癌細胞の移植は、癌のメカニズムおよび治療応答の同定のための重要なツールである。現在の技術は免疫不全動物に依存する。ここでは、腫瘍細胞の挙動およびインビボでの薬物応答の長期解析のために、ゼブラフィッシュ腫瘍細胞を免疫コンピテント胚に移植する方法を説明する。
腫瘍細胞移植は、癌細胞増殖、移動、および宿主応答を制御するメカニズムを定義するとともに、治療に対する潜在的な患者の応答を評価する重要な技術である。現在の方法は、腫瘍移植片の拒絶を避けるために、同系または免疫不全動物の使用に大きく依存する。そのような方法は、免疫腫瘍細胞相互作用の分析をしばしば妨げる特定の遺伝的株の使用を必要とする、および/または特定の遺伝的背景に限定される。ゼブラフィッシュの代替法は、腫瘍細胞を短期アッセイ( すなわち、 3〜10日)で使用するために移植する、3日前に胚の脳における不完全に発達した免疫系を利用する。しかしながら、これらの方法は、宿主の致死性を引き起こし、腫瘍細胞の挙動および薬物応答の長期的な研究を妨げる。このプロトコルは、ゼブラフィッシュ脳腫瘍組織の長期的な同所性移植のための単純かつ効率的な方法を記載している。2日齢の免疫能のあるゼブラフィッシュの第4脳室に送達する。この方法は、1)浸潤および播種などの腫瘍細胞の挙動の長期間の研究; 2)薬物に対する耐性腫瘍応答; 3)腫瘍進展および/または異なる宿主の遺伝的背景の影響の研究のための腫瘍の再移植。要約すると、この技術により、がん研究者は遠隔地の生着、侵入、成長を評価するだけでなく、数ヶ月にわたって化学スクリーニングや細胞競合アッセイを行うことができます。このプロトコールは、他の腫瘍型の研究に拡張することができ、化学療法抵抗性および転移のメカニズムを解明するために使用することができる。
免疫不全動物、特にマウス異種移植片への腫瘍細胞の移植は、癌細胞増殖1,2 、生存、浸潤および転移を制御するメカニズムを研究するために広く使用されている技術であり、同様にプラットフォームを提供するスクリーニング用薬物5,6,7 。より最近では、原発性腫瘍サンプルの免疫不全マウスへの移植は、診断および前臨床薬物スクリーニング目的のための患者由来異種移植(PDX)モデルを生成するために使用されており、パーソナライズド医薬品イニシアチブのバックボーンである8,9,10,11 。しかし、重要な証拠は、免疫系の調節幹は、腫瘍の行動および患者の転帰に劇的な影響を及ぼす可能性がある12,13 。これは、ヒト免疫細胞を腫瘍細胞と同時移植することによってマウスの免疫系が再構成される「ヒト化」マウスを含む異種移植に基づく技術の再設計を促した。しかしながら、このアプローチは技術的に困難であり、その技術に関連した変動する再現性および毒性があり、重要なコスト14,15に加えています。従って、免疫賦活動物における新しい移植技術は、癌進行および薬物応答の免疫および腫瘍特異的メカニズムの発見を加速するために必要とされる。
ゼブラフィッシュは、ヒトがんの研究のための代替動物モデルであり、現在20以上のがんモデルが確立されており、 16例には、悪性度の高い脳17 、メラ noma 18,19,20 、および膵臓癌21,22ならびに多くの白血病23,24,25,26,27が挙げられる。ゼブラフィッシュシステムの2つの特質は、癌研究に特に適している:1)半透明動物の光学的透明性は、単純な顕微鏡技術を用いた癌細胞の挙動( すなわち、増殖、生存、浸潤および播種)女性のゼブラフィッシュは、低コストで遺伝子スクリーニングまたは薬物スクリーニングのための動物数の迅速なスケーリングを可能にし、1日あたり200個の胚を産生することができる。さらに、ゼブラフィッシュおよびヒトの癌ゲノムは、高度に保存されている(癌遺伝子および腫瘍抑制遺伝子を含む)これらの特性はまた、ゼブラフィッシュを移植技術の理想的な動物モデルとし、システムのイメージング、スケーラビリティ、および低コストを利用します。
