Summary
Используя липофильную методику окрашивания перхлоратом 1,1'-диоктадеци-3,3,3 ', 3'-тетраметилиндокарбоцианин (DiI), Ambystoma mexicanum может подвергаться сосудистой перфузии, что позволяет легко визуализировать сосудистую систему.
Abstract
Методы перфузии использовались на протяжении веков для визуализации циркуляции тканей. Axolotl (Ambystoma mexicanum) - это вид саламандры, который стал важной моделью исследований регенерации. Мало что известно о том, как реваскуляризация возникает в контексте регенерации у этих животных. Здесь мы сообщаем простой способ визуализации сосудистой сети в аксолотле посредством перфузии перхлората 1,1'-диоктидаци-3,3,3 ', 3'-тетраметилиндокарбоцианина (DiI). DiI - липофильный карбоцианиновый краситель, который мгновенно встраивается в плазматическую мембрану эндотелиальных клеток. Перфузия осуществляется с использованием перистальтического насоса, так что DiI входит в циркуляцию через аорту. Во время перфузии краситель течет через кровеносные сосуды аксолотля и включается в липидный бислой сосудистых эндотелиальных клеток при контакте. Процедура перфузии занимает приблизительно один час для восьмидюймового аксолотля. Сразу после перфузии wiTh DiI, аксолотль можно визуализировать с помощью конфокального флуоресцентного микроскопа. DiI излучает свет в красно-оранжевом диапазоне при возбуждении зеленым флуоресцентным фильтром. Эта процедура перфузии DiI может быть использована для визуализации сосудистой структуры аксолотлей или для демонстрации моделей реваскуляризации в регенерирующих тканях.
Introduction
Визуализация сосудистой сети играет важную роль в понимании структуры и функции организмов у многих видов. Изучены модели и графические представления об обращении с 16 -го века с Леонардо да Винчи 1 . Используя воски и резиновые формы, ткани были перфузированы для создания трехмерных моделей сосудистой сети, что позволило изучить органогенез и патогенез 1 , 2 . Смолы и воски окрашивались красителями , такими как индийские чернила или карминовые красные, чтобы обеспечить их легкую визуализацию 1 , 2 . Однако эти методы вызвали множество проблем, поскольку их высокая вязкость препятствовала полной перфузии интересующей ткани 1 . По мере того, как поле становилось все более изощренным, в него входило использование конфокальных и электронных микроскопов, перемещающих перфузионную технику От литейных форм и от жидких перфузий сосудистой сети, некоторые из которых допускают перфузию и визуализацию кровеносных сосудов без разрушения исходной ткани. 3 . DiI, флуоресцентный карбоцианиновый краситель, является одним из таких пятен, который позволяет перфузию животных без повреждения сосудистой ткани.
Карбоцианиновые красители представляют собой липофильные красители, которые вступают в клеточные мембраны при контакте. Эти красители позволяют легко и мгновенно окрашивать сосудистые эндотелиальные клетки, которые затем можно рассматривать под флуоресцентным конфокальным микроскопом. DiI движется через боковую диффузию в липидной мембране клеток, как показано в маркировке и отслеживании нейронов 4 . Химически две алкильные цепи DiI дают красителю его высокое сродство к клеточной мембране, тогда как два конъюгированных кольца из флуорохрома, который отвечает за излучение красной длины волны при возбуждении зелеными флуоресцентными светофильтрами> 4. DiI был использован во многих емкостях, включая успешную маркировку плазматической мембраны и антероградную и ретроградную маркировку в нейронах 5 , 6 . DiI ранее использовался в протоколах перфузии при визуализации сосудистой сети мышей 7 .
