यहां, एक विश्लेषणात्मक विशेषता के साथ बहु-स्तरीय इमेजिंग फ्लो साइटोमेट्री जो 3 भोजी मार्करों की उज्ज्वल विस्तृत छवियों की तुलना करती है और एलसी 3 स्पॉट काउंटींग के साथ-साथ उनके सह-स्थानीयकरण का मात्रामान करती है, एक उद्देश्य, मात्रात्मक और सांख्यिकीय रूप से मजबूत तरीके से भोजी को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया था।
आटोफ़ाजी एक अपाचे पथ है जिसमें सामान्य या बेकार सेलुलर घटकों जो वृद्धि और भेदभाव के दौरान जमा होती हैं, लियोसोम के माध्यम से अपमानित होती हैं और पुनर्नवीनीकरण की जाती हैं। भोजी के दौरान, साइटोप्लाज्मिक एलसी 3 प्रोटीन लिपिडेटेड है और ऑटोफॉगोसॉमल झिल्ली को भर्ती किया जाता है। Autophagosome तो lysosome साथ फ़्यूज़ autolysosome बनाने के लिए, जहां autophagosome पुटिका और इसकी सामग्री का टूटना होता है। Ubiquitin- जुड़े प्रोटीन पी 62, जो एलसी 3 से जुड़ा हुआ है, का उपयोग आक्सीकारक फ्लक्स की निगरानी के लिए भी किया जाता है। भोजीभन के माध्यम से चलने वाली कोशिकाओं को पी 62, एलसी 3, और लाइसोसोमल मार्कर के सह-स्थानीयकरण का प्रदर्शन करना चाहिए। इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का इस्तेमाल प्रति सेल के आधार पर एलसी 3 पॉंक्टा, पी 62, और / या लियोसोमों की पहचान करने के लिए किया गया है। हालांकि, एक उद्देश्य और सांख्यिकीय रूप से कठोर मूल्यांकन प्राप्त करना कठिन हो सकता है इन समस्याओं पर काबू पाने के लिए, बहुआयामी इमेजिंग प्रवाह cytometry का प्रयोग एक विश्लेषणात्मक सुविधा के साथ किया गया था जो कि चमकदार डे की तुलना करता हैतीन फार्मेसी मार्करों (एलसी 3, पी 62 और लियोसोम्मल एलएएमपी 1) की पूंछ चित्रों और उद्देश्य, मात्रात्मक, और सांख्यिकीय रूप से मजबूत तरीके से भोजी को मापने के लिए एलसी 3 स्पॉट गणना के संयोजन के साथ, उनके सह-स्थानीयकरण का मात्रा बढ़ाता है।
मैक्रोउोटोफैजी, जिसे बाद में आटोफॉजी कहा जाता है, एक अपाचे पथ है जिसमें क्षतिग्रस्त या बेकार घटक, दीर्घकालिक प्रोटीन और ऑर्गेनल्स को लियोसोम के माध्यम से अपमानित किया जाता है और पुनर्नवीनीकरण 1 होता है । भोजी एक गतिशील, मल्टीस्टिप प्रक्रिया है जिसमें एक ऑटोफॉगोओसोम का गठन होता है; लियोसोम के साथ autophagosome के संलयन, autolysosome बनाने; और autolysosome 2 की सामग्री के क्षरण स्तनधारी प्रणालियों में फार्मेसी की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जाने वाला महत्वपूर्ण जैविक मार्कर माइक्रोट्यूब्यूले से जुड़े प्रोटीन 1 ए / 1 बी-लाइट चेन 3 (एलसी 3) है, जो ऑटोफॉगोसॉमल झिल्ली बनाता है। भोजी के दौरान, साइटोसोलिक एलसी 3-1 एलसी 3-II बनाने के लिए फॉस्फेटिडेलेथेनॉलमाइन को संयुग्मित किया जाता है; एलसी 3-द्वितीय को फिर से ऑटोग्राजासोमल झिल्ली 3 में शामिल किया जाता है ऑटोग्राजिक फ्लक्स के लिए एक और व्यापक रूप से इस्तेमाल किया मार्कर ऑटोजी रिसेप्टर सीक्वेस्टोमोम 1 (एसकेएसटीएम 1, पी 62) है जो शारीरिक रूप से ली गई हैAutophagic झिल्ली 4 , 5 में nks autophagic कार्गो
