Summary
친 유성 1,1'-Dioctadecy-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) 염색 기술을 사용하여 Ambystoma mexicanum 은 혈관 관류를 쉽게 시각화 할 수 있도록 혈관 재관류를받을 수 있습니다.
Abstract
관류 기술은 조직 순환을 시각화하기 위해 수세기 동안 사용되어 왔습니다. Axolotl (Ambystoma mexicanum)은 재생 연구에 필수적인 모델로 부상 한 도롱뇽 종입니다. 이러한 동물에서 재생의 맥락에서 혈관 재개 골이 어떻게 발생하는지에 대해서는 거의 알려지지 않았다. 여기에 우리는 1,1'-Dioctadecy-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI)의 관류를 통한 axolotl에서 vasculature의 시각화를위한 간단한 방법을보고합니다. DiI는 내피 세포의 원형질막에 순간적으로 삽입되는 친 유성 카보시 아닌 염료이다. 관류는 DiI가 대동맥을 통해 혈액 순환을 시작하도록 연동 펌프를 사용하여 이루어집니다. 관류 중에 염료는 axolotl의 혈관을 통해 흐르고 접촉시 혈관 내피 세포의 지질 이중층으로 통합됩니다. 관류 절차는 8 인치 axolotl에 대해 약 1 시간이 걸립니다. 관류 직후Axiotl은 공 촛점 형광 현미경으로 시각화 할 수 있습니다. DiI는 녹색 형광 필터로 여기 될 때 적색 주황색 범위에서 빛을 방출합니다. 이 DiI 관류 절차는 axolotls의 혈관 구조를 시각화하거나 재생 조직에서 revascularization의 패턴을 보여주는 데 사용할 수 있습니다.
Introduction
vasculature의 시각화는 많은 종의 생물체의 구조와 기능을 이해하는 데 중요한 역할을합니다. 레오나르도 다빈치 (Leonardo da Vinci)와 함께 16 세기를 시작으로 순환의 모델과 그래픽 표현이 연구되었습니다 1 . 왁스와 고무 몰드를 사용하여 조직을 관류하여 혈관 구조의 3 차원 모델을 만들어 기관 발생과 병인에 대한 연구를 허용했다. 수지 및 왁스는 인도 잉크 또는 카민 레드와 같은 염료로 착색되어 쉽게 시각화 할 수있었습니다 1 , 2 . 그러나,이 기술은 높은 점도가 관심있는 조직의 완전한 재관류를 방해했기 때문에 많은 문제를 야기했습니다. 분야가 더욱 정교 해짐에 따라 공 초점 및 전자 현미경을 사용하여 관류 기술을 이동 시켰습니다 주형에서 떨어져서 혈관계의 액체 관류로 이동하며, 그 중 일부는 초기 조직을 파괴하지 않고 혈관의 관류 및 영상화를 허용한다. 형광 색소 인 DiI는 혈관 조직에 손상을주지 않고 동물의 재관류를 허용하는 얼룩 중 하나입니다.
Carbocyanine 염료는 접촉시 세포막에 통합되는 친 유성 염료입니다. 이 염료는 혈관 내피 세포를 쉽고 즉각적으로 염색 할 수있게하여 형광 공 촛점 현미경으로 관찰 할 수 있습니다. DiI는 세포의 지질막에서 측면 확산을 통해 이동하며, 뉴런의 표지 및 추적에 나와 있습니다 4 . 화학적으로 DiI의 두 알킬 사슬은 염료에 세포막에 대한 높은 친 화성을 부여하는 반면 녹색 형광등 필터로 여기 될 때 적색 파장을 방출하는 형광 염료의 두 개의 공액 고리> 4. DiI는 뉴런 5 , 6 에서 원형질막의 성공적인 표지 및 전장 및 역행 라벨링을 포함한 많은 역량에 활용되어 왔습니다. DiI는 이전에 관류 프로토콜에서 마우스 7 의 혈관을 시각화하는 동안 사용되었습니다.
