कैंसर तंत्रों और चिकित्सीय प्रतिक्रियाओं की पहचान के लिए कैंसर की कोशिकाओं के प्रत्यारोपण एक महत्वपूर्ण उपकरण है। वर्तमान तकनीक प्रतिरक्षा-अक्षम जानवरों पर निर्भर करती हैं। यहां, हम ट्यूमर सेल व्यवहार के दीर्घकालिक विश्लेषण और विवो औषधि प्रतिक्रियाओं में प्रतिरक्षा-सक्षम भ्रूण में zebrafish ट्यूमर कोशिकाओं के प्रत्यारोपण के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं।
ट्यूमर सेल ट्रांसप्लांटेशन कैंसर सेल विकास, प्रवासन, और मेजबान प्रतिक्रिया को नियंत्रित करने के साथ ही चिकित्सा के लिए संभावित रोगी प्रतिक्रियाओं का आकलन करने के लिए तंत्र को परिभाषित करने के लिए एक महत्वपूर्ण तकनीक है। ट्यूमर भ्रष्टाचार की अस्वीकृति से बचने के लिए मौजूदा तरीकों का मुख्य कारण सिग्नेनिक या प्रतिरक्षा-समझौता जानवरों का उपयोग करने पर निर्भर करता है। इस तरह के तरीकों को विशिष्ट आनुवांशिक उपभेदों के उपयोग की आवश्यकता होती है जो प्रायः प्रतिरक्षा-ट्यूमर सेल के विश्लेषण के विश्लेषण को रोकते हैं और / या विशिष्ट आनुवंशिक पृष्ठभूमि के लिए सीमित हैं। Zebrafish में एक वैकल्पिक विधि 3 दिनों से पहले भ्रूण के मस्तिष्क में एक अपूर्ण विकसित प्रतिरक्षा प्रणाली का लाभ लेता है, जहां ट्यूमर कोशिकाओं को अल्पावधि assays ( यानी, 3 से 10 दिनों) में उपयोग के लिए प्रत्यारोपित किया जाता है। हालांकि, इन तरीकों का कारण होस्ट व्यथा है, जो ट्यूमर सेल व्यवहार और दवा की प्रतिक्रिया के दीर्घकालिक अध्ययन को रोकता है। इस प्रोटोकॉल में ज़ेबराफिश ब्रेन ट्यूमर के ऊतक के दीर्घकालिक ऑर्थोपीक प्रत्यारोपण के लिए एक सरल और कुशल विधि का वर्णन किया गया है।एक 2 दिवसीय पुरानी प्रतिरक्षा-सक्षम zebrafish के चौथे वेंट्रिकल को इस पद्धति की अनुमति है: 1) ट्यूमर कोशिका व्यवहार का दीर्घकालिक अध्ययन, जैसे कि आक्रमण और प्रसार; 2) ड्रग्स के टिकाऊ ट्यूमर प्रतिक्रिया; और 3) ट्यूमर के विकास और / या विभिन्न मेजबान आनुवंशिक पृष्ठभूमि के प्रभाव के अध्ययन के लिए ट्यूमर के पुन :प्रदान। संक्षेप में, यह तकनीक कैंसर के शोधकर्ताओं को कई महीनों में रासायनिक पट्टियों और सेल प्रतियोगिता के एशेज के साथ-साथ दूर-दूर तक साइटों पर इंग्रग्रेटमेंट, आक्रमण और विकास का आकलन करने की अनुमति देती है। इस प्रोटोकॉल को अन्य ट्यूमर प्रकारों के अध्ययन के लिए बढ़ाया जा सकता है और इसका उपयोग रसायनज्ञता और मेटास्टेसिस के तंत्र को स्पष्ट करने के लिए किया जा सकता है।
