Summary
Utilizando uma técnica de coloração de perclorato de diisoxifenil-3,3,3 ', 3'-tetrametilindocarbocianina lipofílica (DiI) lipofílica, o Ambystoma mexicanum pode sofrer perfusão vascular para permitir uma fácil visualização da vasculatura.
Abstract
As técnicas de perfusão têm sido utilizadas há séculos para visualizar a circulação de tecidos. Axolotl (Ambystoma mexicanum) é uma espécie de salamandra que emergiu como um modelo essencial para estudos de regeneração. Pouco se sabe sobre como a revascularização ocorre no contexto da regeneração nesses animais. Aqui, relatamos um método simples para a visualização da vasculatura no axolotl através da perfusão de perclorato de 1,1'-dioctadecy-3,3,3 ', 3'-tetrametilindocarbocyanina (DiI). DiI é um corante de carbocyanina lipofílico que se insere instantaneamente na membrana plasmática de células endoteliais. A perfusão é feita usando uma bomba peristáltica, de modo que a DiI entre na circulação através da aorta. Durante a perfusão, o corante flui através dos vasos sanguíneos do axolotl e incorpora na bicamada lipídica das células endoteliais vasculares após o contato. O procedimento de perfusão leva aproximadamente uma hora para um axolotl de oito polegadas. Imediatamente após a perfusãoDiI, o axolotl pode ser visualizado com um microscópio fluorescente confocal. O DiI emite luz no intervalo vermelho-laranja quando excitado com um filtro fluorescente verde. Este procedimento de perfusão DiI pode ser usado para visualizar a estrutura vascular de axolotls ou para demonstrar padrões de revascularização em tecidos regeneradores.
Introduction
A visualização da vasculatura desempenha um papel vital na compreensão da estrutura e função dos organismos em muitas espécies. A partir do século 16 com Leonardo da Vinci, foram estudados modelos e representações gráficas da circulação 1 . Usando ceras e moldes de borracha, os tecidos foram perfundidos para criar modelos tridimensionais da vasculatura, o que permitiu o estudo de organogênese e patogênese 1 , 2 . As resinas e as ceras foram coloridas com corantes, tais como a tinta da Índia ou vermelho carmin para permitir a sua fácil visualização 1 , 2 . No entanto, essas técnicas causaram muitas questões porque suas altas viscosidades impediram a perfusão total do tecido de interesse 1 . À medida que o campo se tornou mais sofisticado, o uso de microscópios confocais e eletrônicos entrou em jogo, movendo a tecnologia de perfusão Longe dos moldes de fundição e para as perfusões líquidas da vasculatura, algumas das quais permitiram a perfusão e imagem de vasos sanguíneos sem destruir o tecido inicial 3 . DiI, um corante de carbocyanina fluorescente, é uma mancha que permite a perfusão de animais sem danos no tecido vascular.
Os corantes de carbocyanina são corantes lipofílicos que incorporam nas membranas celulares após contato. Estes corantes permitem uma coloração fácil e instantânea de células endoteliais vasculares, que podem então ser vistas sob um microscópio confocal fluorescente. DiI move-se através da difusão lateral na membrana lipídica das células, como mostrado na rotulagem e rastreamento dos neurônios 4 . Quimicamente, as duas cadeias de alquilo de DiI dão ao corante sua alta afinidade para as membranas celulares, enquanto dois anéis conjugados a partir de um fluorochrome que é responsável por emitir um comprimento de onda vermelho quando excitado por filtros de luz verde fluorescente> 4. O DiI tem sido utilizado em muitas capacidades, incluindo rotulagem bem sucedida da membrana plasmática e rotulagem anterógrada e retrógrada nos neurônios 5 , 6 . DiI já foi usado em protocolos de perfusão ao visualizar a vasculatura de camundongos 7 .