Axolotls ( Ambystoma mexicanum )는 멕시코 시티 인근의 소금기가 많은 호수에서 독점적으로 사는 도롱뇽입니다. 이 동물들은 전체 사지, 꼬리 (신경 코드 포함), 심장 및 기타 내장 기관의 일부 및 성인의 눈 부분을 재생할 수 있으므로 재생 과정을 이해하는 데 중요한 모델이되었습니다. 또한 Axolotls에 유전 도구를 최근에 적용함으로써 분자와 세포에 대한 전례없는 통찰력이 이제 가능 해졌다. 성공적인 재생산전체 사지 배합에는 광범위한 혈관 재개 화 과정이 필요하며 이는 단순히 산소와 영양소를 제공하는 혈관의 전통적인 기능 이상으로 중생에 중요한 역할을 할 수 있습니다. 조직 재생의 맥락에서 재 시술을 이해하는 것이 필수적입니다. Axolotl 혈관은 이전에 India Ink를 사용하여 시각화되었으며 그 결과가 흥미 롭지 만이 과정은 이후 10 년 동안 재검토되지 않았습니다. 우리는 axolotl vasculature 7 의 완벽한 재관류 및 시각화를 허용하기 위해 포유류에서 사용하기 위해 개발 된 DiI 관류 프로토콜을 채택하려고했습니다. 이 프로토콜은 DiI 얼룩 기법으로 axolotl 순환을 성공적으로 관류하고 시각화하는 단계를 설명합니다. 이 절차는 조직을 재생하는 것뿐만 아니라 항상성 조직에서 특허 혈관을 정확하게 시각화 할 수있게하며, 시각화를위한 새로운 방법을 제공합니다n 및 axolotl에서 revascularization 과정의 분석.
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Protocol
모든 axolotl 실험은 Brigham and Women 's Hospital (BWH) 기관 동물 관리 및 사용위원회에 따라 수행되었습니다.
1. 관류 실험 설정
- 0.1 % 트리 카인 용액 (MS222)으로 채워진 플라스틱 용기에 성인 axolotl을 15-20 분 동안 또는 완전히 마취 될 때까지 놓습니다. axolotl이 완전히 잠기도록 용기에 충분한 트리 카인 용액이 채워 졌는지 확인하십시오.
주 : 모든 절차는 기관 동물 관리 지침에 따라 수행되어야합니다. BWH에서 axolotl은 foot-pinch test에 실패 할 때 완전히 마비 된 것으로 간주됩니다. 즉, 발이 부드럽게 눌려 질 때 반사 운동이 없음을 의미합니다.
주의 : 트리 세인은 수생 생물에 특별히 사용되는 마취제이지만 트리 카인 용액과 직접 피부 접촉을 피하십시오. - axolotl 관류 스테이션을 설정하십시오.
- 장소흡수성 패드를 평평하고 평평한 표면에 놓고 흡수성면을 위로 향하게합니다.
- anesthetized axolotl가 앙와위 위치에 누워 적절한 크기와 모양입니다 폴리스티렌 폼 프레임에 구멍을 자르십시오. 프레임을 흡수 패드 위에 놓습니다.
참고 : 여분의 종이 타월은 흡수력을 높이기 위해 프레임 바로 아래에 배치 할 수 있습니다. - 연동 튜브에 연동 펌프를로드하십시오. 펌프를 0.7 ml / min의 유속으로 설정하고 시계 방향으로 흐르게하십시오.
- 1 : 4 혼합물로 0.7x PBS와 5 % 포도당으로 희석액을 만듭니다.
- 희석액 10 mL와 DiI 원액 200 μL를 50 mL 원뿔 튜브에 섞는다. 모자를 씌우고 뒤집습니다. 이 튜브를 알루미늄 호일로 덮어 작업 용액이 빛에 노출되지 않도록하십시오.
참고 : 볼륨은 axolotl의 크기에 비례하여 변경해야합니다. 이 값은 약 15cm axolotl (주둥이 - 꼬리 길이)에 대한 것입니다. 에이이 크기의 nalals는 완전한 성적인 성숙에 도달하지 않았을 수 있으므로 동물성은 현재 결정되지 않을 수 있습니다. - 0.7x PBS와 50 ML 원뿔 튜브를 채 웁니다.
