Blandade primära kulturer av murina Tunntarm för studier av Gut hormonutsöndring och Levande cell imaging av enteroendokrina Cells

Summary

Detta protokoll beskriver isolering och odling av blandade murina små tarmceller. Dessa primära intestinala kulturer möjliggöra undersökning av signalvägar underliggande tarmen peptidsekretion genom att använda ett antal tekniker.

Abstract

Tarmen är den största endokrina organ i kroppen, med hormonutsöndrande enteroendocrine celler belägna utmed längden av det gastrointestinala epitelet. Trots deras fysiologiska betydelse enteroendocrine celler utgör endast en liten del av epitelceller befolkningen och i det förflutna, har deras karakterisering presenteras en stor utmaning som resulterar i ett beroende av cellinje modeller. Här ger vi ett detaljerat protokoll för isolering och odling av blandade murina små tarmceller. Dessa primära kulturer har använts för att identifiera de signalvägar som ligger bakom stimulering och inhibering av tarmpeptidsekretion som svar på ett antal näringsämnen och neuropeptider samt farmakologiska medel. Vidare, i kombination med användningen av transgena fluorescerande reporter möss, har vi visat att dessa primära kulturer blivit ett kraftfullt verktyg för undersökning av fluorescerande-taggade enteroendocrine celler vid itracellular nivå, med användning av metoder såsom fläckklämning och encelliga kalcium och cAMP-FRET avbildning.

Introduction

Det övergripande målet med denna metod är att isolera och kultur blandade murina tarmceller för att möjliggöra studier av tarmpeptidsekretion och levande cell imaging av enteroendocrine celler. En tidig version av detta förfarande publicerades ursprungligen 2008 av Reimann et al. ¹ och har sedan legat till grund för ytterligare 20 publikationer från vår grupp. För detta manuskript, valde vi att fokusera på små tarm kulturer eftersom de är svårare att fastställa än kolon kulturer.

Enteroendocrine celler utsöndrar en array av tarmpeptider inklusive glukagonliknande peptid 1 (GLP-1), glukosberoende insulinotropisk peptid (GIP), kolecystokinin (CCK) och peptid YY (PYY) ^2. Dessa gut peptider har viktiga fysiologiska roller i iscensätta postprandial svar såsom det långsammare tarm transitering, potentiering av glukosstimulerad insulinfrisättning och induktion av mättnad. GLP-1-mimetika and läkemedel som inhiberar dess nedbrytning närvarande godkänt för behandling av typ 2-diabetes och det finns pågående bedömning av den terapeutiska potentialen att stimulera den endogena sekretionen av denna peptid ^3. En bättre förståelse av enteroendokrina fysiologi och de mekanismer genom vilka utsöndring är antingen stimulerade eller hämmade är därför av avgörande betydelse.

Gut peptidsekretion kan studeras med hjälp av olika in vitro- och ex vivo experimentella modeller, var och en med fördelar och nackdelar (för en omfattande senaste omdömet också täcker användningen av in vivo-modeller se Svendsen et al. ^4). Ex vivo-tekniker såsom de isolerade perfuserade tarm ⁵ och Ussing kamrarna ⁶ används för närvarande för att utforska gut peptidsekretion som svar på olika ämnen. Den största fördelen med dessa metoder, somjämfört med primära kulturer är att den omedelbara omgivningen av de enteroendocrine cellerna förblir i stort sett intakt och viktigare, är polariteten hos cellerna bevaras. Därför är det möjligt att få fram information om vilka cellytan en sekretagog verkar på ^sex. Men dessa är vanligtvis lågt genomströmning tekniker och kvaliteten på de data som härrör från dem är starkt beroende av integriteten och viabiliteten hos tarmvävnaden, vilket oundvikligen minskar över tiden.

Tarm organoids nu alltmer används som in vitro-modeller för studier av enteroendokrina cellernas funktion och utveckling ^7. Organoids, som kan härledas från både murina och humanvävnad, har fördelen att bilda 3D 'crypt-liknande' strukturer som upprätthåller cell polaritet i kultur. Emellertid organoid härledda enteroendocrine celler har ännu inte fullständigt karakteriserade och deras likhet med nativ L-cells är i stort sett okända. Primära kulturer har fördelen av att vara ett steg närmare den fysiologiska inställning, som enteroendocrine cellerna inte upprätthålls och differentieras i artificiella förhållanden under längre tidsperioder.

