En este sentido, se utilizó la citometría de flujo de imágenes multiespectrales con una característica analítica que compara imágenes detalladas de 3 marcadores de autofagia y cuantifica su co-localización, junto con el recuento de puntos LC3, para medir la autofagia de una manera objetiva, cuantitativa y estadísticamente robusta.
La autofagia es una vía catabólica en la que los componentes celulares normales o disfuncionales que se acumulan durante el crecimiento y la diferenciación se degradan a través del lisosoma y se reciclan. Durante la autofagia, la proteína LC3 citoplasmática se lipide y se recluta en las membranas autofagosómicas. El autofagosoma se fusiona con el lisosoma para formar el autolisosoma, donde se produce la ruptura de la vesícula autofagosoma y su contenido. La proteína p62 asociada a la ubiquitina, que se une a LC3, también se usa para monitorizar el flujo autofágico. Las células sometidas a autofagia deben demostrar la co-localización de p62, LC3 y marcadores lisosómicos. La microscopía de inmunofluorescencia se ha utilizado para identificar visualmente LC3 puncta, p62, y / o lisosomas sobre una base por célula. Sin embargo, una evaluación objetiva y estadísticamente rigurosa puede ser difícil de obtener. Para superar estos problemas, se utilizó citometría de flujo de imágenes multiespectrales junto con una característica analítica que comparaCola de tres marcadores de autofagia (LC3, p62 y lysosomal LAMP1) y cuantifica su co-localización, en combinación con el recuento de puntos LC3 para medir la autofagia de manera objetiva, cuantitativa y estadísticamente robusta.
La macroautofagia, en adelante denominada autofagia, es una vía catabólica en la que los componentes dañados o disfuncionales, las proteínas de larga vida y los orgánulos se degradan a través del lisosoma y se reciclan 1 . La autofagia es un proceso dinámico de varios pasos que implica la formación de un autofagosoma; La fusión del autofagosoma con el lisosoma, formando el autolisosoma; Y la degradación de los contenidos del autolisosoma 2 . El marcador biológico crucial utilizado para identificar la autofagia en los sistemas de mamíferos es la proteína ligada a los microtúbulos 1A / 1B-cadena ligera 3 (LC3), que constituye la membrana autofagosomal. Durante la autofagia, el LC3-1 citosólico se conjuga con fosfatidiletanolamina para formar LC3-II; Entonces se incorpora LC3-II en la membrana autofagosomal 3 . Otro marcador ampliamente utilizado para el flujo autofágico es el receptor de autofagia sequestosome 1 (SQSTM1, p62) que físicamente liCarga autofágica a la membrana autofágica 4 , 5 .
Métodos que se han utilizado tradicionalmente para medir la autofagia son Western blots y microscopía de fluorescencia [ 7] . Sin embargo, ninguno de estos métodos se considera el "patrón oro" , 2 , 6 ya que hay desafíos asociados con ambas técnicas. Western blots sólo dan un promedio porque utilizan una muestra homogeneizada, por lo que los observadores no pueden ver lo que está sucediendo en las células individuales. Por otro lado, la microscopía de fluorescencia proporciona una información del observador a nivel de célula única, pero carece de capacidades de rendimiento, lo que hace difícil obtener evaluaciones objetivas y estadísticamente rigurosas. En los últimos años, la medición de LC3 y p62 por citometría de flujo de imágenes multiespectrales (MIFC, véase la Tabla de Materiales ) ha ido ganando popularidadDebido a su poder cuantitativo, capacidades de alto rendimiento, potencial de multiplexación y capacidad de imagen de cada célula. Uno de los métodos más utilizados para medir la autofagia usando MIFC, junto con su software de análisis complementario (véase la Tabla de Materiales ), es a través del recuento puntual de LC3 puncta o autophagosomes 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 . Sin embargo, un aumento de autofagosomas no significa necesariamente que hay un aumento en la autofagia, ya que también podría representar un bloqueo en el proceso [ 2] . LC3-II volumen de negocios es un parámetro útil para medir el flujo autofágico mediante el análisis de las células en la presencia yAusencia de un inhibidor de degradación lisosómica, como la cloroquina. La cloroquina inhibe la fusión del autofagosoma con el lisosoma, permitiendo así la cuantificación de la formación de autofagosomas como una medida del grado de autofagia deteniendo el flujo autofágico antes de que se produzca la degradación lisosomal 18 . Además, p62 se degrada principalmente por autofagia, y si la degradación lisosomal del autofagosoma y su contenido se bloquea, se espera una acumulación de p62 17 , 19 .
