Summary
Usando una técnica lipofílica de tinción de perclorato de 1,1'-Dioctadecy-3,3,3 ', 3'-tetrametilindocarbocianina (DiI), Ambystoma mexicanum puede someterse a perfusión vascular para permitir una fácil visualización de la vasculatura.
Abstract
Las técnicas de perfusión se han utilizado durante siglos para visualizar la circulación de los tejidos. Axolotl (Ambystoma mexicanum) es una especie de salamandra que ha surgido como un modelo esencial para los estudios de regeneración. Poco se sabe acerca de cómo se produce la revascularización en el contexto de la regeneración en estos animales. Aquí presentamos un método simple para la visualización de la vasculatura en axolotl vía perfusión de 1,1'-Dioctadecy-3,3,3 ', 3'-tetrametilindocarbocianina perclorato (DiI). DiI es un colorante de carbocianina lipofílico que se inserta en la membrana plasmática de las células endoteliales instantáneamente. La perfusión se realiza usando una bomba peristáltica de tal manera que DiI entra en la circulación a través de la aorta. Durante la perfusión, el colorante fluye a través de los vasos sanguíneos del axolotl e incorpora en la bicapa lipídica de las células endoteliales vasculares al contacto. El procedimiento de perfusión dura aproximadamente una hora para un axolotl de ocho pulgadas. Inmediatamente después de la perfusión,Th DiI, el axolotl se puede visualizar con un microscopio confocal fluorescente. El DiI emite luz en el rango naranja-rojo cuando se excita con un filtro fluorescente verde. Este procedimiento de perfusión DiI puede usarse para visualizar la estructura vascular de los axolotes o para demostrar patrones de revascularización en tejidos regeneradores.
Introduction
La visualización de la vasculatura desempeña un papel vital en la comprensión de la estructura y función de los organismos a través de muchas especies. A partir del siglo XVI con Leonardo da Vinci, se han estudiado modelos y representaciones gráficas de la circulación 1 . Usando ceras y moldes de caucho, los tejidos fueron perfundidos para crear modelos tridimensionales de la vasculatura, lo que permitió el estudio de la organogénesis y la patogénesis [ 1 , 2] . Las resinas y las ceras se colorearon con tintes tales como tinta India o rojo carmín para permitir su fácil visualización 1 , 2 . Sin embargo, estas técnicas causaron muchos problemas debido a que sus altas viscosidades impidieron la perfusión total del tejido de interés 1 . A medida que el campo se hizo más sofisticado, el uso de microscopios confocales y electrónicos entró en juego, moviendo la técnica de perfusión Lejos de los moldes y hacia perfusiones líquidas de la vasculatura, algunas de las cuales permitieron la perfusión y la imagen de los vasos sanguíneos sin destruir el tejido inicial 3 . DiI, un colorante de carbocianina fluorescente, es una de tales manchas que permite la perfusión de animales sin dañar el tejido vascular.
Los colorantes de carbocianina son tintes lipófilos que se incorporan en las membranas celulares al contacto. Estos colorantes permiten una tinción fácil e instantánea de las células endoteliales vasculares, que pueden ser vistas después bajo un microscopio confocal fluorescente. DiI se mueve a través de la difusión lateral en la membrana lipídica de las células, como se muestra en el etiquetado y rastreo de las neuronas [ 4] . Quımicamente, las dos cadenas alquılicas de DiI dan al tinte su alta afinidad por las membranas celulares, mientras que dos anillos conjugados de un fluorocromo que es responsable de emitir una longitud de onda roja cuando son excitados por filtros de luz fluorescente verde> 4. DiI se ha utilizado en muchas capacidades, incluyendo el etiquetado exitoso de la membrana plasmática y marcaje anterógrado y retrógrado en las neuronas [ 5 , 6] . DiI se ha utilizado previamente en los protocolos de perfusión, mientras que la visualización de la vasculatura de ratones [ 7] .