पारस्परिक रूप से फार्मेसी को मापने के लिए उपयोग किए जाने वाले तरीके पश्चिमी ब्लोट्स और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी 7 हैं । हालांकि, इन दोनों तरीकों को "सोना मानक" माना जाता है, 2 , 6 क्योंकि इन दोनों तकनीकों से जुड़े चुनौतियां हैं पश्चिमी ब्लॉट केवल एक औसतन देते हैं क्योंकि वे एक समरूप नमूना का उपयोग करते हैं, इसलिए पर्यवेक्षक यह नहीं देख सकते कि व्यक्तिगत कोशिकाओं में क्या हो रहा है। दूसरी ओर, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी एकल-सेल स्तर पर एक पर्यवेक्षक जानकारी देता है, लेकिन इसमें थ्रुपुट क्षमताओं की कमी होती है, जिससे उद्देश्य और सांख्यिकीय रूप से कठोर मूल्यांकन प्राप्त करना मुश्किल हो जाता है। हाल के वर्षों में, बहुआयामी इमेजिंग प्रवाह cytometry (एमआईपी, सामग्री की तालिका देखें) द्वारा एलसी 3 और पी 62 का माप पॉपु को प्राप्त कर रहा हैइसकी मात्रात्मक शक्ति, उच्च क्षमता के कारण, बहुसंकेतन क्षमता, और हर कोशिका को चित्रित करने की क्षमता के कारण लारीता एमआईपी के उपयोग से फास्टफोजी को मापने के लिए सर्वाधिक व्यापक रूप से इस्तेमाल किए जाने वाले तरीकों में से एक, इसके साथी विश्लेषण सॉफ्टवेयर ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ, एलसी 3 पॉन्काटा या ऑटोफॉगोओसोम 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 की जगह की गणना के माध्यम से है। , 15 , 16 , 17 हालांकि, ऑटोफॉगोओसोम में वृद्धि का मतलब यह नहीं है कि भोजी में वृद्धि हुई है, क्योंकि यह प्रक्रिया 2 में नाकाबंदी का प्रतिनिधित्व कर सकती है। एलसी 3-द्वितीय कारोबार उपस्थिति में कोशिकाओं का विश्लेषण करके आंशिक प्रवाह को मापने के लिए एक उपयोगी पैरामीटर हैएक लियोसोमल डिग्रेडेशन अवरोधक की अनुपस्थिति, जैसे क्लोरोक्वाइन। क्लोरोक्विन लाइयोसोम में ऑटिफेगोसोम के संलयन को रोक देता है, जिससे लाइसोजोमल डिग्रेडेशन 18 से पहले ऑटोग्राजिक फ्लक्स को गिरफ्तार करके आंतों की डिग्री के रूप में ऑटिग्रोगोसोम गठन की मात्रा को अनुमति दी जा सकती है। इसके अलावा, पी 62 मुख्य रूप से भोजी द्वारा अवगुणित हो गया है, और यदि आटोफॉगोसोम के लियोसोमल डिग्रेडेशन और इसकी सामग्री को अवरुद्ध कर दिया गया है, तो पी 62 का संचय 17 , 1 9 की अपेक्षा है।
भोजी एक बहुस्तृत प्रक्रिया है, और अकेले एलसी 3 या पी 62 का माप केवल कोशिकाओं में क्या हो रहा है की पूरी तस्वीर नहीं प्रदान करता है। हाल के प्रकाशनों ने ऑटोोलिओसोम 2 , 17 , 20 , 21 के समवर्ती गठन की जांच करने की आवश्यकता पर जोर दिया है। एमआईपी है17, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 – विशिष्ट लाइसोसोम से 15 autophagosome के सह स्थानीयकरण इमेजिंग द्वारा autolysosome के गठन को मापने में सक्षम। इसके अलावा, एमओपी का उपयोग कर पी 62 और एलसी 3 के सह-स्थानीयकरण का भी पता चला है कि ऑटोग्राजिक फ्लक्स 5 को मापने के लिए संदर्भित विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में "सुविधा" जो सह-स्थानीयकरण को उपायों को "उज्ज्वल विस्तार समानता आर 3" (बीडीएस) कहते हैं और विशेष रूप से दो छवियों के छोटे, उज्ज्वल छवि विवरण की तुलना करने के लिए डिज़ाइन किया गया था। बीडीएस 3-पिक्सल या उससे कम के दायरे वाले स्थानीयकृत उज्ज्वल स्पॉटों के लॉग-ट्रांसज्ज्ज्ड पियरसन के सहसंबंध गुणांक है; दूसरे शब्दों में, बीडीएस ओ की डिग्री की गणना करता हैदो अलग-अलग फ्लोरोसेंट चैनलों से सपोर्टिंग पिक्सेल उज्ज्वल स्पॉट या तो सहसंबंधित होते हैं ( यानी, एक ही स्थानिक स्थान) या असंगठित ( यानी, विभिन्न स्थानिक स्थान)। इसलिए, सहसंबंध गुणांक 0 (असंबद्ध) और 1 (पूर्ण सहसंबंध) के बीच भिन्न होता है। गुणांक शून्य और अनन्तता 26 , 27 के बीच सीमा को बढ़ाने के लिए लॉग-ट्रांसफ़ॉर्म किया गया है। केवल बीडीएस पर्याप्त नहीं हो सकते हैं; राजन एट अल पाया गया कि केवल बीडीएस का उपयोग करने से झूठी सकारात्मक या झूठी नकारात्मक परिणाम 21 हो सकता है । बीडीएस भोजी के दो मार्करों के सह-स्थानीयकरण का मूल्यांकन करता है, लेकिन ऑटिफेगोसोम की संख्या पर विचार नहीं करता है ऑटोफॉगोओसोम्स की संख्या के लिए खाता, राजन एट अल एलसी 3 के 21 अंक की स्पॉट-गिनती भी शामिल है राजन एट अल एलसी 3 स्पॉट काउंटी बनाम बीडीएस का एक बिवेरेट स्कैटर प्लॉट का उपयोग करने का प्रस्ताव इस बिविकेट प्लॉट का उपयोग करना, दो जनसंख्या वालेई पहले की पहचान की: एक कोशिका के साथ जो उच्च स्तर के एलसी 3 स्पॉट और एक कोशिका है जिसमें कम स्तर का एलसी 3 स्पॉट होता है। कम सह स्थानीयकरण (यानी, autophagosomes का संचय) और कोशिकाओं उच्च सह स्थानीयकरण (यानी, autolysosomes का संचय) के साथ साथ कोशिकाओं: उच्च LC3 स्थान जनसंख्या आगे दो आबादी में वर्गीकृत किया गया था। इस बिविकेट प्लॉट से कोशिकाओं के बीच बहुत अंतरफोजोसोम और कोशिकाओं के बीच भेद करने की सुविधा मिलती है, जो कि ऑटोफॉगोओसोम और / या ऑटोोलोसोसोम 21 के संग्रह के साथ होती हैं।
अब तक, एमसीईसी सहयोगी विश्लेषण सॉफ्टवेयर ( सामग्री की तालिका देखें) में एकल "सुविधा प्रकार" का उपयोग करके एलसी 3, पी 62 और एलएएमपी 1 (लियोसोमल मार्कर) के एक साथ सह-स्थानीयकरण संभव नहीं था। हालांकि, एक नया फीचर, जिसे हाल ही में संस्करण 6.1 में पेश किया गया है, को ब्राइट डिक्शन कॉलोकलाइजेशन 3 (बीडीसी 3) कहा जाता है। बीडीसी 3 की तीन छवियों में से प्रत्येक की उज्ज्वल विस्तृत छवियों की तुलना करती है (इस मामले में, एलसी3, पी 62, और एलएएमपी 1) और तीन जांचों ( यानी, एलसी 3, पी 62, और एलएएमपी 1) के सह-स्थानीयकरण को मात्राबद्ध करता है। बीडीसी 3 की सुविधा पीयरसन के सहसंबंध गुणांक को तीन छवियों तक विस्तारित करने के लिए संशोधित करता है। चूंकि तीन छवियों में उज्ज्वल स्पॉट्स या तो सहसंबद्ध या असंसठित होते हैं, सहसंबंध गुणांक 0 (असंबद्ध) और 1 (पूर्ण सहसंबंध) के बीच भिन्न होता है। गुणांक 0 और अनंत के बीच गतिशील रेंज को बढ़ाने के लिए लॉग-ट्रांसफ़ॉर्म किया गया है। बीडीसी 3 सुविधा के साथ बीडीएस सुविधा को बदलकर, राजन एट अल द्वारा प्रस्तुत विश्लेषण विधि एक ही समय में एक प्रणाली