Summary
Ambystoma mexicanumは親油性の1,1'-Dioctadecy-3,3,3 '、3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate（DiI）染色法を用いて、脈管構造の容易な可視化を可能にする血管灌流を受けることができる。
Abstract
灌流技術は、組織の循環を可視化するために何世紀にも使用されてきた。 Axolotl（Ambystoma mexicanum）は、再生研究の必須モデルとして浮上してきたサンショウウオの種です。これらの動物における再生の状況において血管再生がどのように起こるかについてはほとんど知られていない。ここでは、1,1'-Dioctadecy-3,3,3 '、3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate（DiI）の灌流による軸索における脈管構造の可視化のための簡単な方法を報告する。 DiIは、内皮細胞の原形質膜に瞬間的に挿入する親油性カルボシアニン色素である。 DiIが大動脈を通って循環に入るように、蠕動ポンプを用いて灌流を行う。灌流の間に、色素は軸索の血管を流れ、接触すると血管内皮細胞の脂質二重層に取り込まれる。灌流の手順は、8インチの軸索の場合約1時間かかる。灌流直後Axiotlは、共焦点蛍光顕微鏡で視覚化することができる。 DiIは、緑色の蛍光フィルターで励起されると、赤 - オレンジ色の範囲で発光します。このDiI灌流手順は、軸索の血管構造を視覚化するために、または再生組織における血管再生のパターンを示すために使用することができる。
Introduction
脈管構造の可視化は、多くの種の生物の構造と機能を理解する上で不可欠な役割を果たします。レオナルド・ダ・ヴィンチとの16世紀の時代から、循環のモデルとグラフィック表現が研究されました1 。ワックスとゴムの型を使用して、組織を灌流して脈管構造の3次元モデルを作成し、器官形成と病因の研究1,2を可能にした 。樹脂やワックスはインドインキやカルミンレッドなどの染料で着色されており、視覚化が容易になりました1,2 。しかしながら、これらの技術は、それらの高い粘度が関心組織1の完全な灌流を妨げたので、多くの問題を引き起こした。フィールドがより洗練されたように、共焦点顕微鏡と電子顕微鏡の使用が開始され、灌流techniq鋳型から離して脈管構造の液体灌流に向かい、その一部は最初の組織を破壊することなく血管の灌流および造影を可能にした3 。蛍光カルボシアニン色素であるDiIは、血管組織を損傷することなく動物の灌流を可能にするそのような染色の1つである。
カルボシアニン色素は、接触すると細胞膜に取り込まれる親油性色素である。これらの色素は、血管内皮細胞の容易かつ瞬時の染色を可能にし、蛍光共焦点顕微鏡の下で見ることができる。 DiIは、細胞の脂質膜の側方拡散を介して動く。これは、ニューロンのラベリングおよびトレース4に示される。化学的には、DiIの2つのアルキル鎖は色素に細胞膜に対する高い親和性を与え、一方、緑色蛍光光フィルターによって励起されたときに赤色波長を放射する原因となる蛍光色素からの2つの共役リング> 4。 DiIは、形質膜の標識の成功、およびニューロンにおける順行性および逆行性両方の標識化を含む、多くの能力において利用されている5,6。 DiIは、マウスの脈管構造を視覚化しながら、以前は灌流プロトコールで使用されていました7 。
Axolotls（ Ambystoma mexicanum ）はメキシコのメキシコシティ近くの汽水湖に独占的に生息するサラマンダーです。これらの動物は、完全な四肢、尾（神経脊髄を含む）、心臓の一部および他の内臓、および大人の眼の部分を再生することができるため、再生プロセスを理解するための重要なモデルとなっている。さらに、Axolotlsにおける遺伝子ツールの最近の応用により、これらのプロセスを駆動する分子および細胞に対する前例のない洞察が可能になりました8 。成功したレグネ四肢全体の割合は、酸素および栄養素を提供する際の血管の伝統的な機能だけでなく、再生において重要な役割を果たす可能性がある広範な血管再生プロセスを必要とする。組織再生の文脈における血管再生の理解は不可欠である。 Axolotlの血管は、以前はインドのインクを使用して視覚化されていましたが、その結果は興味深いものでしたが、このプロセスは10年後に再訪されていません10 。本発明者らは、哺乳動物に使用するために開発されたDiI灌流プロトコールを適応させて、軸索脈管構造の完全な灌流および視覚化を可能にすることを試みた7 。このプロトコールは、DiI染色技術を用いて軸索循環を首尾よく灌流し、続いて視覚化するためのステップを説明する。この手順は、恒常性組織における再生血管および再生血管における正確な視覚化を可能にし、視覚化のための新しい方法を提供するaxolotlにおける血管再生プロセスの分析。