En alternativ primär kultur metod som har använts för bedömning av tarmpeptidsekretion är isoleringen av fetala rått intestinala celler (FRICs) ^8. Emellertid har den kultur av vuxna tarmvävnad träffade mindre framgång och vissa skillnader har observerats i mottagligheten hos FRICs vs. vuxna murina tarmceller (t ex glukos ^8).

Enteroendocrine liknande cellinjer (t.ex. GLUTag, STC-1 och NCI-H716) har traditionellt använts för att särskilja direkt vs. indirekta effekter på enteroendocrine celler och att dissekera underliggande molekylära mekanismer som kopplar stimulera utsöndring; se Kuhre m.fl. 9 för peptidproduktion och utsöndring av 'L celliknande' odödliggjorda cellinjer. Detta har varit nödvändigt eftersom enteroendocrine celler, utspridda längs mag-tarmkanalen, utgör knappt 1% av intestinala epitelceller ¹⁰ och sorteras celler, i våra händer, inte överlever i kultur ^1. Cellinjer förblir användbara verktyg på grund av det faktum att de är en till stor del homogen cellpopulation, som är gynnsam för genetiska manipulationer såsom gentystande. Följaktligen är det lätt att undersöka rollen av proteiner som inte kan riktas farmakologiskt när transgena möss är inte tillgängliga. Men cellinjer är inte alltid giltiga modeller av primära celler. Medan det finns många likheter, fynd från primära kulturer har ibland markerade skillnader i de signalvägar som aktiveras av vissa näringsämnen i primära L-celler jämfört med GLUTag-celler, till exempel (t ex. Peptoner <sup class = "xref"> 11). Avgörande, i kombination med transgena fluorescerande reporter möss, gör det möjligt för primär kultur modell ingående granskning av enskilda primär enteroendocrine celler vid den intracellulära nivån. Fluorescensetikette L-celler inom primära kulturer har använts av vår grupp för patch fastspänning ^{1, 12} studier, och encelliga kalcium ^{11, 13} och cykliskt adenosinmonofosfat-FRET avbildning ¹⁴ studier, som har gett betydande framsteg inom området för enteroendokrina fysiologi.

Följande protokoll är optimerad för att utföra utsöndringsexperiment, med användning av en 24-brunnsplatta eller för framställning av upp till 16 avbildnings rätter, från en 10 cm sektion av tunntarmen från en enda vuxen mus. Protokollet kan lätt modifieras för studiet av kolonceller genom att öka uppslutningstider samt collagenase koncentration.

Protocol

Alla djurförsök godkändes av University of Cambridge djurskydd och etiska granskningsorganet och överensstämde med de djur (Scientific Procedures) Act 1986 Ändring förordningarna (SI 2012/3039).

1. Framställning i Advance

1. Placeras en alikvot av basalmembranmatrisen (BMM) (~ 200 | il) på is för att tina.
   OBS: BMM stelnar vid rumstemperatur (RT).
2. Pre-warm 50 ml steril hög-glukos Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) (med inga tillsatser) och ~ 40 ml sterilt odlingsmedium (hög glukos DMEM kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS), 100 U / ml penicillin och 0,1 mg / ml streptomycin (P / S) och 2 mM L-glutamin) i 50 ml centrifugeringsrör i ett vattenbad vid 37 ^° C
3. Pre-chill kalcium- och magnesiuminnehållande fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
4. Väg upp 15 mg kollagenas (XI rå), lägga till ett 50 ml centrifugrör och hålla den på is.

2. Tissue Collection

1. Lägga ~ 20 ml L-15 medium till ett 50 ml centrifugrör och placera den på is.
2. Euthanize en mus genom cervikal dislokation, eller annan godkänd schema 1 metoden.
   OBS: Intestinal vävnad erhålls typiskt från möss på en C57BL6 bakgrund. Emellertid har andra genetiska bakgrunder också använts t.ex. 129 / SvEv ^15. Imaging experiment kräver användning av fluorescerande reporter möss t.ex. GLU-Venus ^1. Vävnad erhålls från vuxna möss (2-6 månader) av båda könen. Mössen inrymda i individually ventilerad burar med fri tillgång till vatten och regelbunden chow. Men experiment testa effekten av en fettrik diet, till exempel på enteroendokrina cellsfunktionen ¹⁶ kan utföras om de stöds av en projektlicens.
3. Dissekera och försiktigt bort mus tarm (från pylorus till start av rektum) med hjälp av pincett och dissektion sax. Förvara den i L-15-medium på is tills det ska användas.

