Blandet Primære kulturer af murine Tyndtarm Beregnet for Studiet af Gut hormon sekretion og levende celler af enteroendokrine Cells

Summary

Denne protokol beskriver isolering og dyrkning af blandede murine små intestinale celler. Disse primære intestinale kulturer muliggør undersøgelse af signalveje underliggende gut peptidudskillelse under anvendelse af en række teknikker.

Abstract

Tarmen er det største endokrine organ i kroppen, med hormonsecernerende enteroendocrine celler placeret langs længden af ​​det gastrointestinale epitel. På trods af deres fysiologiske betydning, enteroendokrine celler kun udgør en lille brøkdel af epitelcelle befolkning og i fortiden, har deres karakterisering præsenteret en betydelig udfordring, hvilket resulterer i en afhængighed af cellelinje modeller. Her, giver vi en detaljeret protokol til isolering og dyrkning af blandede murine små intestinale celler. Disse primære kulturer er blevet anvendt til at identificere de signalveje ligger til grund for stimulering og inhibering af tarmen peptidudskillelse som svar på en række næringsstoffer og neuropeptider samt farmakologiske midler. Endvidere i kombination med anvendelsen af ​​transgene fluorescerende reporter mus, har vi vist, at disse primære kulturer blevet et stærkt værktøj til undersøgelse af fluorescens-mærkede enteroendocrine celler på itracellular niveau, ved anvendelse af fremgangsmåder, såsom patch damping og encellede calcium og cAMP-FRET billeddannelse.

Introduction

Det overordnede mål med denne fremgangsmåde er at isolere og kultur blandet murine tarmcellerne at muliggøre studiet af tarmen peptidudskillelse og levende celler af enteroendocrine celler. En tidlig version af denne procedure blev oprindeligt udgivet i 2008 af Reimann et al. ¹ og har siden dannet grundlag for yderligere 20 publikationer fra vores gruppe. Til dette manuskript, vi valgte at fokusere på små tarm kulturer, da de er mere udfordrende at etablere end colon kulturer.

Enteroendokrine celler udskiller en række gut peptider, herunder glucagon-lignende peptid 1 (GLP-1), glucose-insulinotropt peptid (GIP), cholecystokinin (CCK) og peptid YY (PYY) ^2. Disse tarmpeptider har vigtige fysiologiske roller i orkestrere postprandiale reaktioner såsom opbremsning af tarmen transit, potensering af glucose insulinfrigivelse og induktion af mæthed. GLP-1 mimetika etnd lægemidler, der hæmmer dens nedbrydning i øjeblikket godkendt til behandling af type 2-diabetes, og der er løbende vurdering af det terapeutiske potentiale til at stimulere den endogene sekretion af dette peptid ^3. En bedre forståelse af enteroendokrine fysiologi og de mekanismer, hvormed sekretion enten stimulerede eller inhiberede er derfor af afgørende betydning.

Gut peptidudskillelse kan undersøges ved anvendelse af forskellige in vitro- og ex vivo eksperimentelle modeller, hver med fordele og ulemper (for en omfattende nylig gennemgang også dækker anvendelsen af in vivo-modeller se Svendsen et al. ^4). Ex vivo teknikker såsom de isolerede perfunderede tarm- ⁵ og Ussing-kamre ⁶ anvendes for tiden til at udforske gut peptidudskillelse som reaktion på forskellige stoffer. Den væsentligste fordel ved disse metoder, somsammenlignet med primære kulturer, er, at den umiddelbare miljø i enteroendokrine celler forbliver stort set intakt og vigtigere, er polariteten af ​​cellerne bevares. Derfor er det muligt at fremkalde information om hvilke celleoverfladen et sekretionsfremmende handler den ^6. Disse er imidlertid typisk lav-throughput teknikker og kvaliteten af ​​de data, der er afledt af dem er stærkt afhængig af integritet og levedygtighed tarmvævet, som uundgåeligt falde over tid.

