Transplantationen av cancerceller är ett viktigt verktyg för identifiering av cancermekanismer och terapeutiska svar. Nuvarande tekniker beror på immunkompetenta djur. Här beskriver vi en metod för att transplantera tumörceller från zebrafisk till immunkompetenta embryon för långsiktig analys av tumörcellsbeteende och in vivo läkemedelsreaktioner.
Tumörcellstransplantation är en viktig teknik för att definiera mekanismerna som reglerar cancercelltillväxt, migration och värdrespons samt att bedöma potentiellt patientrespons på terapi. Nuvarande metoder beror till stor del på att använda syngene eller immunförsvagade djur för att undvika avstötning av tumörtransplantatet. Sådana metoder kräver användning av specifika genetiska stammar som ofta förhindrar analys av immuntumörcellsinteraktioner och / eller är begränsade till specifika genetiska bakgrunder. En alternativ metod i zebrafisk drar nytta av ett ofullständigt utvecklat immunförsvar i den embryonala hjärnan före 3 dagar, där tumörceller transplanteras för användning vid kortvariga analyser ( dvs 3 till 10 dagar). Dessa metoder medför dock värddatalitet, vilket förhindrar den långsiktiga studien av tumörcellsbeteende och läkemedelsrespons. Detta protokoll beskriver en enkel och effektiv metod för den långsiktiga ortototoptransplantationen av zebrafisk hjärntumörvävnad iTill den fjärde kammaren hos en 2-dagars immunkompetent sebrafisk. Denna metod möjliggör: 1) långsiktig studie av tumörcellsbeteenden, såsom invasion och spridning; 2) hållbart tumörsvar mot droger; Och 3) re-transplantation av tumörer för studier av tumörutveckling och / eller inverkan av olika värdgenetiska bakgrunder. Sammanfattningsvis tillåter denna teknik cancerforskare att bedöma engraftment, invasion och tillväxt på avlägsna platser, samt att utföra kemiska skärmar och celltävlingstest under många månader. Detta protokoll kan utvidgas till studier av andra tumortyper och kan användas för att belysa mekanismer för kemoresistens och metastasering.
Transplantationen av tumörceller till immunkompromierade djur, särskilt musxenotransplantat, är en allmänt använd teknik som används för att studera mekanismer som styr cancercellerproliferation 1 , 2 , överlevnad, invasion och metastasering 3 , 4 samt att tillhandahålla en plattform För screening av droger 5 , 6 , 7 . Mer nyligen har transplantationen av primära tumörprover till immunkompromitterade möss använts för att generera patient-avledda xenograftmodeller (PDX) för diagnostisk och preklinisk läkemedelsscreening och är ryggraden i det personliga initiativet 8 , 9 , 10 , 11 . Emellertid visar betydande bevis att modulera immunsystemetStammen kan ha en dramatisk inverkan på tumörbeteendet och patientutfallet 12 , 13 . Detta har drivit omkonstruktionen av xenograftbaserade tekniker för att inkludera "humaniserade" möss, i vilka immunsystemet hos musen rekonstitueras genom samtransplantation av humana immunceller med tumörceller. Emellertid är detta tillvägagångssätt fortfarande tekniskt utmanande, med variabel reproducerbarhet och toxiciteter associerade med tekniken, förutom den betydande kostnaden 14 , 15 . Således behövs nya transplantationstekniker i immunkompetenta djur för att påskynda upptäckten av immun- och tumörspecifika mekanismer för cancerprogression och läkemedelsrespons.
Zebrafish är en alternativ djurmodell för studier av mänsklig cancer, med över 20 cancermodeller som nu etablerats 16 , inklusive mycket maligna hjärnor 17 , mela Noma 18 , 19 , 20 och bukspottkörtelcancer 21 , 22 , såväl som många leukemier 23 , 24 , 25 , 26 , 27 . Två funktioner hos zebrafisksystemet gör det särskilt mottagligt för cancerforskning: 1) Den transparenta djurs optiska klarhet möjliggör direkt visualisering av cancercellsbeteenden ( dvs. proliferation, överlevnad, invasion och spridning) med hjälp av enkla mikroskopitekniker och 2) Kvinnlig zebrafisk kan producera upp till 200 embryon per dag, vilket möjliggör snabb skaling av djurnummer för genetisk eller läkemedelssökning till låg kostnad. Dessutom är cancergenomerna hos zebrafisk och människor starkt konserverade (inklusive onkogener och tumör-suppressorgener)F "> 28, vilket möjliggör att mekaniska och läkemedelsupptäckter snabbt översättas till däggdjursystem. Dessa egenskaper gör också zebrafisken en idealisk djurmodell för transplantationstekniker som utnyttjar avbildning, skalbarhet och låg kostnad för systemet.