ट्यूमर कोशिकाओं में प्रतिरक्षा-समझौता जानवरों में प्रत्यारोपण, विशेष रूप से माउस एक्सनोग्राफ्ट, एक व्यापक रूप से इस्तेमाल की जाने वाली तकनीक है जो कि कैंसर सेल प्रसार 1 , 2 , अस्तित्व, आक्रमण और मेटास्टेसिस 3 , 4 को नियंत्रित करने के साथ-साथ एक मंच प्रदान करने के लिए तंत्र का अध्ययन करता है 5 , 6 , 7 की स्क्रीनिंग दवाओं के लिए हाल ही में, प्राथमिक ट्यूमर के नमूनों की प्रतिरक्षा-समझौता चूहों में प्रत्यारोपण रोगी-व्युत्पन्न एक्सनोग्राफ्ट (पीडीएक्स) मॉडल को नैदानिक और पूर्व-क्लिनिक दवा स्क्रीनिंग उद्देश्यों के लिए उपयोग करने के लिए किया गया है और यह व्यक्तिगत चिकित्सा पहल की रीढ़ है 8 , 9 , 10 , 11 । हालांकि, महत्वपूर्ण साक्ष्य से पता चलता है कि प्रतिरक्षा प्रणाली modulatingस्टेम ट्यूमर के व्यवहार और रोगी परिणाम 12 , 13 पर एक नाटकीय प्रभाव हो सकता है। इसने "मानवीकृत" चूहों को शामिल करने के लिए एक्सनोग्राफ्ट आधारित तकनीकों का नया डिज़ाइन प्रेरित किया है, जिसमें ट्यूमर कोशिकाओं के साथ मानव प्रतिरक्षा कोशिकाओं के सह-प्रत्यारोपण द्वारा माउस की प्रतिरक्षा प्रणाली का पुनर्गठन किया गया है। हालांकि, यह तरीका तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है, चरणीय प्रजनन क्षमता और तकनीक से जुड़ी विषाक्तता, 14 , 15 की महत्वपूर्ण लागत के अलावा। इस प्रकार, प्रतिरक्षा-सक्षम जानवरों में नई प्रत्यारोपण तकनीक की आवश्यकता होती है जो कि कैंसर की प्रगति और नशीली दवाओं की प्रतिक्रिया के प्रतिरक्षा-और ट्यूमर-विशिष्ट तंत्र की खोज में तेजी लाने की आवश्यकता होती है।
ज़ेबराफिस मानव कैंसर के अध्ययन के लिए एक वैकल्पिक पशु मॉडल हैं, जिसमें से 20 से अधिक कैंसर के मॉडल अब 16 की स्थापना कर चुके हैं, जिनमें अत्यधिक घातक मस्तिष्क 17 , मेला नमा 18 , 1 9 , 20 , और अग्नाशय के कैंसर 21 , 22 , साथ ही साथ कई ल्यूकेमिया 23 , 24 , 25 , 26 , 27 Zebrafish प्रणाली के दो विशेषताओं कैंसर अनुसंधान के लिए विशेष रूप से इसे सक्षम बनाता है: 1) पारदर्शी जानवरों की ऑप्टिकल स्पष्टता सरल माइक्रोस्कोपी तकनीकों का उपयोग कर कैंसर सेल व्यवहार ( यानी, प्रसार, अस्तित्व, आक्रमण और प्रसार) के प्रत्यक्ष दृश्य के लिए अनुमति देता है 2) महिला zebrafish प्रति दिन 200 भ्रूण पैदा कर सकता है, जिससे कम लागत पर आनुवांशिक या दवा स्क्रीनिंग के लिए पशु संख्याओं में तेजी से स्केलिंग की अनुमति मिलती है। इसके अलावा, zebrafish और मनुष्यों के कैंसर जीनोम अत्यधिक संरक्षित हैं (ओंकोजिन और ट्यूमर-दमनकारी जीन सहित)28 ", जिससे तंत्रज्ञानी और ड्रग की खोजों को तेजी से स्तनधारी प्रणालियों में अनुवादित किया जा सके। इन विशेषताओं में भी प्रत्यारोपण तकनीक के लिए zebrafish एक आदर्श पशु मॉडल बनाते हैं, जो इमेजिंग, स्केलेबिलिटी और सिस्टम की कम लागत का लाभ लेते हैं।
