Summary
En utilisant une technique lipidique lipophile de 1,1'-Dioctadecy-3,3,3 ', 3'-tétraméthylindocarbocyanine perchlorate (DiI), Ambystoma mexicanum peut subir une perfusion vasculaire pour permettre une visualisation facile du système vasculaire.
Abstract
Les techniques de perfusion ont été utilisées depuis des siècles pour visualiser la circulation des tissus. Axolotl (Ambystoma mexicanum) est une espèce de salamandre qui est apparue comme un modèle essentiel pour les études de régénération. On sait peu de choses sur la façon dont la revascularisation se produit dans le contexte de la régénération chez ces animaux. Ici, nous rapportons une méthode simple pour la visualisation de la vascularisation dans l'axolotl par perfusion de perchlorate de 1,1'-dioctadecy-3,3,3 ', 3'-tétraméthylindocarbocyanine (DiI). DiI est un colorant de carbocyanine lipophile qui s'insère instantanément dans la membrane plasmique des cellules endothéliales. La perfusion se fait à l'aide d'une pompe péristaltique telle que DiI entre dans la circulation à travers l'aorte. Pendant la perfusion, le colorant s'écoule à travers les vaisseaux sanguins de l'axolotl et incorpore dans la bicouche lipidique des cellules endothéliales vasculaires lors du contact. La procédure de perfusion prend environ une heure pour un axolotl de huit pouces. Immédiatement après la perfusion avecThiI, l'axolotl peut être visualisé avec un microscope fluorescent confocal. Le DiI émet de la lumière dans la gamme rouge-orange lorsqu'il est excité par un filtre fluorescent vert. Cette procédure de perfusion DiI peut être utilisée pour visualiser la structure vasculaire des axolotls ou pour démontrer des modèles de revascularisation dans les tissus régénérants.
Introduction
La visualisation de la vascularisation joue un rôle essentiel dans la compréhension de la structure et de la fonction des organismes dans de nombreuses espèces. À partir du 16 ème siècle avec Leonardo da Vinci, des modèles et des représentations graphiques de la circulation ont été étudiés 1 . En utilisant des cires et des moules en caoutchouc, les tissus ont été perfusés pour créer des modèles tridimensionnels de la vascularisation, ce qui a permis d'étudier l'organogenèse et la pathogenèse 1 , 2 . Les résines et les cires ont été colorées avec des colorants tels que l'encre Inde ou le rouge carmin pour permettre leur visualisation facile 1 , 2 . Cependant, ces techniques ont causé de nombreuses problèmes parce que leurs viscosités élevées ont empêché une perfusion complète du tissu d'intérêt 1 . Au fur et à mesure que le terrain devenait plus sophistiqué, l'utilisation de microscopes confocaux et électroniques entrainait, en déplaçant la technique de perfusion À l'écart des moules et aux perfusions liquides de la vascularisation, dont certains ont permis la perfusion et l'imagerie des vaisseaux sanguins sans détruire le tissu initial 3 . DiI, un colorant fluorescent de carbocyanine, est une telle tache qui permet la perfusion d'animaux sans endommager le tissu vasculaire.
Les colorants de carbocyanine sont des colorants lipophiles qui incorporent dans les membranes cellulaires lors du contact. Ces colorants permettent une coloration facile et instantanée des cellules endothéliales vasculaires, qui peuvent ensuite être visualisées sous un microscope confocal fluorescent. DiI se déplace par diffusion latérale dans la membrane lipidique des cellules, comme le montrent le marquage et le traçage des neurones 4 . Chimiquement, les deux chaînes alkyle de DiI donnent au colorant sa haute affinité pour les membranes cellulaires, tandis que deux anneaux conjugués d'un fluorochrome qui est responsable de l'émission d'une longueur d'onde rouge lorsqu'ils sont excités par des filtres fluorescents verts> 4. Le DII a été utilisé à bien des égards, y compris l'étiquetage réussi de la membrane plasmique et l'étiquetage antérogène et rétrograde dans les neurones 5 , 6 . DiI a déjà été utilisé dans les protocoles de perfusion lors de la visualisation du système vasculaire de souris 7 .