Axolotls ( Ambystoma mexicanum ) son salamandras que viven exclusivamente en lagos salobres cerca de la Ciudad de México, México. Estos animales se han convertido en un modelo importante para la comprensión de los procesos regenerativos, ya que pueden regenerar los miembros completos, la cola (incluyendo el cordón nervioso), las porciones del corazón y otros órganos internos y las porciones del ojo como adultos 8 , 9 . Además, con la reciente aplicación de herramientas genéticas en axolotls, una visión sin precedentes en las moléculas y las células que conducen estos procesos es ahora posible 8 . El exitoso regeneRación de una extremidad entera requiere un proceso extensivo de la revascularización, que puede desempeñar un papel significativo en la regeneración más allá de las funciones tradicionales de los vasos sanguíneos en proporcionar el oxígeno y los alimentos. Entender la revascularización en el contexto de la regeneración tisular es imperativo. Axolotl vasos sanguíneos han sido previamente visualizados con India Ink, y si bien los resultados fueron intrigantes, este proceso no ha sido revisado en las décadas posteriores [ 10] . Se intentó adaptar un protocolo de perfusión DII desarrollado para su uso en mamíferos para permitir una completa perfusión y visualización de la axolotl vascular 7 . Este protocolo describe las medidas tomadas para perfusar con éxito y posteriormente visualizar la circulación del axolotl con una técnica de tinción DII. Este procedimiento permitirá una visualización precisa de los vasos sanguíneos patentes en tejidos homeostáticos, así como en tejidos regeneradores, y proporciona un nuevo método para la visualizaciónN y análisis del proceso de revascularización en axolotl.
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Protocol
Todos axolotl experimentación se realizó de acuerdo con Brigham y Women's Hospital (BWH) Institucional Cuidado de Animales y el Comité de Uso.
1. Configure Experimento de Perfusión
- Coloque un axolotl adulto en un recipiente de plástico lleno de solución de tricaína al 0,1% (MS222) durante 15-20 min o hasta anestesiar completamente. Asegúrese de que el recipiente esté lleno de suficiente solución de tricaína de modo que el axolotl esté completamente sumergido.
Nota: Todos los procedimientos deben realizarse de acuerdo con las pautas institucionales de cuidado de los animales. En BWH, un axolotl se considera anestesiado completamente cuando falla una prueba de la pinzadura del pie, significando allí no es movimiento reflexivo cuando el pie es apretado suavemente.
Precaución: Aunque tricaine es un anestésico específicamente utilizado para organismos acuáticos, se debe evitar el contacto directo de la piel con la solución de tricaína. - Establecer la estación de perfusión axolotl.
- Colocar elAbsorbente sobre una superficie plana y nivelada con el lado absorbente hacia arriba.
- Cortar un agujero en el marco de espuma de poliestireno que es el tamaño y la forma adecuada para el axolotl anestesiado para establecer en posición supina. Coloque el marco sobre la almohadilla absorbente.
Nota: Algunas toallas de papel adicionales se pueden colocar inmediatamente debajo del marco para una absorción adicional. - Cargue la bomba peristáltica con el tubo de perfusión. Ajuste la bomba a un caudal de 0,7 ml / min, fluyendo en el sentido de las agujas del reloj.
- Hacer la solución diluida con 0,7x PBS y 5% de glucosa en una mezcla 1: 4.
- Mezclar 10 ml de solución diluyente con 200 μl de la solución madre DiI en un tubo cónico de 50 ml. Tape y mezcle por inversión. Cubra este tubo con papel de aluminio para proteger la solución de trabajo de la exposición a la luz.
Nota: Los volúmenes deben cambiarse proporcionalmente según el tamaño del axolotl. Estos valores son para un axolotl de aproximadamente 15 cm (longitud de hocico a cola). UNLos nimales de este tamaño pueden no haber alcanzado la madurez sexual completa, por lo que el sexo animal no se puede determinar en este momento. - Llenar un tubo cónico de 50 ml con PBS 0,7x.
Nota: Se utilizará PBS para cebar el lazo y la exsanguinación axolotl. - Conecte la aguja de mariposa de calibre 27 al extremo de salida de la tubería de perfusión. Doble las alas de la mariposa sobre el otro y coloque en el soporte de la abrazadera.
