Il trapianto di cellule tumorali è un importante strumento per l'identificazione dei meccanismi del cancro e delle risposte terapeutiche. Le tecniche correnti dipendono dagli animali immuno-incompetenti. Qui descriviamo un metodo per il trapianto di cellule tumorali di zebrafish in embrioni immuni-competenti per l'analisi a lungo termine del comportamento delle cellule tumorali e delle risposte in vivo .
Il trapianto di cellule tumorali è una tecnica importante per definire i meccanismi che controllano la crescita delle cellule tumorali, la migrazione e la risposta dell'ospite, nonché per valutare la potenziale risposta del paziente alla terapia. I metodi correnti dipendono in larga misura dall'utilizzo di animali singenici o immunizzati per evitare il rigetto dell'innesto tumorale. Tali metodi richiedono l'impiego di ceppi genetici specifici che spesso impediscono l'analisi delle interazioni di cellule immunitarie e / o sono limitate a specifici ambiti genetici. Un metodo alternativo nel zebrafish approfitta di un sistema immunitario incompletamente sviluppato nel cervello embrionale prima di 3 giorni, in cui le cellule tumorali vengono trapiantate per essere utilizzate nei test a breve termine ( ovvero da 3 a 10 giorni). Tuttavia, questi metodi provocano la letalità dell'ospite, che impedisce lo studio a lungo termine del comportamento delle cellule tumorali e della risposta ai farmaci. Questo protocollo descrive un metodo semplice ed efficiente per il trapianto ortotopico a lungo termine del tessuto tumorale cerebrale di zebrafish inAl quarto ventricolo di un zebrafish di 2 giorni di immune competenza. Questo metodo consente: 1) studio a lungo termine dei comportamenti delle cellule tumorali, come invasione e disseminazione; 2) risposta tumorale durevole alle droghe; E 3) rintracciamento dei tumori per lo studio dell'evoluzione del tumore e / o l'impatto di diversi background genetici dell'home. In sintesi, questa tecnica consente ai ricercatori del cancro di valutare l'ingestione, l'invasione e la crescita nei siti lontani, nonché per eseguire schermi chimici e test di concorrenza cellulare per molti mesi. Questo protocollo può essere esteso a studi di altri tipi di tumore e può essere utilizzato per chiarire i meccanismi di chemoresistenza e metastasi.
Il trapianto di cellule tumorali in animali compromessi dall'immunizzazione, in particolare i xenograft di mouse, è una tecnica ampiamente usata per studiare meccanismi che controllano la proliferazione delle cellule tumorali 1 , 2 , la sopravvivenza , l' invasione e la metastasi 3 , 4 , oltre a fornire una piattaforma Per la screening dei farmaci 5 , 6 , 7 . Più recentemente, il trapianto di campioni tumorali primari in topi immunitari compromessi è stato usato per generare modelli di xenograft (PDX) derivanti dal paziente per scopi diagnostici e preclinici di screening dei farmaci e costituisce la spina dorsale dell'iniziativa 8 , 9 , 10 , 11 della medicina personalizzata . Tuttavia, evidenze significative mostrano che modulare l'immune syLo stelo può avere un impatto drammatico sul comportamento del tumore e sul risultato del paziente 12 , 13 . Ciò ha spinto il ridisegno delle tecniche basate su xenograft a includere i topi "umanizzati", in cui il sistema immunitario del mouse viene ricostituito co-trapianto di cellule immunitarie umane con cellule tumorali. Tuttavia, questo approccio è ancora tecnicamente impegnativo, con riproducibilità variabile e tossicità associate alla tecnica, oltre al costo significativo 14 , 15 . Pertanto, sono necessarie nuove tecniche di trapianto in animali immunitario-competenti per accelerare la scoperta di meccanismi specifici immunologici e tumorali di progressione del cancro e risposta ai farmaci.
Zebrafish sono un modello alternativo di animali per lo studio del cancro umano, con oltre 20 modelli di cancro ora stabiliti 16 , tra cui cervello altamente maligno 17 , mela Noma 18 , 19 , 20 e tumori del pancreas 21 , 22 , così come molte leucemie 23 , 24 , 25 , 26 , 27 . Due attributi del sistema zebrafish rendono particolarmente adattabile alla ricerca sul cancro: 1) la chiarezza ottica degli animali traslucidi consente la visualizzazione diretta dei comportamenti delle cellule tumorali (proliferazione, sopravvivenza, invasione e diffusione) utilizzando semplici tecniche di microscopia e 2) Gli zebrafish femmine possono produrre fino a 200 embrioni al giorno, consentendo la rapida riduzione dei numeri di animali per lo screening genetico o di droga ad un costo ridotto. Inoltre, i genomi del cancro dei pesci zebra e degli esseri umani sono altamente conservati (inclusi oncogeni e geni-soppressori tumorali)F "> 28, permettendo alla meccanica e alle scoperte di droga di essere rapidamente tradotte nei sistemi di mammiferi. Questi attributi rendono anche i zebrafish un modello animale ideale per le tecniche di trapianto, che sfruttano l'imaging, la scalabilità e il basso costo del sistema.