Axolotls ( Ambystoma mexicanum ) sont des salamandres qui vivent exclusivement dans des lacs saumâtres près de Mexico, au Mexique. Ces animaux sont devenus un modèle important pour la compréhension des processus régénératifs car ils peuvent régénérer les membres complets, la queue (y compris le cordon nerveux), les parties du cœur et d'autres organes internes et des parties de l'œil en tant qu'addents 8 , 9 . En outre, avec la récente application d'outils génétiques dans les axolotls, un aperçu sans précédent des molécules et des cellules conduisant ces processus est maintenant possible 8 . Le regene réussieLa ration d'un membre entier nécessite un processus de revascularisation étendu, qui peut jouer un rôle important dans la régénération au-delà des fonctions traditionnelles des vaisseaux sanguins en fournissant de l'oxygène et des nutriments. La compréhension de la revascularisation dans le contexte de la régénération tissulaire est impérative. Les vaisseaux sanguins d'Axolotl ont déjà été visualisés en utilisant l'encre de l'Inde, et pendant que les résultats étaient intrigants, ce processus n'a pas été revisité au cours des décennies suivantes 10 . Nous avons cherché à adapter un protocole de perfusion DiI développé pour être utilisé chez les mammifères pour permettre une perfusion et une visualisation complète de la vascularisation axolotl 7 . Ce protocole décrit les étapes de perfusion et de visualisation ultérieure de la circulation axolotl avec une technique de coloration DiI. Cette procédure permettra une visualisation précise des vaisseaux sanguins brevetés dans les tissus homéostatiques, ainsi que dans la régénération des tissus, et fournit une nouvelle méthode de visualisationN et analyse du processus de revascularisation dans l'axolotl.
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Protocol
Toute l'expérimentation axolotl a été effectuée conformément au Comité de soins et d'aide aux animaux institutionnels de Brigham and Women's Hospital (BWH).
1. Mettre en place l'expérience de perfusion
- Placez un axolotl adulte dans un récipient en plastique rempli de solution de tricaine 0,1% (MS222) pendant 15-20 min ou jusqu'à ce qu'il soit complètement anesthésié. Assurez-vous que le récipient est rempli d'une solution de tricaine suffisante pour que l'axolotl soit complètement immergé.
Remarque: Toutes les procédures doivent être effectuées conformément aux lignes directrices institutionnelles sur les soins des animaux. Chez BWH, un axolotl est considéré comme complètement anesthésié lorsqu'il échoue à un test de pincement de pied, ce qui signifie qu'il n'y a pas de mouvement réfléchi lorsque le pied est serré doucement.
Attention: Bien que la tricaine soit une anesthésie spécifiquement utilisée pour les organismes aquatiques, il faut éviter le contact direct avec la peau avec la solution tricaine. - Mettre en place la station de perfusion axolotl.
- Placer leAbsorbant sur une surface plate et plane avec le côté absorbant vers le haut.
- Couper un trou dans le cadre en mousse de polystyrène qui est la taille et la forme appropriées pour que l'axolotl anesthésié soit positionné en position couchée. Placez le cadre sur le tampon absorbant.
Remarque: Certaines serviettes en papier supplémentaires peuvent être placées immédiatement sous le cadre pour une absorbance supplémentaire. - Chargez la pompe péristaltique avec le tube de perfusion. Réglez la pompe à un débit de 0,7 ml / min, coulant dans le sens des aiguilles d'une montre.
- Effectuez la solution diluée avec 0,7 x PBS et 5% de glucose dans un mélange 1: 4.
- Mélanger 10 mL de solution de diluant avec 200 μL de la solution mère DiI dans un tube conique de 50 mL. Cap et mélange par inversion. Couvrir ce tube avec du papier d'aluminium pour protéger la solution de travail de l'exposition à la lumière.
Remarque: Les volumes doivent être modifiés en fonction de la taille de l'axolotl proportionnellement. Ces valeurs sont pour un axolotl d'environ 15 cm (longueur de queue à queue). UNELes nimaux de cette taille peuvent ne pas avoir atteint la maturité sexuelle complète, de sorte que le sexe animal peut ne pas être déterminé en ce moment. - Remplir un tube conique de 50 ml avec PBS 0,7x.
Remarque: PBS sera utilisé pour amorcer la boucle et l'exsanguination axolotl. - Fixez l'aiguille à papillon calibre 27 à l'extrémité de sortie du tube de perfusion. Pliez les ailes de papillon l'une sur l'autre et placez-les dans le support de serrage.
