Summary
लाइपोफिलिक 1,1'-डायोक्टाडेसी -3,3,3 ', 3'-टेट्रामैथिलैन्डोकार्बॉकाइनिन प्रक्लोरेट (डीआई) स्टेनिंग तकनीक का प्रयोग करना, अम्बुस्टोमा मैनेट्यूम vasculature के आसान दृश्य के लिए अनुमति देने के लिए संवहनी छिड़काव से गुजर सकता है।
Abstract
छिड़काव तकनीकों का उपयोग सदियों से किया गया है ताकि ऊतकों के संचलन की कल्पना की जा सके। एक्सोलोटल (एम्बैस्टोमा मैनेट्यूम) सैलामिंडर की एक प्रजाति है जो उत्थान के अध्ययन के लिए एक आवश्यक मॉडल के रूप में उभरा है। इन जानवरों के पुनर्जन्म के संदर्भ में, रेग्युलायराइजेशन के बारे में बहुत कुछ पता नहीं है। यहां हम 1,1'-डायोक्टाडेसी -3,3,3 ', 3'-टेट्रामिथिलंडोकार्बोकायनिन प्रक्लेलोरेनेट (डीआईआई) के छिड़काव के माध्यम से एक्सोलॉटल में vasculature के विज़ुअलाइज़ेशन के लिए एक सरल विधि की रिपोर्ट करते हैं। डीआईआई एक लाइपोफिलिक कार्बोकाइनाइन डाई है जो अंतःस्थल कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली में तत्काल सम्मिलित होती है। इरिस्टाइटी पंप का उपयोग करके छिड़काव किया जाता है ताकि डीआईआई महाधमनी के माध्यम से संचरण में प्रवेश कर सके। छिड़काव के दौरान, ऐंजोलॉटल के रक्त वाहिकाओं के माध्यम से डाई प्रवाह होता है और संपर्क पर संवहनी एंडोथिलियल कोशिकाओं के लिपिड बिलेयर में शामिल होता है। छिड़काव की प्रक्रिया में आठ इंच के अक्षोटोलल के लिए लगभग एक घंटे लगते हैं। छिड़काव वाई के तुरंत बादवें डीआई, एक्सोलोटल को एक कन्फोकल फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के साथ देखा जा सकता है। डीआईआई लाल-नारंगी रेंज में प्रकाश का उत्सर्जन करता है जब हरा फ्लोरोसेंट फिल्टर के साथ उत्साहित होता है। इस DiI छिड़काव प्रक्रिया का उपयोग एक्सोलोटल्स के संवहनी संरचना को देखने के लिए या फिर ऊतकों को पुनर्जन्मित करने में पुनरुत्पादन के पैटर्न को प्रदर्शित करने के लिए किया जा सकता है।
Introduction
कई प्रजातियों में जीवों के संरचना और कार्य को समझने में vasculature का विज़ुअलाइज़ेशन महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। 16 वीं शताब्दी में लियोनार्डो दा विंसी के साथ, मॉडलों और परिसंचरण के ग्राफिक प्रतिनिधित्व 1 का अध्ययन किया गया है। मोक्स और रबर के ढालना का उपयोग करना, ऊतकों को vasculature के तीन आयामी मॉडल बनाने के लिए लगाया गया था, जो जीवसंचार और रोगजनन 1 , 2 के अध्ययन के लिए अनुमति देता है। रेजिन और मोक्स रंगों के साथ रंगे थे जैसे कि भारत इंक या कारमिन लाल, जो उनके आसान दृश्य 1 , 2 के लिए अनुमति देते हैं। हालांकि, इन तकनीकों के कारण कई मुद्दों के कारण उनकी ऊंची चिपचिपाहट ब्याज 1 के ऊतक के पूर्ण छिड़काव को रोका गया। जैसा कि क्षेत्र अधिक परिष्कृत हो गया, confocal और इलेक्ट्रॉन सूक्ष्मदर्शी का उपयोग खेलने में आया, छिड़काव techniq चलती प्रारंभिक ऊतक 3 को नष्ट किए बिना डाली-मोल्ड और वास्क्यूलेक्चर के तरल रूप से दूर जाने से, जिनमें से कुछ रक्त वाहिकाओं के छिड़काव और इमेजिंग के लिए अनुमति देते हैं। डीआईआई, एक फ्लोरोसेंट कार्बोकाइनाइन डाई, एक ऐसे दाग है जो संवहनी ऊतक को नुकसान न किए जाने वाले जानवरों के छिड़काव की अनुमति देता है।
