Summary
Трансплантация раковых клеток является важным инструментом для идентификации раковых механизмов и терапевтических реакций. Современные методы зависят от иммунокомпетентных животных. Здесь мы описываем метод трансплантации опухолевых клеток данио в иммунокомпетентные эмбрионы для долгосрочного анализа поведения опухолевых клеток и ответов на наркотики in vivo .
Abstract
Трансплантация опухолевых клеток является важным методом определения механизмов, контролирующих рост раковых клеток, миграцию и реакцию хозяев, а также оценку возможного ответа пациента на терапию. Современные методы во многом зависят от использования сингенных или иммунокомпромиссных животных, чтобы избежать отторжения опухолевого трансплантата. Такие методы требуют использования специфических генетических штаммов, которые часто препятствуют анализу взаимодействий иммуно-опухолевых клеток и / или ограничены конкретными генетическими корнями. Альтернативный метод у рыбок данио использует незавершенно развитую иммунную систему в эмбриональном мозге до 3 дней, когда опухолевые клетки трансплантируют для использования в краткосрочных анализах ( т. Е. От 3 до 10 дней). Тем не менее, эти методы вызывают летальность организма, что препятствует долгосрочному изучению поведения опухолевых клеток и лекарственного ответа. Этот протокол описывает простой и эффективный метод долговременной ортотопической трансплантации ткани опухоли головного мозга данио вК четвертому желудочку 2-дневного иммунокомпетентного данио. Этот метод позволяет: 1) долгосрочное изучение поведения опухолевых клеток, таких как инвазия и распространение; 2) длительный ответ опухоли на лекарства; И 3) повторной трансплантации опухолей для изучения эволюции опухоли и / или воздействия различных генетических особенностей хозяина. Таким образом, эта методика позволяет исследователям рака оценивать приживление, инвазию и рост на отдаленных участках, а также проводить химические экраны и анализы клеточной конкуренции в течение многих месяцев. Этот протокол может быть распространен на исследования других типов опухолей и может быть использован для выяснения механизмов хеморезистентности и метастазирования.
Introduction
Трансплантация опухолевых клеток в иммунокомпрометированных животных, особенно ксенотрансплантатов мыши, является широко используемой методикой, используемой для изучения механизмов контроля пролиферации раковых клеток 1 , 2 , выживаемости, инвазии и метастазирования 3 , 4 , а также для обеспечения платформы Для скрининга препаратов 5 , 6 , 7 . Совсем недавно трансплантация образцов первичной опухоли на мышей с иммунной системой была использована для создания моделей ксенотрансплантата (PDX), полученных пациентами, для целей диагностики и доклинической скрининга лекарственных средств и является основой инициативы персонализированной медицины 8 , 9 , 10 , 11 , Тем не менее, значительные доказательства показывают, что модулирование иммунной системыСтволовые клетки могут оказать существенное влияние на поведение опухоли и исход лечения 12 , 13 . Это привело к переориентации методов на основе ксенотрансплантатов, включая «гуманизированных» мышей, в которых иммунная система мыши восстанавливается путем совместной трансплантации иммунных клеток человека с опухолевыми клетками. Тем не менее, этот подход по-прежнему технически сложный, с переменной воспроизводимостью и токсичностью, связанной с техникой, в дополнение к значительным затратам 14,15. Таким образом, необходимы новые методы трансплантации у иммунокомпетентных животных, чтобы ускорить открытие иммунных и опухолеспецифических механизмов прогрессирования рака и лекарственной реакции.
Zebrafish - это альтернативная модель животных для исследования рака человека, в настоящее время установлено более 20 моделей рака 16 , включая высоко злокачественный мозг 17 , mela Нома 18 , 19 , 20 и рак поджелудочной железы 21 , 22 , а также многие лейкемии 23 , 24 , 25 , 26 , 27 . Два признака системы данио делают его особенно подходящим для исследований рака: 1) оптическая прозрачность полупрозрачных животных позволяет непосредственно визуализировать поведение раковых клеток ( т.е. пролиферацию, выживание, инвазию и распространение) с использованием простых методов микроскопии и 2) Самка данио может производить до 200 эмбрионов в день, что позволяет быстро масштабировать число животных для генетического или лекарственного скрининга при низкой стоимости. Кроме того, геномы рака рыбок данио и человека являются высококонсервативными (включая онкогены и гены-супрессоры опухолей)F "> 28, что позволяет быстро переводить открытия механики и лекарства в системы млекопитающих, что также делает рыбу данио идеальной моделью животного для трансплантации, которая использует преимущества визуализации, масштабируемости и низкой стоимости системы.
Предыдущие исследования по трансплантации опухолей у иммунокомпрометированных рыбок данио облегчили идентификацию возможностей самообновления, злокачественности опухоли и инвазии / распространения 11 , 29 . Краткосрочные исследования поведения опухолевых клеток могут быть проведены после трансплантации в γ-облученных взрослых, иммунная система которых эффективно подавляется в течение ~ 20 дней 11 , 30 . Лечение взрослых данио с дексаметазоном подавляет B- и Т-клетки в течение 30 дней до отторжения. 31 . Еще одна менее распространенная стратегия предусматривает использование клональных штаммов рыбок даниоКоторые позволяют проводить длительные исследования на иммунокомпетентном хозяине 32 . Однако было создано лишь ограниченное количество клональных штаммов, которые трудно поддерживать из-за низкой плодовитости. Кроме того, большинство разработанных моделей опухолей данио формируются в других генетических условиях, поэтому эти опухоли не могут быть трансплантированы в клональные штаммы без подавления иммунной системы 11 , 33 , 34 . Более современные подходы к улучшению долгосрочных исследований по трансплантации включают разработку мутантной линии rag2 E450fs с нарушенными функциями В- и Т-клеток, которая была использована для успешной трансплантации множественных видов рака 35 , 36 . Чтобы обойти требование клональных линий данио или иммунокомпромиссного хозяина, ряд групп использовали эмбрионы ранней стадии ( то есть > 72 л.с.(Hpf)) для трансплантации опухолевых клеток человека, так как эти эмбрионы еще не полностью развили адаптивную иммунную систему 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , 43 . Однако эти методы ограничены кратковременным анализом поведения опухолевых клеток или ответа на лекарственные средства (обычно менее 2 недель), поскольку раковые клетки человека или сама методика трансплантации убивают хозяина, предотвращая долгосрочные исследования и повторную трансплантацию.
