux contrôles différents ont été utilisés: Control and Control + Chloroquine. L'échantillon de contrôle a été utilisé pour définir le seuil pour les régions. Il représente le niveau basal de l'autophagie sans arrêter la dégradation lysosomale et est le contrôle de l'échantillon mort. Cependant, l'échantillon de contrôle n'est pas un contrôle approprié pour comparer avec les résultats de l'échantillon Starved + Chloroquine car la chloroquine influe lui-même sur l'échantillon témoin. Par conséquent, il fallait avoir un échantillon Control + Chloroquine.
Avant d'effectuer toute analyse pour l'autophagie, il est important d'analyser uniquement les cellules individuelles qui sont concentrées ( c'est-à-dire un gradient RMS supérieur à 60), car les résultats pourraient être affectés s'il y a plus d'une cellule ou que les images sont flou. Il est crucial que l'autophagosomEs et les lysosomes sont concentrés pour un comptage local correct et une analyse BDC3. Les cellules apoptotiques doivent être enlevées avant l'analyse autophagique, car elles peuvent fausser les résultats et ne doivent pas être incluses. Il devrait y avoir une coloration appropriée pour les trois marqueurs ( c.-à-d., LC3, p62 et LAMP1). Par exemple, les trois marqueurs sont intracellulaires et devraient avoir un signal ponctuel; Si le signal n'est pas ponctuel, ou s'il se trouve à la surface de la cellule, la coloration ne convient pas et l'expérience / la coloration doit être refaite. En outre, pour BDC3 pour être précis, il est essentiel de passer des cellules brillantes pour les trois marqueurs fluorescents d'intérêt. L'activation des événements positifs est nécessaire pour empêcher la mesure de BDC3 sur les liaisons non spécifiques, les artefacts d'image et / ou le bruit. Ceci est crucial, car BDC3 peut potentiellement amplifier des artefacts qui ne sont pas des signaux vrais. Étant donné que BDC3 ne peut être effectué que sur des événements lumineux positifs, de nombreuses cellules peuvent ne pas être incluses dans l'analyse finale; Ceci est especPour les cellules témoins qui n'ont pas d'accumulation de LC3, p62 et / ou LAMP1. Ainsi, une limitation de ce dosage est que BDC3 examine uniquement les cellules positives pour les trois marqueurs, ce qui pourrait ne pas convenir à toutes les expériences d'autophagie.
Comme BDS, qui a été précédemment rapporté 15 , 16 , 17 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , BDC3 seul ne tient pas compte du nombre d'organelles autophagiques qui co-localisent, ce qui entraîne un degré élevé De la variabilité du nombre d'autophagosomes. Par conséquent, l'approche bivariée présentée par Rajan et al. était employé. En regardant les parcelles bivariées, on pourrait se demander siLes cellules doivent être positives pour LC3, p62 et LAMP1; Pourquoi y a-t-il tant de cellules qui ont 0 points? Ceci est dû au fait que le signal LC3 pourrait être assez lumineux pour la co-localisation, mais il pourrait ne pas respecter le seuil défini par le masque de crête (Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4)) nécessaire pour être considéré comme un place.
Le protocole présenté ici a utilisé MIFC pour compter LC3 puncta et la co-localisation de trois marqueurs autophagiques pour mesurer le flux autophagique. Dans les conditions basales (échantillon témoin), le nombre d'autophagosomes était faible et peu de cellules ont été trouvées avec des "points élevés". Avec l'addition de la chloroquine, qui inhibe la fusion autophagosomère / lysosome, il y a eu une augmentation du nombre de points LC3. Puisque le lysosome est incapable de décomposer l'autophagosome et le p62, qui réside dans l'autophagone, cela entraîne une augmentation de la co-localisation de l'accumulation d'autolysosomes LC3, P62 et LAMP1. Cet effet a été amplifié sous l'effet de l'étoile en éléments nutritifsIon, ce qui induit l'autophagie. Cependant, sans l'ajout de chloroquine, il n'y a pas eu d'augmentation significative du nombre d'autophagosomes, probablement en raison d'une augmentation du taux de renouvellement autophagique. Lorsque les cellules ont été affamées en présence de chloroquine, il y a eu une augmentation de la localisation et du nombre d'autophagosomes, ce qui permet de conclure que la famine augmente le flux autophagique. EBSS est connu pour être un inducteur puissant d'autophagie. Par conséquent, on s'attend à ce que l'augmentation soit importante. Si une autre méthode, telle que l'induction du médicament, est utilisée pour induire une autophagie, la différence entre le contrôle et les échantillons traités peut être plus subtile.
Ce protocole particulier a été conçu pour mesurer l'autophagie dans les lignées cellulaires humaines, mais le dosage pourrait être adapté à d'autres espèces en passant à des anticorps pour cette espèce particulière. De plus, la méthode d'analyse pourrait être utilisée pour toute application intracellulaire nécessitant une co-localisationDe trois sondes / marqueurs.
The authors have nothing to disclose.