참고 : PBS는 루프 및 axolotl exsanguination을 준비하는 데 사용됩니다. - 27 게이지 버터 플라이 바늘을 관류 튜빙의 출구 끝 부분에 부착하십시오. 나비 날개를 서로 접어 클램프 스탠드에 놓습니다.
- 전체 튜빙이 솔루션으로 가득 때까지 0.7x PBS로 채워진 50 ML 원뿔 튜브에 재관류 튜빙의 자유 엔드를 배치하고 재관류 펌프를 실행합니다. 전체 튜빙이 PBS로 채워지면 펌프를 멈추십시오.
참고 : 튜빙에 항상 공기 방울이 없어야합니다. 튜브가 공기 방울이 없으므로 축삭 안에 공기 색전이 생기고 완전 관류가되지 않게됩니다. - 폴리스티렌 폼 프레임의 axolotl 모양 금형에 종이 타월을 둡니다. 전송 피펫을 사용하여 수건에 트리 세인 용액을 담급니다.
참고 : 종이 묶음의 중간에 작은 사각형을 자릅니다.el을 사용하여 재관류 과정 중에 유체의 배액을 허용합니다. - 마취 된 axolotl을 폴리스티렌 폼 프레임 안의 종이 타월에 올려 놓습니다.
2. Axolotl 가슴 열기
- 외과 용 집게를 사용하여 어깨 라인 바로 아래 axolotl 가슴의 중심 축을 따라 피부를 집어 넣습니다. 당겨.
- 메스를 사용하여 피부를 뽑은 작은 절개를하십시오.
- 두 개의 연골 판을 드러내려면 가슴 위에 피부의 정사각형 패치를 제거하십시오.
- 심장을 명확하게 볼 수있을만큼 충분히 큰 흉강과 심장에서 약 5 mm 떨어진 대동맥을 덮는 창을 열려면 피부를 제거하십시오.
- 주요 혈관을 자르지 않으려면 포셉 또는 닫힌 가위를 사용하여 조심스럽게 결합 조직을 찢습니다.
- 겸자를 사용하여 각 연골 플레이트를 개별적으로 들어 올리고수술 용 가위.
- 조심스럽게 포 셉으로 심낭을 집어 올려서 위로 들어 올려 외과 용 가위로 구멍을 뚫습니다. 이 절개는 매우 얇은 심낭을 뚫기에 충분할 정도로 깊어 야하고 심낭을 제거 할만큼 충분히 커야합니다. 심장을 자르지 않도록주의하십시오.
- 심장과 대동맥을 노출시키기 위해 섬세하게 심낭을 제거하십시오.
참고 : 전송 피펫을 사용하여 주기적으로 흉강과 아가미를 트리 카인 용액으로 세척하여 영역을 깨끗하게 유지하고 axolotl을 마취 상태로 유지하십시오.
3. Axolotl의 관류
- 클램프의 팔이 axolotl 대동맥에 바늘을 삽입하기 위해 쉽게 조작 할 수 있도록로드 된 나비 바늘과 폴리스티렌 폼 프레임 옆에 클램프 스탠드를 놓습니다. 삽입하는 동안 동물의 주동기 측면을 향해 바늘의 끝 부분을 가리키고 대동맥과 평행을 유지하여 수술을 통해 구멍을 뚫지 않도록하십시오긍정적 측면.
- 연동 펌프를 켭니다. 0.7x PBS는 튜브를 통해 계속 흐릅니다.
- 대동맥에 바늘을 삽입합니다.
- 대동맥 아치 아래에 집게를 슬라이드하고 쉽게 접근 할 수 있도록 약간 당겨.
- 바늘이 대동맥의 길이를 따라 움직 이도록 머리를 향해 위로 향하게하는 바늘 조이기 조합을 조종하십시오. 대동맥 뒤에 지원을위한 포 셉를 사용하는 동안 바늘을 삽입합니다.
