Summary
Utilizzando una tecnica di colorazione perplata di Di-tetraetilindocarbocyanina perchlorato (DiI) lipofilica, l' Ambystoma mexicanum può essere sottoposta a perfusione vascolare per consentire una facile visualizzazione della vasculatura.
Abstract
Le tecniche di perfusione sono state utilizzate da secoli per visualizzare la circolazione dei tessuti. Axolotl (Ambystoma mexicanum) è una specie di salamandra che è emersa come un modello essenziale per gli studi di rigenerazione. Poco si sa circa come si verifica la rivascolarizzazione nel contesto della rigenerazione in questi animali. Qui riportiamo un metodo semplice per la visualizzazione della vasculatura in axolotl attraverso la perfusione di 1,1'-Dioctadecy-3,3,3 ', 3'-tetrametilindocarbocyanin perchlorato (DiI). DiI è un colorante lipocilico di carbocyanina che inserisce istantaneamente nella membrana plasmatica delle cellule endoteliali. La perfusione avviene usando una pompa peristaltica in modo che DiI entri nella circolazione attraverso l'aorta. Durante la perfusione, il colorante scorre attraverso i vasi sanguigni dell'assolotl e si incorpora nel bilayer lipidico delle cellule endoteliali vascolari al contatto. La procedura di perfusione dura circa un'ora per un axolotl da otto pollici. Immediatamente dopo la perfusione wiTh DiI, l'axolotl può essere visualizzata con un microscopio fluocentrico confocale. Il DiI emette luce nella gamma rossa-arancione quando viene eccitato con un filtro fluorescente verde. Questa procedura di perfusione DiI può essere usata per visualizzare la struttura vascolare degli assoloti o per dimostrare modelli di rivascolarizzazione nei tessuti rigeneranti.
Introduction
La visualizzazione della vascolarizzazione svolge un ruolo fondamentale nella comprensione della struttura e della funzione degli organismi in molte specie. A partire dal XVI secolo con Leonardo da Vinci sono stati studiati modelli e rappresentazioni grafiche della circolazione 1 . Utilizzando cere e stampi di gomma, i tessuti sono stati perfusi per creare modelli tridimensionali della vasculatura, che hanno permesso lo studio dell'organogenesis e della patogenesi 1 , 2 . Le resine e le cere sono state colorate con coloranti come India Ink o rosso carminio per consentire la loro facile visualizzazione 1 , 2 . Tuttavia, queste tecniche hanno causato molti problemi perché le loro elevate viscosità impediscono la perfusione completa del tessuto di interesse 1 . Poiché il campo è diventato più sofisticato, l'uso di microscopi confocali ed elettronici è entrato in gioco, spostando la tecnica di perfusione Lontano dagli stampi e verso perfusioni liquide della vasculatura, alcune delle quali permettevano la perfusione e l'imaging dei vasi sanguigni senza distruggere il tessuto iniziale 3 . DiI, un colorante fluorescente di carbocyanina, è una tale macchia che permette la perfusione di animali senza danneggiare il tessuto vascolare.
I coloranti di carbocianina sono coloranti lipofili che incorporano nelle membrane cellulari al contatto. Questi coloranti permettono la colorazione facile e istantanea di cellule endoteliali vascolari, che possono essere visualizzate sotto un microscopio confocale fluorescente. DiI si muove attraverso la diffusione laterale nella membrana lipidica delle cellule, come mostrato nell'etichettatura e nella traccia dei neuroni 4 . Chemically, le due catene alchiliche di Di conferiscono al colorante la sua elevata affinità per le membrane cellulari, mentre due anelli coniugati da un fluorochrome che è responsabile di emettere una lunghezza d'onda rossa quando eccitato dai filtri di luce fluorescenti verdi> 4. DiI è stato utilizzato in molte capacità, tra cui l'etichettatura di successo della membrana plasmatica e l'etichettatura anterograda e retrograda nei neuroni 5 , 6 . DiI è stato precedentemente utilizzato nei protocolli di perfusione mentre visualizza la vasculatura dei topi 7 .