J'aimerais remercier mes collègues de MilliporeSigma, Philip J. Morrissey et Sherree L. Friend, pour leur soutien et leur orientation au cours des années. Je voudrais également remercier Vidya Venkatachalam et Bryan R. Davidson pour leur aide avec la fonctionnalité BDC3 dans le logiciel IDEAS , Ryan P. Jessup pour l'aide pour l'édition de ce manuscrit, Raymond Kong pour l'aide le jour du tournage et un merci spécial Au maquilleur Cynthia Xamonthiene.
15 mL centrifuge tube | Falcon | 352096 | |
50 mL centrifuge tube | Falcon | 352070 | |
AF647 labeled Donkey anti-Mouse – IgG | Invitrogen | A-31571 | Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647. Concntration 2mg/mL. https://www.thermofisher.com/antibody/product/Donkey-anti-Mouse-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-31571 |
anti-human CD107a-PE (LAMP1) | BioLegend | 328607 | Clone H4A3. Concentration 400 µg/mL. http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html |
anti-human CD45- AF488 | BioLegend | 304017 | Clone HI30. http://www.biolegend.com/alexa-fluor-488-anti-human-cd45-antibody-2738.html |
anti-human CD45- PE | BioLegend | 304008 | Clone HI30. http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd45-antibody-708.html |
anti-human CD45-AF647 | BioLegend | 304018 | Clone HI30. http://www.biolegend.com/alexa-fluor-647-anti-human-cd45-antibody-2739.html |
Anti-LC3 (Human) mAb clone 4E12 | MBL International Corporation | M152-3 | Clone 4E+12. Concentration 2 mg/mL. https://www.mblintl.com/products/m152-3 |
Anti-SQSTM1 / p62 antibody [EPR4844] – Autophagosome Marker (Alexa Fluor 488) | abcam | ab185015 | Clone EPR4844. Concentration 0.5 mg/mL. http://www.abcam.com/sqstm1-p62-antibody-epr4844-autophagosome-marker-alexa-fluor-488-ab185015.html |
Chloroquine diphosphate Salt | Sigma-Aldrich | C6628-25G | |
Cleanser – Coulter Clenz | Beckman Coulter | 8546931 | Fill container with 200 mL of Cleanser. https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/ |
DAPI Stain 5mg/mL | MilliporeSigma | 508741 | http://www.emdmillipore.com/US/en/product/DAPI-Stain—CAS-28718-90-3—Calbiochem,EMD_BIO-508741 |
Debubbler – 70% Isopropanol | MilliporeSigma | 1.3704 | Fill container with 200 mL of Debubbler. http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 10X | MilliporeSigma | BSS-2010-B | Ca++Mg++ Free |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X | MilliporeSigma | BSS-1006-B | PBS Ca++Mg++ Free |
Earle's Balanced Salt Solution 1X | Gibco | 14155 | |
Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 | |
Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure | Polysciences, Inc. | 04018 | This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed. Irritating to the eyes, respiratory systems and skin. May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes. Potential cancer hazard. http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/ |
Hanks' Balanced Salt Solution 1X | Gibco | 14175 | |
Jurkat, Clone E6-1 (ATCC TIB-152) | ATCC | TIB-152 | https://www.atcc.org/products/all/TIB-152.aspx |
MEM Non-Essential Amino Acids 100X | HyClone | SH30238.01 | |
MIFC – ImageStreamX Mark II | MilliporeSigma | 100220 | A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405nm, 488nm, and 642nm lasers was used. http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006 |
MIFC analysis software – IDEAS 6.2 | MilliporeSigma | 100220 | The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII). IDEAS version 6.2 |
MIFC software – INSPIRE | MilliporeSigma | 100220 | This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII). INSPIRE version 200.1.388.0 |
PE anti-human CD107a (LAMP-1) Antibody clone H4A3 | BioLegend | 328608 | http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html |
Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100X | HyClone | SV30082.1 | |
Rinse – Ultrapure water or deionized water | NA | NA | You can use any ultrapure water or deionized water. Fill container with 900 mL of Rinse. |
RPMI-1640 Medium 1X | HyClone | SH30027.01 | |
Sheath – PBS | MilliporeSigma | BSS-1006-B | This is the same as Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X Ca++MG++ free. Fill container with 900mL of Sheath. |
Siliconized polypropylene microcentrifuge tubes | Fisherbrand | 02-681-320 | Fisherbran Siliconized Low-Retention Microcentrifuge Tubes 1.5 mL. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-siliconized-low-retention-microcentrifuge-tubes-8/p-193936 |
Sodium Pyruvate solution (100mM) | HyClone | SH30239.01 | |
Sterilizer – 0.4-0.7% Hypochlorite | VWR | JT9416-1 | This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water. Fill container with 200 mL of Sterilzer. |
System Calibration Reagent – SpeedBead | MilliporeSigma | 400041 | Each tube holds ~10 mL. https://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/support-training/XDqb.qB.wQMAAAFLBDUp.zHu,nav |
T75 flask | Falcon | 353136 | |
TRITON X-100, PROTEIN GRADE Detergent, 10% Solution, Sterile-Filtered | MilliporeSigma | 648463-50ML | http://www.emdmillipore.com/US/en/product/TRITON-X-100,-PROTEIN-GRADE-Detergent,-10%25-Solution,-Sterile-Filtered—CAS-9002-93-1—Calbiochem,EMD_BIO-648463 |
Water, Cell Culture Grade | HyClone | SH30529.03 |