참고 : 바늘은 관류 중에 미끄러지지 않도록 충분히 깊게 대동맥에 삽입해야합니다. 이것은 15cm axolotl에 대해 약 5mm 일 수 있습니다. 혈관의 완전한 천공을 피하기 위해 바늘이 대동맥과 완벽하게 일치하는지 확인하십시오. through-and-through 구멍은 거대한 출혈을 일으키고 관류 성공률을 감소시킬 수 있습니다. 성공적인 삽입은 심장의 심방이 눈에 띄게 확대되어 확인할 수 있습니다.
- sci로 하나의 아트리움을 빠르게 찢어 내십시오.혈액을 배출하도록 허용합니다.
- 흉강 내 혈액 축적 및 응고 형성을 방지하기 위해 트리 세인 용액으로 세척하십시오.
- 약 20-30 ML PBS로 axolotl을 Perfuse. 동물은 성공적인 재관류에서 밝은 핑크색에서 흰색으로 바뀌어야합니다.
- 연동 펌프를 멈추고 튜브의 자유 단을 DiI 용액 15 mL 튜브에 넣으십시오. 펌프를 다시 시작하고 튜빙에 공기 방울이 생기지 않도록주의하십시오.
- DiI의 전체 작업 재고로 axolotl을 퍼 퓨즈하십시오.
참고 : 성공적으로 재관류, Diol의 밝은 분홍색으로 변경 색상 axolotl. 이것은 아가미에서 가장 두드러 질 것입니다. - DiI로 관류 한 후 펌프를 멈추고 튜브의 자유 단을 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 용액에 넣고 조직을 고정시킵니다. 펌프를 다시 시작하고 PFA 10 mL 이상을 관류하십시오.
주의 : PFA는 독성 물질이므로 취급 및 폐기해야합니다.적절하게 sed. 장갑과 보안경을 착용하고 용액을 흄 후드 안에서 만들어야합니다. 조직을 고정시키기 위해 PFA로 axolotl을 관류 시키면 동물이 사망하게됩니다.
4. 관류 및 시각화 준비 종료
- 연동 펌프를 멈추고 axolotl 대동맥에서 바늘을 제거하십시오.
- 플라스틱 접시에 axolotl을 놓으십시오.
참고 : 대형 페트리 접시의 절반을 사용하면 잘 작동하고 피부를 젖게하고 시각화 품질을 향상시키기 위해 axricotl에 소량의 Tricaine 또는 PBS를 부어 넣을 수 있습니다. - 사용 된 모든 재료는 적절한 쓰레기통에 버리십시오. 수술 도구를 70 % 에탄올로 청소하고, 동물 사이에 유리 비드 멸균기를 사용하여 소독하고, 절차에 따라 고압 증기 멸균으로 멸균하십시오. PBS 용액으로 튜브를 세척 한 다음 배액하고 완전히 말린 다음 나중에 사용할 수 있도록 보관하십시오.
5. Perfused Axolotl의 시각화
참고 : 고화질 이미지를 얻으려면 1.1 초 노출, 1 배 게인, 1.0 채도, 2 배 배율의 매개 변수를 사용할 수 있습니다.
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Representative Results
DiI 염색으로 Axolotl의 혈관계를 쉽게 시각화 할 수 있습니다. 친 유성 염료로 관류 된 동물의 혈관은 형광 공 촛점 현미경으로 즉시 볼 수 있습니다. 그림 1 .1-1.5 는 재관류 프로토콜의 개략도입니다. 밝은 핑크색 염료로 관류 한 후, 성공적으로 관류 된 축색 돌기가 분홍색으로 보일 것입니다. 공 촛점 현미경에 녹색 형광 필터를 사용하면 혈관 네트워크의 빨간색 방출이 나타납니다. DiI 염색은 꼬리, 사지, 아가미 및 눈 ( 그림 2A , 그림 2B , 그림 2C , 그림 2D , 각각)을 포함하여 관류가 성공적 일 때 모든 신체 조직에서 발생합니다. 실패한 관류는 적색으로 염색 된 vasculature가 부족하거나 혈관이 뭉툭하게 얼룩지게합니다.