Autofagia es un proceso de varios pasos, y la medición de LC3 o p62 por sí sola no proporciona una imagen completa de lo que está sucediendo en las células. Publicaciones recientes han enfatizado la necesidad de examinar la formación concurrente del autolisosoma 2 , 17 , 20 , 21 . El MIFC esSingularmente capaz de medir la formación del autolisosoma mediante la imagen de la co-localización del autofagosoma al lisosoma 15 – 17 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 . Además, la co-localización de p62 y LC3 utilizando MIFC también se ha explorado para medir el flujo autofágico [ 5] . En el software de análisis referenciado, la "característica" que mide la co-localización se llama "Bright Detail Similarity R3" (BDS) y fue específicamente diseñada para comparar los detalles de imagen pequeños y brillantes de dos imágenes. BDS es el coeficiente de correlación log-transformado de Pearson de las manchas brillantes localizadas con un radio de 3 píxeles o menos; En otras palabras, BDS calcula el grado de oVerlapping pixels de dos canales fluorescentes diferentes. Los puntos brillantes están correlacionados ( es decir, la misma ubicación espacial) o no correlacionados ( es decir, diferentes ubicaciones espaciales). Por lo tanto, el coeficiente de correlación varía entre 0 (no correlacionado) y 1 (correlación perfecta). El coeficiente es log-transformado para aumentar el rango entre cero e infinito 26 , 27 . BDS solo puede no ser suficiente; Rajan et al. Encontró que el uso de sólo BDS podría conducir a falsos positivos o falsos resultados negativos [ 21] . BDS evalúa la co-localización de dos marcadores de autofagia, pero no considera el número de autofagosomas. Para explicar el número de autofagosomas, Rajan et al. Incluido el recuento puntual de las puntas de LC3 21 . Rajan et al. Propuesta utilizando un diagrama de dispersión bivariado de LC3 spot count versus BDS. Usando esta gráfica bivariada, dos poblaciones fueronE identificado por primera vez: uno con células que tienen un alto nivel de manchas LC3 y una con células que tienen un bajo nivel de manchas LC3. La población de puntos altos de LC3 se clasificó además en dos poblaciones: células con baja co-localización ( es decir, acumulación de autofagosomas) y células con alta co-localización ( es decir, acumulación de autolisosomas). Esta gráfica bivariada permite distinguir entre células con muy pocos autofagosomas y células con acumulación de autofagosomas y / o autolisosomas [ 21] .
Hasta ahora, no era posible la co-localización simultánea de LC3, p62 y LAMP1 (marcador lisosómico) utilizando un solo "Feature Type" en el software de análisis de acompañamiento del MIFC (véase la Tabla de Materiales ). Sin embargo, una nueva característica, recientemente introducida en la versión 6.1, se llama Bright Detail Colocalization 3 (BDC3). BDC3 compara las imágenes de detalle brillante de cada una de las tres imágenes (en este caso, LC3, p62 y LAMP1) y cuantifica la co-localización de las tres sondas ( es decir, LC3, p62 y LAMP1). La característica BDC3 calcula el coeficiente de correlación de Pearson modificado para extenderse a tres imágenes. Como los puntos brillantes de las tres imágenes están correlacionados o no correlacionados, el coeficiente de correlación varía entre 0 (sin correlación) y 1 (correlación perfecta). El coeficiente es log-transformado para aumentar el rango dinámico entre 0 e infinito. Al cambiar la función BDS con la característica BDC3, el método de análisis presentado por Rajan et al. Ahora pueden incorporar los tres marcadores más usados para medir la autofagia en un sistema al mismo tiempo. La capacidad de co-localizar estos tres marcadores de autofagia en un solo ensayo podría conducir a nuevos conocimientos sobre la inducción y regulación de la autofagia. El siguiente protocolo describe los pasos para inducir la autofagia en células Jurkat; Marcar las células con anticuerpos LC3, p62 y LAMP1; Adquirir datos en un sistema multispCitometría de flujo de imágenes ectrales; Y analizar los datos para evaluar el flujo autofágico.
Al realizar este análisis, hay algunas cosas a considerar. Es importante tener muestras de control apropiadas. Para este experimento, se utilizaron dos controles diferentes: Control y Control + Cloroquina. La muestra de control se utilizó para establecer el umbral para las regiones. Representa el nivel basal de autofagia sin detener la degradación lisosomal y es el control de la muestra Starved. Sin embargo, la muestra Control no es un control apropiado para comparar con los resultados de la muestra de Starved + Cloroquina porque la propia cloroquina influye en la muestra de control. Por lo tanto, fue necesario tener una muestra Control + Cloroquina.