- Placez l'extrémité libre du tube de perfusion dans le tube conique de 50 ml rempli de PBS 0,7x et faites fonctionner la pompe à perfusion jusqu'à ce que le tube entier soit rempli de solution. Pause la pompe une fois que le tube entier est rempli de PBS.
Remarque: Assurez-vous que le tube est exempt de bulles d'air en tout temps, car cela entraînera des émboles d'air dans l'axolotl et empêchera la perfusion complète. - Placez une serviette en papier dans le moule en forme d'axolotl dans le cadre en mousse de polystyrène. À l'aide d'une pipette de transfert, imbibez la serviette avec une solution de tricaine.
Remarque: Couper un petit carré au milieu du câble de papierEl pour permettre le drainage des fluides pendant la procédure de perfusion. - Placez l'axolotl déconneillé anesthésié sur la serviette en papier à l'intérieur du cadre en mousse de polystyrène.
2. Ouverture du coffre Axolotl
- Utilisez des pinces chirurgicales pour pincer la peau le long de l'axe central de la poitrine de l'axolotl, juste en dessous de la ligne des épaules. Remonter.
- Utilisez un scalpel pour faire une petite incision où la peau a été tirée.
- Retirez un morceau de peau carré sur la poitrine afin de révéler deux plaques de cartilage.
- Retirez la peau pour ouvrir une fenêtre sur la cavité thoracique assez grande pour voir clairement le cœur et environ 5 mm de l'aorte se ramifiant du cœur.
- Détachez soigneusement le tissu conjonctif à l'aide de pinces ou de ciseaux fermés afin d'éviter de couper tous les vaisseaux sanguins majeurs.
- Soulevez chaque plaque de cartilage individuellement à l'aide de la pince et accusez-les.Avec les ciseaux chirurgicaux.
- Pincez soigneusement le péricarde avec la pince, tirez-le, et percez-le à l'aide des ciseaux chirurgicaux; Cette incision devrait être juste assez profonde pour percer le pericardium très mince et devrait être suffisamment grande pour permettre l'élimination du péricarde. Veillez à ne pas couper le cœur.
- Retirez délicatement le péricarde pour exposer le cœur et l'aorte.
Remarque: À l'aide d'une pipette de transfert, rincer périodiquement la cavité thoracique et les branchies avec une solution de tricaine pour garder la zone dégagée et garder l'axolotl anesthésié.
3. Perfusion de l'Axolotl
- Placez le support de serrage avec l'aiguille papillon chargée à côté du cadre en mousse de polystyrène, de sorte que le bras de la pince peut facilement être manipulé pour insérer l'aiguille dans l'aorte axolotl. Pointez la pointe de l'aiguille vers l'aspect rostral de l'animal pendant l'insertion et gardez l'aiguille parallèle à l'aorte pour éviter de la perforer à travers l'opCôté positif.
- Allumez la pompe péristaltique. 0.7x PBS devrait continuer à circuler à travers les tubes.
- Insérez l'aiguille dans l'aorte.
- Faites glisser la pince sous l'arc aortique et tirez légèrement pour permettre un accès facile.
- Manœuvrer la combinaison aiguille-serre telle que l'aiguille s'étend sur la longueur de l'aorte, en pointant vers la tête. Insérez l'aiguille tout en utilisant la pince pour le soutien derrière l'aorte.
Remarque: L'aiguille doit être insérée suffisamment profondément dans l'aorte pour éviter qu'elle ne glisse pendant la perfusion. Cela peut être d'environ 5 mm pour un axolotl de 15 cm. Assurez-vous que l'aiguille est parfaitement adaptée à l'aorte pour éviter une ponction complète du vaisseau. Les piqûres traversantes peuvent provoquer une hémorragie massive et diminuer les taux de réussite de la perfusion. L'insertion réussie peut être confirmée par l'agrandissement visible des oreillers du cœur.
- Détermine rapidement un atrium avec la sciSsors et permettre le drainage du sang.
- Rincer avec une solution de tricaine pour prévenir l'accumulation de caillots et la formation de caillots dans la cavité thoracique.