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Protocol
Axolotlのすべての実験は、Brigham and Women's Hospital（BWH）機関動物管理および使用委員会に従って実施した。
1.灌流実験を設定する
- 0.1％トリカイン溶液（MS222）を満たしたプラスチック容器に15〜20分間、または完全に麻酔するまで成人axolotlを置きます。 axolotlが完全に浸水するように、容器に十分なトリカイン溶液が充填されていることを確認します。
注意：すべての処置は、施設内の動物保護ガイドラインに従って実施する必要があります。 BWHでは、アフォーロトールはフットピンチ試験に失敗したときに完全に麻酔されたとみなされます。つまり、足を静かに握ったときに反射的な動きがないことを意味します。
注意：トリカインは水生生物に特に使用される麻酔薬ですが、トリカイン溶液との直接の皮膚接触を避けるべきです。 - axolotl灌流ステーションを設定します。
- 配置吸収性の面を上にして平らで平坦な表面上にある吸収性パッド。
- 麻酔したアコモトールが仰臥位になるための適切なサイズと形状のポリスチレンフォームフレームに穴をあけます。フレームを吸収パッドの上に置きます。
注：余分なペーパータオルをフレームのすぐ下に置いて吸水性を高めることもできます。 - 蠕動ポンプに潅流チューブを装着します。ポンプを0.7 ml / minの流速に設定し、時計回りに流してください。
- 0.7倍のPBSと5％のグルコースを含む希釈溶液を1：4の混合液で調製する。
- 希釈液10 mLとDiI原液200μLとを50 mLコニカルチューブで混合する。反転して重ね合わせる。このチューブにアルミホイルペーパーを被覆して、作業溶液が光にさらされないようにしてください。
注：ボリュームは、比例的にaxolotlのサイズに応じて変更する必要があります。これらの値は約15cmの軸索（鼻尾から尾までの長さ）の値です。 Aこのサイズの児童は完全な性的成熟に達していない可能性があり、このため動物性別が決定されない可能性があります。 - 0.7x PBSを含む50mLコニカルチューブを充填する。
注：PBSは、ループおよび軸索逸出をプライミングするために使用される。 - 27ゲージの蝶針を灌流管の出口端に取り付ける。バタフライウィングをお互いに折ってクランプスタンドに置きます。
- 0.7×PBSで満たした50mLコニカルチューブに灌流チュービングの自由端を置き、チューブ全体が溶液で満たされるまで灌流ポンプを作動させます。チューブ全体がPBSで満たされたらポンプを停止します。
注意：チューブには常にエアーバブルがないことを確認してください。エアー塞栓が発生し、完全な灌流が妨げられます。 - ポリスチレン発泡体の枠内にあるaxolotl型の型にペーパータオルを置きます。移送ピペットを使用して、タケル溶液でタオルを浸します。
注：ペーパートウの真ん中に小さな四角を切ってください灌流処置の間に流体の排出を可能にする。 - 麻酔したaxolotlをポリスチレン発泡体フレームの内側にあるペーパータオルに置きます。
2. Axolotlの胸を開く
- 外科用鉗子を使用して、腋の下の腋の下の胸の中心軸に沿って皮膚を挟みます。引き上げる。
- 皮膚が引っ張られた小さな切開を作るためにメスを使います。
- 2つの軟骨板を明らかにするために、胸の皮膚の正方形のパッチを除去する。
- 心臓をはっきりと見るのに十分な大きさの胸腔と、心臓から枝分かれした約5mmの大動脈の窓を開くために皮膚を除去する。
- 主要な血管の切断を避けるために、鉗子または閉じたはさみを使用して結合組織を注意深く裂く。
- 鉗子を使用して各軟骨板を個別に持ち上げ、それらを切除する。手術用はさみ。
- 慎重に鉗子で心膜を挟み込み、引っ張り、外科用ハサミで穿刺する。この切開は、非常に薄い心膜を穿刺するのに十分な深さでなければならず、心膜の除去を可能にするのに十分な大きさでなければならない。心を切らないように注意してください。
- 心臓と大動脈を暴露するために、心膜を微妙に除去する。
注：移送ピペットを使用して、定期的に胸腔および鰓にトリカイン溶液を流して、その領域を透明に保ち、アキソロットを麻酔状態に保つ。
3. Axolotlの灌流
- クランプスタンドを、挿入されたバタフライ針をポリスチレン発泡体フレームの隣に置き、クランプのアームを容易に操作して針を軸索大動脈に挿入することができるようにする。挿入中に動物の吻側に針の先端を向け、針を大動脈と平行に保ち、手術中に穿刺しないようにする正面側。
- 蠕動ポンプの電源を入れます。 0.7x PBSはチューブを通って流れ続けなければならない。