कार्बोकाइनाइन रंजक लाइपोफिलिक रंजक होते हैं जो संपर्क पर सेल झिल्ली में शामिल होते हैं। ये रंजक संवहनी एन्डोथेलियल कोशिकाओं के आसान और तात्कालिक धुंधला होने की अनुमति देते हैं, जो तब फ्लोरोसेंट इन्फोकल माइक्रोस्कोप के नीचे देखे जा सकते हैं। डीआईआई कोशिकाओं के लिपिड झिल्ली में पार्श्व प्रसार के माध्यम से चलता है, जैसा कि न्यूरॉन्स 4 के लेबलिंग और अनुरेखण में दिखाया गया है। रासायनिक रूप से, डीआईआई के दो अल्किल जंजीरों को कोशिका झिल्ली के लिए इसकी उच्च आत्मीयता देता है, जबकि फ्लोरोक्रोम से दो संयुग्मित छल्ले जो लाल तरंगदैर्ध्य को उत्सर्जित करने के लिए जिम्मेदार होता है जब हरे फ्लोरोसेंट प्रकाश फिल्टर> 4 डीआईआई का उपयोग कई क्षमताओं में किया गया है, जिसमें प्लाज्मा झिल्ली का सफल लेबलिंग और न्यूरॉन्स 5 , 6 में एंटीओग्रेड और प्रतिगामी लेबलिंग दोनों शामिल हैं। चूहों 7 के vasculature visualizing करते समय DiI पहले छिड़काव प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया गया था
एक्सोलोटल्स ( एम्बीस्टोमा मैनेट्यूम ) वे सलामंडर्स हैं जो मैक्सिको सिटी, मैक्सिको के पास खारा झीलों में विशेष रूप से रहते हैं। ये जानवर पुनर्योजी प्रक्रियाओं को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल बन गए हैं क्योंकि वे पूरे अंग, पूंछ (तंत्रिका कॉर्ड सहित), दिल के हिस्सों और अन्य आंतरिक अंगों और आंखों के हिस्से को वयस्क 8 , 9 के रूप में पुनर्जीवित कर सकते हैं। इसके अतिरिक्त, अक्षतंतु में आनुवंशिक उपकरणों के हालिया आवेदन के साथ, इन प्रक्रियाओं को चलाने वाले अणुओं और कोशिकाओं में अभूतपूर्व जानकारी अब संभव है 8 । सफल रीजेंनेएक पूरे अंग के राशन के लिए एक व्यापक पुनरोद्धार प्रक्रिया की आवश्यकता होती है, जो ऑक्सीजन और पोषक तत्व प्रदान करने में रक्त वाहिकाओं के पारंपरिक कार्यों से परे पुनर्जनन में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकती है। ऊतक पुनर्जनन के संदर्भ में पुनरुत्पादन को समझना अनिवार्य है। एक्सलोट्ल रक्त वाहिकाओं को भारत इंक का उपयोग करके पहले देखा गया है, और जब परिणाम दिलचस्प थे, तो इस प्रक्रिया को बाद के दशकों में फिर से दोबारा गौर नहीं किया गया है। हमने एक्सलोटल वैस्क्यूचर 7 के संपूर्ण छिड़काव और दृश्यता की अनुमति देने के लिए स्तनधारियों में इस्तेमाल के लिए डिआईआई छिड़काव प्रोटोकॉल को अनुकूलित करने की मांग की थी। यह प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक छेड़छाड़ करने और बाद में डीआईआई स्नेनिंग तकनीक के साथ एक्सोलोटल संचलन की कल्पना करने के लिए उठाए गए कदमों का वर्णन करता है। यह प्रक्रिया होमोस्टेटिक ऊतकों में पेटेंट रक्त वाहिकाओं के सटीक दृश्य के लिए, साथ ही साथ ऊतकों को पुनर्जन्म करने की भी अनुमति देती है, और दृश्यता के लिए एक उपन्यास विधि प्रदान करती हैए और एक्सलोट्ल में पुनर्विकरण प्रक्रिया के विश्लेषण।
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Protocol
ब्रिघम और महिला अस्पताल (बीडब्ल्यूएच) संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति के अनुसार सभी अक्षीय प्रयोग का प्रदर्शन किया गया था।
1. पेफ्यूअंस प्रयोग सेट अप करें
- एक प्लास्टिक कंटेनर में वयस्क एक्सोलॉटल रखें, जो 0.1% ट्राईसीन समाधान (एमएस 222) से 15-20 मिनट या पूरी तरह से संवेदनाहट के लिए भरा है। यह सुनिश्चित करें कि कंटेनर पर्याप्त tricaine समाधान से भरा है जैसे कि axolotl पूरी तरह से जलमग्न है।
नोट: सभी प्रक्रियाओं को संस्थागत पशु देखभाल दिशानिर्देशों के अनुसार किया जाना चाहिए। बीडब्लूएच में, एक एक्सोलोट्ल को पूरी तरह से संवेदनाहृत माना जाता है, जब यह पैर-चुटकी परीक्षण में विफल रहता है, जिसका अर्थ है कि जब पैर धीरे से निचोड़ा हुआ होता है तो कोई आत्मक्षेपण नहीं होता है।