- Perfuser l'axolotl avec environ 20-30 ml de PBS. L'animal doit passer d'un rose clair à un blanc dans une perfusion réussie.
- Pause la pompe péristaltique et déplacez l'extrémité libre du tube dans le tube de 15 ml de la solution DiI. Redémarrez la pompe, veillez à ne pas créer de bulles d'air dans le tube.
- Perfuser l'axolotl avec l'ensemble du stock de travail de DiI.
Remarque: Dans une perfusion réussie, l'axolotl avec une couleur de changement au rose clair du DiI. Ce sera plus visible dans les branchies. - Pause la pompe après la perfusion avec DiI est terminée et placez l'extrémité libre du tube dans une solution à 4% de Paraformaldéhyde (PFA) pour réparer le tissu. Redémarrez la pompe et perfusez au moins 10 mL de PFA.
Attention: le PFA est toxique et devrait être manipulé et dispoDe manière appropriée. Des gants et des lunettes de sécurité devraient être portés, et des solutions devraient être faites à l'intérieur d'une hotte aspirante. La perfusion de l'axolotl avec PFA pour réparer le tissu entraîne la mort de l'animal.
4. Fin de la préparation de la perfusion et de la visualisation
- Arrêtez la pompe péristaltique et retirez l'aiguille de l'aorte axolotl.
- Placez l'axolotl sur une plaque en plastique.
Remarque: l'utilisation d'une moitié d'une grande boîte à pétri fonctionne bien et permet de verser une petite quantité de Tricaine ou PBS sur l'axolotl pour garder sa peau mouillée et améliorer la qualité de la visualisation. - Éliminer tous les matériaux utilisés dans les poubelles appropriées. Nettoyer les outils chirurgicaux avec de l'éthanol à 70%, désinfecter à l'aide d'un stérilisateur à perles de verre entre les animaux et stériliser en autoclave suivant la procédure. Rincez les tubes avec la solution PBS, puis évacuez, séchez complètement, et rangez-les pour une utilisation ultérieure.
5. Visualisation de l'Axolotl Perfused
Remarque: Pour obtenir une image de haute qualité, les paramètres suivants peuvent être utilisés: exposition pour 1.1 s, gain de 1x, saturation de 1.0, amplification de 2X.
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Representative Results
Avec la coloration DiI, le système vasculaire de l'axolotl peut être facilement visualisé. Les vaisseaux sanguins des animaux perfusés avec le colorant lipophile sont immédiatement visibles sous un microscope confocal fluorescent. La figure 1 .1-1.5 est une représentation schématique du protocole de perfusion. Après perfusion avec le colorant rose vif, un axolotl perfusion réussie apparaîtra en rose. À l'aide d'un filtre fluorescent vert sur un microscope confocal, une émission rouge du réseau vasculaire apparaîtra. La coloration DiI se produit dans tous les tissus corporels lorsque la perfusion réussit, y compris la queue, les membres, les branchies et les yeux ( Figure 2A , Figure 2B , Figure 2C , Figure 2D , rétrospectivement). Les perfusions infructueuses entraînent un manque de vascularisation colorée au rouge ou une coloration inégale des vaisseaux.
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Figure 1: schéma du protocole de perfusion. Les axolotls perfusés avec succès avec le colorant lipophile, DiI, démontrent une coloration complète de la vascularisation lors de l'imagerie. 1: Axolotl supine supine avant l'expérience de perfusion. 2: Ouverture de la poitrine de l'axolotl. 2: Axolotl avec une cavité de poitrine ouverte. 3: Insertion de l'aiguille papillon 27 G dans l'aorte de l'axolotl. 4: Les tubes devraient d'abord contenir 0,7x PBS, puis la solution de travail DiI et enfin 4% PFA. 5: les axolotls complètement perfusés apparaissent en rose. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: Images d'un Axolo complètement PerfusedTl. Les images de la vascularisation axolotl ont été prises en utilisant un microscope confocal fluorescent après une perfusion réussie avec la tache DiI. 2A: queue. 2B: Pied. 2C: Gills. 2D: Eye. L'imagerie se fait à l'aide d'un microscope confocal avec un cube filtrant d'émission fluorescente vert. L'agrandissement pour les images A, B, C et D est respectivement de 1.74X, 2.16X, 1.18X et 5.69X. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
La visualisation du système vasculaire de l'axolotl peut être réalisée avec succès par perfusion avec le colorant carbocyanine lipophile, DiI. Dans cette étude, nous décrivons un nouveau protocole pour la perfusion de l'axolotl avec DiI à l'aide d'une pompe péristaltique. Nous montrons également la visualisation ultérieure de la vascularisation axolotl à l'aide d'un microscope confocal fluorescent. Ce protocole était une adaptation du protocole de perfusion DiI de rongeurs vu dans Li et al. 7 , cependant les différences majeures entre le rongeur et l'axolotl nécessitaient une révision du protocole pour s'adapter au modèle axolotl.