Axolotls ( Ambystoma mexicanum ) sono salamandri che vivono esclusivamente in laghetti salmastre vicino a Città del Messico, in Messico. Questi animali sono diventati un importante modello per comprendere processi rigenerativi in quanto possono regenerare gli arti completi, la coda (compreso il cavo nervo), le parti del cuore e altri organi interni e le parti dell'occhio come adulti 8 , 9 . Inoltre, con la recente applicazione di strumenti genetici in axolotls, è ora possibile conoscere senza precedenti le molecole e le cellule che guidano questi processi 8 . Il regene di successoLa razione di un arto intero richiede un ampio processo di rivascolarizzazione, che può svolgere un ruolo significativo nella rigenerazione oltre le semplici funzioni dei vasi sanguigni nel fornire ossigeno e sostanze nutritive. La comprensione della rivascolarizzazione nel contesto della rigenerazione dei tessuti è indispensabile. I vasi sanguigni Axolotl sono stati precedentemente visualizzati usando l'India Ink e, mentre i risultati erano intriganti, questo processo non è stato rivisto nei decenni successivi 10 . Abbiamo cercato di adattare un protocollo di perfezionamento DiI sviluppato per essere utilizzato nei mammiferi per consentire una completa perfusione e visualizzazione della vasculatura axolotl 7 . Questo protocollo descrive le fasi adottate per perfezionare e successivamente visualizzare la circolazione dell'assolotlina con una tecnica di colorazione DiI. Questa procedura consentirà una visualizzazione precisa dei vasi sanguigni di brevetto nei tessuti omeostatici, nonché nel rigenerare i tessuti e fornisce un nuovo metodo di visualizatioN e l'analisi del processo di rivascolarizzazione nell'assolotl.
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Protocol
Tutta la sperimentazione dell'assolotl è stata eseguita in accordo con il comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali di Brigham e dell'ospedale femminile (BWH).
1. Impostare Esperimento di Perfusion
- Posizionare un axolotl adulto in un contenitore di plastica riempito con soluzione 0,1% di tricina (MS222) per 15-20 min o fino a quando completamente anestetizzato. Assicurarsi che il contenitore sia riempito con sufficiente soluzione di triciclici in modo che l'axolotl sia completamente sommerso.
Nota: Tutte le procedure devono essere eseguite in conformità alle istruzioni istituzionali per la cura degli animali. A BWH, un axolotl è considerato completamente anestetizzato quando non riesce a provare un pizzicotto, il che significa che non c'è movimento riflessivo quando il piede viene spremuto dolcemente.
Attenzione: Anche se la tricina è un anestetico specificamente utilizzato per gli organismi acquatici, è necessario evitare il contatto diretto della pelle con la soluzione tricina. - Impostare la stazione di perfusione axolotl.
- Posiziona ilRilievo assorbente su una superficie piana e livellata con il lato assorbente rivolto verso l'alto.
- Tagliare un foro nel telaio in polistirolo espanso che è la dimensione e la forma appropriati per l'assolotolo anestetizzato per giacere in posizione supina. Posizionare il telaio sul tampone assorbente.
Nota: alcuni tovaglioli di carta supplementari possono essere posizionati immediatamente sotto il telaio per ulteriori assorbimenti. - Caricare la pompa peristaltica con il tubo di perfusione. Impostare la pompa ad una portata di 0,7 ml / min, che scorre in senso orario.
- Preparare la soluzione diluita con 0,7x PBS e 5% di glucosio in una miscela 1: 4.
- Mescolare 10 ml di soluzione diluente con 200 μL della soluzione di base DiI in un tubo conico da 50 ml. Coprire e mescolare per inversione. Coprire questo tubo con carta in alluminio per proteggere la soluzione di lavoro dall'esposizione alla luce.