सावधानी: यद्यपि त्रिकैनी जलीय जीवों के लिए विशेष रूप से प्रयोग किया जाता है, ट्रिक्सिन समाधान के साथ प्रत्यक्ष त्वचा संपर्क से बचा जाना चाहिए। - Axolotl perfusion स्टेशन सेट करें
- इसे रखोशोषक पैड को एक फ्लैट, स्तर की सतह पर शोषक पक्ष का सामना करना पड़ रहा है।
- पॉलिस्टररीन फोम फ्रेम में एक छेद काटकर रखें जो लापरवाह स्थिति में निहित करने के लिए एनेस्थेटेड axolotl के लिए उचित आकार और आकार है। शोषक पैड पर फ्रेम रखें
नोट: अतिरिक्त अतिरिक्त अवशोषण के लिए फ्रेम के नीचे कुछ अतिरिक्त कागज़ के तौलिये तुरंत रखा जा सकता है। - छिड़काव टयूबिंग के साथ इमलीस्टाल्टिक पंप लोड करें 0.7 मिलीग्राम / मिनट की प्रवाह दर के लिए पंप को सेट करें, दक्षिणावर्त दिशा में बहते हुए।
- 1: 4 मिश्रण में 0.7x पीबीएस और 5% ग्लूकोज के साथ निर्बाध समाधान करें।
- 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में डीआई स्टॉक समाधान के 200 μL के साथ 10 मिलीलीटर कमजोर समाधान को मिलाएं। कैप और व्युत्क्रम द्वारा मिश्रण। इस ट्यूब को एल्यूमीनियम फ़ॉइल पेपर के साथ कवर करें ताकि प्रकाश के संपर्क में काम कर रहे समाधान को बचा सके।
नोट: वॉल्यूम को एक्सोलॉटल के आकार के अनुसार आनुपातिक रूप से बदला जाना चाहिए। ये मूल्य लगभग 15 सेमी एक्सोलोटल (स्नौप-टू-पूंछ लंबाई) के लिए हैं एइस आकार के निमंत्रण पूरी यौन परिपक्वता तक नहीं पहुंच पाएंगे इसलिए पशु सेक्स इस समय निर्धारित नहीं किया जा सकता है। - 0.7x पीबीएस के साथ 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब भरें
नोट: पीबीएस का प्रयोग लूप और एक्सोलोटल एक्ससेंगुनेशन के लिए किया जाएगा। - छिड़काव टयूबिंग के बाहर निकलने के लिए 27-गेज तितली सुई संलग्न करें। एक दूसरे पर तितली पंखों को मोड़ो और क्लैंप स्टैंड में रखें।
- छिड़काव टयूबिंग का निशुल्क अंत 0.7x पीबीएस से भरे 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में रखें और छिड़काव पंप को चलाने तक पूरी टयूबिंग समाधान से भर जाता है। एक बार पूरे टयूबिंग पीबीएस से भरा हुआ पंप को रोकें।
नोट: सुनिश्चित करें कि टयूबिंग हर समय हवा के बुलबुले से मुक्त हो, क्योंकि इससे एक्सोलोटल में वायु उभरा होता है और पूर्ण छिड़काव को रोकता है। - पॉलीस्टाइन फोम फ्रेम में एक्सोलोट-आकार के साँचे में एक कागज तौलिया रखें। ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करना, ट्राइनेन समाधान के साथ तौलिया को सोखें।
नोट: पेपर टो के मध्य में एक छोटा सा वर्ग कट करेंएल छिड़काव प्रक्रिया के दौरान तरल पदार्थ के जल निकासी के लिए अनुमति देने के लिए। - पॉलीस्टाइन फोम फ्रेम के अंदर पेपर तौलिया पर एनेस्थेटिज्ड एक्सोलोटल लेटिन रखें।
2. एक्सोलोटल चेस्ट खोलना
- कणों की रेखा के ठीक नीचे axolotl छाती के केंद्रीय अक्ष में त्वचा को चुटकी लगाने के लिए शल्य संदंश का प्रयोग करें अपने आप को रोकना।
- एक छोटे से चीरा जहां त्वचा खींच लिया गया है बनाने के लिए एक स्केलपेल का प्रयोग करें।
- दो उपास्थि प्लेटें प्रकट करने के लिए छाती पर त्वचा के एक चौकोर पैच निकालें।
- हृदय को स्पष्ट रूप से देखने के लिए वक्षग्रस्त गुहा पर एक खिड़की खोलने के लिए त्वचा को निकालना और दिल की लगभग 5 मिलीग्राम महाधमनी शाखाएं बंद होती है।
- किसी भी बड़े रक्त वाहिकाओं को काटने से बचने के लिए संयोजी ऊतक को संदंश या बंद कैंची से सावधानीपूर्वक फाड़ें।
- प्रत्येक कार्टिलेज प्लेट को व्यक्तिगत रूप से संदंश का उपयोग करके लिफ्ट करें और उन्हें एक्साइज करेंसर्जिकल कैंची ith