Этот протокол детализирует модифицированный метод эмбриональной трансплантации в просвет четвертого желудочка мозга эмбриона на 2 дня после оплодотворения (dpf). Он минимизирует токсичность для организма-хозяина и может сочетаться с моделями опухолей головного мозга рыбок данио для долговременного приживления опухолевых клеток. Таким образом, этот метод alМинимумов для повторной трансплантации опухолевых клеток в новые хозяева в течение многих поколений, облегчая будущие исследования гетерогенности опухоли, реакции хозяина / иммунной системы, лекарственной реакции или метастатического потенциала. Этот метод также прост, эффективен и масштабируем, так как до одного человека в сутки может выполнять до 300 трансплантаций, при этом приживление достигает 90%. Это позволяет быстро распространять одиночные первичные опухоли на сотни эмбрионов в 2 д.ф.ф. для генетических или скрининговых проектов или напрямую визуализировать поведение опухолевых клеток головного мозга в разных фоновых условиях хозяина в течение многих месяцев.
Protocol
Все процедуры на животных были одобрены и соблюдались в соответствии с руководящими принципами ухода за животными Комитета по уходу и использованию институциональных животных Университета штата Юта (IACUC № 16-03019).
1. Подготовка оборудования для микроинъекции
- Подготовка инжекционной пластины.
- Приготовить 50 мл раствора 1,2% агарозы, растворенной в яичной воде (0,6 г / л аквариумной соли в воде обратного осмоса + 0,01 мг / л метиленового синего). Кипятите раствор до растворения агарозы, а затем дополните его добавлением 0,05 мг / л метиленового синего. Налейте 25 мл конечного раствора в 10 см чашку Петри и дайте ему затвердеть. Поместите оставшиеся 25 мл раствора агарозы в водяную баню на 42 ° С до готовности к этапу 1.1.2.
- Установите стакан диаметром 2 дюйма в центре затвердевшей поверхности и вылейте оставшиеся 25 мл 1,2% агарозы.
ПРИМЕЧАНИЕ. Это создает поверхность инъекции на периферии пластины и сердцевину в центре, котораяОбеспечивает область для тестирования размера иглы и консистенции суспензии опухоли.- Поддерживайте инжекционную пластину при 28 ° C в течение как минимум 30 минут перед инъекцией или при 4 ° C для длительного хранения.
- Подготовка игл для инъекций.
- Сделайте иглы, потянув капилляры 10 см с наружным размером 1,2 мм и внутренний размер 0,9 мм (без нити) на две иголки на съемнике иглы.
ПРИМЕЧАНИЕ. Каждая игла должна иметь общую длину 6 см, при этом конус примерно 1,5 см от конца должен быть сужен. - Аккуратно поместите иглу на предметный стежок микроскопа, завернутый в пластиковую парафиновую пленку. Используйте лезвие бритвы, чтобы отрезать конец иглы под углом 45 °, чтобы создать иглу с отверстием на кончике.
ПРИМЕЧАНИЕ. Обычно удаляют от 0,1 мм до 0,3 мм от конца иглы. Для выполнения инъекций не требуется скошенный наконечник.
- Сделайте иглы, потянув капилляры 10 см с наружным размером 1,2 мм и внутренний размер 0,9 мм (без нити) на две иголки на съемнике иглы.
- Подготовьте микроинъекционную установку.
- <Li> Организовать стандартную установку микроинъекции, включая стереомикроскоп, манипулятор и микроинъектор для трансплантации.
2. Подготовка эмбрионов для трансплантации
- Соберите до 500 эмбрионов mitfa w2 44 (или эмбрионов любых других генотипов рыбок данио, как определено пользователем), как описано 45, и выдерживайте в инкубаторе при 28 ° C.
- Dechorionate эмбрионов в 24 hpf, добавив 100 мкл 10 мг / мл протеазы коктейль раствор, разведенный в яйцевой воде и осторожно рок около 20 минут. Промойте эмбрионы 3 раза свежей яйцовой водой, чтобы удалить остаточную протеазу.
- Экранируйте эмбрионы при 48 hpf для соответствующей стадии развития, как это определено стандартными критериями серийного ряда 45 .
Примечание: для трансплантации следует использовать только правильно поставленные и морфологически нормальные эмбрионы. - анестезироватьПриблизительно двадцать 48-hpf эмбрионов в яичной воде, содержащей 0,002% трикаина-S в чашке Петри. Подтвердите правильную анестезию, наблюдая за прекращением движения.
3. Подвеска опухолевой клетки
ПРИМЕЧАНИЕ. Модели опухолей мозга Zebrafish могут быть получены с помощью генно-инженерных комбинаций онкогенов и генов-супрессоров опухолей 17 , 46 , 47 . Здесь, как было недавно описано 17, использовался модель NRAS WT с промотором sox10, модель p53 zdf1 / zdf1 CNS-PNET zebra.
- Усыпите опухоль, несущую опухоль головного мозга, чья опухоль составляет приблизительно 20% от общего размера тела, используя 0,4% передозировки Tricaine-S с последующим погружением в ледяную воду в соответствии с протоколами, утвержденными IACUC.
- Разобейте флуоресцентно меченую опухоль лезвием бритвы и пинцетами под флуоресценциейМикроскопа с использованием стерильной техники и поместите его в 5 мл 1x фосфатно-буферного солевого раствора (PBS).