- 大動脈に針を挿入します。
- 大動脈弓の下に鉗子をスライドさせ、簡単にアクセスできるようにわずかに引き上げます。
- ニードルが大動脈の長さに沿って走り、頭に向かって上を向くようにニードルクランプの組み合わせを操縦する。大動脈の後ろのサポートのために鉗子を使用しながら針を挿入します。
注：針は、灌流中に滑り落ちないように、大動脈に十分に深く挿入する必要があります。これは、15cm軸索の場合、約5mmであり得る。血管の完全な穿刺を避けるために、針が大動脈と完全に一致していることを確認する。スルー・アンド・スルーによる穿刺は、大量の出血を引き起こし、灌流の成功率を低下させる可能性があります。成功した挿入は、心臓の心房の目に見える拡大によって確認することができる。
- 1つのアトリウムをsciで素早く傷つける血を流すことができます。
- 胸腔に血液が蓄積するのを防ぐために、トリカイン溶液で洗い流してください。
- 約20〜30mLのPBSで軸索を灌流する。 灌流が成功すると、動物はライトピンク色から白色に変化するはずです。
- 蠕動ポンプを停止し、チューブの自由端をDiI溶液の15mLチューブに移す。ポンプを再始動し、チューブに気泡が発生しないように注意してください。
- AxolotlにDiIの全作業用ストックを灌流する。
注：成功した灌流では、DiIの明るいピンク色に変色するアキソロールがある。これはアレルで最も顕著になります。 - DiIでの灌流が完了した後、ポンプを停止し、チューブの自由端を4％パラホルムアルデヒド（PFA）溶液に入れて組織を固定する。ポンプを再起動し、少なくとも10mLのPFAを灌流する。
注意：PFAは毒性があるため、取り扱い、処分する必要があります適切にsed。手袋と安全眼鏡を着用し、煙草のフード内で解決策を講ずるべきである。組織を固定するためにaxolotlにPFAを灌流すると、動物が死亡する結果になります。
4.灌流および視覚化準備の終了
- 蠕動ポンプを停止し、axolotl大動脈から針を取り外します。
- axolotlをプラスチックプレートの上に置きます。
注意：大きなペトリ皿の半分を使用するとうまくいき、皮膚を濡らさず視覚化の質を向上させるために、少量のトリカインまたはPBSを軸索に注ぐことができます。 - すべての使用済み材料を適切な廃棄物ビンに廃棄してください。手術器具を70％エタノールで洗浄し、動物間でガラスビーズ滅菌器を用いて消毒し、手順に従ってオートクレーブ滅菌する。 PBS溶液でチューブを洗い流し、水気を切って完全に乾燥させ、使用のために保管してください。
5.灌流されたAxolotlの可視化
注：高品質の画像を得るには、1.1秒の露出、1倍のゲイン、1.0の彩度、2倍の倍率のパラメータを使用できます。
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Representative Results
DiI染色により、軸索の脈管構造を容易に視覚化することができる。親油性色素で灌流された動物の血管は、蛍光共焦点顕微鏡下ですぐに見ることができる。 図1 .1-1.5は、灌流プロトコールの模式図です。明るいピンク色素で灌流した後、首尾よく灌流された軸索はピンク色に見える。共焦点顕微鏡上で緑色蛍光フィルターを使用して、血管網の赤色発光が現れる。 DiI染色は、尾、肢、鰓、および目（ 図2A 、 図2B 、 図2C 、 図2D 、それぞれ）を含む灌流が成功した場合、すべての体組織で起こる。失敗した灌流は、赤く染色された脈管構造の欠如または血管の不鮮明な染色をもたらす。
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図1：灌流プロトコルの略図。親油性色素であるDiIで首尾よく灌流されたAxolotlsは、画像化の際に脈管構造の完全な染色を示す。 1：灌流実験前の完全な仰臥位アキソロット。 2：axolotlの胸を開きます。 2：開いた胸腔を有するアキソテール。 3：軸索の大動脈への27Gバタフライ針の挿入。 4：チューブには最初に0.7倍のPBS、次にDiI作業溶液、最後に4％のPFAが入っていなければなりません。 5：完全に灌流された軸索はピンク色に見える。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図2：完全に灌流されたAxoloの画像tl。 Axlotl脈管構造の画像はDiI染色で首尾よく灌流した後、蛍光共焦点顕微鏡を用いて撮影した。 2A：テール。 2B：足。 2C：鰓。 2D：目。イメージングは、緑色蛍光発光フィルターキューブを有する共焦点顕微鏡を用いて行われる。画像A、B、C、Dの倍率はそれぞれ1.74X、2.16X、1.18X、5.69Xです。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