- सावधानी से संदंश के साथ पेरिकार्डियम को चुटकी, खींचो, और सर्जिकल कैंची का उपयोग कर इसे पंचर; यह चीरा बहुत पतली pericardium को छिद्र करने के लिए पर्याप्त गहरा होना चाहिए और पेरिकार्डियम को हटाने की अनुमति देने के लिए पर्याप्त होना चाहिए। दिल को कटौती न करें ध्यान रखें
- हृदय और महाधमनी का पर्दाफाश करने के लिए पेरीकार्डियम को नाजुक रूप से हटा दें।
नोट: ट्रांसफर पिपेट का प्रयोग करना, समय-समय पर सीने की गुहा और ट्रिक्सिन समाधान के साथ गहरे पानी को फ्लश कर देता है ताकि क्षेत्र को साफ किया जा सके और एक्सोलोटल एनेस्थेटेड हो सके।
3. एक्सलोटल का छिड़काव
- क्लॉम्प स्टैंड पॉलिशस्टीरिन फोम फ्रेम के बगल में लोड किए गए तितली सुई के साथ रखें, इस तरह से क्लैंप की बांह आसानी से धुरी के एरोल्टोल महाधमनी में सुई डालने के लिए छेड़छाड़ की जा सकती है। सम्मिलन के दौरान जानवर की छाती के पहलू की ओर सुई की टिप को इंगित करें और ऑरटा के समांतर सुई को ऑप्शन के माध्यम से छानने से बचें।पॉज़िट साइड
- पिस्टलास्टिक पंप चालू करें 0.7x पीबीएस टयूबिंग के माध्यम से प्रवाह जारी रखना चाहिए।
- महाधमनी में सुई डालें
- महाधमनी आर्क के नीचे संदंश स्लाइड करें और आसान पहुंच की अनुमति के लिए थोड़ा ऊपर खींचें।
- सुई-दबाना संयोजन जैसे कि सुई महाधमनी की लंबाई के साथ चलती है, सिर की ओर इशारा करते हुए। महाधमनी के पीछे समर्थन के लिए संदंश का उपयोग करते हुए सुई डालें।
नोट: सुई को एरोटा में गहराई से डालने के लिए यह सुनिश्चित करना चाहिए कि यह छिड़काव के दौरान नहीं निकल जाएगा। यह 15 सेंटीमीटर एक्सोलोट्ल के लिए लगभग 5 मिमी हो सकता है। सुनिश्चित करें कि सुई पूरी तरह से पोत के पूर्ण पंचर से बचने के लिए महाधमनी के अनुरूप है। के माध्यम से और छिद्रण के कारण भारी रक्तस्रावी हो सकता है और छिड़काव की सफलता दर कम हो सकती है। दिल के एट्रियास के दृश्य बढ़ने से सफल सम्मिलन की पुष्टि की जा सकती है।
- जल्दी से विज्ञान के साथ एक एरीटियम चूसनाSsors और खून बहाने के लिए अनुमति देते हैं।
- छाती गुहा में रक्त संचय और थक्के गठन को रोकने के लिए tricaine समाधान के साथ फ्लश।
- पीबीएस के बारे में 20-30 एमएल के साथ एक्सोलोटल को छिड़कना जानवर को हल्के गुलाबी रंग से सफेद रंग में एक सफल छिड़काव में बदलना चाहिए।
- इमरिकलेटिक पंप को रोकें और टयूबिंग के निशुल्क अंत को डीआईआई समाधान के 15 एमएल ट्यूब में ले जाएं। पंप को पुनरारंभ करें, टयूबिंग में किसी भी हवाई बुलबुले बनाने से बचने के लिए सावधानी बरतें।
- डीआईआई के पूरे कामकाजी स्टॉक के साथ axolotl को छिलकाएं
नोट: एक सफल छिड़काव में, डिओआई के उज्ज्वल गुलाबी को बदलने के रंग के साथ एक्सोलोटल यह गलियों में सबसे अधिक ध्यान देने योग्य होगा। - डीआईआई के साथ छिड़काव के बाद पंप को रोकें और ऊतक को ठीक करने के लिए टयूबिंग का नि: शुल्क अंत 4% पैराफॉम्रडायहाइड (पीएफए) समाधान में रखें। पंप को पुनरारंभ करें और पीएफए के कम से कम 10 एमएल का उपयोग करें।
सावधानी: पीएफए विषाक्त है और इसे संभाला और प्रेषण करना चाहिएसीएडी उचित रूप से दस्ताने और सुरक्षा चश्मा पहना जाना चाहिए, और समाधान एक धूआं हुड के अंदर किया जाना चाहिए। पशु की मृत्यु में ऊतक के परिणाम को ठीक करने के लिए पीएफए के साथ एक्सोलोटल का छिड़काव
4. छिड़काव और विज़ुअलाइज़ेशन तैयारी समाप्त करना
- क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप बंद करो और axolotl महाधमनी से सुई को हटा दें।