Axolotls ( Ambystoma mexicanum ) são salamandras que vivem exclusivamente em lagos saloquiais perto da Cidade do México, no México. Esses animais tornaram-se um modelo importante para a compreensão dos processos regenerativos, pois eles podem regenerar membros completos, cauda (incluindo corda nervosa), porções do coração e outros órgãos internos e partes do olho como adultos 8 , 9 . Além disso, com a recente aplicação de ferramentas genéticas em axolotls, uma visão sem precedentes das moléculas e células que conduzem esses processos agora é possível 8 . O regene de sucessoA ração de um membro inteiro requer um extenso processo de revascularização, que pode desempenhar um papel significativo na regeneração, além das simples funções tradicionais dos vasos sanguíneos no fornecimento de oxigênio e nutrientes. Compreender a revascularização no contexto da regeneração tecidual é imperativo. Os vasos sanguíneos de Axolotl foram previamente visualizados usando a tinta da Índia, e enquanto os resultados eram intrigantes, esse processo não foi revisitado nas décadas subseqüentes 10 . Buscamos adaptar um protocolo de perfusão DiI desenvolvido para uso em mamíferos para permitir uma perfusão completa e visualização da vasculatura axolotl 7 . Este protocolo descreve as etapas tomadas para perfurar com êxito e, posteriormente, visualizar a circulação axolotl com uma técnica de coloração DiI. Este procedimento permitirá uma visualização precisa dos vasos sanguíneos de patentes nos tecidos homeostáticos, bem como nos tecidos regeneradores e fornece um novo método de visualizaçãoN e análise do processo de revascularização no axolotl.
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Protocol
Toda experimentação axolotl foi realizada de acordo com o Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Brigham and Women's Hospital (BWH).
1. Configurar Experiência de Perfusão
- Coloque um axolotl adulto em um recipiente de plástico preenchido com 0,1% de solução de tricaína (MS222) por 15-20 min ou até completamente anestesiado. Certifique-se de que o recipiente esteja cheio de solução de tricaína suficiente, de modo que o axolotl esteja completamente submerso.
Nota: Todos os procedimentos devem ser realizados de acordo com as diretrizes institucionais de cuidados com animais. Na BWH, um axolotl é considerado totalmente anestesiado quando falha em um teste de puxar os pés, o que significa que não há movimento reflexivo quando o pé é suavemente espremido.
Atenção: Embora a tricaína seja um anestésico especificamente utilizado para organismos aquáticos, o contato direto com a pele com a solução de tricaína deve ser evitado. - Configure a estação de perfusão axolotl.
- Coloque oAlmofada absorvente em uma superfície plana e nivelada com o lado absorvente voltado para cima.
- Corte um furo na estrutura de espuma de poliestireno que é o tamanho e a forma apropriados para que o axolotl anestesiado se apresente na posição supina. Coloque o quadro na almofada absorvente.
Nota: algumas toalhas de papel adicionais podem ser colocadas imediatamente sob o quadro para absorção adicional. - Carregue a bomba peristáltica com o tubo de perfusão. Ajuste a bomba para um caudal de 0,7 ml / min, fluindo no sentido horário.
- Faça a solução diluída com 0,7x de PBS e 5% de glicose numa mistura de 1: 4.
- Misture 10 mL de solução diluente com 200 μL da solução de reserva DiI em um tubo cônico de 50 mL. Cap e misture por inversão. Cubra este tubo com papel de alumínio para proteger a solução de trabalho da exposição à luz.
Nota: Os volumes devem ser alterados de acordo com o tamanho do axolotl proporcionalmente. Estes valores são para um axolotl de aproximadamente 15 cm (comprimento do focinho até a cauda). UMANimais deste tamanho podem não ter atingido a maturidade sexual completa, de modo que o sexo animal não pode ser determinado no momento. - Encha um tubo cônico de 50 mL com PBS 0,7x.
Nota: PBS será usado para iniciar o loop e a exsanguinação axolotl. - Anexe a agulha de borboleta de calibre 27 até a extremidade de saída da tubulação de perfusão. Dobre as asas de borboleta uma sobre a outra e coloque no suporte de braçadeira.