में भोजी को मापने के लिए अब तीन सबसे अधिक उपयोग किए गए मार्करों को शामिल कर सकते हैं। एक एकल परख के इन तीन मार्करों को सह-स्थानीयकरण करने की क्षमता के कारण प्रेरण और भोजी के विनियमन में उपन्यास अंतर्दृष्टि हो सकती है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल जर्कट कोशिकाओं में भोजी को प्रेरित करने के लिए कदम की रूपरेखा; एलसी 3, पी 62, और एलएएमपी 1 एंटीबॉडी वाले कोशिकाओं को लेबल करें; एक multisp पर डेटा प्राप्त करेंइक्ट्र्रल इमेजिंग प्रवाह cytometer; और आंशिक फ्लक्स का आकलन करने के लिए डेटा का विश्लेषण करें।
इस विश्लेषण के दौरान, विचार करने के लिए कुछ चीजें हैं। उचित नियंत्रण नमूने होना महत्वपूर्ण है इस प्रयोग के लिए, दो अलग-अलग नियंत्रणों का इस्तेमाल किया गया: नियंत्रण और नियंत्रण + क्लोरोक्वीन। नियंत्रण नमूना क्षेत्रों के लिए सीमा निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। यह लियोसोमल डिग्रेडेशन को रोकते बिना भोजी के मूल स्तर का प्रतिनिधित्व करता है और भूरा नमूना के लिए नियंत्रण है। हालांकि, नियंत्रण नमूना भूखे + क्लोरोक्वाइन नमूने से परिणाम के साथ तुलना करने के लिए एक उचित नियंत्रण नहीं है क्योंकि क्लोरोक्विन स्वयं नियंत्रण नमूना को प्रभावित करता है। इसलिए, नियंत्रण होना आवश्यक था + क्लोरोक्वाइन नमूना।
भोजी के लिए कोई विश्लेषण करने से पहले, केवल एकल कोशिकाओं पर फ़ोकस ( यानी, ढाल आरएमएस, 60 से अधिक) पर विश्लेषण करना / गेट करना महत्वपूर्ण है, क्योंकि परिणाम एक से अधिक सेल या छवियों से प्रभावित हो सकते हैं ओझल। यह महत्वपूर्ण है कि autophagosomईएस और लियोसोमस उचित स्थान की गिनती और बीडीसी 3 विश्लेषण के लिए ध्यान केंद्रित कर रहे हैं। अपोपाटिक कोशिकाओं को भोजी विश्लेषण से पहले हटाया जाना चाहिए, क्योंकि वे परिणामों को तिरछा कर सकते हैं और उन्हें शामिल नहीं किया जाना चाहिए। सभी तीन मार्करों के लिए उचित धुंधला होना चाहिए ( यानी, एलसी 3, पी 62, और एलएएमपी 1)। उदाहरण के लिए, सभी तीन मार्करें अंतःस्रावीय होती हैं और उन्हें एक विराम संकेत होना चाहिए; अगर सिग्नल ठीक नहीं है, या यह सेल की सतह पर है, तो धुंधला हो जाना उचित नहीं होगा और प्रयोग / धुंधला को फिर से बदला जाना चाहिए। इसके अलावा, बीडीसी 3 के लिए सटीक होना, ब्याज के सभी तीन फ्लोरोसेंट मार्करों के लिए चमकदार कोशिकाओं पर द्वार के लिए आवश्यक है। गैर-विशिष्ट बाध्यकारी, इमेजिंग कलाकृतियों, और / या शोर पर बीडीसी 3 के माप को रोकने के लिए सकारात्मक घटनाओं पर ध्यान देने की आवश्यकता है। यह महत्वपूर्ण है, क्योंकि बीडीसी 3 संभावित रूप से कलाकृतियों को बढ़ाना कर सकता है जो सही संकेत नहीं हैं। चूंकि बीडीसी 3 केवल उज्ज्वल सकारात्मक घटनाओं पर ही प्रदर्शन किया जा सकता है, इसलिए कई कोशिकाओं को अंतिम विश्लेषण में शामिल नहीं किया जा सकता है; यह espec हैनियंत्रण कोशिकाओं के लिए सही है जो कि एलसी 3, पी 62 और / या एलएएमपी 1 के कोई संचय नहीं है। इस प्रकार, इस परख की एक सीमा यह है कि बीडीसी 3 केवल उन तीनों मार्करों के लिए पॉजिटिव सकारात्मक कोशिकाओं की जांच करता है, जो सभी भोजी प्रयोगों के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है।