Cette étude traite d'une méthode de perfusion DiI de l'axolotl afin de visualiser avec succès le système vasculaire. Différences dans l'anatomie et la physiologie entre la salamandre et les modifications de la demande des rongeurs dans les principaux aspects de la perfusion, y compris l'emplacement de l'insertion de l'aiguille, la méthode de perfusion et les réactifs utilisés. Afin deUne perfusion réussie, nous avons limité les dommages causés à la vascularisation de l'axolotl. En ouvrant la cavité thoracique, on a soigneusement exposé le coeur et l'aorte tout en évitant tout dommage ou lacération dans les vaisseaux sanguins majeurs. Limiter l'utilisation des ciseaux chirurgicaux a empêché l'écrêtage accidentel des gros vaisseaux tandis que de petites incisions ont maintenu le contrôle de l'exposition du cœur et de l'aorte. Les taux de réussite des perfusions ont également augmenté lorsque l'aiguille DiI a été insérée à travers l'aorte, plutôt que directement dans les chambres du cœur. L'axolotl, contrairement à la souris, a un cœur à trois chambres, contenant seulement un ventricule avec une musculature significativement moins grande que celle de la souris. En raison de ces différences, l'emplacement de l'insertion d'aiguille devait être déplacé vers l'aorte plus stable. L'aorte était déterminée à être la position optimale pour l'insertion de l'aiguille de perfusion car elle était suffisamment grande pour la crevaison par une aiguille de 27 G et a un mouvement limité. Le mouvement était minimeAfin d'éviter l'enlèvement accidentel ou le glissement de l'aiguille de perfusion ou la ponction par passage de l'aorte. Les perfusions cardiaques utilisant le ventricule comme point d'insertion ont prouvé un taux de succès beaucoup plus faible que ceux avec un point d'insertion aortique. La ponction erronée du système vasculaire a souvent entraîné la formation d'emboles ou une perfusion empêchée, ce qui a donné lieu à de très faibles taux d'étiquetage vasculaire réussi. En utilisant un support de serrage pour maintenir l'aiguille papillon pendant la perfusion, nous avons diminué son mouvement, ce qui augmente le taux de perfusion réussie. En outre, en raison de la délicatesse du tissu axolotl, par rapport à la souris, une pompe de perfusion péristaltique était nécessaire, par opposition à la perfusion manuelle préalablement utilisée. L'utilisation de cette pompe a permis une approche mains-libres de la perfusion d'axolotl pour minimiser la ponction erronée des tissus minces. Les perfusions ont été infructueuses pour de nombreuses autres raisons, y compris le coup de grâceUre, la coagulation et l'embolie. Dans le cas où l'aiguille a été insérée dans l'aorte et qu'une seconde crevaison a été créée à travers la paroi postérieure, la solution DiI s'écoulerait directement dans la cavité thoracique plutôt que de traverser la circulation systémique. En outre, une fois que le sang a quitté le système vasculaire, il a rapidement formé un caillot de sang qui pourrait entraver la perfusion. Des caillots et des bulles d'air pourraient également se former dans le système vasculaire, provoquant des embolies qui empêchent une perfusion réussie. Enfin, ce protocole a incorporé des réactifs ajustés pour s'adapter à l'osmolalité axolotl, qui diffère significativement de celle du mammifère. L'adaptation de ce protocole et les changements importants apportés au modèle axolotl aideront à comprendre le processus de revascularisation des tissus pendant la régénération.