- Coloque el extremo libre de la tubería de perfusión en el tubo cónico de 50 ml lleno de PBS 0,7x y haga funcionar la bomba de perfusión hasta que se llene toda la tubería con solución. Detenga la bomba una vez que el tubo completo esté lleno de PBS.
Nota: Asegúrese de que el tubo esté libre de burbujas de aire en todo momento, ya que causarán embolias aéreas en el axolotl y evitarán la perfusión completa. - Coloque una toalla de papel en el molde en forma de axolotl en el marco de espuma de poliestireno. Utilizando una pipeta de transferencia, remoje la toalla con solución de tricaína.
Nota: Cortar un pequeño cuadrado en el medio del remolque de papelEl para permitir el drenaje de fluidos durante el procedimiento de perfusión. - Coloque el axolotl supinado anestesiado sobre la toalla de papel dentro del marco de espuma de poliestireno.
2. Apertura del tórax Axolotl
- Utilice una pinza quirúrgica para pellizcar la piel a lo largo del eje central del tórax del axolotl, justo debajo de la línea de los hombros. Levantar.
- Utilice un bisturí para hacer una pequeña incisión donde se ha retirado la piel.
- Quitar un parche cuadrado de piel sobre el pecho para revelar dos placas de cartílago.
- Quitar la piel para abrir una ventana sobre la cavidad torácica lo suficientemente grande como para ver claramente el corazón y aproximadamente 5 mm de la aorta se ramifica fuera del corazón.
- Cuidadosamente romper el tejido conectivo con fórceps o las tijeras cerradas con el fin de evitar el corte de los vasos sanguíneos principales.
- Levante cada placa de cartílago individualmente usando la pinza y sáquelaCon las tijeras quirúrgicas.
- Cuidadosamente pellizque el pericardio con la pinza, tire hacia arriba y pinche con las tijeras quirúrgicas; Esta incisión debe ser lo suficientemente profunda como para perforar el pericardio muy delgado y debe ser lo suficientemente grande para permitir la eliminación del pericardio. Tenga cuidado de no cortar el corazón.
- Delicadamente quitar el pericardio para exponer el corazón y la aorta.
Nota: Utilizando una pipeta de transferencia, enjuague periódicamente la cavidad torácica y las branquias con solución de tricaína para mantener la zona libre y mantener el axolotl anestesiado.
3. Perfusión del Axolotl
- Coloque el soporte de la abrazadera con la aguja de mariposa cargada junto al bastidor de espuma de poliestireno, de manera que el brazo de la abrazadera pueda manipularse fácilmente para insertar la aguja en la aorta axolotl. Apunte la punta de la aguja hacia el aspecto rostral del animal durante la inserción y mantenga la aguja paralela a la aorta para evitar perforarla a través de la operaciónLado positivo
- Encienda la bomba peristáltica. 0.7x PBS debe continuar fluyendo a través de la tubería.
- Inserte la aguja en la aorta.
- Deslice la pinza bajo el arco aórtico y levántela ligeramente para permitir un fácil acceso.
- Maniobrar la combinación de aguja-abrazadera de modo que la aguja se extienda a lo largo de la aorta, apuntando hacia la cabeza. Inserte la aguja mientras usa el fórceps para apoyo detrás de la aorta.
Nota: La aguja debe insertarse lo suficientemente profundo en la aorta para asegurar que no se resbale durante la perfusión. Esto puede ser de aproximadamente 5 mm para un axolotl de 15 cm. Asegúrese de que la aguja esté perfectamente alineada con la aorta para evitar una punción completa del vaso. Los pinchazos directos pueden causar hemorragia masiva y disminuir las tasas de éxito de la perfusión. La inserción exitosa puede ser confirmada por la ampliación visible de las aurículas del corazón.
- Rápidamente lacerar un atrio con el sciSsors y permitir que la sangre se drene.
- Enjuague con solución de tricaína para prevenir la acumulación de sangre y la formación de coágulos en la cavidad torácica.
- Perfundir el axolotl con aproximadamente 20-30 mL de PBS. El animal debe cambiar de color rosa claro a blanco en una perfusión exitosa.
- Haga una pausa en la bomba peristáltica y mueva el extremo libre del tubo en el tubo de 15 ml de solución DiI. Reinicie la bomba, tenga cuidado de no crear burbujas de aire en el tubo.