Intestinale organoider bliver nu i stigende grad som in vitro-modeller til undersøgelse af enteroendokrine cellefunktion og udvikling ^7. Organoider, som kan afledes fra både murine og humane væv, har fordelen af ​​at danne 3D 'krypt-lignende' strukturer, der opretholder cellepolaritet i kultur. Dog organoide-afledte enteroendocrine celler har endnu ikke fuldt karakteriseret, og deres lighed med nativt L cells stadig stort set ukendt. Primære kulturer har den fordel at være et skridt tættere på den fysiologiske omgivelser, som enteroendocrine celler ikke vedligeholdes og differentieres i kunstige omgivelser i længere perioder.

En alternativ primær kultur, som har været anvendt til vurdering af tarmen peptidudskillelse er isoleringen af føtale rotte intestinale celler (FRICs) ^8. Imidlertid har kulturen i voksne tarmvæv mødt med mindre succes og er blevet observeret nogle forskelle i reaktionsevne FRICs vs. voksne murine intestinale celler (fx glucose ^8).

Enteroendocrine-lignende cellelinier (f.eks GLUTag, STC-1 og NCI-H716) traditionelt er blevet anvendt til at skelne direkte vs. indirekte virkninger på enteroendokrine celler og til at dissekere underliggende molekylære mekanismer kobling stimulus til sekretion; se Kuhre et al 9 for peptid produktion og sekretion ved 'L cellelignende' udødeliggjorte cellelinier. Dette har været nødvendigt, da enteroendokrine celler, spredt langs mavetarmkanalen, udgør knap 1% af intestinale epitelceller ¹⁰ og sorterede celler, i vores hænder, ikke overlever i kultur ^1. Cellelinier forbliver nyttige værktøjer som beror på, at de er en stort set homogen cellepopulation, der er befordrende for genetiske manipulationer såsom gendæmpning. Følgelig er det let at undersøge rollen af ​​proteiner, som ikke kan målrettes farmakologisk, når transgene mus er ikke tilgængelige. Men cellelinjer er ikke altid gyldige modeller af primære celler. Mens der er mange ligheder, fund fra primære kulturer har til tider fremhævet forskelle i signalveje aktiveret af visse næringsstoffer i primære L-celler sammenlignet med GLUTag celler, for eksempel (f.eks. Peptoner <sup class = "xref"> 11). Afgørende, i kombination med transgene fluorescerende reporter mus, den primære kultur model muliggør detaljeret undersøgelse af individuelle primære enteroendocrine celler ved det intracellulære niveau. Fluorescens-mærkede L-celler inden primære kulturer er blevet anvendt af vores gruppe for patch fastspænding ^{1, 12} undersøgelser, og encellede calcium ^{11, 13} og cyklisk adenosinmonophosphat-FRET billeddannelse ¹⁴ studier, som har udløst betydelige fremskridt inden for enteroendokrine fysiologi.

Den følgende protokol er optimeret til udførelse sekretionssignaler eksperimenter under anvendelse af en plade med 24 brønde eller til fremstilling af op til 16 billeddannende retter, fra en 10 cm sektion af tyndtarmen fra en enkelt voksen mus. Protokollen kan let modificeres til undersøgelse af colon celler ved at øge fordøjelsesperiode og collagenase koncentration.

Protocol

Alle procedurer dyr blev godkendt af University of Cambridge Dyrevelfærd og etisk organ og var i overensstemmelse med de Dyr (videnskabelige procedurer) Act 1986 Ændring forordninger (SI 2012/3039).

1. Fremstilling i Advance

1. Anbringes en alikvot af basalmembranmatrix (BMM) (~ 200 pi) på is for at tø.
   BEMÆRK: BMM størkner ved stuetemperatur (RT).
2. Pre-varm 50 mL sterilt høj-glucose Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) (uden tilsætninger) og ~ 40 ml sterilt dyrkningsmedium (høj-glucose DMEM suppleret med 10% kalvefosterserum (FBS), 100 U / ml penicillin og 0,1 mg / ml streptomycin (P / S) og 2 mM L-glutamin) i 50 ml-centrifugerør i et vandbad ved 37 ^° C
3. Pre-chill calcium og magnesium-holdige phosphatbufret saltvand (PBS).
4. Afvej 15 mg collagenase (XI råt), tilsættes til et 50 ml centrifugerør og holde det på is.