Tidigare tumörtransplantationsstudier i immunkompromitterad zebrafisk har underlättat identifieringen av självförnyelsekapacitet, tumörmalignitet och invasion / spridning 11 , 29 . Kortsiktiga studier av tumörcellsbeteende kan utföras efter transplantation till γ-bestrålade vuxna, vars immunsystem effektivt undertryckas för ~ 20 dagar 11 , 30 . Behandlingen av vuxna zebrafisk med dexametason undertrycker B- och T-celler i upp till 30 dagar innan avstötning sker 31 . En annan mindre vanlig strategi använder klonala zebrafiskstammarSom möjliggör långsiktiga undersökningar i en immunkompetent värd 32 . Emellertid har endast ett begränsat antal klonstammar genererats och är svåra att upprätthålla på grund av låg fecunditet. Dessutom genereras de flesta av de etablerade zebrafisktumormodellerna i andra genetiska bakgrunder, så dessa tumörer kan inte transplanteras i klonstammarna utan att undertrycka immunsystemet 11 , 33 , 34 . Nyare tillvägagångssätt för att förbättra långsiktiga transplantationsstudier inkluderar utvecklingen av rag2 E450fs mutantlinjen , med komprometterade B- och T-cellfunktioner, som har använts för att framgångsrikt transplantera flera cancerformer 35 , 36 . För att kringgå kravet på klonala zebrafisklinjer eller en immunförsvarad värd har ett antal grupper använt embryon i tidigt stadium ( dvs. > 72 hkOst-befruktning (hpf)) för human tumörcellstransplantation, eftersom dessa embryon ännu inte helt utvecklat ett adaptivt immunsystem 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , 43 . Dessa metoder är emellertid begränsade till den kortsiktiga analysen av tumörcellsbeteende eller läkemedelsrespons (vanligtvis mindre än 2 veckor) eftersom de mänskliga cancercellerna eller själva transplantationstekniken dödar värden, förhindrar långtidsstudier och re-transplantation.
Detta protokoll beskriver en modifierad embryonal transplantationsmetod i lumen i den fjärde ventrikeln i en 2-dagars efterbefruktning (dpf) embryohjärna. Det minimerar toxiciteten hos värden och kan kombineras med zebrafisk hjärntumörmodeller för långsiktig engraftment av tumörceller. Således är denna teknik alLows för re-transplantation av tumörceller till nya värdar över flera generationer, underlättande framtida studier av tumör heterogenitet, värd / immunsvar, läkemedelssvar eller metastatisk potential. Denna metod är också enkel, effektiv och skalbar, eftersom upp till 300 transplantationer kan utföras av en enskild användare per dag, med upp till 90% engraftment. Detta möjliggör snabb fortplantning av enskilda primära tumörer i hundratals embryon vid 2 dpf för genetiska eller läkemedelssökningsprojekt eller för direkt visualisering av hjärntumörcellsbeteende i olika värdbakgrunder under många månader.
Detta protokoll beskriver en enkel och effektiv transplantationsanalys som innefattar injektion av zebrafisk-tumörceller i ventrikeln i ett 2-dpf-embryo som kommer att utveckla ett fullt kompetent immunsystem. Hittills har zebrafisk CNS-PNET 17 och melanom (data ej visat) framgångsrikt transplanterats för långsiktiga studier av tumörcellsbeteende och invasion. De kritiska stegen i detta protokoll innefattar att man säkerställer den lämpliga nålborrstorleken och den korrekta tumörcellsuspensionen och adekvat anestesiserande värdembryon. För varje enskild forskare kan ytterligare optimering av denna teknik innefatta justering av tumörcellskoncentration, injektionstryck och embryoorientering. Dessutom kan det föreligga heterogenitet i viskositeten hos suspensioner som härrör från olika tumörer, så olika tumortyper kan vara mer eller mindre svåra att åter suspendera och transplantera. Genom att justera nålborrstorleken och använda diffeHyrspädningar av tumörsuspensionen är det möjligt att övervinna svårigheter associerade med tumörviskositeter.