- Perfundir el axolotl con todo el stock de trabajo de DiI.
Nota: En una perfusión exitosa, el axolotl con cambio de color al rosa brillante del DiI. Esto será más notable en las branquias. - Pausa la bomba después de la perfusión con DiI es completa y coloque el extremo libre de la tubería en 4% paraformaldehído (PFA) solución para fijar el tejido. Reinicie la bomba y perfuse al menos 10 ml de PFA.
Precaución: PFA es tóxico y debe ser manipulado y dispoSed de manera apropiada. Se deben usar guantes y gafas de seguridad, y las soluciones deben hacerse dentro de una campana extractora. La perfusión del axolotl con PFA para fijar el tejido resulta en la muerte del animal.
4. Finalización de la perfusión y preparación de visualización
- Detenga la bomba peristáltica y retire la aguja de la aorta axolotl.
- Coloque el axolotl en una placa de plástico.
Nota: El uso de una mitad de una placa de Petri grande funciona bien y permite verter una pequeña cantidad de Tricaine o PBS en el axolotl para mantener su piel húmeda y mejorar la calidad de visualización. - Deseche todos los materiales usados en los contenedores de desechos apropiados. Limpiar las herramientas quirúrgicas con etanol al 70%, desinfectar con un esterilizador de vidrio entre animales y esterilizar en autoclave siguiendo el procedimiento. Enjuague el tubo con la solución de PBS y luego drene, seque completamente y guárdelo para su uso posterior.
5. Visualización del Axolotl Perfecto
- Coloque el axolotl bajo un microscopio confocal fluorescente.
- Apague las luces, ya que la visualización de los vasos teñidos por DiI es impedida por la luz.
- Utilice un cubo de filtro de emisión de fluorescencia verde ( por ejemplo, ET-CY3) con el microscopio confocal para visualizar la vasculatura del axolotl. Utilice una luz de excitación de 545 nm de longitud de onda.
Nota: Para obtener una imagen de alta calidad, se pueden utilizar los siguientes parámetros: exposición de 1,1 s, ganancia de 1x, saturación de 1,0, aumento de 2X.
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Representative Results
Con la tinción DiI, la vasculatura del axolotl se puede visualizar fácilmente. Los vasos sanguíneos de los animales perfundidos con el colorante lipófilo son inmediatamente visibles bajo un microscopio fluorescente confocal. La figura 1 .1-1.5 es una representación esquemática del protocolo de perfusión. Después de la perfusión con el colorante rosa brillante, un axolotl perfectamente perfundido aparecerá rosa. Usando un filtro fluorescente verde en un microscopio confocal aparecerá una emisión roja de la red vascular. La tinción DiI ocurre en todos los tejidos corporales cuando la perfusión es exitosa, incluyendo la cola, las extremidades, las branquias y los ojos ( Figura 2A , Figura 2B , Figura 2D , repectivamente). Las perfusiones sin éxito producen una falta de vasos sanguíneos manchados de rojo o una tinción irregular de los vasos.
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Figura 1: Esquema del protocolo de perfusión. Los axolotl perfundidos con éxito con el colorante lipofílico, DiI, demuestran una tinción completa de la vasculatura tras la formación de imágenes. 1: Axolotl supino total antes del experimento de perfusión. 2: Apertura del cofre del axolotl. 2: Axolotl con una cavidad torácica abierta. 3: Inserción de la aguja de la mariposa 27 G en la aorta del axolotl. 4: La tubería debe contener primero PBS 0,7x, luego la solución de trabajo DiI, y finalmente PFA al 4%. 5: Axolotls completamente perfundidos aparecen rosa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Imágenes de un Axolo completamente perfundidoTl Las imágenes de la vasculatura axolotl se tomaron usando un microscopio confocal fluorescente después de una perfusión exitosa con la tinción DiI. 2A: Cola. 2B: Pie. 2C: Branquias. 2D: Ojo. La imagen se realiza utilizando un microscopio confocal con un cubo de filtro de emisión fluorescente verde. La ampliación para las imágenes A, B, C y D son 1.74X, 2.16X, 1.18X y 5.69X, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La visualización de la vasculatura del axolotl puede lograrse con éxito mediante la perfusión con el colorante de carbocianina lipófilo, DiI. En este estudio se describe un nuevo protocolo para la perfusión del axolotl con DiI utilizando una bomba peristáltica. También se muestra la posterior visualización de la vasculatura axolotl utilizando un microscopio confocal fluorescente. Este protocolo fue una adaptación del protocolo de perfusión DiI de roedor observado en Li et al. 7 , sin embargo diferencias importantes entre el roedor y el axolotl requirieron una revisión del protocolo para ajustarse al modelo axolotl.