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Discussion
Axolotlの脈管構造の可視化は、親油性カルボシアニン色素DiIによる灌流によって首尾よく達成することができる。本研究では、蠕動ポンプを用いてDiIで軸索を灌流するための新規プロトコールを記載する。我々はまた、蛍光共焦点顕微鏡を用いて軸索脈管構造のその後の可視化を示す。このプロトコルは、Li らに見られるげっ歯類DiI灌流プロトコールの適応であった。しかし、げっ歯類とアキソロットの間の主な相違点は、アフォーロットモデルに適合させるためのプロトコールの改訂が必要であったことである。
本研究では、脈管構造を正常に視覚化するためにAxolotlのDiI灌流の方法について議論する。サラマンダーとげっ歯類との間の解剖学および生理学の相違は、針挿入の位置、灌流の方法、および使用される試薬を含む、灌流の主要な側面における変更を要求する。アーチをするためにすなわち、灌流が成功した場合、我々は軸索の脈管構造に及ぼす損傷を制限した。胸腔を開いている間、大血管への損傷や裂傷を避けながら、心臓と大動脈を十分に暴露するよう注意した。手術用ハサミの使用を制限することで、主要な血管の偶発的なクリッピングを防ぎ、小さな切開部は心臓および大動脈の暴露を制御した。 DiI針を心臓の室に直接挿入するのではなく、大動脈に挿入すると、灌流の成功率も増加した。 axolotlは、マウスとは異なり、マウスよりも筋組織が著しく少ない1つの脳室のみを含む、3つの動脈を有する心臓を有する。これらの違いのために、針挿入の位置は、より安定した大動脈に移動しなければならなかった。大動脈は、27G針による穿刺に十分に大きく、運動が制限されているので、潅流針を挿入するのに最適な位置であると判断された。動きは最小限だった潅流針の偶発的な除去または滑りまたは大動脈のスルースルー穿刺を回避するために、心室を挿入点として使用する心臓灌流は、大動脈挿入点を有するものよりもはるかに低い成功率を有することが判明した。脈管構造の誤った穿刺は、しばしば、塞栓の形成または灌流の防止をもたらし、血管標識の成功率が非常に低い。灌流中に蝶の針を保持するためにクランプスタンドを使用することによって、我々はその動きを減少させ、したがって、成功した灌流の割合を増加させる。さらに、Axolotl組織の繊細さのために、以前に使用された手動灌流とは対照的に、マウスと比較した場合、蠕動灌流ポンプが必要であった。このポンプの使用は、薄い組織の誤った穿刺を最小限に抑えるために、軸索灌流に対するハンズフリーアプローチを可能にした。灌流は、スルー・スルー・パンク（punct through）を含む多くの追加の理由により不成功であった尿、凝固および塞栓症が含まれる。針が大動脈に挿入され、後壁を通して第2の穿刺が形成された場合、DiI溶液は、全身循環を通過するのではなく、胸腔内に直接流れる。さらに、いったん血液が脈管構造を出ると、すぐに血栓が形成され、灌流を妨げる可能性があった。凝血塊および気泡も脈管構造内に形成され、灌流の成功を妨げる塞栓を引き起こす可能性がある。最後に、このプロトコールは、哺乳動物のものとは著しく異なる、アキソオールオスモル濃度に適合するように調整された試薬を組み込んだ。このプロトコールの適応および軸索モデルに適合させるためになされた重要な変更は、再生中の組織の血管再生のプロセスを理解するのを助ける。
DiIは、色がピンクで、動物を灌流させ、明るい桃色の色合いを与えます。首尾よく灌流された軸索は、鮮明なピンク色になり、より強く染色されたように見える血管新生領域。緑色フィルターを用いた蛍光共焦点顕微鏡で観察した灌流動物は、赤橙色発光スペクトルで視覚化することができる。脈管構造は、非血管組織の偶発的なDiI染色を最小限にする、より薄い組織で最も視覚化された。 DiI灌流直後の4％パラホルムアルデヒド（PFA）による組織の灌流は、組織を固定するために行われなければならない。
DiI灌流は、アコロットのエンドポイント実験である。処置の間、動物の血液の全てが効果的に排液され、0.7xPBS、直後にDiI溶液、最後に4％PFAで置換される。これは、ガス交換の不可欠な行為に従事するアコノトルの能力を崩壊させ、体組織に酸素を供給する能力を失う。この終点の性質のために、各灌流は血管成長の単一の時点のみを捕捉し、動物は後でさらに灌流することができない。この時間制限のために血管形成の時間経過を記述するために複数の動物を使用しなければならない。