बीडीएस की तरह, जिसे पहले 15 , 16 , 17 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , बीडीसी 3 की सूचना दी गई है, वह अकेली स्थानीयकृत अंगों की संख्या को ध्यान में नहीं रखता है, जिसके परिणामस्वरूप एक बड़ी डिग्री Autophagosomes की संख्या में परिवर्तनशीलता की। इसलिए, राजीव एट अल द्वारा प्रस्तुत द्विवार्षिक दृष्टिकोण नौकरी कर रहा था। द्विवार्षिक भूखंडों को देखते हुए, कोई पूछ सकता है कि क्याकोशिकाओं को एलसी 3, पी 62 और एलएएमपी 1 के लिए सकारात्मक होना चाहिए; क्यों इतने सारे कक्ष हैं जिनके पास 0 स्पॉट हैं? इसका कारण यह है कि एलसी 3 संकेत सह-स्थानीयकरण के लिए काफी उज्ज्वल हो सकता है, लेकिन यह चोटी मुखौटा (पीक (एम 11, सीएच -11-एलसी -3-एएफ 647, ब्राइट, 4)) द्वारा निर्धारित थ्रेशोल्ड को पूरा नहीं कर सकता है क्योंकि इसके लिए एक मौके।
यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल ने LC3 puncta को गणना करने के लिए MIFC का उपयोग किया और स्वस्थ फैलाव को मापने के लिए तीन भोजी मार्करों के सह-स्थानीयकरण का उपयोग किया। मूल स्थितियों (नियंत्रण नमूना) के तहत, ऑटोफॉगोओसोम की संख्या कम थी, और कुछ कोशिकाओं को "उच्च स्पॉट" के साथ मिला। क्लोरोक्वाइन के अलावा, जो ऑटिफेगोसोम / लाइसोसोम फ्यूजन को रोकता है, वहां एलसी 3 स्पॉट की संख्या में वृद्धि हुई थी। चूंकि लियोसोम ऑटोफेगोसोम और पी 62 को तोड़ने में असमर्थ है, जो ऑटिफ़ोगोसोम में रहता है, इसने एलसी 3, पी 62 और एलएएमपी 1 के ऑटोलिसोसोम संचय के सह-स्थानीयकरण में वृद्धि की ओर बढ़ता है। इस आशय को पोषक तत्व सितारावाट के तहत बढ़ाया गया थाआयन, जो भोजी लाती है हालांकि, क्लोरोक्वाइन के अलावा, autophagosomes की संख्या में कोई महत्वपूर्ण वृद्धि नहीं हुई थी, सबसे अधिक संभावना है कि ऑटोफैजिक टर्नओवर की दर में वृद्धि हुई है। जब क्लोरोक्वाइन की उपस्थिति में कोशिकाओं को भूख लगी, सह-स्थानीयकरण और ऑटोफॉगोओसोम की संख्या में वृद्धि हुई थी, जो इस निष्कर्ष का समर्थन करता है कि भूख से स्वस्थ फैलाव बढ़ जाता है। EBSS भोजी के एक शक्तिशाली inducer के रूप में जाना जाता है इसलिए, यह उम्मीद है कि वृद्धि बड़ी होगी अगर एक अन्य विधि, जैसे दवा प्रेरण, का प्रयोग भोजी को प्रेरित करने के लिए किया जाता है, तो नियंत्रण और इलाज के नमूने के बीच का अंतर सूक्ष्म हो सकता है।
यह विशेष प्रोटोकॉल मानव कोशिका लाइनों में भोजी को मापने के लिए डिज़ाइन किया गया था, लेकिन इस परख उस विशेष प्रजाति के लिए एंटीबॉडी पर स्विच करके अन्य प्रजातियों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इसके अलावा, किसी भी इंट्रासेल्युलर एप्लिकेशन के लिए विश्लेषण विधि का उपयोग किया जा सकता है जिसके लिए सह-स्थानीयकरण की आवश्यकता होती हैतीन जांच / मार्करों का
The authors have nothing to disclose.