Antes de realizar cualquier análisis para la autofagia, es importante analizar / gate solo en las células individuales que están en foco ( es decir, gradiente RMS mayor de 60), ya que los resultados podrían verse afectados si hay más de una célula o las imágenes son fuera de foco. Es crucial que el autofagosomaEs y los lisosomas están en foco para el recuento apropiado del punto y el análisis de BDC3. Las células apoptóticas deben ser removidas antes del análisis de autofagia, ya que pueden sesgar los resultados y no deben ser incluidas. Debe haber tinción apropiada para los tres marcadores ( es decir, LC3, p62 y LAMP1). Por ejemplo, los tres marcadores son intracelulares y deben tener una señal punteada; Si la señal no es punteada, o si está en la superficie de la célula, la tinción no sería apropiada y el experimento / tinción debe ser rehecho. Además, para que la BDC3 sea precisa, es esencial que las células de las celdas que son brillantes para los tres marcadores fluorescentes de interés. Para evitar la medición de BDC3 en la fijación no específica, los artefactos de formación de imágenes y / o el ruido es necesario disponer de eventos positivos. Esto es crucial, ya que BDC3 potencialmente puede amplificar artefactos que no son señales verdaderas. Debido a que BDC3 sólo puede realizarse en eventos positivos brillantes, muchas células pueden no ser incluidas en el análisis final; Esto es especRealmente es cierto para las células de control que no tienen acumulación de LC3, p62 y / o LAMP1. Por lo tanto, una limitación de este ensayo es que BDC3 sólo examina las células que son positivas para los tres marcadores, que podría no ser apropiado para todos los experimentos de autofagia.
Al igual que BDS, que se ha informado previamente 15 , 16 , 17 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , BDC3 solo no tiene en cuenta el número de organelas de autofagia que se co-localizan, dando lugar en gran medida De variabilidad en el número de autofagosomas. Por lo tanto, el enfoque bivariado presentado por Rajan et al. fue empleado. En cuanto a las parcelas bivariadas, uno podría preguntar siLas células deben ser positivas para LC3, p62 y LAMP1; ¿Por qué hay tantas células que tienen 0 puntos? Esto se debe a que la señal LC3 puede ser lo suficientemente brillante para la co-localización, pero puede no satisfacer el umbral establecido por la máscara de pico (Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4) lugar.
El protocolo presentado aquí utiliza MIFC para contar LC3 puncta y la co-localización de tres marcadores de autofagia para medir el flujo autofágico. Bajo condiciones basales (muestra de control), el número de autofagosomas era bajo, y pocas células se encontraron con "High Spots". Con la adición de cloroquina, que inhibe la fusión de autofagosomas / lisosomas, hubo un aumento en el número de manchas de LC3. Dado que el lisosoma es incapaz de romper el autofagosoma y el p62, que reside en el autofagosoma, esto conduce a un aumento en la co-localización de la LC5, p62 y LAMP1 autolysosome acumulación. Este efecto se amplificó bajo el rostro de nutrientesIon, que induce la autofagia. Sin embargo, sin la adición de cloroquina, no hubo un aumento significativo en el número de autofagosomas, muy probablemente debido a un aumento en la tasa de rotación autofágica. Cuando las células se someten a hambre en presencia de cloroquina, hubo un aumento en la co-localización y el número de autofagosomas, lo que apoya la conclusión de que la inanición aumenta el flujo autofágico. EBSS es conocido por ser un poderoso inductor de la autofagia. Por lo tanto, se espera que el aumento sea grande. Si se usa otro método, como la inducción del fármaco, para inducir la autofagia, la diferencia entre las muestras control y tratada puede ser más sutil.
Este protocolo particular fue diseñado para medir la autofagia en líneas celulares humanas, pero el ensayo podría adaptarse a otras especies cambiando a anticuerpos para esa especie particular. Además, el método de análisis podría utilizarse para cualquier aplicación intracelular que requiera la co-localizaciónDe tres sondas / marcadores.
The authors have nothing to disclose.
Me gustaría dar las gracias a mis compañeros de trabajo en MilliporeSigma, Philip J. Morrissey y Sherree L. Friend, por su apoyo y orientación a lo largo de los años. También quiero dar las gracias a Vidya Venkatachalam y Bryan R. Davidson por su ayuda con la función BDC3 en el software IDEAS , Ryan P. Jessup para ayudar a la edición de este manuscrito, Raymond Kong para ayudar en el día de rodaje, y un agradecimiento especial A la artista de maquillaje Cynthia Xamonthiene.