प्रतिरक्षा-समझौता zebrafish में पिछले ट्यूमर प्रत्यारोपण के अध्ययन ने आत्म-नवीकरण क्षमता, ट्यूमर की दुर्दशा, और आक्रमण / प्रसार 11 , 2 9 की पहचान में सहायता की है । ट्यूमर कोशिका व्यवहार का अल्पकालिक अध्ययन γ- विकिरणित वयस्कों में निम्नलिखित प्रत्यारोपण के लिए किया जा सकता है, जिनकी प्रतिरक्षा प्रणाली ~ 20 दिन 11 , 30 के लिए प्रभावी रूप से दब गई है। अस्वीकृति के साथ वयस्क zebrafish के इलाज के साथ 30 दिन तक बी- और टी-कोशिकाओं को खारिज कर दिया जाता है। एक और कम आम रणनीति क्लोनल ज़ेबराफिश उपभेदों को रोजगार देती हैजो प्रतिरक्षा-सक्षम होस्ट 32 में दीर्घकालिक जांच को सक्षम करता है हालांकि, केवल सीमित संख्या में क्लोनल उपभेदों का निर्माण किया गया है और कम उर्वरता के कारण बनाए रखना मुश्किल है। इसके अलावा, अधिकांश स्थापित जैबराफिश ट्यूमर मॉडल अन्य आनुवंशिक पृष्ठभूमि में उत्पन्न होते हैं, इसलिए इन ट्यूमर को प्रतिरक्षा तंत्र 11 , 33 , 34 को दबाने के बिना क्लोनल नस्लों में प्रत्यारोपित नहीं किया जा सकता है। लंबे समय तक प्रत्यारोपण के अध्ययन में सुधार के लिए हाल के दृष्टिकोणों में शामिल हैं, आरजी 2 E450fs उत्परिवर्ती लाइन का विकास, जिसमें समझौता बी- और टी-सेल फ़ंक्शंस शामिल हैं, जिसका इस्तेमाल कई कैंसर 35 , 36 को सफलतापूर्वक ट्रांसप्लांट करने के लिए किया गया है। क्लोनल ज़ेब्राफिश लाइनों या प्रतिरक्षा-समझौता मेजबान के लिए आवश्यकता को दरकिनार करने के लिए, कई समूहों ने प्रारंभिक चरण के भ्रूण ( यानी, > 72 एचपीमानव ट्यूमर कोशिका प्रत्यारोपण के लिए उप-निषेचन (एचपीएफ)) के रूप में, इन भ्रूणों ने अभी तक पूरी तरह से अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली 37 , 38 , 3 9 , 40 , 41 , 42 , 43 नहीं विकसित की है। हालांकि, ये पद्धति ट्यूमर सेल व्यवहार या दवा प्रतिक्रिया (आमतौर पर कम से कम 2 सप्ताह) के अल्पकालिक विश्लेषण तक सीमित होती हैं क्योंकि मानव कैंसर कोशिकाओं या ट्रांसप्लांटेशन तकनीक स्वयं मेजबान को मारता है, दीर्घकालिक अध्ययन और पुन: प्रत्यारोपण को रोकता है।
इस प्रोटोकॉल में एक संशोधित भ्रूण प्रत्यारोपण विधि का विवरण दिया गया है जो 2 दिन के बाद निषेचन (डीपीएफ) भ्रूण मस्तिष्क के चौथे वेंट्रिकल के लुमेन में है। यह मेजबान को विषाक्तता को कम करता है और ट्यूमर कोशिकाओं के दीर्घकालिक engraftment के लिए zebrafish ब्रेन ट्यूमर मॉडल के साथ जोड़ा जा सकता है। इस प्रकार, यह तकनीक अलट्यूमर कोशिकाओं के पुन: प्रत्यारोपण के लिए कई पीढ़ियों में नए मेजबानों के लिए चढ़ाव, ट्यूमर विविधता, मेजबान / प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं, दवा प्रतिक्रियाओं, या मेटास्टैटिक क्षमता पर भविष्य के अध्ययन की सुविधा देता है। यह पद्धति भी सरल, कुशल और स्केलेबल है, क्योंकि प्रति दिन एक एकल उपयोगकर्ता द्वारा 300 प्रत्यारोपण किए जा सकते हैं, जिसमें 9 0% इंग्रैमेंटमेंट हैं। इससे आनुवंशिक या दवा स्क्रीनिंग परियोजनाओं के लिए 2 डीपीएफ पर भ्रूण के सैकड़ों भ्रूण में एकल प्राथमिक ट्यूमर के तीव्र प्रचार की अनुमति मिल सकती है या कई महीनों में अलग-अलग मेजबान पृष्ठभूमि में सीधे ब्रेन ट्यूमर सेल व्यवहार की कल्पना कर सकता है।
यह प्रोटोकॉल एक साधारण और कुशल प्रत्यारोपण परख का विवरण देता है जिसमें 2 डीपीएफ भ्रूण के निलय में zebrafish ट्यूमर कोशिकाओं का इंजेक्शन शामिल होता है जो पूरी तरह से सक्षम प्रतिरक्षा प्रणाली विकसित करेगा। अब तक, सीओएन-पीएनईई 17 और मेलेनोमा (डेटा नहीं दिखाया गया है) को सफलतापूर्वक ट्यूमर सेल व्यवहार और आक्रमण के दीर्घकालिक अध्ययन के लिए ट्रांसप्लांट किया गया है। इस प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण कदमों में उचित सुई बोर आकार और उचित ट्यूमर सेल निलंबन सुनिश्चित करने और मेजबान भ्रूण पर्याप्त रूप से anesthetizing सुनिश्चित करना शामिल है। प्रत्येक व्यक्ति के शोधकर्ता के लिए, इस तकनीक के आगे अनुकूलन में ट्यूमर सेल एकाग्रता, इंजेक्शन दबाव, और भ्रूण अभिविन्यास के समायोजन शामिल हो सकते हैं। इसके अलावा, अलग-अलग ट्यूमर से होने वाली निलंबन की चिपचिपाहट में विविधता हो सकती है, इसलिए अलग-अलग ट्यूमर प्रकार पुनः-निलंबित और प्रत्यारोपण के लिए अधिक या कम मुश्किल हो सकता है। हालांकि, सुई बोर आकार का समायोजन करके और diffe का उपयोग करकेट्यूमर के निलंबन के किरायों का किराया, ट्यूमर चिपचिपापन से जुड़े कठिनाइयों को दूर करना संभव है
हमारे अनुभव में, वेंट्रिकल में विरल कोशिकाओं / असंगत कोशिकाओं के लिए सबसे सामान्य कारण इस प्रकार हैं: 1) ट्यूमर सेल निलंबन बहुत पतला है; 2) सुई बोर आकार बहुत छोटा है; 3) इंजेक्शन का समय और दबाव बहुत कम है; और / या 4) शेष ऊतक ट्यूमर से फ़िल्टर नहीं किए गए थे और सुई में दर्ज किए गए थे। जब ट्यूमर सेल निलंबन इंजेक्शन के बाद वेंट्रिकल से बहता है, तो यह होने की संभावना है: 1) वेंट्रिकल के तल के खिलाफ सुई का स्थान; 2) एक उच्च इंजेक्शन दबाव और समय; और / या 3) एक सुई बोर आकार जो बहुत बड़ा है प्रत्यारोपित भ्रूणों का निम्न अस्तित्व निम्न कारण हो सकता है: 1) समय की विस्तारित अवधि के लिए भ्रूण को संवेदनाहट करना; 2) इंजेक्शन प्लेट पर भ्रूण छोड़कर सूखने के लिए; 3) वायुमंडल में हवा के बुलबुले का इंजेक्शन; और / या 4) महत्वपूर्ण अंगों को छेदना, जैसे कि मस्तिष्क औरदिल, क्योंकि सुई वेंट्रिकल के माध्यम से चला गया।