2. Tissue Collection

1. Tilføj ~ 20 ml L-15-medium til et 50 ml centrifugerør og placere den på is.
2. Aflive en mus ved cervikal dislokation, eller andre godkendte tidsplan 1 metode.
   BEMÆRK: Intestinal væv opnås typisk fra mus på en C57BL6 baggrund. Imidlertid har andre genetiske baggrunde også været anvendt f.eks 129 / SvEv ^15. Imaging eksperimenter kræver anvendelse af fluorescerende reporter mus f.eks GLU-Venus ^1. Væv opnået fra voksne mus (2-6 måneder) af begge køn. Musene er opstaldet i individually ventileret bure med ad libitum adgang til vand og almindeligt foder. Men forsøg for at teste virkningen af en kost med højt fedtindhold, for eksempel på enteroendokrin cellefunktion ¹⁶ kan udføres, hvis understøttet af en projekt licens.
3. Dissekere og forsigtigt fjerne musetarm (fra pylorus til start af rektum) under anvendelse af pincet og dissektion saks. Opbevar det i L-15 medium på is, indtil klar til brug.

3. Vævspræparation

1. Placere tarmvæv i en 10 cm petriskål indeholdende nok PBS til at dække vævet. Tage 10 cm ønskede væv (f.eks øvre tyndtarm, top 10 cm, distalt for pylorus).
2. Skyl ud tarm indhold ved hjælp af en plastik Pasteur-pipette og kølet PBS.
   1. Med pincet, fint greb ene ende af tarmsegmentet og placere spidsen af ​​en Pasteur-pipette ind i det. Skylle indhold med kølet PBS. Gentag fra begge ender, indtil majokerhed af indholdet er blevet skyllet ud. Overførsel til en ren petriskål indeholdende fersk kølet PBS.
3. Ved hjælp af pincet, fjerne fedtvæv og mesenterium, idet man ikke trække ud musklen lag på samme tid.
4. Peel musklen lag off "som en sok" under et dissektionsmikroskop under anvendelse af to sæt af fine tænger.
   BEMÆRK: Dette trin er ikke afgørende, men anbefales. Der er alternative måder at fjerne musklen lag med den beskrevet her. For eksempel kan tarmen skæres åben på langs først, før fjernelsen af ​​musklen lag.
   1. Finde et udgangspunkt i mere proximale ende af væv, hvor der er en synlig flap af musklen. Træk forsigtigt væk en lille mængde af muskel lag hele vejen rundt tarmen.
      BEMÆRK: For at undgå rivning af musklen lag eller tarmepitelet, reducere trækkraften ved at spænde et større overfladeareal stedet for at bruge tips af de fine pincet.
   2. Klemme tarmen og så meget af musklen klap som muligt, træk forsigtigt fra hinanden og starte skrælning fra muskellag fra hele tarmen. For at undgå at rive både musklen lag og epithel, holde justering placeringen af ​​pincet til at holde dem tæt sammen. På denne måde fjernes muskellag fra hele længden af ​​tarmsegmentet og skille.
5. Skær tarmen åben på langs og vask ved omrystning i en ren petriskål med frisk kølet PBS. Gentag om nødvendigt at fjerne eventuelt resterende Chyme eller slim.
6. Hakkekød væv med en kirurgisk skalpel for at opnå pladser i ~ 1-2 ^mm2 og tilføje disse til ~ 20 ml afkølet PBS i et 50 ml centrifugerør under anvendelse af en Pasteur-pipette. At undgå vævsstykker klæber til pipetten, afbrød spidsen og befugte pipetten ved triturering med PBS.
7. Ryst forsigtigt røret for yderligere at vaske vævsstykkerne. Tillad vævet at falde til og hælde eller pipette off størstedelen af ​​PBS og gentag med frisk PBS indtil PBS ser klart.