このDiIプロトコルおよびそれを改善するために適用された修飾を用いて、軸索の脈管構造をうまく標識し可視化することができる。 Axolotlは再生研究のための不可欠なモデル生物であるため、成功した灌流は、再生中の血管新生プロセスを調べる機会を開く。 axolotlは、新生動物であり、したがって成人期までに再生する顕著な能力を保持しているため、再生の研究のためのモデル生物である8 。しかし、再生組織の血管再生プロセスは十分に理解されていないため、DiI灌流のaxolotlシステムへの適応は、哺乳動物モデルでは不可能であった再生を理解する機会を提供する。 DiIを用いたアゴロットの灌流は、リバスの研究のための新しい技術であるしたがって、このプロトコールは、疾患の間の発生および血管新生の間の器官形成を理解するために、さらには再生の研究の間の重要なツールとして利用することができる。
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Disclosures
著者は何も開示することはない。
Acknowledgments
この研究は、Brigham＆Women's HospitalとMarch of Dimesの支援を受けました。著者はWhited Labのメンバー全員の支援と助言に感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Peristaltic Pump | Marshall Scientific | RD-RP1 | |
| Perfusion tubing | Excelon Lab & Vacuum Tubing | 436901705 | size S1A |
| 27g butterfly needle | EXELint Medical Products | 26709 | |
| NaCl | AmericanBio | 7647-14-5 | |
| KCl | AmericanBio | 7747-40-7 | |
| Na2HPO4 | AmericanBio | 7558-79-4 | |
| NaH2PO4 | AmericanBio | 10049-21-5 | |
| Distilled water | |||
| HCl | AmericanBio | 7647-01-0 | |
| Glucose | ThermoFischer | A2494001 | |
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Sigma Aldrich | 468495 | |
| Ethanol (100% vol/vol) | Sigma Aldrich | 64-17-5 | |
| Surgical foreceps | Medline | MDG0748741 | |
| Polystyrene foam frame | any polystyrene foam square with an axolotl-shaped cut out | ||
| Surgical scissors | Medline | DYND04025 | |
| Scalpel | Medline | MDS15210 | |
| Absorbent underpad | Avacare Medical | PKUFSx | |
| Paper towels | |||
| Standard disposable transfer pipette | Fisherbrand | 50216954 | |
| Clamp stand | Adafruit | 291 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma Aldrich | E10521 | Tricaine powder |
| Adult axolotl | |||
| MgSO4 | AmericanBio | 10034-99-8 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016-100G | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761-500G | |
| Plastic tanks | Varying size appropriate for the axolotl | ||
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 30525-89-4 | |
| Axolotl | |||
| Leica Microscope | Leica | M165 FC | |
| ET-CY3 Fluorescent Filter | Leica | M205FA/M165FC | |
| MS-222 |
References
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