Este estudio discute un método de perfusión DiI del axolotl con el fin de visualizar con éxito la vasculatura. Las diferencias en la anatomía y la fisiología entre la salamandra y el roedor requieren alteraciones en los aspectos principales de la perfusión, incluyendo la localización de la inserción de la aguja, el método de perfusión y los reactivos utilizados. Con el fin deCreemos una perfusión exitosa, limitamos el daño hecho a la vasculatura del axolotl. Al abrir la cavidad torácica, se tuvo cuidado de exponer completamente el corazón y la aorta evitando cualquier daño o laceraciones a los vasos sanguíneos principales. La limitación del uso de las tijeras quirúrgicas evitó el recorte accidental de los vasos mayores mientras que las incisiones pequeñas mantuvieron el control sobre la exposición del corazón y la aorta. Las tasas de éxito de las perfusiones también aumentaron cuando la aguja DII se insertó a través de la aorta, en lugar de directamente en las cámaras del corazón. El axolotl, a diferencia del ratón, tiene un corazón de tres cámaras, que contiene sólo un ventrículo con una musculatura significativamente menor que la del ratón. Debido a estas diferencias, la localización de la inserción de la aguja tuvo que ser movida a la aorta más estable. Se determinó que la aorta era la localización óptima para la inserción de la aguja de perfusión, ya que es lo suficientemente grande para la punción por una aguja de 27 G y tiene movimiento limitado. El movimiento fue mínimoCon el fin de evitar el retiro accidental o el deslizamiento de la aguja de perfusión o la perforación pasante de la aorta. Las perfusiones cardíacas que usaban el ventrículo como punto de inserción demostraron tener una tasa de éxito mucho menor que aquellas con un punto de inserción aórtico. La punción errónea de la vasculatura a menudo da lugar a la formación de embolia oa la perfusión prevenida, dando como resultado tasas muy bajas de marcaje vascular exitoso. Utilizando un soporte de sujeción para sujetar la aguja de la mariposa durante la perfusión, hemos disminuido su movimiento, aumentando así la tasa de perfusiones exitosas. Además, debido a la delicadeza del tejido axolotl, en comparación con el ratón, era necesaria una bomba de perfusión peristáltica, en contraposición a la perfusión manual previamente utilizada. El uso de esta bomba permitió una aproximación manos libres a la perfusión de axolotl para minimizar la punción equivocada de los tejidos finos. Perfusiones no tuvieron éxito por muchas razones adicionales, incluyendo a través de y-a través de punctUre, la coagulación y la embolia. En el caso de que la aguja se inserta en la aorta y se crea una segunda punción a través de la pared posterior, la solución DiI fluiría directamente a la cavidad torácica en lugar de pasar a través de la circulación sistémica. Además, una vez que la sangre salió de la vasculatura, rápidamente formó un coágulo de sangre que podría impedir la perfusión. También podrían formarse coágulos y burbujas de aire en la vasculatura, causando embolias que impiden una perfusión exitosa. Por último, este protocolo incorporó reactivos ajustados para ajustarse a la osmolalidad axolotl, que difiere significativamente de la del mamífero. La adaptación de este protocolo y los cambios significativos realizados para ajustarse al modelo axolotl ayudarán a comprender el proceso de revascularización de los tejidos durante la regeneración.