4. Fremstilling af BBM-overtrukne plade / Fade og fordøjelse Medium
BEMÆRK: bør udføres De følgende trin i en vævskultur hætte (med inkubationstrin i 37 ° C vandbad).

1. En 2% BMM opløsning i afkølet DMEM (uden tilsætninger). Mens du arbejder, holde løsningen på is. For en 2% opløsning, tilsættes 140 pi optøet BMM til 7 ml DMEM (nok til at forberede en enkelt plade med 24 brønde).
   1. Tilsæt 250 pi 2% BMM opløsning per brønd (plade med 24 brønde) eller pr glasbund billeddannelse skålen.
   2. Inkuber coatede plader / skåle i mindst 30 minutter i en inkubator ved 37 ° C for at give mulighed for tilstrækkelig polymerisation af BMM.
2. Tilsæt 50 ml forvarmet DMEM (uden tilsætninger) til 15 mg collagenase (fra trin 1,2 og 1,4) til dannelse af en 0,3 mg / ml opløsning og vend at opløse.
   1. Påce fuldstændigt opløst, under anvendelse af en 20 ml sprøjte, foretage collagenaseopløsningen gennem et 0,2 um sterilt filter ned i en ny steril 50 ml centrifugerør. Mærk dette som fordøjelsen medium.

5. vævsfordøjelse

1. Fjern de vævsstykker fra PBS under anvendelse af en 10 ml serologisk pipette og tilsæt til et sterilt 50 ml centrifugerør indeholdende afkølet steril DMEM (uden tilsætninger), hvirvel og derefter fjerne DMEM.
   BEMÆRK: For at undgå væv klæber til den serologiske pipette, våde det ved triturering med DMEM før kontakt med vævet.
2. 'Digest' 1 og 2: Fjernelse af cellerester og enkeltceller
   1. Tilsættes 7 ml fordøjelse medium til vævsstykkerne og give røret en hvirvel.
   2. Der inkuberes i 5 minutter i et vandbad ved 37 ° C.
   3. Ryst (ikke hvirvle) røret i -3 s.
   4. Tillad vævet at falde til og kassere fordøjelsen medium, reservere enlille volumen til at se på under mikroskopet.
      BEMÆRK: Især når der starter ud, er det stærkt anbefales at inspicere et lille volumen af ​​hver 'fordøje' (~ 30 pi) under mikroskop for at måle forløbet af fordøjelsesprocessen. Hvis der observeres mange krypter i denne fase kan omrystningen være for kraftig. For repræsentative billeder af, hvad de forskellige 'fordøje' stadier typisk se ud, se figur 1.
   5. Gentag trin 5.2.-5.2.4 (med frisk fordøjelse medium).
3. 'Fordøjelsesvæskerne' 3 til 5: Indsamling af crypt fragmenter
   1. Tilsættes 7 ml fordøjelse medium til vævet.
   2. Inkuber i 10 minutter ved 37 ° C.
      1. Under inkubationen ryste hver 5 min til 10-12 s.
         BEMÆRK: rysten er mere energisk end den ryster efter 'fordøjer' 1 og 2.
   3. Tillad ufordøjet væv at afvikle og indsamle fordøjelsen medium i en 15 ml centrifugerør. Hvisvæv ved et uheld opsamles sammen med mediet, gør det muligt at sætte sig, fjerne det ved hjælp af en 10 ml serologisk pipette og overføre den tilbage til 50-ml centrifugerør indeholdende det ufordøjede væv.
   4. Centrifuge indsamlede medium / supernatant ved stuetemperatur i 3 minutter ved 100 x g.
   5. Supernatanten fjernes, og genopslæmmes cellepelletten i 5 ml forvarmet dyrkningsmedium ved forsigtig triturering og afsat.
   6. Inspicere et lille volumen af ​​cellesuspensionen under mikroskop (se note fra trin 5.2.4).
      BEMÆRK: Ideelt crypt fragmenter begynde at dukke op i 'fordøje' 3 langs med cellerester og enkeltceller. 'Fordøjelsesvæskerne' 4 og 5 indeholder en signifikant større antal crypt fragmenter med reduceret cellerester (figur 1). Juster ryste intensitet som nødvendigt, dvs. hvis vævet ikke er fordøje og krypt fragmenter vises ikke, ryste mere energisk.
   7. Gentag trin 5.3.1-5.3.6 indtil 5 'fordøjer' har væretafsluttet eller indtil hovedparten af væv er blevet spaltet (kan kræves en 6 ^th fordøjelsesprodukt).
   8. Når alle supernatanter fra 'fordøjelser' 3-5 (eller 3-6) er blevet opsamlet, centrifugeres fordøje supernatanter ved stuetemperatur i 3 minutter ved 100 x g.
   9. For sekretionssignaler eksperimenter kombinere supernatanterne fra 'fordøjelser' 3-5 (eller 3-6) før centrifugering.
      BEMÆRK: Der er behov for mindre væv til billeddannelse eksperimenter, derfor vælge den fordøjede supernatant, der er den reneste (fravær af cellerester og enkeltceller) med det større antal krypt fragmenter. Dette er typisk 'fordøje' 4 eller 5.
   10. Supernatanten fjernes, og forsigtigt genopslaemmes pelleten ved triturering indtil der ikke klumper er synlige. Resuspender pellet i foropvarmede dyrkningsmedium suppleret med 10 pM Y-27632 dihydrochlorid (for at forhindre anoikis ^17). Anvende 5 ml for sekretionssignaler eksperimenter og 2 ml dyrkningsmedium til billeddannelse eksperimenter.
   11. Filtercellesuspension gennem en 100-um filter (til fjernelse af eventuelt ufordøjet væv). Køre en yderligere 2 ml forvarmet dyrkningsmedium gennem filteret for at vaske (totalvolumen: 7 ml og 4 ml for sekretion og billeddannelse, henholdsvis).
       BEMÆRK: Filtrering er ikke afgørende, men større væv fragmenter tendens til ikke at holde sig til pladen / tallerkener.