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그림 1 : 관류 프로토콜의 도식. 친 지질 염료 DiI로 성공적으로 관류 한 Axolotls는 영상화시 혈관 구조의 완전한 염색을 보여줍니다. 1 : 관류 실험 전 완전 앙굴라 axolotl. 2 : axolotl의 가슴을 열어. 2 : 개방 된 가슴 구멍이있는 Axolotl. 3 : 27 G 나비 바늘 axolotl의 대동맥에 삽입. 4 : 배관은 먼저 0.7x PBS, DiI 작업 용액 및 마지막으로 4 % PFA를 포함해야합니다. 5 : 완전히 관류 된 축삭이 분홍색으로 나타난다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 완전히 관통 된 Axolo의 이미지tl. Axlotl vasculature의 이미지는 DiI 얼룩을 성공적으로 관류 한 후 형광 공 촛점 현미경을 사용하여 촬영했습니다. 2A : 꼬리. 2B : 발. 2C : 아가미. 2D : 눈. 이미징은 녹색 형광 필터 큐브가있는 공 촛점 현미경을 사용하여 수행됩니다. 이미지 A, B, C 및 D의 배율은 각각 1.74X, 2.16X, 1.18X 및 5.69X입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
axolotl의 vasculature의 시각화는 lipophilic 카보시 아닌 염료, DiI와 재관류를 통해 성공적으로 수행 할 수 있습니다. 이 연구에서는 연축 펌프를 사용하여 DiI로 axolotl을 재관류하기위한 새로운 프로토콜을 설명합니다. 우리는 또한 형광 공 촛점 현미경을 사용 axolotl vasculature의 후속 시각화를 보여줍니다. 이 프로토콜은 Li et al. 에서 볼 수있는 설치류 DiI 재관류 프로토콜의 적응 이다. 7 , 그러나 설치류와 axolotl 사이의 주요 차이점은 axolotl 모델에 맞게 프로토콜의 개정이 필요했습니다.
이 연구는 혈관 구조를 성공적으로 시각화하기 위해 axolotl의 DiI 재관류 방법을 논의합니다. 도롱뇽과 설치류 사이의 해부학 및 생리학의 차이는 바늘 삽입 위치, 재관류 방법 및 사용 된 시약을 포함하여 관류의 주요 측면에서 변경을 요구합니다. ach에성공적인 관류를 제외하고, 우리는 Axolotl의 혈관계에 가한 손상을 제한했습니다. 흉강을 여는 동안 주요 혈관에 손상이나 열상을 피하면서 심장과 대동맥을 완전히 노출 시키도록주의를 기울였습니다. 외과 용 가위의 사용을 제한하면 주요 혈관의 우발적 인 클리핑을 방지하고 작은 절개는 심장 및 대동맥의 노출을 제어했습니다. DiI 바늘이 심장의 실에 직접적으로 삽입되는 것이 아니라 대동맥을 통해 삽입 될 때도 재관류 성공률이 증가했습니다. axolotl은 마우스와 달리 3 개의 심장을 가지고 있는데, 마우스보다 훨씬 적은 근육을 가진 하나의 심실만을 포함합니다. 이러한 차이 때문에 바늘 삽입 위치가 안정 대동맥으로 이동되어야했습니다. 