Transplantationen af kræftceller er et vigtigt redskab til identifikation af kræftmekanismer og terapeutiske reaktioner. Nuværende teknikker afhænger af immunkompetente dyr. Her beskriver vi en metode til transplantation af zebrafisk-tumorceller til immunkompetente embryoner til den langsigtede analyse af tumorcelleadfærd og in vivo- lægemiddelresponser.
Tumorcelletransplantation er en vigtig teknik til at definere mekanismerne til regulering af kræftcellevækst, migration og værtsrespons samt at vurdere potentielt patientrespons på terapi. Nuværende metoder afhænger i høj grad af at anvende syngene eller immunforstyrrede dyr for at undgå afvisning af tumorgraft. Sådanne fremgangsmåder kræver anvendelse af specifikke genetiske stammer, der ofte forhindrer analysen af immuntumorcelleinteraktioner og / eller er begrænset til specifikke genetiske baggrunde. En alternativ metode i zebrafisk drager fordel af et ufuldstændigt udviklet immunsystem i den embryonale hjerne inden 3 dage, hvor tumorceller transplanteres til brug i kortvarige analyser ( dvs. 3 til 10 dage). Disse metoder medfører imidlertid værtsdatalitet, som forhindrer den langsigtede undersøgelse af tumorcelleadfærd og lægemiddelrespons. Denne protokol beskriver en simpel og effektiv metode til langsigtet ortototopisk transplantation af zebrafisk hjernetumorvæv iTil den fjerde ventrikel af en 2-dages gammel immunkompetent zebrafisk. Denne metode giver mulighed for: 1) langvarig undersøgelse af tumorcelleadfærd, såsom invasion og formidling; 2) varigt tumorrespons på lægemidler Og 3) re-transplantation af tumorer til undersøgelse af tumorevolution og / eller virkningen af forskellige værtsgenetiske baggrunde. Sammenfattende giver denne teknik mulighed for kræftforskere til at vurdere engraftment, invasion og vækst på fjerne steder samt at udføre kemiske skærme og cellekonkurrenceanalyser i mange måneder. Denne protokol kan udvides til undersøgelser af andre tumortyper og kan bruges til at belyse mekanismer for kemoresistance og metastase.
Transplantationen af tumorceller til immunkompromitterede dyr, især musen xenotransplantater, er en almindeligt anvendt teknik anvendt til at studere mekanismer, der styrer cancercelleproliferation 1 , 2 , overlevelse, invasion og metastase 3 , 4 såvel som at tilvejebringe en platform Til screening af lægemidler 5 , 6 , 7 . For nylig er transplantationen af primære tumorprøver til immunkompromitterede mus blevet brugt til at generere patient-afledte xenograftmodeller (PDX) til diagnostisk og præklinisk lægemiddel screening og er rygraden i det personlige medicin initiativ 8 , 9 , 10 , 11 . Imidlertid viser betydelige beviser at modulere immunsystemetStamme kan have en dramatisk indvirkning på tumoradfærd og patientudfald 12 , 13 . Dette har drevet redesignet af xenograft-baserede teknikker til at inkludere "humaniserede" mus, hvori immunsystemet af musen rekonstitueres ved co-transplantation af humane immunceller med tumorceller. Denne fremgangsmåde er dog stadig teknisk udfordrende, med variabel reproducerbarhed og toksiciteter forbundet med teknikken, ud over den betydelige omkostning 14 , 15 . Således er nye transplantationsteknikker i immunkompetente dyr nødvendige for at fremskynde opdagelsen af immun- og tumor-specifikke mekanismer for kræftprogression og lægemiddelrespons.
Zebrafish er en alternativ dyremodel til undersøgelse af humant kræft, med over 20 kræftmodeller etableret nu 16 , herunder meget ondartet hjerne 17 , mela Noma 18 , 19 , 20 og bukspyttkjertelkræft 21 , 22 såvel som mange leukæmier 23 , 24 , 25 , 26 , 27 . To zebrafisksystemers to egenskaber gør det særligt egnet til kræftforskning: 1) Den transparente dyrs optiske klarhed muliggør direkte visualisering af kræftcelleadfærd ( dvs. spredning, overlevelse, invasion og formidling) ved brug af enkle mikroskopiteknikker og 2) Kvindelige zebrafisk kan producere op til 200 embryoner om dagen, hvilket gør det muligt hurtigt at scalere dyrenumre til genetisk eller medikament screening til en lav pris. Derudover er kræftgenomene af zebrafisk og mennesker stærkt konserverede (herunder onkogener og tumor-suppressor-gener)F "> 28, som gør det muligt hurtigt at omdanne mekanismer og stofopdagelser til pattedyrsystemer. Disse egenskaber gør også zebrafisken til en ideel dyremodel til transplantationsteknikker, der udnytter billeddannelsen, skalerbarheden og den lave pris ved systemet.