Figur 1: Repræsentative billeder af 'fordøjelser' fra primær tyndtarmen dyrkningsmetode. (A) Typisk materiale fra 'fordøjelser' 1 og 2, der primært indeholder enkeltceller og cellerester. (B) Et eksempel på produkter fra 'fordøje' 3. De sorte pile angiver crypt fragmenter, der findes i fordøje materialet. (C) Typisk af 'fordøje' 4 eller 5. Panel (D) betegner puljet fordøje materiale fra'fordøjelser' 3-5 ledes gennem en 100 um filter for at fjerne de større uønskede vævsfragmenter set i (C). Alle billeder blev taget med et digitalt omvendt mikroskop med en 20X objektiv. Målestok = 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

6. Belægning Intestinale kulturer (Beriget for kryptceller)

1. Fjern overskydende BMM løsning fra pladen eller retter, og der tilsættes 250 pi forvarmet dyrkningsmedium pr sekretion godt.
   BEMÆRK: Billedbehandling retter er efterladt uden medium, så gå videre til næste trin hurtigt for at forhindre fadet tørrer ud.
2. Plade 250 pi cellesuspension pr brønd (plade med 24 brønde) eller pr glasbund skål.
   1. Plade dråbevis i en langsom 'zig-zag' motion tværs brønden. Tillad krypt fragmenter til at nøjes med ~ 5 min før bevæge pladen til the inkubator.
      BEMÆRK: Denne bør tilskynde en jævn fordeling af krypter / celler i brønden.
3. Inkuber plade eller retter natten over ved 37 ° C og 5% _CO2.
   BEMÆRK: En 'pletvist' monolag burde have dannet. For en repræsentativ billede af kulturer efter tre vaske, se figur 2A.
4. 'Flood' imaging retter med 2 ml forvarmet dyrkningsmedium pr skål.
   BEMÆRK: Disse retter vil være egnede til billeddannelse til op til ~ 72 timer efter udpladning. Colon kulturer vare typisk længere, op til 7 dage. Celler, som ikke har klæbet kan fjernes ved et vasketrin. Primære kulturer er nu klar til at blive brugt til forsøg.