免疫不全ゼブラフィッシュにおける以前の腫瘍移植研究は、自己再生能、腫瘍悪性腫瘍、および浸潤/播種の同定を容易にした11,29。腫瘍細胞挙動の短期間の研究は、γ線を照射した成人への移植後に行うことができ、その免疫系は〜20日間効果的に抑制される11,30。成人ゼブラフィッシュのデキサメタゾンによる治療は、拒絶反応が起こるまでに30日までB細胞およびT細胞を抑制する31 。別のあまり一般的でない戦略は、クローンゼブラフィッシュ株免疫能を有する宿主における長期的な調査を可能にする。しかしながら、限られた数のクローン株しか生成されず、産卵数が少ないために維持することが困難である。さらに、確立されたゼブラフィッシュ腫瘍モデルのほとんどは、他の遺伝的背景において生成されるので、免疫系を抑制することなくこれらの腫瘍をクローン株に移植することはできない11,33,34。長期移植研究を改善するためのより最近のアプローチには、複数の癌35,36の移植に成功したB細胞機能およびT細胞機能の障害を有するrag2 E450fs突然変異株の開発が含まれる。クローンゼブラフィッシュ系統または免疫不全宿主の必要性を回避するために、多数のグループが早期段階の胚を使用している( すなわち、 > 72馬力これらの胚はまだ適応免疫系を完全に発達させていない37,38,39,40,41,42,43のヒト腫瘍細胞移植のための胚性幹細胞移植(ost-fertilization(hpf))がある。しかしながら、これらの方法は、ヒト癌細胞または移植技術自体が宿主を殺し、長期間の研究および再移植を妨げるため、腫瘍細胞の挙動または薬物応答(通常は2週間未満)の短期分析に限定される。
このプロトコールは、受精後2日(dpf)胚の脳の第4脳室の内腔への修正された胚移植法を詳述している。それは宿主に対する毒性を最小限に抑え、腫瘍細胞の長期生着のためにゼブラフィッシュ脳腫瘍モデルと組み合わせることができます。従って、この技術は、腫瘍の異種性、宿主/免疫応答、薬物応答、または転移能についての将来の研究を容易にし、腫瘍細胞の新しい世代への再移植のための最低限度を提供する。この方法は、最大90%の生着を伴い、1日に1人のユーザーが最大300回の移植を行うことができるため、シンプルで効率的でスケーラブルです。これにより、遺伝子または薬物スクリーニングプロジェクトのために、単一の原発腫瘍を2 dpfの数百の胚に迅速に増殖させることが可能になり、または数ヶ月にわたって様々な宿主背景で脳腫瘍細胞の行動を直接視覚化することが可能になる。
このプロトコルは、完全にコンピテントな免疫系を発達させる2-dpf胚の心室にゼブラフィッシュ腫瘍細胞を注入することを含む、単純かつ効率的な移植アッセイを詳述する。これまでのところ、ゼブラフィッシュCNS-PNET17および黒色腫(データは示さず)は、腫瘍細胞の挙動および浸潤の長期研究のために首尾よく移植されている。このプロトコルの重要なステップには、適切な針の穴の大きさと適切な腫瘍細胞懸濁液の確保と適切な麻酔の宿主胚の確保が含まれます。個々の研究者ごとに、この技術のさらなる最適化には、腫瘍細胞濃度、注入圧力、および胚の配向の調整が含まれ得る。さらに、異なる腫瘍に由来する懸濁液の粘度には不均質性が存在する可能性があるので、異なる腫瘍型は、再懸濁および移植が多少難しくなる可能性がある。ただし、ニードルの穴径を調整してdiffe腫瘍懸濁液の希釈液を希釈することにより、腫瘍の粘性に関連する困難を克服することが可能である。
我々の経験では、心室の疎細胞/不一致細胞塊の最も一般的な理由は以下の通りである:1)腫瘍細胞懸濁液が希薄である。 2)針の口径が小さすぎる。 3)噴射時間と圧力が低すぎる。および/または4)残りの組織は、腫瘍から濾過されず、針内に留置された。腫瘍細胞懸濁液が注射後に心室から流出するとき、それは、1)心室の床に対する針の配置; 2)高い射出圧力および時間;および/または3)針の孔径が大きすぎる。移植された胚の低い生存は、1)長期間胚を麻酔すること; 2)注射プレート上に胚を残して乾燥させる。 3)気泡の心室への注入;および/または4)脳などの重要な臓器を突き刺すこと、および針は心室を通過したので、心臓。