- प्लास्टिक प्लेट पर एक्सोलोटल रखें
नोट: एक बड़े पेट्री डिश का आधा हिस्सा अच्छी तरह से काम करता है और इसकी त्वचा को गीला रखने और दृश्य गुणवत्ता को सुधारने के लिए एक्सलोटल पर ट्राईकेन या पीबीएस की एक छोटी मात्रा डालने की अनुमति देता है। - उपयुक्त कचरे के डिब्बे में सभी प्रयुक्त सामग्रियों को निकालना। 70% इथेनॉल के साथ स्वच्छ शल्यचिकित्सा उपकरण, जानवरों के बीच एक गिलास-मनका अजीवाणु बनाने वाला यंत्र का उपयोग करने कीटाणुरहित, और प्रक्रिया के बाद आटोक्लेविंग द्वारा निष्फल। पीबीएस समाधान के साथ टयूबिंग फ्लश करें और फिर नाली, पूरी तरह से सूखे और आगे उपयोग के लिए स्टोर करें।
5. विज़ुअलाइज़ेशन पेरफ़ूज़ एक्सोलोटल
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Representative Results
डीआईआई धुंधला होने के साथ, एक्सलोट्ल का वास्क्यूलेट आसानी से देख सकता है। लाइपोफिलिक डाई के साथ perfused जानवरों के रक्त वाहिकाओं को तुरंत एक फ्लोरोसेंट confocal सूक्ष्मदर्शी के तहत दिखाई दे रहे हैं। चित्रा 1 .1-1.5 छिड़काव प्रोटोकॉल का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व है। उज्ज्वल गुलाबी डाई के साथ छिड़काव के बाद, एक सफलतापूर्वक छिद्रित axolotl गुलाबी दिखाई देगा। एक confocal सूक्ष्मदर्शी पर एक हरे रंग की फ्लोरोसेंट फिल्टर का उपयोग संवहनी नेटवर्क का एक लाल उत्सर्जन दिखाई देगा। पूंछ, अंग, गहरे और आंखों ( चित्रा 2 ए , चित्रा 2 बी , चित्रा 2 सी , चित्रा 2 डी , अनुमानित) सहित, छिड़काव सफल होने पर डीआई धुंधला होता है। असंतुलित छिड़काव का परिणाम लाल-दाग वाले vasculature की कमी या जहाजों के धब्बेदार धुंध में होता है।
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चित्रा 1: छिड़काव प्रोटोकॉल के योजनाबद्ध। एसिलोोटल्स, लिपॉफिलिक डाई के साथ सफलतापूर्वक perfused, आईआईआई, इमेजिंग पर vasculature के पूर्ण धुंधला दिखाना 1: छिड़काव प्रयोग से पहले पूर्ण सूक्ष्म axolotl। 2: एक्सोलॉटल की छाती खोलना 2: एक खुले सीने की गुहा के साथ एक्सोलोटल 3: एक्सलोटल के महाधमनी में 27 जी तितली सुई को सम्मिलन 4: ट्यूबिंग में सबसे पहले 0.7x पीबीएस होना चाहिए, फिर डीआई कार्यरत समाधान, और अंत में 4% पीएफए। 5: पूरी तरह से छिद्रित axolotls गुलाबी दिखाई देते हैं इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
चित्रा 2: एक पूरी तरह से perfused Axolo की छवियाँtl। डीआईआई दाग के साथ सफल छिड़काव के बाद एक्सोलोटल vasculature की छवियों को एक फ्लोरोसेंट इन्फ़ोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर लिया गया था। 2 ए: पूंछ 2 बी: फुट 2 सी: गलियों। 2 डी: आई एक हरे फ्लोरोसेंट उत्सर्जन फिल्टर क्यूब के साथ एक confocal सूक्ष्मदर्शी का उपयोग करके इमेजिंग किया जाता है। ए, बी, सी, और डी के लिए संवर्द्धन क्रमशः 1.74X, 2.16X, 1.18X, और 5.6 9 एक्स हैं। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
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Discussion
एक्सीलोटल के व्युत्पत्ति का विज़ुअलाइज़ेशन लाइपोफिलिक कारबोकायनिन डाई, डीआईआई के साथ छिड़काव के माध्यम से सफलतापूर्वक पूरा किया जा सकता है। इस अध्ययन में, हम डीआईआई के साथ एक्सोलोटल के छिड़काव के लिए उपन्यास पंप का उपयोग करते हुए एक उपन्यास प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। हम एक फ्लोरोसेंट इन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करते हुए एक्सोलोट्ल vasculature के बाद के विज़ुअलाइज़ेशन को भी दिखाते हैं। यह प्रोटोकॉल ली एट अल में देखा गया कृंतक डीआई छिड़काव प्रोटोकॉल का अनुकूलन था 7 , हालांकि कृंतक और एक्सोलोटल के बीच मुख्य अंतर के लिए प्रोटोलॉल का एक अक्षांश मॉडल फिट करने के लिए संशोधन की आवश्यकता थी।