Tidligere tumortransplantationsundersøgelser i immunforstyrret zebrafisk har lettet identifikationen af selvfornyelsesevner, tumor malignitet og invasion / formidling 11 , 29 . Kortvarige undersøgelser af tumorcelleadfærd kan udføres efter transplantation til y-bestrålede voksne, hvis immunsystem effektivt undertrykkes i ~ 20 dage 11 , 30 . Behandlingen af voksne zebrafisk med dexamethason undertrykker B- og T-celler i op til 30 dage før afstødning sker 31 . En anden mindre fælles strategi anvender klonale zebrafiskstammerDer muliggør langsigtede undersøgelser hos en immunkompetent vært 32 . Imidlertid er kun et begrænset antal klonestammer genereret og er vanskelige at opretholde på grund af lav fecunditet. Derudover genereres de fleste af de etablerede zebrafisktumormodeller i andre genetiske baggrunde, så disse tumorer kan ikke transplanteres i klonestammerne uden at undertrykke immunsystemet 11 , 33 , 34 . Nyere tilgange til forbedring af langsigtede transplantationsundersøgelser omfatter udvikling af rag2 E450fs mutantlinien med kompromitterede B- og T-cellefunktioner, som er blevet brugt til succesfuldt transplantation af flere kræftformer 35 , 36 . For at omgå kravet om klonale zebrafisk linjer eller en immunkompromitteret vært har en række grupper brugt embryoner i tidligt stadium ( dvs. > 72 hkOste-befrugtning (hpf)) til human tumorcelletransplantation, da disse embryoner endnu ikke fuldt ud har udviklet et adaptivt immunsystem 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , 43 . Disse metoder er imidlertid begrænset til den kortsigtede analyse af tumorcelleadfærd eller lægemiddelrespons (normalt mindre end 2 uger), fordi de humane cancerceller eller selve transplantationsteknikken dræber værten, forhindrer langtidsstudier og gentransplantation.
Denne protokol beskriver en modificeret embryonal transplantationsmetode i lumen i den fjerde ventrikel i en 2-dages post-befrugtning (dpf) embryo-hjerne. Det minimerer toksiciteten for værten og kan kombineres med zebrafisk hjerne tumor modeller til langsigtet engraftment af tumorceller. Således er denne teknik alLows for omplantning af tumorceller til nye værter i mange generationer, hvilket letter fremtidige undersøgelser af tumor heterogenitet, værts / immunrespons, lægemiddelrespons eller metastatisk potentiale. Denne metode er også enkel, effektiv og skalerbar, da op til 300 transplantationer kan udføres af en enkelt bruger om dagen med op til 90% engraftment. Dette giver mulighed for hurtig udbredelse af enkelt primære tumorer i hundreder af embryoner ved 2 dpf til genetiske eller lægemiddel screening projekter eller direkte visualisere hjerne tumor celle adfærd i forskellige vært baggrunde i mange måneder.
Denne protokol beskriver et simpelt og effektivt transplantationsassay, der involverer injektion af zebrafisk-tumorceller i ventriklen i et 2-dpf-embryo, som vil udvikle et fuldt kompetent immunsystem. Hidtil er zebrafisk CNS-PNET 17 og melanom (data ikke vist) med succes transplanteret til langsigtede undersøgelser af tumorcelleadfærd og invasion. De kritiske trin i denne protokol omfatter sikring af den passende nålboringsstørrelse og den korrekte tumorcellesuspension og tilstrækkeligt bedøvende værtsembryoner. For hver enkelt forsker kan yderligere optimering af denne teknik indbefatte justeringen af tumorcellekoncentration, indsprøjtningstryk og embryoorientering. Derudover kan der være heterogenitet i viskositeten af suspensioner, der stammer fra forskellige tumorer, så forskellige tumortyper kan være mere eller mindre vanskelige at genop suspendere og transplantere. Ved at justere nålens borestørrelse og ved at anvende diffeLejefortyndinger af tumorsuspensionen er det muligt at overvinde vanskeligheder forbundet med tumorviskositeter.