成体または胚性ゼブラフィッシュ脳における腫瘍移植の従来の方法は、成人(遺伝的に、薬理学的に、または放射線を介して )の免疫抑制に依存するか、または胚38,43,52,53,54におけるヒトまたはマウス細胞の短期間の研究に限定されている 。例えば、マウス脳腫瘍は、短期間(約2日間)の前臨床薬物アッセイで使用するために、デキサメタゾン免疫抑制30-dpf、若年ゼブラフィッシュに鼻腔内注射することができる54 。しかし、これらの実験における注射部位は、頭蓋および脳組織によって覆い隠され、正常な脳組織への損傷をもたらし、宿主の生存率および生着効率を低下させる可能性がある。別の最近記載された方法は、ヒトの膠葉の注射ラストーマ細胞株をゼブラフィッシュ胚の中脳領域に導入し、成長、浸潤および薬物応答の短期分析を可能にした43 。再度、注射部位の正確な位置は可変であり、正常組織に損傷を与える可能性がある。従って、胚性脳移植の従来の方法は、宿主の生存能力を損なうことが多く、これらの研究を短期間の分析( すなわち、 2〜14日)に制限し、不明瞭な注射部位による個々の注射間の可変性の増加をもたらし、複数の世代にわたる細胞挙動および薬物反応または再移植の長期的な分析が含まれる。
ここに記載されている方法は、ゼブラフィッシュの胚性および免疫不全移植技術における現在の限界に対処するもので、研究者は、1)周辺組織への損傷を最小限に抑えながら同じ場所に再現性よく注射することができる。 2)注射部位を直接可視化して最大化する生着効率; 3)1日に何百もの胚を移植する。 4)免疫賦活動物において腫瘍が増殖することを可能にする; 5)ゼブラフィッシュの寿命にわたって腫瘍細胞の挙動および耐性薬物応答のモニタリングを可能にする; 6)腫瘍の進化または薬物再発のメカニズムに関する潜在的な研究のために、多くの世代にわたって腫瘍の再移植が可能である。さらに、このプロトコルにより、研究者は異なる免疫集団を含む宿主応答の評価に任意のゼブラフィッシュ遺伝子型を利用することが可能になる。これらの特性により、この方法はすでにゼブラフィッシュで標準的なマイクロインジェクションを行っているラボで容易に適用できます。最後に、この方法は、ゼブラフィッシュ脳腫瘍の同所注射に理想的であるが、肝臓または膵臓などの他の腫瘍型を移植する場合、同位体部位は免疫能力より重要であり得る( 例えば、研究者が間質腫瘍増殖に関する微小環境)。このシナリオでは、新しく開発された免疫不全ゼブラフィッシュモデルは、同所性腫瘍移植を行うために、より適切かもしれない11 。
このプロトコルは、腫瘍細胞の競合アッセイを実施し、二重標識腫瘍を注入するために使用されている。水への薬剤の添加による移植後の胚の治療を含む、腫瘍形成に対する化学化合物の有効性の評価のための潜在的な治療戦略も議論された。移植前の腫瘍細胞のエクスビボ治療のための方法も以前に報告されている17 。さらに、移植された腫瘍は、複数回の再移植のためにプールされており、腫瘍進化および化学療法抵抗性の研究に有益であろう17 。現在、前臨床試験は、潜在的な化合物の有効性を評価するためのマウス異種移植片に依存している。しかし、これらの研究は時間がかかるコストがかかる。ゼブラフィッシュとヒトの間の発がん性シグナル伝達経路の高度の保存を考慮すると、この方法は従来のマウスおよびヒトの細胞研究を補完して、前臨床および臨床試験に入る有効化合物のより迅速な同定を可能にする。結局のところ、この方法は、プライマリ患者の腫瘍の迅速な化学的スクリーニングに有用であることが判明する可能性があり、パーソナライズド・メディス・イニシアチブをさらに推進する可能性がある。しかしながら、ゼブラフィッシュ(成体または胚)におけるヒト細胞の長期間の増殖のための条件を同定する必要がある。
The authors have nothing to disclose.