इस अध्ययन में एक्सलोट्ल के डीआई छिड़काव की एक विधि के बारे में चर्चा की गई ताकि वसाक्लेचर की सफलतापूर्वक कल्पना की जा सके। छिड़काव के प्रमुख पहलुओं में सैलामिंडर और सड़कों की मांग में बदलाव के बीच शारीरिक रचना और शरीर विज्ञान में अंतर, सुई प्रविष्टि के स्थान, छिड़काव की विधि, और अभिकर्मकों का इस्तेमाल होता है। एच के लिएएक सफल छिड़काव करना, हम axolotl के vasculature के लिए किया नुकसान सीमित सीने की गुहा खोलते समय, रक्त और रक्त वाहिकाओं के किसी भी नुकसान या लसीकरण से बचने के दौरान हृदय और महाधमनी का पर्दाफाश करने के लिए ध्यान रखा गया था। सर्जिकल कैंची के उपयोग को सीमित करने से प्रमुख जहाजों की आकस्मिक कतरन रोका जा सकता है जबकि छोटे चीरों ने दिल और महाधमनी के जोखिम पर नियंत्रण बनाए रखा था। हृदयाभद के सीधे कक्षों के बजाय, एआरटीए के माध्यम से डीआई सुई डाली गई थी, जब ख़ुराक की सफलता दर भी बढ़ जाती है। माउस के विपरीत axolotl के पास तीन कक्षीय हृदय होता है, जिसमें केवल एक वेंट्रिकल होता है जिसमें माउस की तुलना में काफी कम मांसलता होती है। इन मतभेदों के कारण, सुई प्रविष्टि का स्थान अधिक स्थिर महाधमनी में स्थानांतरित किया जाना था। महाधमनी छिड़काव सुई को सम्मिलित करने के लिए इष्टतम स्थान के रूप में निर्धारित किया गया था क्योंकि यह 27 जी सुई द्वारा पंचर के लिए पर्याप्त है और सीमित आंदोलन है आंदोलन छोटा थामहाधमनी के छिड़काव सुई या के माध्यम से और के माध्यम से छेड़ने के आकस्मिक हटाने या फिसलने से बचने के लिए ized एक प्रविष्टि बिंदु के रूप में वेंट्रिकल का उपयोग करते हुए कार्डियक इरिफेशन एक महाधमनी सम्मिलन बिंदु से उन लोगों की तुलना में सफलता का बहुत कम दर साबित हुआ। Vasculature के गलती से छेड़छाड़ अक्सर emboli या रोकथाम छिड़काव के गठन के परिणामस्वरूप, सफल संवहनी लेबलिंग की बहुत कम दर में जिसके परिणामस्वरूप। छिड़काव के दौरान तितली सुई को पकड़ने के लिए एक क्लैंप स्टैंड का उपयोग करके, हमने इसके आंदोलन में कमी की है, इसलिए सफल विक्रय की दर में वृद्धि इसके अतिरिक्त, एक्सोलोटल ऊतक की विनम्रता के कारण, जब माउस की तुलना में, पहले से इस्तेमाल किए जाने वाले मैन्युअल छिड़काव के विरोध के रूप में, पेरिस्टालिक पेरिअ्यूस पंप आवश्यक था। पतली ऊतकों के गलत पेंचचर को कम करने के लिए इस पंप के उपयोग से एक्सोलोटल छिड़काव के लिए हाथ-मुक्त दृष्टिकोण की अनुमति दी गई थी। कई अतिरिक्त कारणों के लिए पर्फ्यूसन असफल रहे, जिनमें से-और-थ्रू पेनकट शामिल हैंUre, थक्के और अन्त: शल्यता इस मामले में कि सुई महाधमनी में डाली गई थी और द्वितीय खंड को पीछे की दीवार के माध्यम से बनाया गया था, डीआई समाधान प्रणालीगत परिसंचरण के माध्यम से पारित होने की बजाय सीने की गुहा में सीधे प्रवाह होगा। इसके अतिरिक्त, एक बार खून से vasculature से बाहर निकलने के बाद, यह जल्दी से खून का थक्का बन गया जो छिड़काव में बाधा उत्पन्न कर सकता था। क्लॉथ और वायु बुलबुले vasculature में भी बना सकते हैं, जिससे शिलाली सफल पेफ्युज़न को रोकती है। अन्त में, इस प्रोटोकॉल ने एक्सोलोट्ल ऑस्मोलैलिटी फिट करने के लिए समायोजित अभिकर्मकों को शामिल किया, जो कि स्तनपायी से काफी अलग है। इस प्रोटोकॉल का अनुकूलन और अक्षलोटल मॉडल में फिट होने के लिए किए गए महत्वपूर्ण बदलाव उत्थान के दौरान ऊतकों के पुनर्वासीकरण की प्रक्रिया को समझने में सहायता करेंगे।