3. Vävnadsberedning

1. Placera tarmvävnad i en 10 cm petriskål innehållande tillräckligt PBS för att täcka vävnaden. Ta 10 cm av önskad vävnad (t.ex. övre tunntarmen, topp 10 cm, distala till pylorus).
2. Spola ut tarminnehållet med hjälp av en plast pasteurpipett och kylda PBS.
   1. Använd pincett, fint grepp ena änden av tarmsegmentet och placera spetsen på en pasteurpipett i den. Spola ut innehållet med kyld PBS. Upprepa från båda ändarna tills majohet av innehållet har tömts ut. Överföring till en ren petriskål som innehåller färsk kyld PBS.
3. Använd pincett, ta bort fettvävnad och tarmkäx, var noga med att inte dra av muskellagret samtidigt.
4. Skala muskellagret off "som en strumpa" under ett dissektionsmikroskop med hjälp av två uppsättningar av fin pincett.
   OBS: Detta steg är inte nödvändigt men rekommenderas starkt. Det finns alternativa sätt att ta bort muskellagret till den som beskrivs här. Till exempel, kan tarmen skäras upp i längdriktningen först, före avlägsnandet av muskellagret.
   1. Hitta en utgångspunkt vid mer proximala änden av vävnaden där det finns en synlig flik av muskler. Dra försiktigt bort en liten mängd muskellagret hela vägen runt tarmen.
      OBS: För att undvika sönderrivning av muskelskiktet eller det intestinala epitelet, minska dragkraften genom att spänna fast en större ytarea stället för att använda tips av fin pincett.
   2. Kläm tarmen och så mycket av muskeln flik som möjligt genom att försiktigt dra isär och börja dra bort muskellagret från hela tarmen. För att undvika att riva både muskellagret och epitel, hålla omjustering placeringen av pincett för att hålla dem nära varandra. På detta sätt, avlägsna muskelskiktet från hela längden av tarmsegmentet och kassering.
5. Skär tarmen öppna längs och tvätta med virvlande i en ren petriskål med färsk kyld PBS. Upprepa om så behövs för att avlägsna eventuella kvarvarande CHYMUS eller slem.
6. Färs vävnad med en kirurgisk skalpellblad för att uppnå rutor av ~ 1-2 mm ² och lägga till dessa i ~ 20 ml kyld PBS i en 50-ml centrifugrör med användning av en Pasteur-pipett. För att undvika vävnadsbitar fastnar på pipetten, avskurna spetsen och väta pipetten genom triturering med PBS.
7. Skaka försiktigt röret för att ytterligare tvätta vävnaden bitar. Tillåta vävnaden sedimentera och häll eller pipette bort majoriteten av PBS och upprepa med färsk PBS tills PBS ser klart.

4. Framställning av BBM-belagda plattan / Porslin och Digestion Medium
OBS: Följande steg skall utföras i en vävnadsodling huva (med inkubationssteg i 37 ° C vattenbad).

1. Bered en 2% BMM lösning i kylt DMEM (utan tillsatser). Under arbetet, hålla lösningen på is. För en 2% -ig lösning, tillsätt 140 | il upptinade BMM till 7 ml DMEM (tillräckligt för att framställa en enda 24-brunnsplatta).
   1. Tillsätt 250 | il 2% BMM lösning per brunn (24-brunnsplatta) eller per glas botten avbildning skålen.
   2. Inkubera belagda plattor / rätter för minst 30 min i en inkubator vid 37 ° C för att möjliggöra adekvat polymerisation av BMM.
2. Tillsätt 50 ml förvärmda DMEM (utan tillsatser) till 15 mg kollagenas (från steg 1,2 och 1,4) för att bilda en 0,3 mg / ml lösning och invertera för att lösa upp.
   1. Påce fullständigt upplöst, med användning av en 20 ml spruta, filtrera kollagenas lösningen genom ett 0,2 ^ m sterilfilter i en ny steril 50 ml centrifugrör. Märk detta som matsmältningen medium.