Axolotls ( Ambystoma mexicanum ) являются саламандрами, которые живут исключительно в солоноватых озерах вблизи Мехико, Мексика. Эти животные стали важной моделью для понимания процессов регенерации, поскольку они могут восстанавливать полные конечности, хвост (включая нервный шнур), части сердца и другие внутренние органы и части глаз, как взрослые 8 , 9 . Кроме того, с недавним применением генетических инструментов в аксолотлях стало возможным беспрецедентное проникновение в молекулы и клетки, управляющие этими процессами. Успешное возвращениеРадиус целой конечности требует обширного процесса реваскуляризации, который может играть значительную роль в регенерации за пределами просто традиционных функций кровеносных сосудов в обеспечении кислорода и питательных веществ. Понимание реваскуляризации в контексте регенерации тканей обязательно. Ранее сосуды Axolotl визуализировались с использованием индийских чернил, и хотя результаты были интригующими, этот процесс не был повторно рассмотрен в последующие десятилетия 10 . Мы стремились адаптировать протокол перфузии DiI, разработанный для использования у млекопитающих, чтобы обеспечить полную перфузию и визуализацию аксолотлевой сосудистой системы 7 . Этот протокол описывает шаги, предпринятые для успешной перфузии и последующего визуализации циркуляции аксолотля с использованием метода окрашивания DiI. Эта процедура позволит точно визуализировать патентные кровеносные сосуды в гомеостатических тканях, а также в регенерирующих тканях и обеспечивает новый метод визуализацииN и анализ процесса реваскуляризации в аксолотле.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты с аксолотом проводились в соответствии с Комитетом по уходу за больными и их использованием в Бригаме и Женской больнице (BWH).
1. Настройте эксперимент по перфузии
- Поместите взрослый аксолотль в пластиковый контейнер, заполненный 0,1% раствором трикаина (MS222) в течение 15-20 минут или до полного обезболивания. Убедитесь, что контейнер заполнен достаточным количеством раствора трикаина, так что аксолотль полностью погружен в воду.
Примечание. Все процедуры должны выполняться в соответствии с руководящими принципами ухода за животными. При BWH аксолотль считается полностью анестезированным, когда он не проходит тест на ногу, что означает, что рефлекторное движение отсутствует, когда нога мягко сжимается.
Осторожно: хотя трикаин - это анестетик, специально используемый для водных организмов, следует избегать прямого контакта с кожей с раствором трикаина. - Настройте перфузионную станцию аксолотля.
- ПоместитеАбсорбирующей прокладки на плоской ровной поверхности с абсорбирующей стороной вверх.
- Отрежьте отверстие в каркасе из пенополистирола, соответствующее размеру и форме, чтобы обезболенный аксолотль лежал в положении лежа на спине. Поместите рамку на абсорбирующую подушку.
Примечание. Некоторые дополнительные бумажные полотенца могут быть размещены сразу под рамой для дополнительной впитывающей способности. - Загрузите перистальтический насос перфузионной трубкой. Установите насос на скорость потока 0,7 мл / мин, протекая по часовой стрелке.
- Сделайте разбавленный раствор 0,7x PBS и 5% глюкозы в смеси 1: 4.
- Смешайте 10 мл раствора разбавителя с 200 мкл исходного раствора DiI в конической трубке 50 мл. Крышка и смесь путем инверсии. Накройте эту трубку алюминиевой фольгой для защиты рабочего раствора от воздействия света.
Примечание: Объемы должны меняться в зависимости от размера аксолотля пропорционально. Эти значения приведены для приблизительно 15 см аксолотля (длина рыла до хвоста).Нималы такого размера, возможно, не достигли полной половой зрелости, поэтому животный секс не может быть определен в это время. - Заполните 50 мл коническую трубку 0,7x PBS.
Примечание: PBS будет использоваться для заливки цикла и подгонки аксолотля. - Прикрепите иглу бабочки 27-го калибра к выходному концу перфузионной трубки. Сложите крылья бабочки друг на друга и поместите в стойку для зажима.
- Поместите свободный конец перфузионной трубки в 50-миллилитровую коническую трубку, заполненную 0,7x PBS, и запустите перфузионный насос, пока вся трубка не будет заполнена раствором. Остановите насос, как только вся трубка заполнена PBS.
Примечание. Обязательно убедитесь, что в трубке всегда есть пузырьки воздуха, так как это вызовет эмболии воздуха в аксолотле и предотвратит полную перфузию. - Поместите бумажное полотенце в форме аксолотля в рамке из пенополистирола. Используя переносную пипетку, промойте полотенце раствором трикаина.