डीआई, जो रंग में गुलाबी है, जानवरों को छिलका देगा और इसे एक चमकदार गुलाबी रंग देगा। सफलतापूर्वक छिद्रित एक्सोलोटल नग्न आंखों के साथ उज्ज्वल गुलाबी बन गए, जिनमें से अत्यधिकवास्कुलराइज्ड क्षेत्रों में अधिक तीव्रता से दाग दिखाई देते हैं। लाल-नारंगी उत्सर्जन स्पेक्ट्रम में एक हरे रंग की फिल्टर का उपयोग करके फ्लोरोसेंट इन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ परिचित जानवरों को देखा जा सकता है। वास्कुलचर सबसे अच्छी तरह से पतले ऊतकों में देखा गया था जो गैर-संवहनी ऊतकों की आकस्मिक डिआई धुंधला को कम कर देता था। ऊतक को ठीक करने के लिए डीआई छिड़काव के तुरंत बाद 4% पैराफॉर्मालाइडहाइड (पीएफए) के साथ ऊतक का छिड़काव किया जाना चाहिए।
डीआईआई एक्सप्रोशन एक्सोलोट्ल के लिए अंत-बिंदु प्रयोग हैं। प्रक्रिया के दौरान, जानवरों के सभी खून को प्रभावी ढंग से सूखा और 0.7x पीबीएस के साथ बदल दिया जाता है, तुरंत डीआई समाधान द्वारा पीछा किया जाता है, और अंत में 4% पीएफए। इससे गैस एक्सचेंज के महत्वपूर्ण कार्य में संलग्न होने की कुल्हाड़ी की क्षमता में बाधा आ गई है और यह अपने शरीर के ऊतकों को ऑक्सीजन बनाने की क्षमता को खो देता है। इस अंत-बिंदु प्रकृति के कारण, प्रत्येक छिड़काव संवहनी वृद्धि का केवल एक समय-समय पर कब्जा करता है, और बाद में जानवरों को और अधिक परिरक्षित नहीं किया जा सकता है। इस समय- limi के कारणटिंग फैक्टर, संवहनी विकास के समय के पाठ्यक्रम का वर्णन करने के लिए कई जानवरों का इस्तेमाल किया जाना चाहिए।
यह डीआई प्रोटोकॉल, और इसे सुधारने के लिए लागू संशोधनों, अक्षतंतु के vasculature को सफलतापूर्वक लेबल और विज़ुअलाइज़ करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। उत्थान के अध्ययन के लिए axolotl एक आवश्यक मॉडल जीव है, चूंकि सफल पुनर्संस्थापन के दौरान एंजियोजेनेसिस की प्रक्रिया से पूछताछ के लिए अवसरों को खोलते हैं। एक्सोलोटल उत्थान के अध्ययन के लिए एक मॉडल जीव है क्योंकि यह एक नपुंसक पशु है और इसलिए वयस्कता 8 में पुनर्जीवित करने की एक उल्लेखनीय क्षमता को बरकरार रखती है। ऊतकों को पुनर्जन्मित करने की पुनरावृत्ति प्रक्रिया, हालांकि, अच्छी तरह से समझ नहीं है, इसलिए ऐआईओआई छिड़काव के अक्षतंतु प्रणाली के अनुकूलन को पुनर्जन्म समझने के अवसर प्रस्तुत करता है जो स्तनधारी मॉडल के साथ उपलब्ध नहीं थे। डीआई का उपयोग करते हुए एक्सोलोटल के छिड़काव, पुनरावृत्तियों के अध्ययन के लिए एक नई तकनीक हैइस पशु मॉडल में ऊतक को पुन: उत्पन्न करने के लिए, इस प्रोटोकॉल का उपयोग रोग के दौरान विकास और एंजियोजेनेसिस के दौरान जीवों को समझने के लिए और पुनर्जन्म के अध्ययन के दौरान एक महत्वपूर्ण उपकरण के रूप में भी किया जा सकता है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
इस शोध को ब्रिघम एंड वुमेन्स हॉस्पिटल और मार्च ऑफ डाइम्स द्वारा समर्थित किया गया था। लेखक अपने समर्थन और सलाह के लिए व्हाइटीब लैब के सभी सदस्यों का धन्यवाद करना चाहते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Peristaltic Pump | Marshall Scientific | RD-RP1 | |
| Perfusion tubing | Excelon Lab & Vacuum Tubing | 436901705 | size S1A |
| 27g butterfly needle | EXELint Medical Products | 26709 | |