ПРИМЕЧАНИЕ: Точные методы рассечения будут определяться пользователем и зависят от типа опухоли и расположения ткани. Смотрите приведенные ссылки для подробных процедур для вскрытия различных органов данио и опухолей головного мозга 17 , 48 . - Вручную нарушают массу опухоли с использованием пипетки p1000 до тех пор, пока не образуется однородный, мутный раствор. Удалите крупные частицы с помощью наконечника пипетки или с помощью клеточного фильтра 40 мкм (это зависит от опухоли). Центрифугируют суспензию при комнатной температуре в течение 5 мин при 290 × g и удаляют супернатант.
Примечание: Флуоресцентно-активированная сортировка клеток (FACS) не выполняется для изоляции опухолевых клеток. Это позволяет трансплантировать гетерогенную популяцию стромальных, иммунных и опухолевых клеток. - Ресуспендируют осадок опухолевой клетки в 100 мкл стерильного PBS и переносят его в 1,5 мл микроЦентрифужная трубка. Взять 5 мкл суспензии клеток и развести его в 250 мкл PBS. Подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра. Центрифуга суспензии в течение 3 мин при 290 xg, удалить супернатант, и ресуспендируют осадок в стерильных PBS для получения желаемой концентрации клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ. Как правило, клетки, ресуспендированные в 30-40 мкл стерильного PBS, дают раствор, который является вязким и непрозрачным (концентрация клеток ≥100 клеток / нл) и имеют тенденцию генерировать наиболее успешные трансплантаты. Жизнеспособность клеток не оценивается. - Хранить опухоль суспензии на 28 ° C тепла блок во время трансплантации процедуры.
4. Инъецирование опухолевой суспензии в четвертый желудочек 2-dpf эмбриона
- Переносят 10-20 анестезированных эмбрионов (с этапа 2.4) на периферию инъекционной пластины с помощью переносной пипетки; Эмбрионы должны падать латерально на пластину инъекции, при этом желудочки хорошо видны и доступны, Используйте угловой зонд, чтобы отрегулировать эмбрионы по мере необходимости и расположите их подальше от внешнего края пластины инъекции.
- Загрузите 1-2 мкл суспензии опухолевых клеток в иглу инъекции, используя наконечники пипетки для загрузки геля, и вставьте иглу в манипулятор.
- Вручную опустите манипулятор, удерживая иглу под углом 45 °. Отрегулируйте ручки на микроманипуляторе в направлениях x, y и z, пока игла не окажется чуть выше и примерно на 5 мм вправо от головки эмбриона. Посмотрите в окуляры стереомикроскопа и медленно отрегулируйте микроманипулятор в направлении x, пока игла не проткнет четвертый желудочек эмбриона. Не позволяйте игле проколоть сердце или желток.
- Надавите на педаль, прикрепленную к микроинъектору, чтобы ввести суспензию опухолевых клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ. Давление впрыска и время впрыска будут зависеть от размера отверстия в игле, но хорошей отправной точкой являются 5 - 10 фунтов на кв. Дюйм и 50 - 100 мс.Объем вводимых опухолевых клеток можно оценить стандартными методами капель масла путем инъекции в минеральное масло, если это необходимо 49 . Инъекции 500 мкл с диаметром капель 0,1 мм обычно дают наилучшие результаты.
- Надавите на педаль, прикрепленную к микроинъектору, чтобы ввести суспензию опухолевых клеток.
- Осторожно промойте впрыснутые эмбрионы с пластины для инъекций и в чашку Петри, используя свежую воду из яиц. Поддерживайте эмбрионы в яичной воде для оставшихся процедур или пока они не вырастут в баках (как описано в шаге 4.9.1).
- Осмотрите введенные эмбрионы под флуоресцентным стереомикроскопом. Убедитесь, что давление впрыска, угол, размер иглы и вязкость клеточной суспензии приводят к тому, что опухолевые клетки заполняют 25-50% пространства желудочка. При необходимости отрегулируйте эти параметры.
- Повторите шаги 4.1-4.5 для всех оставшихся эмбрионов. При необходимости анестезируйте дополнительные эмбрионы (описано в шаге 2.4).
ПРИМЕЧАНИЕ. Опытный пользователь может ввести до 300 эмбрионов в течение 3-4 часов. - Поместите эмбрионы обратно вИнкубатор 28 ° С в течение ночи.
- На следующий день оценивайте выживаемость эмбрионов, изучая морфологические и физиологические особенности, такие как нормальное развитие сердца и головного мозга, как описано 45 .
- Для скрининга обезболивают эмбрионы, как описано в шаге 2.4, через 1 день после трансплантации (dpt).
- Используйте трансферную пипетку, чтобы добавить 4% метилцеллюлозы на середину чашки Петри и добавить эмбрионы в каплю метилцеллюлозы. Ориентируйте эмбрионы (вентральная сторона, обращенная к источнику света), используя угловой зонд и экран для согласованного размера приживления, используя флуоресцентный микроскоп. Удалите любые эмбрионы с опухолевыми клетками, не ограничивающимися желудочком или теми, которые содержат опухолевые клетки, содержащие менее 25% пространства желудочка.
Примечание: последовательное приживление определяется как эмбрионы с одной опухолевой массой, которая охватывает 25-50% пространства 17 желудочков. Для скрининга используйте флуоресценцию sТереомикроскоп с объективом 1X, числовая апертура 0,15, увеличение от 0,7 до 1,6 раз и время экспозиции от 50 мс до 1 с. Для всех изображений используйте канал яркого поля в дополнение к каналу GFP или RFP. - Для поддержания опухолей пересаживайте пересаженных эмбрионов в емкости до 45 dpf (6 dpt).
- Используйте трансферную пипетку, чтобы добавить 4% метилцеллюлозы на середину чашки Петри и добавить эмбрионы в каплю метилцеллюлозы. Ориентируйте эмбрионы (вентральная сторона, обращенная к источнику света), используя угловой зонд и экран для согласованного размера приживления, используя флуоресцентный микроскоп. Удалите любые эмбрионы с опухолевыми клетками, не ограничивающимися желудочком или теми, которые содержат опухолевые клетки, содержащие менее 25% пространства желудочка.