- Coloque a extremidade livre do tubo de perfusão no tubo cônico de 50 mL preenchido com 0,7x PBS e execute a bomba de perfusão até que a tubagem inteira seja preenchida com solução. Pausar a bomba uma vez que a tubagem inteira é preenchida com PBS.
Nota: Certifique-se de que a tubagem está livre de bolhas de ar em todos os momentos, pois isso irá causar embolia de ar no axolotl e evitar a perfusão total. - Coloque uma toalha de papel no molde em forma de axolotl na armação de espuma de poliestireno. Usando uma pipeta de transferência, remova a toalha com solução tricaína.
Nota: Corte um pequeno quadrado no meio do reboque de papelPara permitir a drenagem de fluidos durante o procedimento de perfusão. - Coloque o axolotl anestesiado supino sobre a toalha de papel dentro do quadro de espuma de poliestireno.
2. Abertura do Cofre Axolotl
- Use fórceps cirúrgicos para beliscar a pele ao longo do eixo central do cofre do axolotl, logo abaixo da linha dos ombros. Puxar para cima.
- Use um bisturi para fazer uma pequena incisão onde a pele foi puxada.
- Remova um remendo quadrado de pele sobre o tórax para revelar duas placas de cartilagem.
- Remova a pele para abrir uma janela sobre a cavidade torácica grande o suficiente para ver claramente o coração e aproximadamente 5 mm da aorta se ramificando do coração.
- Rasgue cuidadosamente o tecido conjuntivo usando fórceps ou tesoura fechada para evitar o corte de vasos sanguíneos maiores.
- Levar cada placa de cartilagem individualmente usando a pinça e consumá-lasCom as tesouras cirúrgicas.
- Aperte cuidadosamente o pericárdio com a pinça, puxe-o e perfure-o usando as tesouras cirúrgicas; Esta incisão deve ser apenas profunda o suficiente para perfurar o pericárdio muito fino e deve ser grande o suficiente para permitir a remoção do pericárdio. Tenha cuidado para não cortar o coração.
- Retire delicadamente o pericárdio para expor o coração e a aorta.
Nota: Usando uma pipeta de transferência, escove periodicamente a cavidade torácica e as brânquias com solução tricaína para manter a área limpa e mantenha o axolotl anestesiado.
3. Perfusão do Axolotl
- Coloque o suporte de braçadeira com a agulha de borboleta carregada ao lado do quadro de espuma de poliestireno, de modo que o braço da braçadeira possa ser facilmente manipulado para inserir a agulha na aorta axolotl. Aponte a ponta da agulha em direção ao aspecto rostral do animal durante a inserção e mantenha a agulha paralela à aorta para evitar perfurá-la através da opLado positivo.
- Ligue a bomba peristáltica. 0.7x PBS deve continuar a fluir através da tubulação.
- Insira a agulha na aorta.
- Deslize a pinça sob o arco aórtico e puxe ligeiramente para permitir um fácil acesso.
- Manobra a combinação da agulha-agulha de modo que a agulha percorre o comprimento da aorta, apontando para a cabeça. Insira a agulha enquanto usa a pinça para apoio por trás da aorta.
Nota: A agulha deve ser inserida profundamente o suficiente na aorta para garantir que ela não escorregue durante a perfusão. Isso pode ser de cerca de 5 mm para um axolotl de 15 cm. Certifique-se de que a agulha esteja perfeitamente em linha com a aorta para evitar a perfuração completa do vaso. As perfurações através e passagem podem causar hemorragia maciça e diminuir as taxas de sucesso de perfusão. A inserção bem sucedida pode ser confirmada pelo aumento visível das auroras do coração.
- Rapidamente lacerar um átrio com a ciênciaSsors e deixe o sangue escorrer.
- Lavar com solução de tricaína para prevenir o acúmulo de sangue e formação de coágulos na cavidade torácica.
- Perfogue o axolotl com cerca de 20-30 mL de PBS. O animal deve mudar de cor rosa claro para branco em uma perfusão bem sucedida.