| NaCl | AmericanBio | 7647-14-5 | |
| KCl | AmericanBio | 7747-40-7 | |
| Na2HPO4 | AmericanBio | 7558-79-4 | |
| NaH2PO4 | AmericanBio | 10049-21-5 | |
| Distilled water | |||
| HCl | AmericanBio | 7647-01-0 | |
| Glucose | ThermoFischer | A2494001 | |
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Sigma Aldrich | 468495 | |
| Ethanol (100% vol/vol) | Sigma Aldrich | 64-17-5 | |
| Surgical foreceps | Medline | MDG0748741 | |
| Polystyrene foam frame | any polystyrene foam square with an axolotl-shaped cut out | ||
| Surgical scissors | Medline | DYND04025 | |
| Scalpel | Medline | MDS15210 | |
| Absorbent underpad | Avacare Medical | PKUFSx | |
| Paper towels | |||
| Standard disposable transfer pipette | Fisherbrand | 50216954 | |
| Clamp stand | Adafruit | 291 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma Aldrich | E10521 | Tricaine powder |
| Adult axolotl | |||
| MgSO4 | AmericanBio | 10034-99-8 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016-100G | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761-500G | |
| Plastic tanks | Varying size appropriate for the axolotl | ||
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 30525-89-4 | |
| Axolotl | |||
| Leica Microscope | Leica | M165 FC | |
| ET-CY3 Fluorescent Filter | Leica | M205FA/M165FC | |
| MS-222 |
References
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- Hasan, M. R., Herz, J., Hermann, D. M., Doeppner, T. R. Intravascular perfusion of carbon black ink allows reliable visualization of cerebral vessels. J Vis Exp. (71), e4374 (2013).
- Minnich, B., Lametschwandtner, A. Scanning electron microscopy and vascular corrosion casting for the characterization of microvascular networks in human and animal tissues. Microscopy: Science, Technology, Applications, and Education. 1, 29-39 (2010).
- Honig, M., Hume, R. I. DiI and DiO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends Neurosci. 13, 333-335 (1989).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Fluorescent carbocyanine dyes allow living neurons of identified origin to be studied in long-term cultures. J Cell Biol. 103 (1), 171-187 (1986).
- Schwartz, M., Agranoff, B. W. Outgrowth and maintenance of neurites from cultured goldfish retinal ganglion cells. Brain Res. 206 (2), 331-343 (1981).
- Li, Y., Song, Y., Zhao, L., Gaidosh, G., Laties, A. M., Wen, R. Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI. Nat Protoc. 3 (11), 1703-1708 (2008).
- Kuo, T. H., Kowalko, J. E., DiTommaso, T., Nyambi, M., Montoro, D. T., Essner, J. J., Whited, J. L. Evidence of TALEN-mediated gene editing of an endogenous locus in axolotl. Regeneration. 2 (1), 37-43 (2015).
- Brockes, J. P., Kumar, A. Appendage Regeneration in Adult Vertebrates and Implications for Regenerative Medicine. Science. 310 (5756), 1919-1923 (2005).
- Smith, A. R., Wolpert, L. Nerves and angiogenesis in amphibian limb regeneration. Nature. 257 (5523), 224-225 (1975).