Precedenti studi di trapianto tumorale in zebrafish immunitario compromettono l'identificazione delle capacità di auto-rinnovamento, malignità tumorale e invasione / diffusione 11 , 29 . Studi di breve durata del comportamento delle cellule tumorali possono essere condotte dopo il trapianto negli adulti γ-irradiati, i cui sistemi immunitari sono effettivamente soppressi per ~ 20 giorni 11 , 30 . Il trattamento di zebrafish adulte con dexametasone sopprime le cellule B e T fino a 30 giorni prima del rigetto 31 . Un'altra strategia meno comune utilizza ceppi clonal zebrafishChe consentono indagini a lungo termine in un ospite immunitario-competente 32 . Tuttavia, solo un numero limitato di ceppi clonali sono stati generati e sono difficili da mantenere a causa della bassa fecondità. Inoltre, la maggior parte dei modelli tumorali di zebrafish stabiliti vengono generati in altri background genetici, per cui questi tumori non possono essere trapiantati nei ceppi clonal senza sopprimere il sistema immunitario 11 , 33 , 34 . Gli approcci più recenti per migliorare gli studi sul trapianto a lungo termine includono lo sviluppo della linea mutante di rag2 E450fs , con compromesso delle funzioni di B e T che sono state utilizzate per il trapianto di tumori multipli 35 , 36 . Per aggirare il requisito per le linee di zebrafish clonari o per un host immunitario compromesso, un certo numero di gruppi hanno utilizzato embrioni di fase precoce ( cioè > 72 HPFecondazione ost (hpf)) per il trapianto di cellule tumorali umane, poiché questi embrioni non hanno ancora sviluppato completamente un sistema immunitario adattativo 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , 43 . Tuttavia, questi metodi sono limitati all'analisi a breve termine del comportamento delle cellule tumorali o della reazione di farmaci (di solito meno di 2 settimane) in quanto le cellule tumorali umane o la tecnica di trapianto uccidono l'ospite, impedendo studi a lungo termine e rintracciamenti.
Questo protocollo descrive un metodo di trapianto embrionale modificato nel lumen del quarto ventricolo di un cervello embrionale di fecondazione a due giorni (dpf). Minimizza la tossicità per l'ospite e può essere combinata con i modelli tumorali cerebrali di zebrafish per l'inserimento a lungo termine delle cellule tumorali. Così, questa tecnica alBassi per il reintegro delle cellule tumorali in nuovi padroni di casa per molte generazioni, facilitando studi futuri su eterogeneità tumorale, risposta host / immunitaria, risposte farmacologiche o potenziale metastatico. Questo metodo è anche semplice, efficiente e scalabile, in quanto fino a 300 trapianti possono essere eseguiti da un singolo utente al giorno, fino al 90% di assunzione. Ciò consente la rapida diffusione di singoli tumori primari in centinaia di embrioni a 2 dpf per progetti di screening genetico o di droga o per visualizzare direttamente il comportamento delle cellule tumorali cerebrali in diversi background ospitanti per molti mesi.
Questo protocollo descrive un esame di trapianto semplice ed efficiente che coinvolge l'iniezione di cellule tumorali di zebrafish nel ventricolo di un embrione a 2 dpf che svilupperà un sistema immunitario completamente competente. Finora, i zebrafish CNS-PNET 17 e il melanoma (dati non mostrati) sono stati trapiantati con successo per studi a lungo termine del comportamento e dell'invasione delle cellule tumorali. Le fasi critiche di questo protocollo comprendono l'adeguata dimensione del foro e la corretta sospensione delle cellule tumorali e l'anestesia adeguata degli embrioni dell'ospite. Per ogni singolo ricercatore, un'ulteriore ottimizzazione di questa tecnica può includere la regolazione della concentrazione delle cellule tumorali, della pressione di iniezione e dell'orientamento degli embrioni. Inoltre, possono esserci eterogeneità nella viscosità delle sospensioni provenienti da tumori diversi, in modo che i diversi tipi di tumore possono essere più o meno difficili da ri-sospendere e trapiantare. Tuttavia, regolando la dimensione del foro e utilizzando diffeÈ possibile superare le difficoltà associate alle viscosità tumorali.