DiI, qui est de couleur rose, perturbera l'animal et lui donnera une teinte rose vif. Les axolotls perfusés avec succés sont devenus roses à l'oeil nu,Les régions vascularisées apparaissent plus intensément colorées. Les animaux perfusés regardés avec un microscope confocal fluorescent à l'aide d'un filtre vert peuvent être visualisés dans le spectre d'émission rouge-orange. La vascularisation a été mieux visualisée dans des tissus plus minces qui ont réduit au minimum la coloration accidentelle de tissus non vasculaires. La perfusion du tissu avec 4% de paraformaldéhyde (PFA) immédiatement après la perfusion DiI doit être faite pour corriger le tissu.
Les perfusions DiI sont des expériences d'extrémité pour l'axolotl. Au cours de la procédure, tout le sang de l'animal est efficacement évacué et remplacé par PBS 0,7x, suivi immédiatement par la solution DiI et enfin 4% PFA. Cela perturbe la capacité de l'axolotl à s'engager dans l'acte vital de l'échange de gaz et il perd la capacité d'oxygéner ses tissus corporels. En raison de cette nature de point final, chaque perfusion ne capture qu'un seul point temporel de croissance vasculaire, et l'animal ne peut plus être perfusé ultérieurement. En raison de ce temps-limiIl faut utiliser de multiples animaux pour décrire une évolution temporelle du développement vasculaire.
Ce protocole DiI et les modifications appliquées pour l'améliorer peuvent être utilisés pour étiqueter et visualiser avec succès le système vasculaire de l'axolotl. Puisque l'axolotl est un organisme modèle essentiel pour l'étude de la régénération, les perfusions réussies ouvrent des occasions d'interroger le processus d'angiogenèse pendant la régénération. L'axolotl est un organisme modèle pour l'étude de la régénération car il s'agit d'un animal néotenous et conserve donc une capacité remarquable à se régénérer tout au long de l'âge adulte 8 . Le processus de revascularisation de la régénération des tissus, cependant, n'est pas bien compris, donc l'adaptation de la perfusion DiI au système axolotl présente des occasions de comprendre la régénération qui n'était pas disponible avec le modèle mammalien. La perfusion de l'axolotl à l'aide de DiI est une technique nouvelle pour l'étude des revasCularisation du tissu régénérant dans ce modèle animal, ce protocole peut donc être utilisé plus avant pour comprendre l'organogenèse pendant le développement et l'angiogenèse pendant la maladie et être utilisé comme un outil important lors de l'étude de la régénération.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Cette recherche a été soutenue par le Brigham & Women's Hospital et March of Dimes. Les auteurs souhaitent remercier tous les membres du Whited Lab pour leur soutien et leurs conseils.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Peristaltic Pump | Marshall Scientific | RD-RP1 | |
| Perfusion tubing | Excelon Lab & Vacuum Tubing | 436901705 | size S1A |
| 27g butterfly needle | EXELint Medical Products | 26709 | |
| NaCl | AmericanBio | 7647-14-5 | |
| KCl | AmericanBio | 7747-40-7 | |
| Na2HPO4 | AmericanBio | 7558-79-4 | |
| NaH2PO4 | AmericanBio | 10049-21-5 | |
| Distilled water | |||
| HCl | AmericanBio | 7647-01-0 | |
| Glucose | ThermoFischer | A2494001 | |
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Sigma Aldrich | 468495 | |
| Ethanol (100% vol/vol) | Sigma Aldrich | 64-17-5 | |
| Surgical foreceps | Medline | MDG0748741 | |
| Polystyrene foam frame | any polystyrene foam square with an axolotl-shaped cut out | ||
| Surgical scissors | Medline | DYND04025 | |
| Scalpel | Medline | MDS15210 | |
| Absorbent underpad | Avacare Medical | PKUFSx | |
| Paper towels | |||
| Standard disposable transfer pipette | Fisherbrand | 50216954 | |
| Clamp stand | Adafruit | 291 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma Aldrich | E10521 | Tricaine powder |
| Adult axolotl | |||
| MgSO4 | AmericanBio | 10034-99-8 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016-100G | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761-500G | |
| Plastic tanks | Varying size appropriate for the axolotl | ||
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 30525-89-4 | |
| Axolotl | |||
| Leica Microscope | Leica | M165 FC | |
| ET-CY3 Fluorescent Filter | Leica | M205FA/M165FC | |
| MS-222 |
References
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