Enligt vår erfarenhet är de vanligaste orsakerna till glesa celler / inkonsekventa cellmassor i ventrikeln följande: 1) tumörcellsuspensionen är för utspädd; 2) nålborrstorleken är för liten; 3) Injektionstid och tryck är för låga. Och / eller 4) återstående vävnad filtrerades inte från tumören och placerades i nålen. När tumörcellsuspensionen strömmar ut ur ventrikeln efter injektion beror det troligen på: 1) placeringen av nålen mot ventrikelns golv; 2) ett högt injektionstryck och tid; Och / eller 3) en nålborrstorlek som är för stor. Låg överlevnad av transplanterade embryon kan orsakas av: 1) bedövning av embryon under en längre tid; 2) lämnar embryon på injektionsplattan för att torka; 3) injektion av luftbubblor in i ventrikeln; Och / eller 4) piercing vitala organ, som hjärnan ochHjärta, eftersom nålen gick genom ventrikeln.
Tidigare metoder för tumörtransplantation hos den vuxna eller embryonala zebrafiskhjärnan är beroende av immunosuppression hos vuxna (genetiskt, farmakologiskt eller via strålning) eller är begränsade till kortvariga studier av humana eller musceller i embryon 38 , 43 , 52 , 53 , 54 . Till exempel kan hjärntumörer i mus injiceras intranasalt i dexametason-immunsupprimerad 30-dpf juvenil zebrafisk för användning vid kortvariga (~ 2 dagar) prekliniska läkemedelsanalyser 54 . Injektionsstället i dessa experiment döljs emellertid av skallen och hjärnvävnaden och leder sannolikt till skador på normal hjärnvävnad vilket minskar värdens livskraft och engraftmenteffektivitet. En annan nyligen beskriven metod innefattar injektion av humant gliobLastoma celllinjer i midbrainområdet av zebrafiskembryon, vilket möjliggjorde den kortsiktiga analysen av tillväxt, invasion och läkemedelssvar 43 . Återigen är den exakta placeringen av injektionsstället variabel och skadar sannolikt normal vävnad. Således äventyrar tidigare metoder för embryonala hjärntransplantationer ofta värden hos värdarna, vilket begränsar dessa studier till kortsiktig analys ( dvs. 2 till 14 dagar), vilket medför ökad variation mellan individuella injektioner på grund av förmörkade injektionsställen och förhindrande av långvarig Termisk analys av cellbeteenden och läkemedelssvar eller omtransplantation över flera generationer.
Metoden som beskrivs här behandlar nuvarande begränsningar i embryonala och immunkompromitterade transplantationstekniker genom att tillåta forskare att: 1) reproducerbart injicera på samma plats med minimal skada på omgivande vävnad; 2) visualisera direkt injektionsstället för att maximeraEngraftment effektivitet; 3) transplantera hundratals embryon per dag; 4) tillåta tumörer att växa i immunkompetenta djur 5) möjliggöra övervakning av tumörcellsbeteende och hållbara läkemedelsreaktioner över zebrafiskens liv; Och 6) tillåter re-transplantation av tumörer över många generationer för potentiella studier på tumörutveckling eller läkemedelsreaktionsmekanismer. Dessutom möjliggör detta protokoll forskare att använda någon zebrafiskgenotyp för bedömning av värdrespons, inklusive olika immunpopulationer. Dessa attribut gör denna metod lätt anpassningsbar av alla laboratorier som redan utför standardmikroinjektioner i zebrafisk. Slutligen, medan denna metod är idealisk för ortopotopinjektioner av zebrafisk hjärntumörer, kan transplantationen av andra tumortyper, såsom lever eller bukspottskörtel, vara viktigare än immunkompetens ( t.ex. om en forskare studerar effekterna av stromal Mikromiljö på tumörtillväxt). I det här scenariotNyutvecklade, immundefektera zebrafiskmodeller kan vara mer lämpliga för utförande av ortotopiska tumortransplantationer 11 .