DiI, que es de color rosa, perfundirá el animal y le dará un color rosa brillante. Los axolotes perfectamente perfundidos se volvieron de color rosa brillante a simple vista,Regiones vascularizadas que aparecen más intensamente teñidas. Los animales perfundidos vistos con un microscopio confocal fluorescente usando un filtro verde se pueden visualizar en el espectro de emisión rojo-anaranjado. La vasculatura se visualizó mejor en tejidos más delgados que minimizaron la tinción accidental de DI de tejidos no vasculares. Perfusión del tejido con 4% de paraformaldehído (PFA) inmediatamente después de la perfusión DII debe hacerse para fijar el tejido.
Las perfusiones DiI son experimentos de punto final para el axolotl. Durante el procedimiento, toda la sangre del animal se drena eficazmente y se reemplaza con PBS 0,7x, seguida inmediatamente por solución DiI, y finalmente PFA al 4%. Esto interrumpe la capacidad del axolotl para participar en el acto vital del intercambio de gas y pierde la capacidad de oxigenar sus tejidos del cuerpo. Debido a esta naturaleza de punto final, cada perfusión capta solamente un único punto de tiempo de crecimiento vascular, y el animal no puede ser perfundido más adelante en un momento posterior. Debido a este tiempo-limiTante, se deben utilizar múltiples animales para describir un curso del tiempo de desarrollo vascular.
Este protocolo DiI, y las modificaciones aplicadas para mejorarlo, pueden usarse para etiquetar y visualizar con éxito la vasculatura del axolotl. Dado que el axolotl es un organismo modelo esencial para el estudio de la regeneración, las perfusiones exitosas abren oportunidades para interrogar el proceso de angiogénesis durante la regeneración. El axolotl es un organismo modelo para el estudio de la regeneración porque es un animal neotenous y por lo tanto conserva una capacidad notable de regenerar a través de la edad adulta 8 . Sin embargo, el proceso de revascularización de los tejidos regeneradores no es bien comprendido, por lo que la adaptación de la perfusión DiI al sistema axolotl presenta oportunidades para entender la regeneración que no estaban disponibles con el modelo de mamífero. La perfusión del axolotl usando DiI es una técnica novedosa para el estudio de revasCularización del tejido regenerador en este modelo animal, por lo tanto, este protocolo puede utilizarse además para comprender la organogénesis durante el desarrollo y la angiogénesis durante la enfermedad, así como ser utilizado como una herramienta importante durante el estudio de la regeneración.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada por el Brigham & Women's Hospital y la March of Dimes. Los autores desean agradecer a todos los miembros del Whited Lab por su apoyo y asesoramiento.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Peristaltic Pump | Marshall Scientific | RD-RP1 | |
| Perfusion tubing | Excelon Lab & Vacuum Tubing | 436901705 | size S1A |
| 27g butterfly needle | EXELint Medical Products | 26709 | |
| NaCl | AmericanBio | 7647-14-5 | |
| KCl | AmericanBio | 7747-40-7 | |
| Na2HPO4 | AmericanBio | 7558-79-4 | |
| NaH2PO4 | AmericanBio | 10049-21-5 | |
| Distilled water | |||
| HCl | AmericanBio | 7647-01-0 | |
| Glucose | ThermoFischer | A2494001 | |
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Sigma Aldrich | 468495 | |
| Ethanol (100% vol/vol) | Sigma Aldrich | 64-17-5 | |
| Surgical foreceps | Medline | MDG0748741 | |
| Polystyrene foam frame | any polystyrene foam square with an axolotl-shaped cut out | ||
| Surgical scissors | Medline | DYND04025 | |
| Scalpel | Medline | MDS15210 | |
| Absorbent underpad | Avacare Medical | PKUFSx | |
| Paper towels | |||
| Standard disposable transfer pipette | Fisherbrand | 50216954 | |
| Clamp stand | Adafruit | 291 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma Aldrich | E10521 | Tricaine powder |
| Adult axolotl | |||
| MgSO4 | AmericanBio | 10034-99-8 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016-100G | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761-500G | |
| Plastic tanks | Varying size appropriate for the axolotl | ||
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 30525-89-4 | |
| Axolotl | |||
| Leica Microscope | Leica | M165 FC | |
| ET-CY3 Fluorescent Filter | Leica | M205FA/M165FC | |
| MS-222 |
References
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