- Pausar a bomba peristáltica e mover a extremidade livre da tubulação para o tubo de 15 ml da solução DiI. Reinicie a bomba, tome cuidado para evitar a criação de bolhas de ar na tubulação.
- Perfogue o axolotl com todo o estoque de trabalho da DiI.
Nota: Em uma perfusão bem sucedida, o axolotl com cor de mudança para o rosa brilhante do DiI. Isso será mais notável nas brânquias. - Pausar a bomba após a perfusão com DiI é completa e colocar a extremidade livre da tubulação em solução de Paraformaldeído a 4% (PFA) para consertar o tecido. Reinicie a bomba e perfuse pelo menos 10 mL de PFA.
Atenção: o PFA é tóxico e deve ser tratado e dispoSed de forma apropriada. Devem ser usadas luvas e óculos de segurança, e as soluções devem ser feitas dentro de uma exaustão. A perfusão do axolotl com PFA para consertar o tecido resulta na morte do animal.
4. Finalização da Preparação de Perfusão e Visualização
- Pare a bomba peristáltica e remova a agulha da aorta axolotl.
- Coloque o axolotl em uma placa de plástico.
Nota: usar uma metade de uma grande placa de Petri funciona bem e permite derramar uma pequena quantidade de Tricaine ou PBS no axolotl para manter sua pele molhada e melhorar a qualidade da visualização. - Descarte todos os materiais usados nas lixeiras apropriadas. Limpe as ferramentas cirúrgicas com etanol a 70%, desinfeteie usando um esterilizador de grânulos de vidro entre animais e esterilize-se por autoclave seguindo o procedimento. Elimine a tubulação com a solução PBS e, em seguida, drene, seque completamente e guarde para uso posterior.
5. Visualização do Axolotl Perfido
Nota: Para obter uma imagem de alta qualidade, os seguintes parâmetros podem ser usados: exposição para 1.1 s, ganho de 1x, saturação de 1.0, ampliação de 2X.
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Representative Results
Com a coloração DiI, a vasculatura do axolotl pode ser facilmente visualizada. Os vasos sanguíneos de animais perfundidos com o corante lipofílico são imediatamente visíveis sob um microscópio confocal fluorescente. A Figura 1 .1-1.5 é uma representação esquemática do protocolo de perfusão. Após a perfusão com o corante rosa brilhante, um axolotl perfundido com sucesso aparecerá rosa. Usando um filtro fluorescente verde em um microscópio confocal, aparecerá uma emissão vermelha da rede vascular. A coloração DiI ocorre em todos os tecidos do corpo quando a perfusão é bem sucedida, incluindo a cauda, os membros, as brânquias e os olhos ( Figura 2A , Figura 2B , Figura 2C , Figura 2D , repectivamente). Perfurações infrutíferas resultam na falta de vasculatura manchada de vermelho ou em manchas irregulares dos vasos.
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Figura 1: Esquema do protocolo de perfusão. Axolotls com perfusão bem sucedida com o corante lipofílico, DiI, demonstram coloração total da vasculatura após a imagem. 1: axolotl supino supino antes da experiência de perfusão. 2: Abrindo o baú do axolotl. 2: Axolotl com uma cavidade de caixa aberta. 3: Inserção da agulha borboleta 27 G na aorta do axolotl. 4: A tubulação deve primeiro conter PBS 0,7x, depois a solução de trabalho DiI e, finalmente, 4% de PFA. 5: Axolotls totalmente perfundidos aparecem de cor-de-rosa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imagens de um Axolo Completamente PerfusedTl. As imagens da vasculatura axolotl foram realizadas usando um microscópio confocal fluorescente após perfusão bem sucedida com a mancha de DiI. 2A: Cauda. 2B: Pé. 2C: Gills. 2D: olho. A imagem é feita usando um microscópio confocal com um cubo de filtro de emissão fluorescente verde. A ampliação para as imagens A, B, C e D são 1,74X, 2,16X, 1,18X e 5,69X, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A visualização da vasculatura do axolotl pode ser realizada com sucesso através da perfusão com o corante de carbocyanina lipofílico, DiI. Neste estudo, descrevemos um novo protocolo para a perfusão do axolotl com DiI usando uma bomba peristáltica. Mostramos também a subsequente visualização da vasculatura axolotl utilizando um microscópio confocal fluorescente. Este protocolo foi uma adaptação do protocolo de perfusão Dii de roedores visto em Li et al. 7 , no entanto, as principais diferenças entre o roedor e o axolotl exigiram uma revisão do protocolo para se adequar ao modelo axolotl.