Representative Results

Anvendelsen af ​​serielle fordøjelsestrin mulighed for indsamling af en relativt ren fremstilling af crypt fragmenter, der skal udplades for eksperimenter. De første to fordøjelser fjerner primært enkeltceller og cellerester fra fordøje materiale (figur 1A). Under den tredje fordøjelse, crypt fragmenter vises i det fordøjede materiale (figur 1B). Fordøjer 4 og 5 udbytte et større antal crypt fragmenter med færre enkelte celler (figur 1C). Filtrering af det poolede materiale fra fordøjelser 3-5 fjerner større stykker ufordøjet væv, som kan være skadelige for kultur, der producerer en ren krypt fragmentpræparation (figur 1D).

Efter 18-24 timers dyrkning, er monolag af primære små intestinale celler observeret (figur 2A). Anvendelse kulturer genereret fra transgene mus specifikt udtrykker calcium fluorescerende sensor, GCaMP3, under kontrol af proglucagon-promotoren ^11, L-celler let kan identificeres og indflettet inden for kulturen (figur 2B). I primære tyndtarmstumorerne kulturer, forbindelser målrette _Gq -Ca ²⁺ _i og cAMP _i -afhængig veje stimulerede sekretionen af GLP-1 (for sekretion eksperiment metodik se Reimann et al. ^1). Bombesin (BBS, 100 nM) og samtidig påføring af forskolin og 3-isobutyl-1-methylxanthin (IBMX) (F / I, 10 pM hver) udløste en 2- og 11-fold, stimulering af GLP-1 frigivelse i forhold til basal henholdsvis (figur 2C). Specifik L-celle ekspression af GCaMP3 muliggør identifikationen af ​​og tidstro overvågning af calciummobilisering i individuelle L-celler. Både 100 nM bombesin (BBS) og 30 mM kaliumchlorid (KCI) stimulerede forbigående stigninger i intracellulært calcium indikerer den kendte _{Gq <}/ sub> - og elektrogenisk-koblede omsætningsveje i primære L-celler (Figur 2D).

Figur 2: Repræsentative data fra primære tyndtarmens kulturer. Eksempel billeder af blandede primære tyndtarmens kulturer anvendes til (A) sekretion og (B) til billeddannelse eksperimenter skrive 24 timer plating. (A) Billede taget fra en 24-brønds plade under anvendelse af et digitalt inverteret mikroskop med et 4X objektiv. Skala bar = 500 um. (B) Under anvendelse af GLU-Cre x ROSA26 GCamP3 mus, L-celler i synsfeltet (grønne celler) blev identificeret ved fluorescensen af GCaMP3. Skala søjle repræsenterer 50 um. (C) GLP-1-sekretion blev målt som respons på bombesin (BBS, 100 nM) og forskolin / 3-isobutyl-1-methylxanthin (IBMX) (F / I, 10 pM hver). Procentdel GLP-1-sekretion blev beregnetved at måle GLP-1-niveauer i supernatanterne og cellelysater. Data repræsenterer gennemsnit ± SEM af n = 3 for hver tilstand. (D) GCaMP3 fluorescens (der afspejler cytosolisk calcium) af de to celler, der er skitseret i (B) overvåget i realtid som respons på kaliumchlorid (KCI, 30 mM) og BBS (100 nM). Enkelt celle billeddannelse blev udført under anvendelse af et omvendt fluorescensmikroskop med et 40X olieimmersionsobjektiv. GCaMP3 blev anslået ved 475/10 nm, under anvendelse af en 75 W xenonbuelampe og en monokromator kontrolleret ved fluorescens imaging software. Emissionen blev optaget med en høj opløsning digital ladningskoblet indretning (CCD) kamera ved hjælp af et dikroisk spejl og et 510-560 nm båndbredde filter. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Denne protokol beskriver isolering og dyrkning af blandede murine små tarmcellerne at muliggøre studiet af tarmen peptidudskillelse og enkelt celle billeddannelse af mærkede enteroendocrine celler.