5. Изображения трансплантированных эмбрионов для клеточного поведения
- Обезболить эмбрионы в 3-8 dpf (1-6 dpt) и смонтировать (дорзальная сторона, обращенная к покровному стеклу) в 1,2% агарозе с низким содержанием расплава. Проводят покадровое изображение смонтированных эмбрионов с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа в течение необходимого периода времени для визуализации клеточного поведения, такого как миграция, клеточное деление или клеточные взаимодействия, при необходимости 38 , 43 , 53 .
ПРИМЕЧАНИЕ. Используйте формат 1024 × 1024, скорость сканирования 8 и #181; s / пиксел. Используйте усреднение сканирования и определяйте размеры z-глубины, чтобы обеспечить захват всей массы опухоли (1000-1500 мкм). Кроме того, выполняйте 4-часовые эксперименты с замедленной съемкой, получая изображение каждые 10-15 мин, используя цель 40x, чтобы контролировать инвазивное поведение. Чувствительность детектора будет варьироваться в зависимости от интенсивности опухолевой массы, а мощность лазера зависит от микроскопа, но обычно рекомендуется, чтобы она составляла от 15 до 40%. - Как только изображение будет завершено, освободите установленный эмбрион от агарозы, используя угловой зонд, и перенесите его в чашку Петри со свежей водой.
6. Лекарственное взаимодействие с трансплантированными эмбрионами и оценка бремени опухолей 17
- Анестезируйте эмбрионы с концентрацией 3 dpf и сориентируйте их в 4% метилцеллюлозе, с вентральной стороны, обращенной к источнику света. Изображение эмбрионов предварительной обработки с использованием флуоресцентного микроскопа 17 .
- ПлаТрансплантированных эмбрионов в 3 dpf в 12-луночном планшете, с 10 эмбрионов на лунку в 0,5 мл воды из яиц. Добавьте соответствующее количество препарата для получения желаемой конечной концентрации ( например, 50 мкМ ингибитора МЕК) и верните эмбрионы в инкубатор с температурой 28 ° С. На следующий день удалите обработанную лекарством воду из яиц с помощью пипетки с тонким отверстием и добавьте свежую обработку. Повторите это ежедневно, пока эмбрионы не достигнут 8 dpf.
- При 8 dpf удалите эмбрионы из лекарственной терапии и поместите их в свежую яйценовую воду. Анестезируйте эмбрионы и ориентируйте (вентральная сторона, обращенная к источнику света) в 4% метилцеллюлозе. Постобработка изображений эмбрионов с использованием флуоресцентного микроскопа. Определите площадь опухоли с помощью соответствующего программного обеспечения, как описано 17 .
- Отделяйте эмбрионы в зависимости от вида лечения и помещайте их в емкости для роста. Через 4-9 недель обезболивают рыб и оценивают их для общей опухолевой нагрузки с использованием стандартного флуоресцентного стереомикроскопа, так как d17 .
Representative Results
Трансплантация и приживление опухоли
Схематичный план процедуры представлен на рисунке 1 . Флуоресцентно меченные опухолевые клетки извлекаются из сайта первичного органа, и одноэлементная суспензия генерируется для трансплантации в четвертый желудочек эмбрионов рыбок данио 2-dpf mitfa w2 44 . На рисунке 2 показаны репрезентативные результаты для этого метода с использованием модели примитивной нервной эктодермальной опухоли центральной нервной системы (CNS-PNET), в которой промотор sox10 управляет экспрессией NRAS дикого типа или активированной NRAS, слитой с mCherry в p53- дефектных олигонуральных клетках-предшественниках 17 . Мутант mitfa w2- данио- 44 , у которого нет меланофоров, использовался для более легкой визуализацииОпухолевые клетки после трансплантации и / или во взрослую жизнь. Другие пигментные мутанты можно также использовать для обеспечения дополнительной ясности изображения, такой как Casper 50 . Уже через 24 ч после трансплантации опухолевые клетки могут проникать в окружающие ткани головного мозга ( рис. 2А , 3 dpf, стрелки). Трансплантаты опухолей продолжают расти в желудочке и окружающих тканях головного мозга в течение следующей недели ( рисунок 2A , 8 dpf). В это время флуоресценцию можно наблюдать и в области почек ( рис. 2 , звёздочки). Это может быть связано с тем, что почки отфильтровывают клеточный мусор от трансплантации, что согласуется с предшествующими исследованиями, в которых флуоресцентные красители используются в качестве анализа для оценки функции почек 51 . Опухолевые клетки продолжают пролиферировать и вторгаться, поэтому на 28 д.ф. опухоль можно увидеть по всему мозгу рыбок данио ( рис. 2А , 28 дпф).
рисунка 2B . Приживление опухоли обычно достигается у 80-90% эмбрионов, а трансплантация опухоли сохраняется во взрослом возрасте; Три репрезентативных примера показаны в нижних панелях на фиг. 2B . Это позволяет собирать и замораживать трансплантаты опухоли или повторно трансплантироваться в течение нескольких поколений.
Вторжение опухоли и ответы на наркотики
На фиг.3А показана схема совместной трансплантации, в которой две разные опухоли, помеченные либо GFP (опухоль А), либо mCherry (опухоль В), собирают целыми опухолямиИли диссоциации (обратите внимание, что FACS здесь не используется, но FACS-отсортированные опухолевые клетки могут быть использованы, если необходимо). Опухоли А и В могут быть из разных мест, индуцированы различными онкогенами или индуцированы в разных генетических условиях. Каждая опухоль обрабатывается в одноклеточную суспензию, затем опухолевые клетки смешиваются вместе при соотношении 1: 1 и трансплантируются в эмбрион 2-dpf. Свойства опухоли, такие как приживление, рост, инвазия и распространение опухоли A против опухоли B, могут затем наблюдаться у одного и того же хозяина, что позволяет осуществлять внутренний контроль за техникой и генетическим фоном.