Nella nostra esperienza, le ragioni più comuni per le cellule sparse / le masse di cellule incoerenti nel ventricolo sono le seguenti: 1) la sospensione della cellula tumorale è troppo diluita; 2) la dimensione del foro è troppo piccola; 3) il tempo di iniezione e la pressione sono troppo bassi; E / o 4) i tessuti rimanenti non sono stati filtrati dal tumore e sono alloggiati nell'ago. Quando la sospensione della cellula tumorale esce dal ventricolo dopo l'iniezione, è probabile che: 1) il posizionamento dell'ago sul pavimento del ventricolo; 2) una pressione e un tempo di iniezione elevata; E / o 3) una dimensione del foro che è troppo grande. La bassa sopravvivenza di embrioni trapiantati può essere causata da: 1) l'anestesia di embrioni per un lungo periodo di tempo; 2) lasciare embrioni sulla piastra di iniezione per asciugare; 3) l'iniezione di bolle d'aria nel ventricolo; E / o 4) organi vitali piercing, come il cervello eCuore, perché l'ago ha attraversato il ventricolo.
I metodi precedenti di trapianto tumorale nel cervello adulto o embriotico si basano sull'immunosoppressione negli adulti (geneticamente, farmacologicamente o mediante radiazioni) o sono limitati a studi a breve termine di cellule umane o di topi negli embrioni 38 , 43 , 52 , 53 , 54 . Ad esempio, i tumori al cervello del mouse possono essere iniettati intranazionalmente in dessametasone-immunosoppresso, 30-dpf, zebrafish giovanile per l'uso in analisi cliniche pre-cliniche a breve termine (~ 2 giorni) 54 . Tuttavia, il sito di iniezione in questi esperimenti è oscurato dal tessuto del cranio e del cervello e probabilmente provoca danni al tessuto cerebrale normale, che riduce la vitalità dell'ospite e l'efficienza di lavorazione. Un altro metodo recentemente descritto prevede l'iniezione di gliob umanoLinee di cellule del lastoma nella regione del midbrain di embrioni di zebrafish, che hanno permesso l'analisi a breve termine della crescita, dell'invasione e della risposta farmacologica 43 . Ancora una volta, la posizione precisa del sito di iniezione è variabile e probabilmente danneggia il tessuto normale. Pertanto, i metodi precedenti dei trapianti di cervello embrionale spesso compromettono la vitalità degli ospiti, limitando questi studi ad analisi a breve termine ( vale a dire da 2 a 14 giorni), causando una maggiore variabilità tra le singole iniezioni a causa di siti d'iniezione oscurati e prevenendo il lungo- Analisi a lungo termine dei comportamenti delle cellule e delle risposte alle droghe o del rintracciamento in molteplici generazioni.
Il metodo qui descritto affronta le limitazioni attuali nelle tecniche di trapianto embrionale di zebrafish e di immune compromessi, consentendo ai ricercatori di: 1) ripetere l'iniezione nella stessa posizione, con minimi danni al tessuto circostante; 2) visualizzare direttamente il sito di iniezione per massimizzareEfficienza di lavorazione; 3) trapianto centinaia di embrioni al giorno; 4) permettono ai tumori di crescere negli animali immunocompetenti; 5) consentire il monitoraggio del comportamento delle cellule tumorali e delle risposte durevoli della droga durante la vita dei pesci zebra; E 6) consentire il rintracciamento dei tumori in molte generazioni per studi potenziali sull'evoluzione del tumore o sui meccanismi di recupero di farmaci. Inoltre, questo protocollo consente ai ricercatori di utilizzare qualsiasi genotipo di zebrafish per la valutazione della risposta dell'ospite, comprese diverse popolazioni immunitarie. Questi attributi rendono questo metodo facilmente adattabile da qualsiasi laboratorio che effettua già microiniziamenti standard in zebrafish. Infine, mentre questo metodo è ideale per le iniezioni ortopediche dei tumori cerebrali di zebrafish, quando il trapianto di altri tipi di tumori, come il fegato o il pancreas, il sito ortotopico può essere più importante della competenza immunitaria ( ad esempio se un ricercatore sta studiando gli effetti dello stromale Microambiente sulla crescita del tumore). In questo scenario, ilI modelli sviluppati di recente sviluppato e difettoso di zebra possono essere più appropriati per eseguire trapianti tumorali ortopediche 11 .