Este estudo discute um método de perfusão DiI do axolotl para visualizar com sucesso a vasculatura. Diferenças na anatomia e fisiologia entre as alterações da demanda de salamandras e roedores nos principais aspectos da perfusão, incluindo localização da inserção da agulha, método de perfusão e os reagentes utilizados. A fim deUma perfusão bem sucedida, limitamos o dano causado à vasculatura do axolotl. Ao abrir a cavidade do tórax, foi tomado o cuidado de expor completamente o coração e a aorta, evitando qualquer dano ou laceração nos principais vasos sanguíneos. Limitar o uso das tesouras cirúrgicas impediu o corte acidental de vasos principais, enquanto pequenas incisões mantiveram o controle sobre a exposição do coração e aorta. As taxas de sucesso de perfusões também aumentaram quando a agulha DiI foi inserida através da aorta, em vez de diretamente nas câmaras do coração. O axolotl, ao contrário do mouse, tem um coração com três camadas, contendo apenas um ventrículo com significativamente menos musculatura do que o do mouse. Devido a essas diferenças, a localização da inserção da agulha teve que ser movida para a aorta mais estável. A aorta estava determinada a ser a localização ideal para a inserção da agulha de perfusão, pois é suficientemente grande para a punção por uma agulha de 27 G e tem movimento limitado. O movimento foi mínimoPara evitar a remoção acidental ou o deslizamento da agulha de perfusão ou a perfuração direta da aorta. As perfusões cardíacas utilizando o ventrículo como ponto de inserção provaram ter uma taxa de sucesso muito menor do que aqueles com um ponto de inserção aórtica. A punção errática da vasculatura freqüentemente resultou na formação de emboli ou impediu a perfusão, resultando em taxas muito baixas de rotulagem vascular bem sucedida. Ao usar um suporte de braçadeira para segurar a agulha de borboleta durante a perfusão, diminuímos seu movimento, aumentando assim a taxa de perfusões bem-sucedidas. Além disso, devido à delicadeza do tecido axolotl, quando comparado ao mouse, foi necessária uma bomba de perfusão peristáltica, em oposição à perfusão manual anteriormente utilizada. O uso desta bomba permitiu uma abordagem mãos-livres para a perfusão axolotl para minimizar a punção equivocada dos tecidos finos. As perfusões foram infrutíferas por muitas razões adicionais, incluindo a punçãoUra, coagulação e embolia. No caso de a agulha ser inserida na aorta e uma segunda punção foi criada através da parede posterior, a solução DiI iria fluir diretamente para a cavidade torácica em vez de passar pela circulação sistêmica. Além disso, uma vez que o sangue saiu da vasculatura, rapidamente formou um coágulo de sangue que poderia impedir a perfusão. Coágulos e bolhas de ar também podem se formar na vasculatura, causando embolias que impedem a perfusão bem-sucedida. Por fim, este protocolo incorporou reagentes ajustados para ajustar a osmolalidade axolótica, que difere significativamente da do mamífero. A adaptação deste protocolo e as mudanças significativas feitas para se adequar ao modelo axolotl irão ajudar na busca do processo de revascularização dos tecidos durante a regeneração.