2人の批評家に原稿の優れた提案と改善を感謝します。ユタ大学ハンツマン・ガン研究所(Huntsman Cancer Institute / University of Utah)にも、動物飼育と維持管理に感謝します。この研究は、米国癌協会(#124250-RSG-13-025-01-CSM)、NIH助成金(P30 CA042014 CRRプログラム)、ユタシードグラント大学、ハンツマン癌基金の資金提供を受けました。
Egg water | in house | maintaining embryos, making injection plate | |
Methylene Blue | Sigma-Aldrich | M9140 | add to egg water to prevent fungal growth |
Petri dish | Thermo Fisher | FB0875711Z | housing embryos, making injection plate |
50 ml beaker (2 inch diameter) | Any commercial brand | making injection plate | |
Agarose | Denville | CA3510-8 | making injection plate |
Glass Container | Any commercial brand | making injection plate | |
Tweezers | Fine Science Tools | 11295-10 | tumor dissection |
Razor Blade | Thermo Fisher | 12640 | needle preparation, tumor dissection |
Glass slide wrapped in parafilm | Any commercial brand | needle preparation | |
Phosphate Buffered Saline 1x, pH 7.4 | Life Technologies | 10010023 | tumor resuspension |
Cell strainer, 40 µm | Corning Falcon | 352340 | tumor resuspension |
1000 µl filter tips | any commercial brand | tumor resuspension | |
100 µl filter tips | any commercial brand | tumor resuspension | |
50 ml conical tubes | Genesee Scientific | 21-108 | tumor resuspension |
15 ml conical tubes | Genesee Scientific | 21-103 | tumor resuspension |
1.7 ml microtubes | Genesee Scientific | 24-281 | tumor resuspension |
Micropipettes | Any commercial brand | tumor resuspension and transplantation | |
Glass capillary (no filament) | World Precision Instruments | TW120-4 | tumor transplantation |
Needle puller | Sutter Instruments | P-97 | tumor transplantation |
Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | tumor transplantation |
Microinjector | Harvard Apparatus | PLI-90 | tumor transplantation |
Tricaine-S (MS-222) | Western Chemical | TRS1 | tumor transplantation, anesthetic |
Angled Probe | Fine Science Tools | 10140-02 | embryo manipulation |
Transfer Pipette | Any commercial brand | embryo manipulation | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | required during tumor resuspension |
Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | required during tumor resuspension |
Stereomicroscope | Olympus | SZ61 | tumor transplantation |
Fluorescent Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | imaging tumor transplants |
Microscope Camera | Olympus | DP-72 | imaging tumor transplants |
Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M7140 | imaging tumor transplants |
Incubator | Any commercial brand | maintaining embryos, warming up injection plate | |
Microwave | Any commercial brand | making injection plate | |
Scale | Any commercial brand | making injection plate | |
Gloves | Any commercial brand | all aspects of the protocol | |
Low Melt Agarose | Any commercial brand | confocal imaging of embryos | |
Glass Bottom Dish | Mattek Corporation | P35G-1.0-20-C | confocal imaging of embryos |
Laser-scanning confocal microscope | Olympus | FLUOVIEW FV1200 | confocal imaging of embryos |
Pronase | Roche Diagnostics | 11459643001 | dechorionate embryos |
PBS | Any commercial brand | resuspend tumor/tumor cells | |
12-well plate | Any commercial brand | drug treatment of embryos | |
Thin-bore transfer pipette | Any commercial brand | drug treatment of embryos | |
Hemocytometer | Any commericial brand | For counting tumor cells in suspension | |
N2 | Any commericial brand | For microinjector set up |