5. Vävnads Digestion

1. Avlägsna vävnaden bitar från PBS med användning av en 10 ml serologisk pipett och tillsätt till en steril 50-ml centrifugrör innehållande kylt sterilt DMEM (utan tillsatser), virvla runt och sedan bort DMEM.
   OBS: För att undvika vävnad fastnar i serologiska pipett blöt det genom rivning med DMEM före kontakt med vävnaden.
2. 'Digest' 1 och 2: Avlägsnande av cellrester och enstaka celler
   1. Lägga 7 ml uppslutningsmediet till vävnadsbitar och ge röret en virvel.
   2. Inkubera i 5 min i ett vattenbad vid 37 ° C.
   3. Skaka försiktigt (ej virvla) röret för ~ 3 s.
   4. Tillåta vävnaden sedimentera och kassera uppslutningsmediet, reservera enliten volym för att titta på under mikroskop.
      OBS: Speciellt när börjat, är det starkt rekommenderat att inspektera en liten volym av varje 'digest' (~ 30 | il) under mikroskop för att mäta fortskridandet av rötningsprocessen. Om många kryptor observeras vid detta skede kan skakningen vara alltför kraftig. För representativa bilder av vad de olika 'Digest' stadier ser normalt ut, se figur 1.
   5. Upprepa steg 5.2.-5.2.4 (med färskt uppslutningsmedium).
3. 'Digest' 3 och 5: Insamling av crypt fragment
   1. Lägga 7 ml uppslutningsmediet till vävnaden.
   2. Inkubera i 10 min vid 37 ° C.
      1. Under inkubation, skaka varje 5 min för 10-12 s.
         OBS! Skakning är mer kraftfull än att skaka på 'Digest' 1 och 2.
   3. Tillåta osmält vävnad sedimentera och samla uppslutningsmedium i en 15 ml centrifugrör. Omvävnad oavsiktligt uppsamlas tillsammans med mediet, tillåter den sätta sig, ta bort den med hjälp av en 10 ml serologisk pipett och överföra den tillbaka till 50-ml centrifugrör innehållande osmält vävnad.
   4. Centrifug uppsamlades medium / supematant vid RT under 3 min vid 100 x g.
   5. Kassera supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 5 ml förvärmda odlingsmediet genom försiktig triturering och ställ åt sidan.
   6. Inspektera en liten volym av cellsuspensionen under mikroskop (se anmärkning från steg 5.2.4).
      OBS: Helst crypt fragment börjar visas i 'digest' 3 tillsammans med celldebris och enskilda celler. 'Digest' 4 och 5 innehåller en signifikant större antal crypt fragment med nedsatt cellrester (Figur 1). Justera skakning intensitet som behov, dvs. om vävnaden inte smälta och crypt fragmenten visas inte, skaka mer kraftfullt.
   7. Upprepa steg 5.3.1-5.3.6 fram till 5 'Digest' harfullbordats eller tills majoriteten av vävnaden har digererats (en ^{6: e} digere kan behövas).
   8. När alla supernatanter från 'digere' 3-5 (eller 3-6) har samlats in, centrifugera smälta supernatanter vid RT under 3 min vid 100 x g.
   9. För sekretionsexperiment, kombinera supernatanterna från 'digere' 3-5 (eller 3-6) före centrifugering.
      OBS: Mindre vävnad behövs för avbildningsexperiment, därför välja den digest supernatant som är den renaste (frånvaro av cellrester och enstaka celler) med det större antalet crypt fragment. Detta är vanligtvis 'smälta' 4 eller 5.
   10. Kassera supernatanten och försiktigt återsuspendera pelleten genom triturering tills inga klumpar är synliga. Återsuspendera pelleten i förvärmda odlingsmedium kompletterat med 10 | iM Y-27.632 dihydroklorid (för att förhindra anoikis ^17). Använda 5 ml för sekretionsexperiment och 2 ml odlingsmedium för avbildning experiment.
   11. Filtreracellsuspension genom en 100-pm filter (för att avlägsna eventuellt osmält vävnad). Köra en ytterligare 2 ml förvärmda odlingsmedium genom filtret för att tvätta (total volym: 7 ml och 4 ml för utsöndring och avbildning, respektive).
       OBS: Filtrering är inte nödvändigt, emellertid, större vävnadsfragment tenderar att inte vidhäfta till plåt / rätter.