На фиг. 3B отмеченную NRAS, меченную mCherry CNS-PNET рыбок данио, и меченый GFP CNS-PNET из мозжечка собирали и обрабатывали в суспензии с одной клеткой. Клетки подсчитывали, и равное количество клеток из каждой опухоли смешивали вместе и трансплантировали в 2-dpf эмбрионы. Четыре дняПосле трансплантации эмбрионы были визуализированы конфокальной микроскопией. Показан репрезентативный эмбрион, демонстрирующий, что опухолевые клетки tectum (красный) более интенсивно мигрируют в мозг хозяина (стрелки), чем мозжечковая опухоль.
Эмбрионы, трансплантированные флуоресцентно мечеными опухолевыми клетками, могут быть использованы в схемах лечения наркозависимости для идентификации соединений, которые ингибируют рост опухоли. Рисунок 3C - типичная временная шкала для лечения и визуализации трансплантаций опухоли. Через 24 ч после трансплантации к эмбрионам получают доступ для согласованного размера приживления и разделяют на группы лечения. В представленном примере эмбрионы, трансплантированные с NRAS-приводом, mCherry-меченым рыбой данио CNS-PNET обрабатываются 50 мкМ диметилсульфоксидом (DMSO) или ингибитором MEK (AZD6244). Эмбрионы обрабатываются в течение 5 дней и визуализируются при 8 dpf, как показано на рисунке 3C . Рисунок 3D (левые панели) показывает репрезентативность Животных из двух групп обработки. У обработанных ингибитором MEK эмбрионов было значительно меньшее количество флуоресценции, чем у обработанных DMSO, как описано 17 . После того, как животные визуализируются, их переносят в резервуары без лекарств и контролируют рост опухоли в течение двух месяцев. В приведенном примере лечение ингибитором MEK приводит к долговременному ответу у взрослых рыб ( рис. 3D , правые панели). Более подробную информацию о лечении, визуализации и количественной оценке лекарственного средства см. В ссылке 17 .
Рисунок 1: Протокол Схема трансплантации опухолевых клеток в четвертый желудочек эмбрионов 2-dpf данио рерио. Общая схема разделов с 3 по 4 протокола, включая альтернативные анализы конечных точек (разделы 4.9-6)./55712/55712fig1large.jpg "target =" _ blank "> Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Приживление опухоли и прогрессирование. (A) Первичные опухолевые клетки Zebrafish CNS-PNET 17 , меченные mCherry, были трансплантированы в четвертый желудочек эмбрионов 2-dpf. При 3 dpf опухолевые клетки проникают в окружающую мозговую ткань (стрелки). При 8 dpf опухолевые клетки растут в желудочке; Красные опухолевые клетки также присутствуют в окружающей мозговой ткани и почках (звездочки). При 28 д.ф. опухолевые клетки проникают и растут во всем головном мозге хозяина. (B) Верхняя панель. Семь 3-dpf эмбрионов, трансплантированных mCherry-мечеными опухолевыми клетками мозга данио. Опухолевые клетки могут быть трансплантированы последовательно в сотни эмбрионов с высокой частотой приживления ( т.е., как правило, 85/100 эмбрионов). Средние иНижние панели. Три репрезентативных взрослых рыбы с трансплантированными опухолями через 4-8 недель после оплодотворения (wpf). Опухоли можно визуализировать с помощью флуоресцентной микроскопии. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Сравнение отражения опухоли и реакции препарата. ( A ) CNS-PNET 17 из оптического слоя или мозжечка маркируются mCherry или GFP, соответственно, перерабатываются в одноклеточную суспензию, смешиваются вместе в соотношении 1: 1 и совместно трансплантируются в 2-dpf-эмбрионы. ( B ) 6-dpf эмбрион, совместно трансплантированный со смешанной суспензией GFP-меченых мозжечковых опухолевых клеток и mCherry-меченых опухолевых клеток из оптического текта. Различия в инвазивных свойствах каждой опухоли в tТот же получатель можно наблюдать с помощью флуоресцентной микроскопии. В этом примере mCherry-меченые опухолевые клетки мигрируют более широко, чем те, которые помечены GFP (стрелки). ( C ) Хронология лечения наркозависимости у эмбрионов, трансплантированных опухолевыми клетками. ( D ) Изображения репрезентативных животных в конце схемы лечения (8 dpf) и через 8 недель после лечения (8 wpf) с контролем ДМСО или 50 мкМ ингибитором МЕК. Опухолевую опухоль можно измерить, количественно определив флуоресценцию, как описано 17 . В этом эксперименте рост меченых mCherry опухолевых клеток снижается у эмбрионов, обработанных ингибитором MEK, и трансформируется в прочный ответ у взрослых. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Discussion
Этот протокол детализирует простой и эффективный анализ трансплантации, который включает инъекцию опухолевых клеток данио в желудочек 2-dpf эмбриона, который будет развивать полностью компетентную иммунную систему. До настоящего времени данио-рыбка CNS-PNET 17 и меланома (данные не показаны) были успешно трансплантированы для долгосрочного изучения поведения и инвазии опухолевых клеток. Критические шаги этого протокола включают обеспечение соответствующего размера отверстия иглы и правильной суспензии опухолевых клеток и адекватного обезболивания эмбрионов хозяина. Для каждого отдельного исследователя дальнейшая оптимизация этого метода может включать корректировку концентрации опухолевых клеток, давления инъекции и ориентации эмбриона. Кроме того, может быть гетерогенность в вязкости суспензий, происходящих из разных опухолей, поэтому разные типы опухолей могут быть более или менее трудно повторно суспендировать и трансплантировать. Однако, регулируя размер отверстия иглы и используя diffeРентгеновских разведений опухолевой суспензии, можно преодолевать трудности, связанные с вязкостью опухоли.