For at øge sandsynligheden af ​​de små intestinale kulturer bliver vellykket, er det vigtigt, at protokollen udføres så hurtigt som muligt (ideelt inden for 3 timer af høst af væv), og at vævet holdes i iskoldt medium eller puffer forud til fordøjelsesprocessen, at begrænse celledød. Mens det ikke er væsentligt, især for colon kulturer er fjernelse af musklen lag fra tyndtarmen opfordres kraftigt. Tyndtarmens kultur protokol er blevet standardiseret så meget som muligt. Det er imidlertid vigtigt at bemærke, at ingen fordøjelsesprocessen er identiske. Der er mange trin i løbet af denne protokol, hvor variabilitet kan indføres på en dag-til-dag basis fx graden af muskel fjernelse, størrelsen af than 'hakket' væv stykker, styrken af rysten, styrken af et bestemt parti collagenase osv. Det er derfor, af afgørende betydning for at inspicere portioner af hver af de forskellige 'fordøjer' under mikroskop for at vurdere fremskridtene i fordøjelsesprocessen og skræddersy ryste, og antallet af 'fordøjer' i overensstemmelse hermed. Det anbefales at ryste mere forsigtigt til at begynde med, og hvis krypt fragmenter er ikke indlysende fra 'fordøje' 3 og fremefter, til at begynde at ryste mere energisk.

Fra vores erfaring, behøver enteroendokrine cellerne ikke formere sig i kulturen og er som regel tabt fra små tarm kulturer inden for 4 dage. Men ikke desto mindre tillader, rigelig tid til at udføre gut peptidudskillelse eksperimenter (typisk udføres over 2 timer, 18-24 timer efter plating) for at teste fysiologiske stimuli og / eller farmakologiske midler. Eksperimenter, der kræver en inkubation natten over forud for sekretion eksperiment er også mulige for eksempeli tilfælde af forbehandling med pertussistoxin ^15.

Den primære kultur teknik præsenteres her, er en veletableret fremgangsmåde, som det fremgår af omfanget af forskning output det har produceret gennem årene. Den primære kultur model er blevet anvendt til at undersøge udskillelsen af en række forskellige tarmpeptider, herunder GLP-1 ^1, GIP ¹⁸ og PYY ^19, som reaktion på forskellige næringsstoffer og ikke-næringsstoffer ^{14, 20} stimuli og inhibitorer. Endvidere har den samme teknik med held været anvendt til dyrkning af humane tarmceller ^21. Ofte en kombination af den primære cellekultur metode sammen med en ekstra forsøgsmodel f.eks. ex vivo eller in vivo kan tilvejebringe den mest indsigt ^6. Navnlig og i modsætning til andre metoder har denne teknik important anvendelsesområder ud over målingen af ​​tarmen peptidfrigivelse. Vi har vist, at primære små intestinale kulturer afledt fra transgene reporter mus er stærke værktøjer til forhør af intracellulære signalveje koblet til gut peptidudskillelse anvendelse af for eksempel Ca2 ⁺ og cAMP sensorer, GCaMP3 ^{11, 13} og Epac2camps ¹⁴ henholdsvis samt elektrofysiologiske teknikker ^12.

Som med alle in vitro-modeller, de primære intestinale kulturer har visse iboende begrænsninger, herunder tab af polariteten af de epiteliale celler i kultur, såvel som nedsat blodtilførsel og innervation. Det er vanskeligt at vurdere de potentielle virkninger af disse kunstige forhold på enteroendokrin celle funktion. Imidlertid har data fra primære kulturer ofte været translaterbar i in vivo Setting (f.eks virkninger af kortkædede fedtsyrer på GLP-1-sekretion ^15).