Figur 1: representativa bilder av 'digere' från primär tunntarmsodlingsmetod. (A) Karaktäristisk material från 'digere' 1 och 2 innehållande primärt enskilda celler och cellrester. (B) Ett exempel på produkter från 'smälta' 3. De svarta pilarna visar crypt fragment som förekommer i det smälta materialet. (C) Typiska för 'digest' 4 eller 5. Panel (D) representerar poolade smälta materialet från'digere' 3-5 passera genom ett 100 pm filter för att avlägsna de större oönskade vävnadsfragment som ses i (C). Alla bilder togs med hjälp av en digital inverterat mikroskop med en 20X mål. Skalstrecken = 100 um. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

6. Plätering Tarmkulturer (Berikat för kryptceller)

1. Avlägsna överskott av BMM-lösning från plattan eller rätter, och tillsätt 250 | il förvärmd odlingsmedium per utsöndring brunn.
   OBS: Imaging rätter lämnas utan mediet så vidare till nästa steg snabbt för att förhindra att skålen från att torka ut.
2. Plattan 250 | il cellsuspension per brunn (24-brunnsplatta) eller per glas nedre skålen.
   1. Plate droppvis i en långsam 'sick-sack' rörelse över brunnen. Tillåta crypt fragment sedimentera under ~ 5 min innan förflytta plattan till the inkubator.
      OBS: Detta bör uppmuntra en jämn fördelning av kryptor / celler i brunnen.
3. Inkubera plattan eller rätter över natten vid 37 ° C och 5% _CO2.
   OBS! 'Ojämn' monolager borde ha bildats. För en representativ bild av kulturer efter tre tvättar, se figur 2A.
4. översvämning avbildnings rätter med 2 ml förvärmda odlingsmedium per skål.
   OBS! Dessa rätter kommer att vara lämpliga för avbildning upp till ~ 72 timmar efter plätering. Kolon kulturer varar vanligtvis längre, upp till 7 dagar. Celler som inte har vidhäftade kan avlägsnas genom ett tvättsteg. Primära kulturer är nu redo att användas för experiment.

Representative Results

Användningen av serie matsmältning steg möjliggör insamling av en relativt ren beredning av crypt fragment som skall pläteras för experiment. De två första digere avlägsna primärt enskilda celler och cellavfall från smälta materialet (Figur 1A). Under det tredje digere, crypt fragment visas i den digererade materialet (figur 1B). Digests 4 och 5 utbyte ett större antal crypt fragment med färre enskilda celler (Figur 1C). Filtrering av det poolade materialet från digere 3-5 avlägsnar större bitar av osmält vävnad, som kan vara skadliga för kulturen, som producerar en ren krypta fragmentpreparat (figur 1D).

Efter 18-24 timmar av kultur, är monoskikt av primära små tarmceller observeras (Figur 2A). Med användning av kulturer som genereras från transgena möss specifikt uttrycker calcium fluorescerande sensor, GCaMP3, under kontroll av den proglukagon promotorn ^11, L-celler är lätt identifierbara och uppblandat inom odlingen (figur 2B). I primära små tarm kulturer, föreningar med inriktning på _Gq -Ca ²⁺ _i och cAMP _jag -beroende vägar stimulerade utsöndringen av GLP-1 (för utsöndring experiment metodik se et al. Reimann ^1). Bombesin (BBS, 100 nM) och co-tillämpning av forskolin och 3-isobutyl-1-metylxantin (IBMX) (F / I, 10 ^ M vardera) utlöste en 2- och 11-faldigt, stimulering av GLP-1 frisättning i förhållande till basala, respektive (figur 2C). Specifik L-cell expression av GCaMP3 möjliggör identifiering av och övervakning i realtid av kalciummobilisering i enskilda L-celler. Både 100 nM bombesin (BBS) och 30 mM kaliumklorid (KCl) stimulerade variga ökningar av intracellulärt kalcium indikerar den kända G _{q <}/ sub> - och elektrogen kopplade vägar i primära L-celler (Fig 2D).