Примечание. Отрежьте небольшой квадрат посередине бумажного буксираEl, чтобы обеспечить дренаж жидкостей во время процедуры перфузии. - Поместите анестезированный аксолотль на спине на бумажное полотенце внутри рамки из пенополистирола.
2. Открытие сустава Axolotl
- Используйте хирургические щипцы, чтобы ущипнуть кожу вдоль центральной оси сундука аксолотля, чуть ниже линии плеч. Поднимитесь.
- Используйте скальпель, чтобы сделать небольшой разрез, когда кожа была вытащена.
- Удалите квадратный слой кожи над сундуком, чтобы выявить две пластины хряща.
- Удалите кожу, чтобы открыть окно над грудной полостью, достаточно большой, чтобы четко видеть сердце и примерно 5 мм аорты, отделяющейся от сердца.
- Тщательно раздирайте соединительную ткань с помощью щипцов или закрытых ножниц, чтобы избежать резки крупных кровеносных сосудов.
- Поднимайте каждую пластину хряща индивидуально с помощью щипцов и вырезайте ихС хирургическими ножницами.
- Аккуратно зажмите перикард щипцами, подтяните и проколоте его хирургическими ножницами; Этот разрез должен быть достаточно глубоким, чтобы проколоть очень тонкий перикард и должен быть достаточно большим, чтобы можно было удалить перикард. Старайтесь не резать сердце.
- Деликатно удалите перикард, чтобы разоблачить сердце и аорту.
Примечание. Используя переносную пипетку, периодически промывайте полость грудной клетки и жабры раствором трикаина, чтобы очистить область и сохранить аксолотль под наркозом.
3. Перфузия Axolotl
- Поместите зажимную подставку с загруженной иглой бабочки рядом с каркасом из пенополистирола, чтобы можно было легко манипулировать рукояткой зажима, чтобы вставить иглу в асколотную аорту. Направьте наконечник иглы на ростральный аспект животного во время вставки и удерживайте иглу параллельно аорте, чтобы избежать прокола ее через опПозитивная сторона.
- Включите перистальтический насос. 0.7x PBS должен продолжать течь через трубку.
- Вставьте иглу в аорту.
- Сдвиньте щипцы под дугу аорты и слегка подтяните, чтобы обеспечить легкий доступ.
- Маневрируйте комбинацию игл-зажим таким образом, чтобы игла проходила вдоль длины аорты, направленной вверх к голове. Вставьте иглу, используя пинцет для поддержки аорты.
Примечание: иглу следует вставить достаточно глубоко в аорту, чтобы она не выскользнула во время перфузии. Это может составлять около 5 мм для аксолотля 15 см. Убедитесь, что игла идеально соответствует аорте, чтобы избежать полного прокола сосуда. Проникающие проколы могут вызвать массовое кровоизлияние и снизить уровень успешности перфузии. Успешное введение может быть подтверждено видимым увеличением предсердий сердца.
- Быстро разорвать один атриум с помощью sciSsors и позволяют сливать кровь.
- Промойте раствором трикаина, чтобы предотвратить накопление крови и образование сгустка в грудной полости.
- Перфузируйте аксолотль примерно с 20-30 мл PBS. Животное должно измениться от светло-розового цвета до белого в успешной перфузии.
- Остановите перистальтический насос и переместите свободный конец трубки в 15-миллилитровую трубку раствора DiI. Перезапустите насос, следите за тем, чтобы не создавать пузырьки воздуха в трубе.
- Перфузируйте аксолотль со всем рабочим слоем DiI.
Примечание: при успешной перфузии аксолотль меняет цвет на ярко-розовый цвет DiI. Это будет наиболее заметно в жабрах. - Остановите насос после перфузии с помощью DiI и поместите свободный конец трубки в раствор 4% Paraformaldehyde (PFA) для фиксации ткани. Перезапустите насос и перфузируйте не менее 10 мл PFA.
Осторожно: PFA токсичен, и его следует обрабатывать и отбрасыватьНадлежащим образом. Необходимо носить перчатки и защитные очки, а растворы следует делать внутри вытяжного шкафа. Перфузия аксолотля с PFA для фиксации ткани приводит к гибели животного.
4. Прекращение подготовки перфузии и визуализации
- Остановите перистальтический насос и вытащите иглу из аскотола аксолотта.