I vores erfaring er de mest almindelige årsager til sparsomme celler / inkonsekvente cellemasser i ventriklen som følger: 1) tumorcellesuspensionen er for fortyndet; 2) nålens borestørrelse er for lille; 3) Injektionstid og tryk er for lave; Og / eller 4) resterende væv blev ikke filtreret fra tumoren og indlagt i nålen. Når tumorcellesuspensionen strømmer ud af ventriklen efter injektion, skyldes det sandsynligvis: 1) placeringen af nålen mod kammerets gulv; 2) et højt indsprøjtningstryk og tid Og / eller 3) en nålboringsstørrelse, der er for stor. Lav overlevelse af transplanterede embryoner kan skyldes: 1) bedøvelse af embryoner i længere tid; 2) forlader embryoner på injektionspladen for at tørre 3) injektion af luftbobler ind i ventriklen Og / eller 4) piercing vitale organer, såsom hjernen ogHjerte, fordi nålen gik gennem ventriklen.
Tidligere metoder til tumortransplantation i den voksne eller embryonale zebrafisk-hjerne er afhængige af immunosuppression hos voksne (genetisk, farmakologisk eller via stråling) eller er begrænset til kortvarige undersøgelser af humane eller museceller i embryoner 38 , 43 , 52 , 53 , 54 . For eksempel kan musens hjernetumorer injiceres intranasalt i dexamethason-immunsupprimeret 30-dpf juvenil zebrafisk til brug i kortvarige (~ 2 dage) prækliniske lægemiddelanalyser 54 . Injektionsstedet i disse forsøg dækkes imidlertid af kraniet og hjernevævet og resulterer sandsynligvis i skade på normalt hjernevæv, hvilket reducerer værtsvævbarhed og engraftmenteffektivitet. En anden nyligt beskrevet metode involverer injektion af humant gliobLastoma cellelinier ind i midterste område af zebrafiskembryoer, hvilket muliggjorde kortfristet analyse af vækst, invasion og lægemiddelrespons 43 . Igen er den præcise placering af injektionsstedet variabel og sandsynligvis ødelægger normalt væv. Således kompromitterer tidligere metoder til embryonale hjerne-transplantationer ofte levedygtigheden af værterne, hvilket begrænser disse undersøgelser til kortvarig analyse ( dvs. 2 til 14 dage), hvilket medfører øget variabilitet mellem individuelle injektioner på grund af uklarede injektionssteder og forebyggelse af langvarig injektion Langsigtet analyse af celleadfærd og lægemiddelrespons eller re-transplantation på tværs af flere generationer.
Den her beskrevne metode omhandler nuværende begrænsninger i embryonale og immunforstyrrede transplantationsteknikker ved zebrafisk ved at tillade forskere at: 1) reproduceres injiceres på samme sted med minimal skade på omgivende væv; 2) visualisere direkte indsprøjtningsstedet for at maksimereEngraftment effektivitet; 3) transplantere hundredvis af embryoner om dagen 4) tillade tumorer at vokse hos immunkompetente dyr 5) tillade overvågning af tumorcelleadfærd og holdbare lægemiddelresponser over zebrafiskens liv; Og 6) muliggøre re-transplantation af tumorer over mange generationer til potentielle undersøgelser af tumorevolution eller lægemiddelrelateret mekanismer. Desuden giver denne protokol forskere mulighed for at udnytte enhver zebrafish genotype til vurdering af værtsrespons, herunder forskellige immunpopulationer. Disse egenskaber gør denne metode nem at tilpasse af ethvert laboratorium, der allerede udfører standardmikroinjektioner i zebrafisk. Endelig, mens denne metode er ideel til ortopotopiske injektioner af zebrafisk hjernetumorer, kan transplantation af andre tumortyper, såsom lever eller pankreas, være vigtigere end immunkompetence ( f.eks. Hvis en forsker studerer virkningerne af stromal Mikro-miljø på tumorvækst). I dette scenario, denNyudviklede immundefekt zebrafiskmodeller kan være mere hensigtsmæssige til udførelse af orthotopiske tumortransplantationer 11 .