Questo protocollo è stato usato per eseguire i test di concorrenza delle cellule tumorali e per iniettare tumori a doppio etichettatura. Si è inoltre discusso di una strategia di trattamento potenziale per la valutazione dell'efficacia dei composti chimici sulla tumorigenesi, che prevede il trattamento di embrioni post-trapianto mediante l'aggiunta del farmaco all'acqua. È stato anche riportato un metodo per il trattamento ex vivo delle cellule tumorali prima del trapianto. Inoltre, i tumori trapiantati sono stati raggruppati per diversi cicli di ri-trapianto, che saranno utili per studi sull'evoluzione del tumore e sulla chemoresistenza 17 . Attualmente, gli studi pre-clinici dipendono da xenografts del mouse per valutare l'efficacia dei potenziali composti. Tuttavia, questi studi richiedono molto tempoE costoso. Considerando l'elevato grado di conservazione dei percorsi di segnalazione oncogena tra zebrafish e umani 28 , si può prevedere che questo metodo complementerà gli studi di cellule umane e umane convenzionali per consentire una più rapida identificazione di composti efficaci che entrino in studi clinici e clinici. In definitiva, questo metodo potrebbe rivelarsi utile per lo screening chimico rapido dei tumori primari del paziente, che potrebbe spingere ulteriormente l'iniziativa della medicina personalizzata. Tuttavia, devono ancora essere individuate le condizioni per la crescita a lungo termine delle cellule umane in zebrafish (adulto o embrio).
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo i due recensori per ottimi suggerimenti e miglioramenti al manoscritto. Ringraziamo anche Huntsman Cancer Institute / University of Utah per la zootecnia e la manutenzione. Questo lavoro è stato finanziato dalla American Cancer Society (n. 124250 – RSG-13-025-01-CSM), una sovvenzione NIH (programma P30 CA042014 CRR), l'Università di Utah Seed Grant e la Huntsman Cancer Foundation.
Egg water | in house | maintaining embryos, making injection plate | |
Methylene Blue | Sigma-Aldrich | M9140 | add to egg water to prevent fungal growth |
Petri dish | Thermo Fisher | FB0875711Z | housing embryos, making injection plate |
50 ml beaker (2 inch diameter) | Any commercial brand | making injection plate | |
Agarose | Denville | CA3510-8 | making injection plate |
Glass Container | Any commercial brand | making injection plate | |
Tweezers | Fine Science Tools | 11295-10 | tumor dissection |
Razor Blade | Thermo Fisher | 12640 | needle preparation, tumor dissection |
Glass slide wrapped in parafilm | Any commercial brand | needle preparation | |
Phosphate Buffered Saline 1x, pH 7.4 | Life Technologies | 10010023 | tumor resuspension |
Cell strainer, 40 µm | Corning Falcon | 352340 | tumor resuspension |
1000 µl filter tips | any commercial brand | tumor resuspension | |
100 µl filter tips | any commercial brand | tumor resuspension | |
50 ml conical tubes | Genesee Scientific | 21-108 | tumor resuspension |
15 ml conical tubes | Genesee Scientific | 21-103 | tumor resuspension |
1.7 ml microtubes | Genesee Scientific | 24-281 | tumor resuspension |
Micropipettes | Any commercial brand | tumor resuspension and transplantation | |
Glass capillary (no filament) | World Precision Instruments | TW120-4 | tumor transplantation |
Needle puller | Sutter Instruments | P-97 | tumor transplantation |
Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | tumor transplantation |
Microinjector | Harvard Apparatus | PLI-90 | tumor transplantation |
Tricaine-S (MS-222) | Western Chemical | TRS1 | tumor transplantation, anesthetic |
Angled Probe | Fine Science Tools | 10140-02 | embryo manipulation |
Transfer Pipette | Any commercial brand | embryo manipulation | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | required during tumor resuspension |
Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | required during tumor resuspension |
Stereomicroscope | Olympus | SZ61 | tumor transplantation |
Fluorescent Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | imaging tumor transplants |
Microscope Camera | Olympus | DP-72 | imaging tumor transplants |
Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M7140 | imaging tumor transplants |
Incubator | Any commercial brand | maintaining embryos, warming up injection plate | |
Microwave | Any commercial brand | making injection plate | |
Scale | Any commercial brand | making injection plate | |
Gloves | Any commercial brand | all aspects of the protocol | |
Low Melt Agarose | Any commercial brand | confocal imaging of embryos | |
Glass Bottom Dish | Mattek Corporation | P35G-1.0-20-C | confocal imaging of embryos |
Laser-scanning confocal microscope | Olympus | FLUOVIEW FV1200 | confocal imaging of embryos |
Pronase | Roche Diagnostics | 11459643001 | dechorionate embryos |
PBS | Any commercial brand | resuspend tumor/tumor cells | |
12-well plate | Any commercial brand | drug treatment of embryos | |
Thin-bore transfer pipette | Any commercial brand | drug treatment of embryos | |
Hemocytometer | Any commericial brand | For counting tumor cells in suspension | |
N2 | Any commericial brand | For microinjector set up |