- Поместите аксолотль на пластиковую пластину.
Примечание. Использование одной половины большой чашки Петри хорошо работает и позволяет разливать небольшое количество трикаина или PBS на аксолотль, чтобы сохранить влажность кожи и улучшить качество визуализации. - Утилизируйте все использованные материалы в соответствующих мусорных баках. Очистите хирургические инструменты с помощью 70% этанола, продезинфицируйте с помощью стерилизатора стеклянных шариков между животными и стерилизуйте автоклавированием в соответствии с процедурой. Промыть трубки раствором PBS, а затем слить, полностью высушить и хранить для дальнейшего использования.
5. Визуализация перфорированного аксолотля
Примечание. Чтобы получить изображение высокого качества, можно использовать следующие параметры: экспозиция на 1,1 с, усиление 1x, насыщенность 1,0, увеличение 2X.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
При окрашивании DiI сосудистая сеть аксолота может быть легко визуализирована. Кровеносные сосуды животных, перфузируемые липофильным красителем, сразу видны под флуоресцентным конфокальным микроскопом. Рисунок 1 .1-1.5 представляет собой схематическое представление протокола перфузии. После перфузии с ярко-розовым красителем успешно перфорированный аксолотль будет розовым. Используя зеленый флуоресцентный фильтр на конфокальном микроскопе, появится красная эмиссия сосудистой сети. Окрашивание DiI происходит во всех тканях организма, когда перфузия успешна, включая хвост, конечности, жабры и глаза ( Рисунок 2A , Рисунок 2B , Рисунок 2C , Рисунок 2D , соответственно). Неуспешные перфузии приводят к отсутствию красноватой сосудистой сети или пятнистому окрашиванию сосудов.
Ntent "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Рисунок 1: Схема протокола перфузии. Axolotls успешно перфузировали липофильным красителем DiI, демонстрируют полное окрашивание сосудистой сети при визуализации. 1: полный контроль над головой аксолотля перед перфузионным экспериментом. 2: Открытие сундука аксолотля. 2: Axolotl с открытой грудной полостью. 3: Вставка иглы бабочки 27 G в аорту аксолотля. 4: Труба должна сначала содержать 0,7x PBS, затем рабочий раствор DiI и, наконец, 4% PFA. 5: Полностью перфузированные аксолотлы кажутся розовыми. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Изображения полностью перфорированного аксолоТЛ. Изображения аксолотлевой сосудистой системы были взяты с использованием флуоресцентного конфокального микроскопа после успешной перфузии с окрашиванием DiI. 2A: Хвост. 2B: Нога. 2C: Жабры. 2D: Глаз. Изображения выполняются с использованием конфокального микроскопа с зеленым флуоресцентным фильтром. Увеличение изображений A, B, C и D составляет 1.74X, 2.16X, 1.18X и 5.69X соответственно. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Визуализация сосудистой сети аксолота может быть успешно достигнута путем перфузии с липофильным карбоцианиновым красителем DiI. В этом исследовании мы описываем новый протокол для перфузии аксолотля с DiI с использованием перистальтического насоса. Мы также показываем последующую визуализацию аксолотской сосудистой сети с использованием флуоресцентного конфокального микроскопа. Этот протокол был адаптирован к протоколу перфузии грызунов DiI, наблюдаемому в Li et al. 7 , однако существенные различия между грызуном и аксолотлом потребовали пересмотра протокола для соответствия модели аксолотля.