Detta protokoll har använts för att utföra tumörcellstävlingstest och att injicera dubbelmärkta tumörer. En potentiell behandlingsstrategi för bedömningen av effektiviteten hos kemiska föreningar på tumörgenesen, som innefattar behandlingen av embryon efter transplantationen via tillsatsen av läkemedlet till vatten, diskuterades också. Ett förfarande för behandling ex vivo av tumörceller före transplantation rapporterades också tidigare 17 . Dessutom har transplanterade tumörer sammanslagits för flera omgångar av re-transplantation, vilket kommer att vara fördelaktigt för studier av tumörutveckling och kemoresistans 17 . För närvarande är prekliniska studier beroende av mus xenotransplantat för att bedöma effekten av potentiella föreningar. Men dessa studier är tidskrävandeOch dyrt. Med tanke på den höga bevarandet av onkogena signalvägar mellan zebrafisk och människor 28 , kan det förväntas att denna metod kommer att komplementera konventionella mus- och humana cellstudier för att möjliggöra en snabbare identifiering av effektiva föreningar som går in i prekliniska och kliniska prövningar. I slutändan kan denna metod visa sig vara användbar för snabb kemisk screening av primära patienttumörer, vilket ytterligare kan driva initiativet för personlig medicin. Dock måste villkor för den långsiktiga tillväxten av humana celler i zebrafisk (vuxen eller embryo) fortfarande identifieras.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar de två granskarna för utmärkta förslag och förbättringar av manuskriptet. Vi tackar också Huntsman Cancer Institute / University of Utah för djurhållning och underhåll. Detta arbete finansierades av American Cancer Society (# 124250-RSG-13-025-01-CSM), ett NIH-bidrag (P30 CA042014 CRR-programmet), University of Utah Seed Grant och Huntsman Cancer Foundation.
Egg water | in house | maintaining embryos, making injection plate | |
Methylene Blue | Sigma-Aldrich | M9140 | add to egg water to prevent fungal growth |
Petri dish | Thermo Fisher | FB0875711Z | housing embryos, making injection plate |
50 ml beaker (2 inch diameter) | Any commercial brand | making injection plate | |
Agarose | Denville | CA3510-8 | making injection plate |
Glass Container | Any commercial brand | making injection plate | |
Tweezers | Fine Science Tools | 11295-10 | tumor dissection |
Razor Blade | Thermo Fisher | 12640 | needle preparation, tumor dissection |
Glass slide wrapped in parafilm | Any commercial brand | needle preparation | |
Phosphate Buffered Saline 1x, pH 7.4 | Life Technologies | 10010023 | tumor resuspension |
Cell strainer, 40 µm | Corning Falcon | 352340 | tumor resuspension |
1000 µl filter tips | any commercial brand | tumor resuspension | |
100 µl filter tips | any commercial brand | tumor resuspension | |
50 ml conical tubes | Genesee Scientific | 21-108 | tumor resuspension |
15 ml conical tubes | Genesee Scientific | 21-103 | tumor resuspension |
1.7 ml microtubes | Genesee Scientific | 24-281 | tumor resuspension |
Micropipettes | Any commercial brand | tumor resuspension and transplantation | |
Glass capillary (no filament) | World Precision Instruments | TW120-4 | tumor transplantation |
Needle puller | Sutter Instruments | P-97 | tumor transplantation |
Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | tumor transplantation |
Microinjector | Harvard Apparatus | PLI-90 | tumor transplantation |
Tricaine-S (MS-222) | Western Chemical | TRS1 | tumor transplantation, anesthetic |
Angled Probe | Fine Science Tools | 10140-02 | embryo manipulation |
Transfer Pipette | Any commercial brand | embryo manipulation | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | required during tumor resuspension |
Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | required during tumor resuspension |
Stereomicroscope | Olympus | SZ61 | tumor transplantation |
Fluorescent Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | imaging tumor transplants |
Microscope Camera | Olympus | DP-72 | imaging tumor transplants |
Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M7140 | imaging tumor transplants |
Incubator | Any commercial brand | maintaining embryos, warming up injection plate | |
Microwave | Any commercial brand | making injection plate | |
Scale | Any commercial brand | making injection plate | |
Gloves | Any commercial brand | all aspects of the protocol | |
Low Melt Agarose | Any commercial brand | confocal imaging of embryos | |
Glass Bottom Dish | Mattek Corporation | P35G-1.0-20-C | confocal imaging of embryos |
Laser-scanning confocal microscope | Olympus | FLUOVIEW FV1200 | confocal imaging of embryos |
Pronase | Roche Diagnostics | 11459643001 | dechorionate embryos |
PBS | Any commercial brand | resuspend tumor/tumor cells | |
12-well plate | Any commercial brand | drug treatment of embryos | |
Thin-bore transfer pipette | Any commercial brand | drug treatment of embryos | |
Hemocytometer | Any commericial brand | For counting tumor cells in suspension | |
N2 | Any commericial brand | For microinjector set up |