De primære intestinale kulturer er en alsidig teknik med mange potentielle anvendelser. De har allerede tilvejebragt vigtig mekanistisk indsigt i reguleringen af ​​tarmen peptid sekretion.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well plates	Costar	3524	For secretion experiments
Bombesin	Sigma-Aldrich	B4272	Positive control (calcium imaging experiment)
Centrifuge tubes, 15 mL, sterile	Greiner bio-one	188261	For tissue preperation/digestion
Centrifuge tubes, 50 mL, sterile	Corning	430828	For tissue preperation/ digestion
Collagenase XI (Crude)	Sigma-Aldrich	C9407	For making up digestion medium
Dichroic mirror	Cairn Research	-	For imaging experiments
DMEM High glucose (4500 mg)	Sigma-Aldrich	D6546	For dissolving matrigel (keep at 4 °C). For making up digestion medium, pre-warm to 37 °C.
Emission Filter (Bandwidth 510-560 nm)	Cairn Research	-	For imaging experiments
Foetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F7524	For making up culture medium
Forceps/Tweezers	Agar Scientific	AGT520	For dissection/removal of intestine
Forskolin	Sigma-Aldrich	F6886	Positive control (secretion experiment)
Glass-bottomed dishes (35 mm)	MatTek	P35G-0-14-C	For imaging experiments
High precision tweezer (110 mm)	IDEAL-TEK	3480641 (5 SA)	For removing muscle layer
High resolution digital CCD camera	Hamamatsu	ORCA-ER	For imaging experiments
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich	I7018	Positive control (secretion experiment)
L-15 Medium (Leibovitz)	Sigma-Aldrich	L1518	For collecting tissue, keep on ice
L-glutamine	Sigma-Aldrich	G7513	For making up culture medium
Matrigel	Corning	354234	Basement Membrane Matrix, for coating plates and dishes
MetaFluor	Molecular Devices (supplied by Cairn Research)	-	Fluorescence ratio imaging software
Mice (C57BL6)	Charles River Laboratories	C57BL/6J	Background mice used for breeding. Can also be used for secretion experiments
Mice (GLU-cre x ROSA26 GCaMP3)	in house	-	For calcium imaging and secretion experiments
Microscope (EVOS XL Core)	Thermo Fisher Scientific	AMEX1000	For photomicrographs of cultures
Microscope	Olympus	IX71	Inverted microscope with 40X oil objective used for imaging experiments
Monochromator	Cairn Research	-	For imaging experiments
Pasteur pipettes	Alpha Laboratories	LW4234	For cleaning tissue
PBS containing Ca2+ and Mg2+	Sigma-Aldrich	D8662	For washing tissue, keep on ice
Penicillin & Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781	For making up culture medium
Petri dishes (100 mm x 20 mm)	Corning	CLS430167	For cleaning tissue and removing muscle layer
Potassium chloride	Fisher Scientific	P/4280/53	Positive control (calcium imaging experiment)
Scissors	Agar Scientific	AGT554	For dissection/removal of intestine
Sterile cell strainer 100 µm	Fisher Scientific	22363549	For filtering crypt cell suspension prior to plating
Surgical scalpel blade No.22 (sterile, stainless)	Swann Morton	0308	For dicing tissue
Syringe filters, Minisart NML (0.2 µm pore size)	Sartorius	16534-K	For filter-sterilising collagenase solution (digestion medium)
Syringes, 20 mL, disposable, sterile, Luer slip	BD	300613	For filter-sterilising collagenase solution (digestion medium)
Xenon arc lamp 75W	Cairn Research	-	For imaging experiments
Y-27632 dihydrochloride	Tocris	1254	ROCK inhibitor, prepare 10 mM stock solution in sterile water (use 1:1,000 in final culture medium)