DiI, que é de cor rosa, perfurará o animal e lhe dará uma tonalidade rosa brilhante. Os axolotls com perfusão bem sucedida tornaram-se brilhantes a olho nu, comRegiões vascularizadas aparecendo mais intensamente coradas. Os animais perfumados vistos com um microscópio confocal fluorescente usando um filtro verde podem ser visualizados no espectro de emissão vermelho-laranja. A vasculatura foi melhor visualizada em tecidos mais finos que minimizaram a coloração acidental de DiI de tecidos não vasculares. A perfusão do tecido com 4% de paraformaldeído (PFA) imediatamente após a perfusão DiI deve ser feita para consertar o tecido.
As perfusões DiI são experimentos de ponto final para o axolotl. Durante o procedimento, todo o sangue do animal é efetivamente drenado e substituído por 0,7x PBS, seguido imediatamente pela solução DiI e, finalmente, 4% de PFA. Isso perturba a capacidade do axolotl de se envolver no ato vital da troca de gás e perde a capacidade de oxigenar seus tecidos corporais. Devido a esta natureza de ponto final, cada perfusão captura apenas um único ponto de tempo de crescimento vascular, e o animal não pode ser mais perfundido em um momento posterior. Devido a este tempo-limiFator ting, vários animais devem ser usados para descrever um curso temporal do desenvolvimento vascular.
Este protocolo DiI, e as modificações aplicadas para melhorá-lo, podem ser usadas para marcar com sucesso e visualizar a vasculatura do axolotl. Uma vez que o axolotl é um organismo modelo essencial para o estudo da regeneração, as perfusões bem-sucedidas abrem oportunidades para interrogar o processo de angiogênese durante a regeneração. O axolotl é um organismo modelo para o estudo da regeneração porque é um animal neotenous e, portanto, mantém uma notável habilidade de regeneração durante a idade adulta 8 . O processo de revascularização dos tecidos regeneradores, no entanto, não é bem compreendido, portanto, a adaptação da perfusão DiI ao sistema axolotl apresenta oportunidades para compreender a regeneração que não estava disponível com o modelo mamífero. A perfusão do axolotl usando DiI é uma nova técnica para o estudo das revasCularização do tecido regenerador neste modelo animal, portanto, este protocolo pode ser mais utilizado para compreender a organogênese durante o desenvolvimento e angiogênese durante a doença, além de ser utilizado como ferramenta importante durante o estudo da regeneração.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada pelo Brigham & Women's Hospital e March of Dimes. Os autores agradecem a todos os membros do Laboratório Whited por seu apoio e conselho.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Peristaltic Pump | Marshall Scientific | RD-RP1 | |
| Perfusion tubing | Excelon Lab & Vacuum Tubing | 436901705 | size S1A |
| 27g butterfly needle | EXELint Medical Products | 26709 | |
| NaCl | AmericanBio | 7647-14-5 | |
| KCl | AmericanBio | 7747-40-7 | |
| Na2HPO4 | AmericanBio | 7558-79-4 | |
| NaH2PO4 | AmericanBio | 10049-21-5 | |
| Distilled water | |||
| HCl | AmericanBio | 7647-01-0 | |
| Glucose | ThermoFischer | A2494001 | |
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Sigma Aldrich | 468495 | |
| Ethanol (100% vol/vol) | Sigma Aldrich | 64-17-5 | |
| Surgical foreceps | Medline | MDG0748741 | |
| Polystyrene foam frame | any polystyrene foam square with an axolotl-shaped cut out | ||
| Surgical scissors | Medline | DYND04025 | |
| Scalpel | Medline | MDS15210 | |
| Absorbent underpad | Avacare Medical | PKUFSx | |
| Paper towels | |||
| Standard disposable transfer pipette | Fisherbrand | 50216954 | |
| Clamp stand | Adafruit | 291 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma Aldrich | E10521 | Tricaine powder |
| Adult axolotl | |||
| MgSO4 | AmericanBio | 10034-99-8 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016-100G | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761-500G | |
| Plastic tanks | Varying size appropriate for the axolotl | ||
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 30525-89-4 | |
| Axolotl | |||
| Leica Microscope | Leica | M165 FC | |
| ET-CY3 Fluorescent Filter | Leica | M205FA/M165FC | |
| MS-222 |
References
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