По нашему опыту, наиболее распространенными причинами появления разреженных клеток / несогласованных клеточных масс в желудочке являются следующие: 1) суспензия опухолевых клеток слишком разбавлена; 2) размер отверстия иглы слишком мал; 3) время впрыска и давление слишком низки; И / или 4) оставшаяся ткань не была отфильтрована из опухоли и застряла в игле. Когда суспензия опухолевых клеток вытекает из желудочка после инъекции, это, вероятно, связано с: 1) размещением иглы на дне желудочка; 2) высокое давление и время впрыска; И / или 3) слишком большой размер отверстия иглы. Низкая выживаемость пересаженных эмбрионов может быть вызвана: 1) обезболиванием эмбрионов в течение длительного периода времени; 2) оставление эмбрионов на пластине для инъекции для высушивания; 3) инъекция воздушных пузырьков в желудочек; И / или 4) прокалывание жизненно важных органов, таких как мозг иСердце, потому что игла прошла через желудочек.
Предыдущие методы трансплантации опухоли у взрослых или эмбриональных головных мозга данио основываются на иммуносупрессии у взрослых (генетически, фармакологически или посредством облучения) или ограничены кратковременными исследованиями клеток человека или мыши у эмбрионов 38 , 43 , 52 , 53 , 54 , Например, опухоли головного мозга мыши могут инъецироваться интраназально в дексаметазона-иммунодепрессию, 30-dpf, ювенильных данио для использования в краткосрочных (~ 2 днях) доклинических исследованиях лекарственных средств 54 . Однако место инъекции в этих экспериментах затенено черепом и мозговой тканью и, вероятно, приводит к повреждению нормальной ткани головного мозга, что снижает жизнеспособность хозяина и эффективность приживления. Другой недавно описанный способ включает в себя инъекцию человеческого gliobКлеточных линий ластомы в область среднего мозга эмбрионов рыбок данио, что позволило провести кратковременный анализ роста, инвазии и лекарственного ответа 43 . Опять же, точное местоположение места инъекции является переменным и, вероятно, повреждает нормальную ткань. Таким образом, предыдущие методы эмбриональных трансплантаций головного мозга часто ставят под угрозу жизнеспособность хозяев, ограничивая эти исследования кратковременным анализом ( т.е. от 2 до 14 дней), вызывая повышенную вариабельность между отдельными инъекциями из-за скрытых мест инъекции и предотвращая долгосрочные Долгосрочный анализ клеточного поведения и реакции на наркотики или повторной трансплантации через несколько поколений.
Описанный здесь метод относится к текущим ограничениям в эмбриональных и иммунокомпетентных методах трансплантации рыбок данио, позволяя исследователям: 1) воспроизводимо вводить в одно и то же место с минимальным повреждением окружающей ткани; 2) непосредственно визуализировать место инъекции для максимизацииЭффективность приживления; 3) пересаживать сотни эмбрионов в день; 4) позволяет опухолям расти у иммунокомпетентных животных; 5) позволяют контролировать поведение опухолевых клеток и долговременные реакции препарата в течение жизни рыбок данио; И 6) учитывают повторную трансплантацию опухолей в течение многих поколений для потенциальных исследований эволюции опухоли или механизмов рецидива лекарств. Кроме того, этот протокол позволяет исследователям использовать любой генотип данио для оценки реакции хозяина, включая различные иммунные популяции. Эти атрибуты делают этот метод легко адаптируемым любой лабораторией, которая уже выполняет стандартные микроинъекции у рыбок данио. Наконец, хотя этот метод идеально подходит для ортотопических инъекций опухолей головного мозга данио, при пересадке других типов опухолей, таких как печень или панкреатит, ортотопический сайт может быть более важным, чем иммунная компетенция ( например, если исследователь изучает эффекты стромальной Микроокружение на рост опухоли). В этом случаеНедавно разработанные, иммунодефицитные модели данио могут быть более подходящими для выполнения ортотопических трансплантаций опухолей 11 .
Этот протокол был использован для проведения конкурентных анализов опухолевых клеток и введения двойных меченых опухолей. Обсуждалась также потенциальная стратегия лечения для оценки эффективности химических соединений при опухолевом генезе, которая включает в себя лечение эмбрионов после трансплантации через добавление лекарственного средства в воду. Ранее был также описан способ ex vivo лечения опухолевых клеток перед трансплантацией 17 . Кроме того, трансплантированные опухоли были объединены для нескольких раундов повторной трансплантации, что будет полезно для исследований эволюции опухоли и химиорезистентности 17 . В настоящее время доклинические исследования зависят от ксенотрансплантатов мыши для оценки эффективности потенциальных соединений. Однако эти исследования отнимают много времениИ дорогостоящим. Учитывая высокую степень сохранения онкогенных сигнальных путей между рыбой данио и людьми 28 , следует ожидать, что этот метод будет дополнять обычные исследования мышей и человеческих клеток, чтобы обеспечить более быструю идентификацию эффективных соединений, поступающих в доклинические и клинические испытания. В конечном счете, этот метод может оказаться полезным для быстрого химического скрининга первичных опухолей пациента, что может дополнительно стимулировать инициативу персонализированной медицины. Тем не менее, условия для долгосрочного роста клеток человека у рыбок данио (взрослый или эмбрион) все еще нуждаются в идентификации.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим двух рецензентов за отличные предложения и улучшения в рукописи. Мы также благодарим Huntsman Cancer Institute / University of Utah за животноводство и техническое обслуживание. Эта работа финансировалась Американским онкологическим обществом (№ 124250-RSG-13-025-01-CSM), грантом NIH (программа P30 CA042014 CRR), Университетом штата Юта Грантом и Фондом борьбы с охотой.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Egg water | in house | maintaining embryos, making injection plate | |