मैं मिलिपोर सिग्मा, फिलिप जे। मॉरसेसे और शेर्री एल मित्र पर अपने सहकर्मियों का आभार व्यक्त करना चाहता हूं, जिनके वर्षों में उनके समर्थन और मार्गदर्शन के लिए। मैं भी विचारों सॉफ्टवेयर में BDC3 सुविधा के साथ उनकी मदद के लिए विद्या वेंकटचलम और ब्रायन आर डेविडसन का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं, इस पांडुलिपि संपादन मदद के लिए रयान पी जेसप, रेमंड काँग शूटिंग के दिन पर मदद, और एक विशेष के लिए धन्यवाद श्रृंगार कलाकार सिंथिया एक्समोन्थिएन
15 mL centrifuge tube | Falcon | 352096 | |
50 mL centrifuge tube | Falcon | 352070 | |
AF647 labeled Donkey anti-Mouse – IgG | Invitrogen | A-31571 | Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647. Concntration 2mg/mL. https://www.thermofisher.com/antibody/product/Donkey-anti-Mouse-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-31571 |
anti-human CD107a-PE (LAMP1) | BioLegend | 328607 | Clone H4A3. Concentration 400 µg/mL. http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html |
anti-human CD45- AF488 | BioLegend | 304017 | Clone HI30. http://www.biolegend.com/alexa-fluor-488-anti-human-cd45-antibody-2738.html |
anti-human CD45- PE | BioLegend | 304008 | Clone HI30. http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd45-antibody-708.html |
anti-human CD45-AF647 | BioLegend | 304018 | Clone HI30. http://www.biolegend.com/alexa-fluor-647-anti-human-cd45-antibody-2739.html |
Anti-LC3 (Human) mAb clone 4E12 | MBL International Corporation | M152-3 | Clone 4E+12. Concentration 2 mg/mL. https://www.mblintl.com/products/m152-3 |
Anti-SQSTM1 / p62 antibody [EPR4844] – Autophagosome Marker (Alexa Fluor 488) | abcam | ab185015 | Clone EPR4844. Concentration 0.5 mg/mL. http://www.abcam.com/sqstm1-p62-antibody-epr4844-autophagosome-marker-alexa-fluor-488-ab185015.html |
Chloroquine diphosphate Salt | Sigma-Aldrich | C6628-25G | |
Cleanser – Coulter Clenz | Beckman Coulter | 8546931 | Fill container with 200 mL of Cleanser. https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/ |
DAPI Stain 5mg/mL | MilliporeSigma | 508741 | http://www.emdmillipore.com/US/en/product/DAPI-Stain—CAS-28718-90-3—Calbiochem,EMD_BIO-508741 |
Debubbler – 70% Isopropanol | MilliporeSigma | 1.3704 | Fill container with 200 mL of Debubbler. http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 10X | MilliporeSigma | BSS-2010-B | Ca++Mg++ Free |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X | MilliporeSigma | BSS-1006-B | PBS Ca++Mg++ Free |
Earle's Balanced Salt Solution 1X | Gibco | 14155 | |
Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 | |
Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure | Polysciences, Inc. | 04018 | This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed. Irritating to the eyes, respiratory systems and skin. May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes. Potential cancer hazard. http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/ |
Hanks' Balanced Salt Solution 1X | Gibco | 14175 | |
Jurkat, Clone E6-1 (ATCC TIB-152) | ATCC | TIB-152 | https://www.atcc.org/products/all/TIB-152.aspx |
MEM Non-Essential Amino Acids 100X | HyClone | SH30238.01 | |
MIFC – ImageStreamX Mark II | MilliporeSigma | 100220 | A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405nm, 488nm, and 642nm lasers was used. http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006 |
MIFC analysis software – IDEAS 6.2 | MilliporeSigma | 100220 | The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII). IDEAS version 6.2 |
MIFC software – INSPIRE | MilliporeSigma | 100220 | This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII). INSPIRE version 200.1.388.0 |
PE anti-human CD107a (LAMP-1) Antibody clone H4A3 | BioLegend | 328608 | http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html |
Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100X | HyClone | SV30082.1 | |
Rinse – Ultrapure water or deionized water | NA | NA | You can use any ultrapure water or deionized water. Fill container with 900 mL of Rinse. |
RPMI-1640 Medium 1X | HyClone | SH30027.01 | |
Sheath – PBS | MilliporeSigma | BSS-1006-B | This is the same as Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X Ca++MG++ free. Fill container with 900mL of Sheath. |
Siliconized polypropylene microcentrifuge tubes | Fisherbrand | 02-681-320 | Fisherbran Siliconized Low-Retention Microcentrifuge Tubes 1.5 mL. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-siliconized-low-retention-microcentrifuge-tubes-8/p-193936 |
Sodium Pyruvate solution (100mM) | HyClone | SH30239.01 | |
Sterilizer – 0.4-0.7% Hypochlorite | VWR | JT9416-1 | This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water. Fill container with 200 mL of Sterilzer. |
System Calibration Reagent – SpeedBead | MilliporeSigma | 400041 | Each tube holds ~10 mL. https://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/support-training/XDqb.qB.wQMAAAFLBDUp.zHu,nav |
T75 flask | Falcon | 353136 | |
TRITON X-100, PROTEIN GRADE Detergent, 10% Solution, Sterile-Filtered | MilliporeSigma | 648463-50ML | http://www.emdmillipore.com/US/en/product/TRITON-X-100,-PROTEIN-GRADE-Detergent,-10%25-Solution,-Sterile-Filtered—CAS-9002-93-1—Calbiochem,EMD_BIO-648463 |
Water, Cell Culture Grade | HyClone | SH30529.03 |