प्रौढ़ या भ्रूणीय zebrafish मस्तिष्क में ट्यूमर प्रत्यारोपण के पूर्व तरीकों वयस्कों में immunosuppression (आनुवंशिक रूप से, फार्माकोलॉजिकल या विकिरण के माध्यम से ) पर निर्भर हैं या 38 , 43 , 52 , 53 , 54 के भ्रूण में मानव या माउस कोशिकाओं के अल्पकालिक अध्ययन तक ही सीमित हैं । उदाहरण के लिए, अल्पावधि (~ 2 दिन) प्री-क्लिनिकल ड्रग एशेज 54 में प्रयोग के लिए माउस ब्रेन ट्यूमर को इंटैनैसल से डेक्सैमेथेसोन-इम्युनोसप्रेसेड, 30-डीपीएफ, किशोर zebrafish में इंजेक्ट किया जा सकता है। हालांकि, इन प्रयोगों में इंजेक्शन की साइट खोपड़ी और मस्तिष्क के ऊतकों और सामान्य मस्तिष्क के ऊतकों को नुकसान में संभावित परिणाम से छिपा हुआ है, जो मेजबान व्यवहार्यता और इंजेक्शन क्षमता को कम करता है। एक अन्य हाल में वर्णित विधि में मानवीय ग्लिब का इंजेक्शन शामिल हैफिजोमा कोशिका लाइनें ज़ेबराफिश भ्रूण के मध्य-मध्य क्षेत्र में, जिससे विकास, आक्रमण और ड्रग की प्रतिक्रिया 43 के अल्पकालिक विश्लेषण को सक्षम किया गया। फिर, इंजेक्शन साइट का सटीक स्थान चर और संभावित नुकसान सामान्य ऊतक है। इस प्रकार, भ्रूण मस्तिष्क प्रत्यारोपण के पिछले तरीकों में अक्सर मेजबानों की व्यवहार्यता का समझौता किया जाता है, इन अध्ययनों को अल्पावधि विश्लेषण ( यानी, 2 से 14 दिनों) तक सीमित कर दिया जाता है, जिससे अस्पष्ट इंजेक्शन साइटों के कारण व्यक्तिगत इंजेक्शन के बीच बढ़ती हुई परिवर्तनशीलता, और लंबे- सेल व्यवहार और दवा प्रतिक्रियाओं या कई पीढ़ियों भर में फिर से प्रत्यारोपण के लिए अवधि का विश्लेषण।
यहां वर्णित विधि में शोधकर्ताओं को अनुमति देने के द्वारा zebrafish भ्रूण और प्रतिरक्षा-समझौता प्रत्यारोपण तकनीकों में मौजूदा सीमाओं को संबोधित किया गया: 1) प्रतिकृत रूप से आसपास के ऊतकों को कम नुकसान के साथ, उसी स्थान में इंजेक्शन; 2) सीधे अधिकतम करने के लिए इंजेक्शन की साइट कल्पनाइंग्रीमेंटमेंट दक्षता; 3) प्रति दिन भ्रूण के सैकड़ों प्रत्यारोपण; 4) ट्यूमर को प्रतिरक्षा-सक्षम जानवरों में विकसित करने की अनुमति; 5) ट्यूमर सेल व्यवहार और टिकाऊ दवा प्रतिक्रियाओं की निगरानी के लिए zebrafish के जीवन पर अनुमति; और 6) ट्यूमर के विकास या ड्रग रिप्लस तंत्र पर संभावित अध्ययन के लिए कई पीढ़ियों तक ट्यूमर के पुन: प्रत्यारोपण की अनुमति देते हैं। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल में शोधकर्ताओं को विभिन्न प्रतिरक्षा आबादी सहित मेजबान प्रतिक्रिया के मूल्यांकन के लिए किसी भी zebrafish जीनोटाइप का उपयोग करने में सक्षम बनाता है। इन विशेषताओं ने इस विधि को किसी भी प्रयोगशाला द्वारा आसानी से अनुकूलनीय बनाया है जो पहले से ही zebrafish में मानक microinjections प्रदर्शन करता है। अंत में, जबकि यह विधि zebrafish ब्रेन ट्यूमर के orthotopic इंजेक्शन के लिए आदर्श है, जब अन्य ट्यूमर प्रकार, जैसे कि यकृत या अग्नाशयी, ट्रांसथ्लंटिक साइट, प्रतिरक्षा क्षमता की तुलना में अधिक महत्वपूर्ण हो सकती है ( उदाहरण के लिए, यदि कोई शोधकर्ता स्ट्रॉमल के प्रभावों का अध्ययन कर रहा है ट्यूमर के विकास पर सूक्ष्म वातावरण) इस परिदृश्य में,नव विकसित, प्रतिरोधी ट्यूमर ट्रांसप्लांटेशन 11 के प्रदर्शन के लिए प्रतिरक्षा-कमी वाले ज़ेब्राफ़िश मॉडल अधिक उपयुक्त हो सकते हैं।
इस प्रोटोकॉल का उपयोग ट्यूमर सेल प्रतियोगिता एशेज करने और दोहरे लेबल वाले ट्यूमर को इंजेक्षन करने के लिए किया गया है। ट्यूमोरिजिनेसिस पर रासायनिक यौगिकों की प्रभावशीलता के आकलन के लिए एक संभावित उपचार रणनीति, जिसमें दवाओं को पानी में जोड़ने के माध्यम से भ्रूण के बाद ट्रांसप्लांट का उपचार शामिल है, पर भी चर्चा की गई थी। प्रत्यारोपण से पहले ट्यूमर कोशिकाओं के पूर्व विवो उपचार के लिए एक विधि भी पहले 17 की सूचना मिली थी। इसके अतिरिक्त, प्रत्यारोपित ट्यूमर को पुन: प्रत्यारोपण के कई दौरों के लिए जोड़ा गया है, जो ट्यूमर के विकास और केमोरेसिस्टेंस 17 के अध्ययन के लिए फायदेमंद होगा। वर्तमान में, पूर्व-नैदानिक अध्ययन संभावित रूप से यौगिकों की प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए माउस एक्सनोग्राफ्ट पर निर्भर हैं। हालांकि, ये अध्ययन समय-उपभोक्ता हैंऔर महंगा Zebrafish और मनुष्यों 28 के बीच ओंकोजेनिक संकेत मार्गों के उच्च स्तर के संरक्षण को ध्यान में रखते हुए, यह उम्मीद है कि इस पद्धति में पूर्व-नैदानिक और नैदानिक परीक्षणों में प्रवेश करने वाले प्रभावी यौगिकों की अधिक तेज़ पहचान की अनुमति देने के लिए पारंपरिक माउस और मानव कोशिका के अध्ययन को पूरा किया जाएगा। अंततः, यह विधि प्राथमिक रोगी ट्यूमर की तेजी से रासायनिक जांच के लिए उपयोगी साबित हो सकती है, जो व्यक्तिगत चिकित्सा पहल को आगे बढ़ा सकती है। हालांकि, zebrafish (वयस्क या भ्रूण) में मानव कोशिकाओं की दीर्घकालिक वृद्धि के लिए अभी भी पहचान की आवश्यकता है
The authors have nothing to disclose.