Figur 2: Representativa data härledda från primära små tarm kulturer. Exempel bilder av blandade primära tunntarmskulturer som används för (A) sekretion och (B) imaging experiment posta 24 h plätering. (A) Bild tagen från en 24-brunnar, med användning av en digital inverterat mikroskop med en 4X objektiv. Scale bar = 500 | im. (B) Med användning av GLU-Cre x ROSA26 GCamP3 möss, L-celler i synfältet (gröna celler) identifierades genom fluorescensen av GCaMP3. Skala stapel representerar 50 um. (C) GLP-1-utsöndring mättes i respons på bombesin (BBS, 100 nM) och forskolin / 3-isobutyl-1-metylxantin (IBMX) (F / I, 10 ^ M vardera). Procentuell GLP-1-utsöndring beräknadesgenom mätning av GLP-1-nivåer i supernatanterna och cellysat. Data representerar medelvärden ± SEM av n = 3 för varje tillstånd. (D) GCaMP3 fluorescens (reflekterande cytosoliskt kalcium) av de två cellerna som beskrivs i (B) övervakas i realtid som svar på kaliumklorid (KCl, 30 mM) och BBS (100 nM). Enda cell imaging utfördes med användning av ett inverterat fluorescensmikroskop med ett 40X oljeimmersionsobjektiv. GCaMP3 exciterades vid 475/10 nm, med användning av en 75 W xenon båglampa och en monokromator styrs av fluorescens bildprogram. Emission registrerades med en högupplöst digital laddningskopplad anordning (CCD) kamera med användning av en dikroisk spegel och en 510-560 nm bandbreddsfilter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Detta protokoll beskriver isolering och odling av blandade murina små tarmceller för att möjliggöra studier av tarmpeptidsekretion och enkelcell avbildning av märkta enteroendocrine celler.

För att öka sannolikheten av de små tarm kulturer vara framgångsrika, är det viktigt att protokollet genomförs så snabbt som möjligt (helst inom 3 h från skörd av vävnad) och att vävnaden hålles i is-kallt medium eller buffert före till uppslutningsprocessen, för att begränsa celldöd. Även om det inte är nödvändigt, särskilt för kolon kulturer är avlägsnande av muskellagret från tunntarmen uppmuntras starkt. Tunntarmens kultur protokoll har standardiserats så mycket som möjligt. Det är dock viktigt att notera att ingen rötningen är identiska. Det finns många steg under detta protokoll där variabilitet kan införas på en dag till dag, t.ex. graden av muskel borttagning, storleken på than 'malet' vävnadsbitar, styrkan i skakning, potensen hos en viss sats av kollagenas osv. Det är därför, av största vikt för att inspektera alikvoter av var och en av de olika 'digests' under mikroskop för att bedöma utvecklingen av rötningsprocessen och skräddarsy skakning och antalet 'digere' i enlighet därmed. Det rekommenderas att skaka mer försiktigt till att börja med, och om crypt fragment inte är uppenbara från 'smälta' 3 och framåt, för att börja skaka mer kraftfullt.

Från vår erfarenhet, inte enteroendocrine cellerna inte förökar sig i kultur och vanligtvis försvinner från små tarm kulturer inom 4 dagar. Icke desto mindre, ger detta gott om tid att utföra tarmpeptidsekretionsexperiment (genomföres typiskt över 2 h, 18-24 h efter plätering) för att testa fysiologiska stimuli och / eller farmakologiska medel. Experiment som kräver en inkubation över natten före utsöndringen experimentet är också möjliga, t.ex.i fallet med förbehandling med pertussistoxin ^15.

Den primära tekniken kulturen presenteras här är en väl etablerad metod, vilket framgår av volymen av forskningsresultaten har producerat genom åren. Primärkulturen modell har använts för att studera utsöndringen av en mängd olika tarmpeptider, inklusive GLP-1 ^1, GIP ¹⁸ och PYY ^19, som svar på varierande näringsämnen och icke-närings ^{14, 20} stimuli och hämmare. Vidare har samma teknik med framgång tillämpas på odling av humana intestinala celler ^21. Ofta, en kombination av den primära cellodlingsmetod tillsammans med ytterligare en experimentmodell t.ex.. ex vivo eller in vivo kan ge den mest insikt ^6. Noterbart och till skillnad från andra metoder, har denna teknik imtig applikationer utöver mätningen av tarmen peptidfrisättning. Vi har visat att primära tunntarms kulturer härledda från transgena reporter möss är kraftfulla verktyg för förhör av intracellulära signaleringsvägar är kopplade till gut peptidsekretion, med användning av exempelvis Ca2 ⁺ och cAMP-sensorer, GCaMP3 ^{11, 13} och Epac2camps ^14, respektive, såväl som elektrofysiologiska tekniker ^12.