Denne protokol er blevet anvendt til at udføre tumorcellekonkurrenceanalyser og til at injicere dobbeltmærkede tumorer. En potentiel behandlingsstrategi til vurdering af effektiviteten af kemiske forbindelser på tumorigenese, som involverer behandling af embryon efter transplantation via tilsætning af lægemidlet til vand, blev også drøftet. En metode til ex vivo behandling af tumorceller forud for transplantation blev også tidligere rapporteret 17 . Derudover er transplanterede tumorer blevet samlet for flere runder af re-transplantation, hvilket vil være gavnligt for undersøgelser af tumorevolution og kemoresistens 17 . I øjeblikket er prækliniske undersøgelser afhængige af muse xenotransplantater for at vurdere effekten af potentielle forbindelser. Disse undersøgelser er imidlertid tidskrævendeOg dyrt. I betragtning af den høje grad af bevarelse af onkogene signalveje mellem zebrafisk og mennesker 28 , kan det forventes, at denne metode vil komplementere konventionelle mus- og humane celleundersøgelser for at muliggøre hurtigere identifikation af effektive forbindelser ind i prækliniske og kliniske forsøg. I sidste ende kunne denne metode vise sig at være nyttig til hurtig kemisk screening af primære patienttumorer, som yderligere kunne fremme det personlige medicininitiativ. Imidlertid skal betingelserne for den langsigtede vækst af humane celler i zebrafisk (voksen eller embryo) stadig identificeres.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker de to korrekturlæsere for fremragende forslag og forbedringer af manuskriptet. Vi takker også Huntsman Cancer Institute / University of Utah til husdyrhold og vedligeholdelse. Dette arbejde blev finansieret af American Cancer Society (# 124250-RSG-13-025-01-CSM), et NIH-tilskud (P30 CA042014 CRR-program), University of Utah Seed Grant og Huntsman Cancer Foundation.
Egg water | in house | maintaining embryos, making injection plate | |
Methylene Blue | Sigma-Aldrich | M9140 | add to egg water to prevent fungal growth |
Petri dish | Thermo Fisher | FB0875711Z | housing embryos, making injection plate |
50 ml beaker (2 inch diameter) | Any commercial brand | making injection plate | |
Agarose | Denville | CA3510-8 | making injection plate |
Glass Container | Any commercial brand | making injection plate | |
Tweezers | Fine Science Tools | 11295-10 | tumor dissection |
Razor Blade | Thermo Fisher | 12640 | needle preparation, tumor dissection |
Glass slide wrapped in parafilm | Any commercial brand | needle preparation | |
Phosphate Buffered Saline 1x, pH 7.4 | Life Technologies | 10010023 | tumor resuspension |
Cell strainer, 40 µm | Corning Falcon | 352340 | tumor resuspension |
1000 µl filter tips | any commercial brand | tumor resuspension | |
100 µl filter tips | any commercial brand | tumor resuspension | |
50 ml conical tubes | Genesee Scientific | 21-108 | tumor resuspension |
15 ml conical tubes | Genesee Scientific | 21-103 | tumor resuspension |
1.7 ml microtubes | Genesee Scientific | 24-281 | tumor resuspension |
Micropipettes | Any commercial brand | tumor resuspension and transplantation | |
Glass capillary (no filament) | World Precision Instruments | TW120-4 | tumor transplantation |
Needle puller | Sutter Instruments | P-97 | tumor transplantation |
Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | tumor transplantation |
Microinjector | Harvard Apparatus | PLI-90 | tumor transplantation |
Tricaine-S (MS-222) | Western Chemical | TRS1 | tumor transplantation, anesthetic |
Angled Probe | Fine Science Tools | 10140-02 | embryo manipulation |
Transfer Pipette | Any commercial brand | embryo manipulation | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | required during tumor resuspension |
Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | required during tumor resuspension |
Stereomicroscope | Olympus | SZ61 | tumor transplantation |
Fluorescent Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | imaging tumor transplants |
Microscope Camera | Olympus | DP-72 | imaging tumor transplants |
Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M7140 | imaging tumor transplants |
Incubator | Any commercial brand | maintaining embryos, warming up injection plate | |
Microwave | Any commercial brand | making injection plate | |
Scale | Any commercial brand | making injection plate | |
Gloves | Any commercial brand | all aspects of the protocol | |
Low Melt Agarose | Any commercial brand | confocal imaging of embryos | |
Glass Bottom Dish | Mattek Corporation | P35G-1.0-20-C | confocal imaging of embryos |
Laser-scanning confocal microscope | Olympus | FLUOVIEW FV1200 | confocal imaging of embryos |
Pronase | Roche Diagnostics | 11459643001 | dechorionate embryos |
PBS | Any commercial brand | resuspend tumor/tumor cells | |
12-well plate | Any commercial brand | drug treatment of embryos | |
Thin-bore transfer pipette | Any commercial brand | drug treatment of embryos | |
Hemocytometer | Any commericial brand | For counting tumor cells in suspension | |
N2 | Any commericial brand | For microinjector set up |