В этом исследовании обсуждается метод перфузии DiI аксолотля, чтобы успешно визуализировать сосудистую систему. Различия в анатомии и физиологии между изменениями саламандры и грызунов в основных аспектах перфузии, включая расположение введения иглы, метод перфузии и используемые реагенты. Для того, чтобыУспешная перфузия, мы ограничили ущерб, причиненный сосудистой сети аксолотля. При открытии полости грудной клетки была предпринята попытка полностью разоблачить сердце и аорту, избегая при этом каких-либо повреждений или рваных ран в крупных кровеносных сосудах. Ограничение использования хирургических ножниц предотвращало случайное отсечение крупных сосудов, в то время как небольшие надрезы поддерживали контроль над воздействием сердца и аорты. Шансы успеха перфузии также увеличивались, когда иглу DiI вставляли через аорту, а не прямо в камеры сердца. Аксолотль, в отличие от мыши, имеет трехкамерное сердце, содержащее только один желудочек со значительно меньшей мускулатурой, чем мышца. Из-за этих различий местоположение вставки иглы должно быть перемещено в более стабильную аорту. Было определено, что аорта является оптимальным местом для введения перфузионной иглы, поскольку она достаточно велика для прокола иглой 27 G и имеет ограниченное движение. Движение было минимальнымЧтобы избежать случайного удаления или скольжения перфузионной иглы или сквозного прокола аорты. Сердечные перфузии с использованием желудочка в качестве точки введения оказались намного более быстрыми, чем у пациентов с точкой вставки аорты. Ошибочная пункция сосудистой сети часто приводила к образованию эмболии или предотвращала перфузию, что приводило к очень низким показателям успешной маркировки сосудов. Используя фиксатор для фиксации иглы бабочки во время перфузии, мы уменьшили ее движение, тем самым увеличивая скорость успешных перфузий. Кроме того, из-за слабости ткани аксолотля по сравнению с мышью был необходим перистальтический перфузионный насос, в отличие от ручной перфузии, ранее использовавшейся. Использование этого насоса позволило использовать бесшумный подход к перфузии аксолотля, чтобы свести к минимуму ошибочный прокол тонких тканей. Перфузии не увенчались успехом по многим дополнительным причинам, в том числе сквозным пунктамМочеиспускания, свертывания и эмболии. В случае, когда игла была вставлена в аорту, и вторая проколка была создана через заднюю стенку, раствор DiI будет поступать непосредственно в грудную полость, а не проходить через системную циркуляцию. Кроме того, как только кровь вышла из сосудистой сети, она быстро сформировала сгусток крови, который мог бы помешать перфузии. Сгустки и пузырьки воздуха могут также образовываться в сосудистой сети, вызывая эмболии, которые препятствуют успешной перфузии. Наконец, в этот протокол включены реагенты, скорректированные с учетом осмоляльности аксолота, которая значительно отличается от таковой у млекопитающего. Адаптация этого протокола и существенные изменения, внесенные в соответствии с моделью аксолотля, помогут в достижении понимания процесса реваскуляризации тканей во время регенерации.
DiI, который имеет розовый цвет, будет перфузировать животное и придавать ему ярко-розовый оттенок. Успешно перфузированные аксолотлы стали ярко-розовыми невооруженным глазом,Васкуляризированные области появляются более интенсивно окрашенными. Перффицированные животные, наблюдаемые с флуоресцентным конфокальным микроскопом с использованием зеленого фильтра, могут быть визуализированы в красно-оранжевом спектре излучения. Вакулатура лучше всего визуализировалась в более тонких тканях, которые сводили к минимуму случайное окрашивание DI невоенных тканей. Перфузию ткани с 4% параформальдегидом (PFA) сразу же после перфузии DiI следует проводить для фиксации ткани.
Перфузии DiI - это конечные эксперименты для аксолотля. Во время процедуры всю кровь животного эффективно дренируют и заменяют 0,7x PBS, затем сразу же раствором DiI и, наконец, 4% PFA. Это нарушает способность аксолотля участвовать в жизненном акте газообмена, и он теряет способность насыщать кислородом свои ткани тела. Из-за этого конечного характера каждая перфузия захватывает только один временной момент сосудистого роста, и животное не может быть дополнительно перфузировано в более позднее время. Благодаря этому времени-limiЧтобы определить временной ход сосудистого развития, необходимо использовать множественные животные.