대동맥은 27G 주사 바늘로 구멍을 뚫기에 충분하고 움직임이 제한되어 있기 때문에 관류 바늘을 삽입하기위한 최적의 위치로 결정되었습니다. 운동은 최소였다.관류 바늘의 우발적 인 제거 또는 미끄러짐 또는 대동맥의 관통 및 관통을 피하기 위해. 심실을 삽입 지점으로 사용하는 심장 관류는 대동맥 삽입 지점을 가진 환자보다 훨씬 낮은 성공률을 보였다. 혈관계의 잘못된 천공은 종종 혈관 형성을 초래하거나 관류를 방지하여 혈관 라벨링 성공률이 매우 낮습니다. 재관류 중 나비 바늘을 고정하기 위해 클램프 받침대를 사용함으로써 우리는 운동을 감소시켜 성공적인 관류의 속도를 증가시킵니다. 또한 axolotl 조직의 섬세함으로 인해 이전에 사용 된 수동 관류와는 달리 마우스에 비해 연동 관류 펌프가 필요했습니다. 이 펌프의 사용은 얇은 조직의 실수로 인한 펑크를 최소화하기 위해 axolotl 재관류에 핸즈프리 접근법을 허용했습니다. 관류는 관절 통증을 포함한 많은 추가적인 이유로 실패했다.ure, 응고 및 색전증. 바늘이 대동맥에 삽입되고 두 번째 구멍이 후벽을 통해 생성 된 경우, DiI 용액은 전신 순환을 통과하지 않고 흉강으로 직접 흐르게됩니다. 또한, 일단 혈액이 혈관을 빠져 나가면 재빨리 혈병이 형성되어 재관류를 방해 할 수 있습니다. 응고와 기포가 또한 혈관계에서 형성되어 성공적인 관류를 막는 색전을 일으킬 수 있습니다. 마지막으로,이 프로토콜은 axolotl osmolality에 맞게 조정 된 시약을 포유류의 것과 크게 다릅니다. 이 프로토콜의 적응과 axolotl 모델에 맞게 만든 중요한 변화는 재생 중 조직의 revascularization의 과정을 이해하는 데 도움이됩니다.
색상이 분홍색 인 DiI는 동물을 관류하고 밝은 분홍색 색조를줍니다. 성공적으로 관류 한 axolotls는 육안으로 밝은 핑크색으로 매우 높게 나타났다.혈관 형성 부위가 더욱 강하게 얼룩지게된다. 녹색 필터를 사용하여 형광 공 촛점 현미경으로 보는 관류 동물을 적색 주황색 방출 스펙트럼으로 시각화 할 수 있습니다. Vasculature는 비 혈관 조직의 우발적 인 DiI 염색을 최소화하는 더 얇은 조직에서 가장 잘 시각화되었습니다. DiI 관류 직후 4 % Paraformaldehyde (PFA)로 조직을 관류하여 조직을 고정해야합니다.
DiI perfusions은 axolotl에 대한 엔드 포인트 실험입니다. 이 과정에서 동물의 모든 혈액이 효과적으로 배수되고 0.7x PBS로 교체되고 곧바로 DiI 용액이 나오고 마침내 4 % PFA가됩니다. 이것은 가스 교환의 중요한 행동에 관여하는 axolotl의 기능을 방해하고 신체 조직에 산소를 공급하는 능력을 상실합니다. 이 끝점 특성으로 인해 각 관류는 혈관 성장의 단일 시점만을 포착하고 동물은 나중에 더 관류 할 수 없습니다. 이 시간 제한 때문에혈관 발달의 시간 경과를 설명하기 위해서는 여러 동물을 사용해야합니다.