| Methylene Blue | Sigma-Aldrich | M9140 | add to egg water to prevent fungal growth |
| Petri dish | Thermo Fisher | FB0875711Z | housing embryos, making injection plate |
| 50 mL beaker (2 inch diameter) | Any commercial brand | making injection plate | |
| Agarose | Denville | CA3510-8 | making injection plate |
| Glass Container | Any commercial brand | making injection plate | |
| Tweezers | Fine Science Tools | 11295-10 | tumor dissection |
| Razor Blade | Thermo Fisher | 12640 | needle preparation, tumor dissection |
| Glass slide wrapped in parafilm | Any commercial brand | needle preparation | |
| Phosphate Buffered Saline 1x, pH 7.4 | Life Technologies | 10010023 | tumor resuspension |
| Cell strainer, 40 µm | Corning Falcon | 352340 | tumor resuspension |
| 1,000 µL filter tips | any commercial brand | tumor resuspension | |
| 100 µL filter tips | any commercial brand | tumor resuspension | |
| 50 mL conical tubes | Genesee Scientific | 21-108 | tumor resuspension |
| 15 mL conical tubes | Genesee Scientific | 21-103 | tumor resuspension |
| 1.7 mL microtubes | Genesee Scientific | 24-281 | tumor resuspension |
| Micropipettes | Any commercial brand | tumor resuspension and transplantation | |
| Glass capillary (no filament) | World Precision Instruments | TW120-4 | tumor transplantation |
| Needle puller | Sutter Instruments | P-97 | tumor transplantation |
| Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | tumor transplantation |
| Microinjector | Harvard Apparatus | PLI-90 | tumor transplantation |
| Tricaine-S (MS-222) | Western Chemical | TRS1 | tumor transplantation, anesthetic |
| Angled Probe | Fine Science Tools | 10140-02 | embryo manipulation |
| Transfer Pipette | Any commercial brand | embryo manipulation | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | required during tumor resuspension |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | required during tumor resuspension |
| Stereomicroscope | Olympus | SZ61 | tumor transplantation |
| Fluorescent Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | imaging tumor transplants |
| Microscope Camera | Olympus | DP-72 | imaging tumor transplants |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M7140 | imaging tumor transplants |
| Incubator | Any commercial brand | maintaining embryos, warming up injection plate | |
| Microwave | Any commercial brand | making injection plate | |
| Scale | Any commercial brand | making injection plate | |
| Gloves | Any commercial brand | all aspects of the protocol | |
| Low Melt Agarose | Any commercial brand | confocal imaging of embryos | |
| Glass Bottom Dish | Mattek Corporation | P35G-1.0-20-C | confocal imaging of embryos |
| Laser-scanning confocal microscope | Olympus | FLUOVIEW FV1200 | confocal imaging of embryos |
| Pronase | Roche Diagnostics | 11459643001 | dechorionate embryos |
| PBS | Any commercial brand | resuspend tumor/tumor cells | |
| 12-well plate | Any commercial brand | drug treatment of embryos | |
| Thin-bore transfer pipette | Any commercial brand | drug treatment of embryos | |
| Hemocytometer | Any commericial brand | For counting tumor cells in suspension | |
| N2 | Any commericial brand | For microinjector set up |
References
- Shaw, T. J., Senterman, M. K., Dawson, K., Crane, C. A., Vanderhyden, B. C. Characterization of intraperitoneal, orthotopic, and metastatic xenograft models of human ovarian cancer. Mol Ther. 10 (6), 1032-1042 (2004).
- Stephen, R. M., et al. Monitoring the development of xenograft triple-negative breast cancer models using diffusion-weighted magnetic resonance imaging. Exp Biol Med. 237 (11), 1273-1280 (2012).
- Deroose, C. M., et al. Multimodality imaging of tumor xenografts and metastases in mice with combined small-animal PET, small-animal CT, and bioluminescence imaging. J Nucl Med. 48 (2), 295-303 (2007).
- Saxena, M., Christofori, G. Rebuilding cancer metastasis in the mouse. Mol Oncol. 7 (2), 283-296 (2013).
- Johnson, J. I., et al. Relationships between drug activity in NCI preclinical in vitro and in vivo models and early clinical trials. Br J Cancer. 84 (10), 1424-1431 (2001).
- Kerbel, R. S. Human tumor xenografts as predictive preclinical models for anticancer drug activity in humans - Better than commonly perceived - But they can be improved. Cancer Biology & Therapy. 2 (4), S134-S139 (2003).
- Scholz, C. C., Berger, D. P., Winterhalter, B. R., Henss, H., Fiebig, H. H. Correlation of Drug Response in Patients and in the Clonogenic-Assay with Solid Human Tumor Xenografts. Eur J Cancer. 26 (8), 901-905 (1990).
- Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Res. 73 (17), 5315-5319 (2013).
- Cho, S. Y., et al. An Integrative Approach to Precision Cancer Medicine Using Patient-Derived Xenografts. Mol Cells. 39 (2), 77-86 (2016).
- Hiroshima, Y., et al. Patient-derived mouse models of cancer need to be orthotopic in order to evaluate targeted anti-metastatic therapy. Oncotarget. 7 (44), 71696-71702 (2016).
- Moore, J. C., Langenau, D. M. Allograft Cancer Cell Transplantation in Zebrafish. Adv Exp Med Biol. 916, 265-287 (2016).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Dranoff, G. Experimental mouse tumour models: what can be learnt about human cancer immunology. Nat Rev Immunol. 12 (1), 61-66 (2011).
- Richmond, A., Su, Y. Mouse xenograft models vs GEM models for human cancer therapeutics. Dis Model Mech. 1 (2-3), 78-82 (2008).
- Bernard, D., Peakman, M., Hayday, A. C. Establishing humanized mice using stem cells: maximizing the potential. Clin Exp Immunol. 152 (3), 406-414 (2008).
- White, R., Rose, K., Zon, L. Zebrafish cancer: the state of the art and the path forward. Nat Rev Cancer. 13 (9), 624-636 (2013).
- Modzelewska, K., et al. MEK Inhibitors Reverse Growth of Embryonal Brain Tumors Derived from Oligoneural Precursor Cells. Cell Rep. 17 (5), 1255-1264 (2016).