Som med alla in vitro-modeller, de primära intestinala kulturer har vissa inneboende begränsningar, inkluderande minskning av polariteten hos epitelceller i odling, samt förlust av försörjning och innervation blod. Det är svårt att uppskatta de potentiella effekterna av dessa konstgjorda villkor enteroendokrina cellfunktion. Dock har data som erhållits från primära kulturer ofta varit översättnings i in vivo Setting (t ex effekter av kortkedjiga fettsyror på GLP-1-utsöndring ^15).

De primära intestinala kulturer är en mångsidig teknik med många potentiella tillämpningar. De har redan gett viktiga mekanistiska inblick i regleringen av tarmpeptidsekretion.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well plates	Costar	3524	For secretion experiments
Bombesin	Sigma-Aldrich	B4272	Positive control (calcium imaging experiment)
Centrifuge tubes, 15 mL, sterile	Greiner bio-one	188261	For tissue preperation/digestion
Centrifuge tubes, 50 mL, sterile	Corning	430828	For tissue preperation/ digestion
Collagenase XI (Crude)	Sigma-Aldrich	C9407	For making up digestion medium
Dichroic mirror	Cairn Research	-	For imaging experiments
DMEM High glucose (4500 mg)	Sigma-Aldrich	D6546	For dissolving matrigel (keep at 4 °C). For making up digestion medium, pre-warm to 37 °C.
Emission Filter (Bandwidth 510-560 nm)	Cairn Research	-	For imaging experiments
Foetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F7524	For making up culture medium
Forceps/Tweezers	Agar Scientific	AGT520	For dissection/removal of intestine
Forskolin	Sigma-Aldrich	F6886	Positive control (secretion experiment)
Glass-bottomed dishes (35 mm)	MatTek	P35G-0-14-C	For imaging experiments
High precision tweezer (110 mm)	IDEAL-TEK	3480641 (5 SA)	For removing muscle layer
High resolution digital CCD camera	Hamamatsu	ORCA-ER	For imaging experiments
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich	I7018	Positive control (secretion experiment)
L-15 Medium (Leibovitz)	Sigma-Aldrich	L1518	For collecting tissue, keep on ice
L-glutamine	Sigma-Aldrich	G7513	For making up culture medium
Matrigel	Corning	354234	Basement Membrane Matrix, for coating plates and dishes
MetaFluor	Molecular Devices (supplied by Cairn Research)	-	Fluorescence ratio imaging software
Mice (C57BL6)	Charles River Laboratories	C57BL/6J	Background mice used for breeding. Can also be used for secretion experiments
Mice (GLU-cre x ROSA26 GCaMP3)	in house	-	For calcium imaging and secretion experiments
Microscope (EVOS XL Core)	Thermo Fisher Scientific	AMEX1000	For photomicrographs of cultures
Microscope	Olympus	IX71	Inverted microscope with 40X oil objective used for imaging experiments
Monochromator	Cairn Research	-	For imaging experiments
Pasteur pipettes	Alpha Laboratories	LW4234	For cleaning tissue
PBS containing Ca2+ and Mg2+	Sigma-Aldrich	D8662	For washing tissue, keep on ice
Penicillin & Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781	For making up culture medium
Petri dishes (100 mm x 20 mm)	Corning	CLS430167	For cleaning tissue and removing muscle layer
Potassium chloride	Fisher Scientific	P/4280/53	Positive control (calcium imaging experiment)
Scissors	Agar Scientific	AGT554	For dissection/removal of intestine
Sterile cell strainer 100 µm	Fisher Scientific	22363549	For filtering crypt cell suspension prior to plating
Surgical scalpel blade No.22 (sterile, stainless)	Swann Morton	0308	For dicing tissue
Syringe filters, Minisart NML (0.2 µm pore size)	Sartorius	16534-K	For filter-sterilising collagenase solution (digestion medium)
Syringes, 20 mL, disposable, sterile, Luer slip	BD	300613	For filter-sterilising collagenase solution (digestion medium)
Xenon arc lamp 75W	Cairn Research	-	For imaging experiments
Y-27632 dihydrochloride	Tocris	1254	ROCK inhibitor, prepare 10 mM stock solution in sterile water (use 1:1,000 in final culture medium)