이 DiI 프로토콜과이를 개선하기 위해 적용된 수정을 사용하여 axolotl의 혈관 구조를 성공적으로 라벨링하고 시각화 할 수 있습니다. Axolotl은 재생 연구를위한 필수적인 모델 유기체이기 때문에, 성공적인 관류는 재생 중 혈관 신생 과정을 조사 할 수있는 기회를 열어줍니다. axolotl은 neotenous 동물이기 때문에 regeneration의 연구를위한 모델 유기체이므로, 성인기까지 재생할 수있는 뛰어난 능력을 보유하고 있습니다. 그러나 재생 조직의 재관류 과정은 잘 알려져 있지 않으므로 DiI 관류를 axolotl 시스템에 적용하면 포유류 모델에서 사용할 수 없었던 재생을 이해할 수있는 기회가 주어집니다. DiI를 사용하는 axolotl의 재관류는 revas의 연구를위한 새로운 기술입니다따라서이 동물 모델에서 조직을 재생하는 과정의 불규칙 화 (cularization)는 질병의 발달과 혈관 신생 과정에서의 기관 발생 과정을 이해하고 재생 연구에서 중요한 도구로 활용 될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 Brigham & Women 's Hospital과 March of Dimes에서 지원되었습니다. 저자는 Whited Lab의 모든 구성원의 지원과 조언에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Peristaltic Pump | Marshall Scientific | RD-RP1 | |
| Perfusion tubing | Excelon Lab & Vacuum Tubing | 436901705 | size S1A |
| 27g butterfly needle | EXELint Medical Products | 26709 | |
| NaCl | AmericanBio | 7647-14-5 | |
| KCl | AmericanBio | 7747-40-7 | |
| Na2HPO4 | AmericanBio | 7558-79-4 | |
| NaH2PO4 | AmericanBio | 10049-21-5 | |
| Distilled water | |||
| HCl | AmericanBio | 7647-01-0 | |
| Glucose | ThermoFischer | A2494001 | |
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Sigma Aldrich | 468495 | |
| Ethanol (100% vol/vol) | Sigma Aldrich | 64-17-5 | |
| Surgical foreceps | Medline | MDG0748741 | |
| Polystyrene foam frame | any polystyrene foam square with an axolotl-shaped cut out | ||
| Surgical scissors | Medline | DYND04025 | |
| Scalpel | Medline | MDS15210 | |
| Absorbent underpad | Avacare Medical | PKUFSx | |
| Paper towels | |||
| Standard disposable transfer pipette | Fisherbrand | 50216954 | |
| Clamp stand | Adafruit | 291 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma Aldrich | E10521 | Tricaine powder |
| Adult axolotl | |||
| MgSO4 | AmericanBio | 10034-99-8 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016-100G | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761-500G | |
| Plastic tanks | Varying size appropriate for the axolotl | ||
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 30525-89-4 | |
| Axolotl | |||
| Leica Microscope | Leica | M165 FC | |
| ET-CY3 Fluorescent Filter | Leica | M205FA/M165FC | |
| MS-222 |
References
- Giuvarasteanu, I. Scanning electron microscopy of vascular corrosion casts - standard method for studying microvessels. Rom J Morphol Embryo. 48 (3), 257-261 (2007).
- Hasan, M. R., Herz, J., Hermann, D. M., Doeppner, T. R. Intravascular perfusion of carbon black ink allows reliable visualization of cerebral vessels. J Vis Exp. (71), e4374 (2013).
- Minnich, B., Lametschwandtner, A. Scanning electron microscopy and vascular corrosion casting for the characterization of microvascular networks in human and animal tissues. Microscopy: Science, Technology, Applications, and Education. 1, 29-39 (2010).
- Honig, M., Hume, R. I. DiI and DiO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends Neurosci. 13, 333-335 (1989).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Fluorescent carbocyanine dyes allow living neurons of identified origin to be studied in long-term cultures. J Cell Biol. 103 (1), 171-187 (1986).
- Schwartz, M., Agranoff, B. W. Outgrowth and maintenance of neurites from cultured goldfish retinal ganglion cells. Brain Res. 206 (2), 331-343 (1981).
- Li, Y., Song, Y., Zhao, L., Gaidosh, G., Laties, A. M., Wen, R. Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI. Nat Protoc. 3 (11), 1703-1708 (2008).
- Kuo, T. H., Kowalko, J. E., DiTommaso, T., Nyambi, M., Montoro, D. T., Essner, J. J., Whited, J. L. Evidence of TALEN-mediated gene editing of an endogenous locus in axolotl. Regeneration. 2 (1), 37-43 (2015).
- Brockes, J. P., Kumar, A. Appendage Regeneration in Adult Vertebrates and Implications for Regenerative Medicine. Science. 310 (5756), 1919-1923 (2005).
- Smith, A. R., Wolpert, L. Nerves and angiogenesis in amphibian limb regeneration. Nature. 257 (5523), 224-225 (1975).