- Patton, E. E., et al. BRAF mutations are sufficient to promote nevi formation and cooperate with p53 in the genesis of melanoma. Curr Biol. 15 (3), 249-254 (2005).
- Dovey, M., White, R. M., Zon, L. I. Oncogenic NRAS cooperates with p53 loss to generate melanoma in zebrafish. Zebrafish. 6 (4), 397-404 (2009).
- Santoriello, C., et al. Kita driven expression of oncogenic HRAS leads to early onset and highly penetrant melanoma in zebrafish. PLoS One. 5 (12), e15170 (2010).
- Park, S. W., et al. Oncogenic KRAS induces progenitor cell expansion and malignant transformation in zebrafish exocrine pancreas. Gastroenterology. 134 (7), 2080-2090 (2008).
- Liu, S., Leach, S. D. Screening pancreatic oncogenes in zebrafish using the Gal4/UAS system. Methods Cell Biol. 105, 367-381 (2011).
- Langenau, D. M., et al. Myc-induced T cell leukemia in transgenic zebrafish. Science. 299 (5608), 887-890 (2003).
- Langenau, D. M., et al. Cre/lox-regulated transgenic zebrafish model with conditional myc-induced T cell acute lymphoblastic leukemia. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (17), 6068-6073 (2005).
- Sabaawy, H. E., et al. TEL-AML1 transgenic zebrafish model of precursor B cell acute lymphoblastic leukemia. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (41), 15166-15171 (2006).
- Chen, J., et al. NOTCH1-induced T-cell leukemia in transgenic zebrafish. Leukemia. 21 (3), 462-471 (2007).
- Feng, H., et al. Heat-shock induction of T-cell lymphoma/leukaemia in conditional Cre/lox-regulated transgenic zebrafish. Br J Haematol. 138 (2), 169-175 (2007).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Li, P., White, R. M., Zon, L. I. Transplantation in zebrafish. Methods Cell Biol. 105, 403-417 (2011).
- Traver, D., et al. Effects of lethal irradiation in zebrafish and rescue by hematopoietic cell transplantation. Blood. 104 (5), 1298-1305 (2004).
- Stoletov, K., Montel, V., Lester, R. D., Gonias, S. L., Klemke, R. High-resolution imaging of the dynamic tumor cell vascular interface in transparent zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (44), 17406-17411 (2007).
- Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
- Mizgirev, I., Revskoy, S. Generation of clonal zebrafish lines and transplantable hepatic tumors. Nat Protoc. 5 (3), 383-394 (2010).
- Mizgireuv, I. V., Revskoy, S. Y. Transplantable tumor lines generated in clonal zebrafish. Cancer Res. 66 (6), 3120-3125 (2006).
- Tenente, I. M., Tang, Q., Moore, J. C., Langenau, D. M. Normal and malignant muscle cell transplantation into immune compromised adult zebrafish. J Vis Exp. (94), (2014).
- Tang, Q., et al. Optimized cell transplantation using adult rag2 mutant zebrafish. Nat Methods. 11 (8), 821-824 (2014).
- Geiger, G. A., Fu, W., Kao, G. D. Temozolomide-mediated radiosensitization of human glioma cells in a zebrafish embryonic system. Cancer Res. 68 (9), 3396-3404 (2008).
- Kitambi, S. S., et al. Vulnerability of glioblastoma cells to catastrophic vacuolization and death induced by a small molecule. Cell. 157 (2), 313-328 (2014).
- Lally, B. E., et al. Identification and biological evaluation of a novel and potent small molecule radiation sensitizer via an unbiased screen of a chemical library. Cancer Res. 67 (18), 8791-8799 (2007).
- Vittori, M., Motaln, H., Turnsek, T. L. The study of glioma by xenotransplantation in zebrafish early life stages. J Histochem Cytochem. 63 (10), 749-761 (2015).
- Yang, X. J., et al. A novel zebrafish xenotransplantation model for study of glioma stem cell invasion. PLoS One. 8 (4), e61801 (2013).
- Zhao, H., Tang, C., Cui, K., Ang, B. T., Wong, S. T. A screening platform for glioma growth and invasion using bioluminescence imaging. Laboratory investigation. J Neurosurg. 111 (2), 238-246 (2009).
- Welker, A. M., et al. Correction: Standardized orthotopic xenografts in zebrafish reveal glioma cell-line-specific characteristics and tumor cell heterogeneity. Dis Model Mech. 9 (9), 1063-1065 (2016).
- Lister, J. A., Robertson, C. P., Lepage, T., Johnson, S. L., Raible, D. W. nacre encodes a zebrafish microphthalmia-related protein that regulates neural-crest-derived pigment cell fate. Development. 126 (17), 3757-3767 (1999).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. (2000).
- Solin, S. L., Shive, H. R., Woolard, K. D., Essner, J. J., McGrail, M. Rapid tumor induction in zebrafish by TALEN-mediated somatic inactivation of the retinoblastoma1 tumor suppressor rb1. Sci Rep. 5, 13745 (2015).
- Ju, B., et al. Oncogenic KRAS promotes malignant brain tumors in zebrafish. Mol Cancer. 14, (2015).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. J Vis Exp. (37), (2010).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Christou-Savina, S., Beales, P. L., Osborn, D. P. Evaluation of zebrafish kidney function using a fluorescent clearance assay. J Vis Exp. (96), e52540 (2015).
- Rampazzo, E., et al. Wnt activation promotes neuronal differentiation of glioblastoma. Cell Death Dis. 4, (2013).
- Lal, S., La Du,, Tanguay, J., L, R., Greenwood, J. A. Calpain 2 is required for the invasion of glioblastoma cells in the zebrafish brain microenvironment. J Neurosci Res. 90 (4), 769-781 (2012).
- Eden, C. J., et al. Orthotopic models of pediatric brain tumors in zebrafish. Oncogene. 34 (13), 1736-1742 (2015).