हम उत्कृष्ट समीक्षाओं और पांडुलिपि में सुधार के लिए दो समीक्षकों का धन्यवाद करते हैं। हम पशुपालन और रखरखाव के लिए हंट्समान कैंसर संस्थान / यूटा विश्वविद्यालय भी धन्यवाद करते हैं। यह काम अमेरिकी कैंसर सोसाइटी (# 124250- आरएसजी-13-025-01-सीएसएम), एनआईएच अनुदान (पी 30 सीए 0442014 सीआरआर प्रोग्राम), यूटा विश्वविद्यालय यूके बीज ग्रांट, और हंट्समान कैंसर फाउंडेशन द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Egg water | in house | maintaining embryos, making injection plate | |
Methylene Blue | Sigma-Aldrich | M9140 | add to egg water to prevent fungal growth |
Petri dish | Thermo Fisher | FB0875711Z | housing embryos, making injection plate |
50 ml beaker (2 inch diameter) | Any commercial brand | making injection plate | |
Agarose | Denville | CA3510-8 | making injection plate |
Glass Container | Any commercial brand | making injection plate | |
Tweezers | Fine Science Tools | 11295-10 | tumor dissection |
Razor Blade | Thermo Fisher | 12640 | needle preparation, tumor dissection |
Glass slide wrapped in parafilm | Any commercial brand | needle preparation | |
Phosphate Buffered Saline 1x, pH 7.4 | Life Technologies | 10010023 | tumor resuspension |
Cell strainer, 40 µm | Corning Falcon | 352340 | tumor resuspension |
1000 µl filter tips | any commercial brand | tumor resuspension | |
100 µl filter tips | any commercial brand | tumor resuspension | |
50 ml conical tubes | Genesee Scientific | 21-108 | tumor resuspension |
15 ml conical tubes | Genesee Scientific | 21-103 | tumor resuspension |
1.7 ml microtubes | Genesee Scientific | 24-281 | tumor resuspension |
Micropipettes | Any commercial brand | tumor resuspension and transplantation | |
Glass capillary (no filament) | World Precision Instruments | TW120-4 | tumor transplantation |
Needle puller | Sutter Instruments | P-97 | tumor transplantation |
Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | tumor transplantation |
Microinjector | Harvard Apparatus | PLI-90 | tumor transplantation |
Tricaine-S (MS-222) | Western Chemical | TRS1 | tumor transplantation, anesthetic |
Angled Probe | Fine Science Tools | 10140-02 | embryo manipulation |
Transfer Pipette | Any commercial brand | embryo manipulation | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | required during tumor resuspension |
Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | required during tumor resuspension |
Stereomicroscope | Olympus | SZ61 | tumor transplantation |
Fluorescent Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | imaging tumor transplants |
Microscope Camera | Olympus | DP-72 | imaging tumor transplants |
Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M7140 | imaging tumor transplants |
Incubator | Any commercial brand | maintaining embryos, warming up injection plate | |
Microwave | Any commercial brand | making injection plate | |
Scale | Any commercial brand | making injection plate | |
Gloves | Any commercial brand | all aspects of the protocol | |
Low Melt Agarose | Any commercial brand | confocal imaging of embryos | |
Glass Bottom Dish | Mattek Corporation | P35G-1.0-20-C | confocal imaging of embryos |
Laser-scanning confocal microscope | Olympus | FLUOVIEW FV1200 | confocal imaging of embryos |
Pronase | Roche Diagnostics | 11459643001 | dechorionate embryos |
PBS | Any commercial brand | resuspend tumor/tumor cells | |
12-well plate | Any commercial brand | drug treatment of embryos | |
Thin-bore transfer pipette | Any commercial brand | drug treatment of embryos | |
Hemocytometer | Any commericial brand | For counting tumor cells in suspension | |
N2 | Any commericial brand | For microinjector set up |