15 mL centrifuge tube | Falcon | 352096 | |
50 mL centrifuge tube | Falcon | 352070 | |
AF647 labeled Donkey anti-Mouse – IgG | Invitrogen | A-31571 | Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647. Concntration 2mg/mL. https://www.thermofisher.com/antibody/product/Donkey-anti-Mouse-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-31571 |
anti-human CD107a-PE (LAMP1) | BioLegend | 328607 | Clone H4A3. Concentration 400 µg/mL. http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html |
anti-human CD45- AF488 | BioLegend | 304017 | Clone HI30. http://www.biolegend.com/alexa-fluor-488-anti-human-cd45-antibody-2738.html |
anti-human CD45- PE | BioLegend | 304008 | Clone HI30. http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd45-antibody-708.html |
anti-human CD45-AF647 | BioLegend | 304018 | Clone HI30. http://www.biolegend.com/alexa-fluor-647-anti-human-cd45-antibody-2739.html |
Anti-LC3 (Human) mAb clone 4E12 | MBL International Corporation | M152-3 | Clone 4E+12. Concentration 2 mg/mL. https://www.mblintl.com/products/m152-3 |
Anti-SQSTM1 / p62 antibody [EPR4844] – Autophagosome Marker (Alexa Fluor 488) | abcam | ab185015 | Clone EPR4844. Concentration 0.5 mg/mL. http://www.abcam.com/sqstm1-p62-antibody-epr4844-autophagosome-marker-alexa-fluor-488-ab185015.html |
Chloroquine diphosphate Salt | Sigma-Aldrich | C6628-25G | |
Cleanser – Coulter Clenz | Beckman Coulter | 8546931 | Fill container with 200 mL of Cleanser. https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/ |
DAPI Stain 5mg/mL | MilliporeSigma | 508741 | http://www.emdmillipore.com/US/en/product/DAPI-Stain—CAS-28718-90-3—Calbiochem,EMD_BIO-508741 |
Debubbler – 70% Isopropanol | MilliporeSigma | 1.3704 | Fill container with 200 mL of Debubbler. http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 10X | MilliporeSigma | BSS-2010-B | Ca++Mg++ Free |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X | MilliporeSigma | BSS-1006-B | PBS Ca++Mg++ Free |
Earle's Balanced Salt Solution 1X | Gibco | 14155 | |
Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 | |
Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure | Polysciences, Inc. | 04018 | This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed. Irritating to the eyes, respiratory systems and skin. May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes. Potential cancer hazard. http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/ |
Hanks' Balanced Salt Solution 1X | Gibco | 14175 | |
Jurkat, Clone E6-1 (ATCC TIB-152) | ATCC | TIB-152 | https://www.atcc.org/products/all/TIB-152.aspx |
MEM Non-Essential Amino Acids 100X | HyClone | SH30238.01 | |
MIFC – ImageStreamX Mark II | MilliporeSigma | 100220 | A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405nm, 488nm, and 642nm lasers was used. http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006 |
MIFC analysis software – IDEAS 6.2 | MilliporeSigma | 100220 | The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII). IDEAS version 6.2 |
MIFC software – INSPIRE | MilliporeSigma | 100220 | This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII). INSPIRE version 200.1.388.0 |
PE anti-human CD107a (LAMP-1) Antibody clone H4A3 | BioLegend | 328608 | http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html |
Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100X | HyClone | SV30082.1 | |
Rinse – Ultrapure water or deionized water | NA | NA | You can use any ultrapure water or deionized water. Fill container with 900 mL of Rinse. |
RPMI-1640 Medium 1X | HyClone | SH30027.01 | |
Sheath – PBS | MilliporeSigma | BSS-1006-B | This is the same as Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X Ca++MG++ free. Fill container with 900mL of Sheath. |
Siliconized polypropylene microcentrifuge tubes | Fisherbrand | 02-681-320 | Fisherbran Siliconized Low-Retention Microcentrifuge Tubes 1.5 mL. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-siliconized-low-retention-microcentrifuge-tubes-8/p-193936 |
Sodium Pyruvate solution (100mM) | HyClone | SH30239.01 | |
Sterilizer – 0.4-0.7% Hypochlorite | VWR | JT9416-1 | This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water. Fill container with 200 mL of Sterilzer. |
System Calibration Reagent – SpeedBead | MilliporeSigma | 400041 | Each tube holds ~10 mL. https://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/support-training/XDqb.qB.wQMAAAFLBDUp.zHu,nav |
T75 flask | Falcon | 353136 | |
TRITON X-100, PROTEIN GRADE Detergent, 10% Solution, Sterile-Filtered | MilliporeSigma | 648463-50ML | http://www.emdmillipore.com/US/en/product/TRITON-X-100,-PROTEIN-GRADE-Detergent,-10%25-Solution,-Sterile-Filtered—CAS-9002-93-1—Calbiochem,EMD_BIO-648463 |
Water, Cell Culture Grade | HyClone | SH30529.03 |