Этот протокол DiI и изменения, применяемые для его улучшения, могут быть использованы для успешной маркировки и визуализации сосудистой сети аксолотля. Поскольку аксолотль является существенной моделью организма для изучения регенерации, успешные перфузии открывают возможности для опроса процесса ангиогенеза во время регенерации. Аксолотль представляет собой модельный организм для изучения регенерации, потому что он является новорожденным животным и поэтому сохраняет замечательную способность к регенерации во время взрослой жизни 8 . Однако процесс реваскуляризации регенерирующих тканей не совсем понятен, поэтому адаптация перфузии DiI к системе аксолотля дает возможность понять регенерацию, недоступную модели млекопитающих. Перфузия аксолотля с использованием DiI - это новый метод исследования revasТаким образом, этот протокол может быть далее использован для понимания органогенеза во время развития и ангиогенеза во время болезни, а также для использования в качестве важного инструмента во время изучения регенерации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано Brigham & Women's Hospital и March of Dimes. Авторы хотели бы поблагодарить всех членов Whited Lab за их поддержку и советы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Peristaltic Pump | Marshall Scientific | RD-RP1 | |
| Perfusion tubing | Excelon Lab & Vacuum Tubing | 436901705 | size S1A |
| 27g butterfly needle | EXELint Medical Products | 26709 | |
| NaCl | AmericanBio | 7647-14-5 | |
| KCl | AmericanBio | 7747-40-7 | |
| Na2HPO4 | AmericanBio | 7558-79-4 | |
| NaH2PO4 | AmericanBio | 10049-21-5 | |
| Distilled water | |||
| HCl | AmericanBio | 7647-01-0 | |
| Glucose | ThermoFischer | A2494001 | |
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Sigma Aldrich | 468495 | |
| Ethanol (100% vol/vol) | Sigma Aldrich | 64-17-5 | |
| Surgical foreceps | Medline | MDG0748741 | |
| Polystyrene foam frame | any polystyrene foam square with an axolotl-shaped cut out | ||
| Surgical scissors | Medline | DYND04025 | |
| Scalpel | Medline | MDS15210 | |
| Absorbent underpad | Avacare Medical | PKUFSx | |
| Paper towels | |||
| Standard disposable transfer pipette | Fisherbrand | 50216954 | |
| Clamp stand | Adafruit | 291 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma Aldrich | E10521 | Tricaine powder |
| Adult axolotl | |||
| MgSO4 | AmericanBio | 10034-99-8 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016-100G | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761-500G | |
| Plastic tanks | Varying size appropriate for the axolotl | ||
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 30525-89-4 | |
| Axolotl | |||
| Leica Microscope | Leica | M165 FC | |
| ET-CY3 Fluorescent Filter | Leica | M205FA/M165FC | |
| MS-222 |
References
- Giuvarasteanu, I. Scanning electron microscopy of vascular corrosion casts - standard method for studying microvessels. Rom J Morphol Embryo. 48 (3), 257-261 (2007).
- Hasan, M. R., Herz, J., Hermann, D. M., Doeppner, T. R. Intravascular perfusion of carbon black ink allows reliable visualization of cerebral vessels. J Vis Exp. (71), e4374 (2013).
- Minnich, B., Lametschwandtner, A. Scanning electron microscopy and vascular corrosion casting for the characterization of microvascular networks in human and animal tissues. Microscopy: Science, Technology, Applications, and Education. 1, 29-39 (2010).
- Honig, M., Hume, R. I. DiI and DiO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends Neurosci. 13, 333-335 (1989).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Fluorescent carbocyanine dyes allow living neurons of identified origin to be studied in long-term cultures. J Cell Biol. 103 (1), 171-187 (1986).
- Schwartz, M., Agranoff, B. W. Outgrowth and maintenance of neurites from cultured goldfish retinal ganglion cells. Brain Res. 206 (2), 331-343 (1981).
- Li, Y., Song, Y., Zhao, L., Gaidosh, G., Laties, A. M., Wen, R. Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI. Nat Protoc. 3 (11), 1703-1708 (2008).
- Kuo, T. H., Kowalko, J. E., DiTommaso, T., Nyambi, M., Montoro, D. T., Essner, J. J., Whited, J. L. Evidence of TALEN-mediated gene editing of an endogenous locus in axolotl. Regeneration. 2 (1), 37-43 (2015).
- Brockes, J. P., Kumar, A. Appendage Regeneration in Adult Vertebrates and Implications for Regenerative Medicine. Science. 310 (5756), 1919-1923 (2005).
- Smith, A. R., Wolpert, L. Nerves and angiogenesis in amphibian limb regeneration. Nature. 257 (5523), 224-225 (1975).