Nota: i volumi dovrebbero essere modificati in base alla dimensione dell'assolotl proporzionalmente. Questi valori sono per un axolotl di circa 15 cm (lunghezza da coda a coda). UNI nomi di questa dimensione non possono avere raggiunto la piena maturità sessuale, quindi il sesso animale non può essere determinato in questo momento. - Riempire un tubo conico da 50 ml con 0,7x PBS.
Nota: PBS verrà utilizzato per l'innesco del ciclo e dell'exolinguizzazione dell'assolotl. - Fissare l'ago a farfalla a 27 gauge all'estremità di uscita del tubo di perfusione. Piegare le ali delle farfalle su un altro e collocare nel supporto del morsetto.
- Posizionare l'estremità libera del tubo di perfusione nel tubo conico da 50 ml riempito di 0,7x PBS e eseguire la pompa di perfusione fino a quando l'intero tubo è riempito di soluzione. Sospendi la pompa una volta che l'intero tubo è riempito con PBS.
Nota: assicurarsi che il tubo sia privo di bolle d'aria in qualsiasi momento, in quanto ciò provocherà l'embolia nell'assolotl e impedisce la perfusione completa. - Mettere un tovagliolo di carta nello stampo a forma di axolotl nel telaio in polistirolo espanso. Usando una pipetta di trasferimento, immergere l'asciugamano con la soluzione di tricaine.
Nota: Tagliare un piccolo quadrato in mezzo alla trama della cartaEl per consentire il drenaggio dei fluidi durante la procedura di perfusione. - Posizionare l'axolotl anestetizzato supino sul tovagliolo di carta all'interno del telaio in polistirene espanso.
2. Apertura della cassa dell'Asolotl
- Utilizzare pinze chirurgiche per pizzicare la pelle lungo l'asse centrale del petto dell'assolotl, appena sotto la linea delle spalle. Tirare in su.
- Usa un bisturi per fare una piccola incisione dove la pelle è stata tirata.
- Rimuovere una patch quadrata di pelle sopra il torace per rivelare due piastre di cartilagine.
- Rimuovi la pelle per aprire una finestra sulla cavità toracica abbastanza grande da vedere chiaramente il cuore e circa 5 mm dell'aletta che si ramifica dal cuore.
- Attentamente strappare il tessuto connettivo con pinze o forbici chiuse per evitare di tagliare i vasi sanguigni più importanti.
- Sollevare ciascuna piastra di cartilagine singolarmente usando le pinze e scambiandoleCon le forbici chirurgiche.
- Stringere con cautela il pericardio con le pinze, sollevare e forzarlo con le forbici chirurgiche; Questa incisione dovrebbe essere abbastanza profonda da percuotere il pericardio molto sottile e dovrebbe essere abbastanza grande da permettere la rimozione del pericardio. Fare attenzione a non tagliare il cuore.
- Rimuovere delicatamente il pericardio per esporre il cuore e l'aorta.
Nota: Usando una pipetta di trasferimento, periodicamente sciacquare la cavità toracica e le gole con la soluzione tricaine per mantenere l'area chiara e mantenere l'axolotl anestetizzato.
3. Perfusione dell'Asolotl
- Posizionare lo staffa con l'ago a farfalla caricato accanto al telaio in polistirolo espanso, in modo tale che il braccio del morsetto possa essere facilmente manipolato per inserire l'ago nell'aletto axolotl. Puntare la punta dell'ago verso l'aspetto rostralo dell'animale durante l'inserimento e mantenere l'ago parallelo all'aorta per evitare di perforarla attraverso l'opLato positiva.
- Accendere la pompa peristaltica. 0.7x PBS dovrebbe continuare a fluire attraverso il tubo.
- Inserire l'ago nell'aletta.
- Far scivolare la pinza sotto l'arco aortico e sollevare leggermente per consentire un facile accesso.
- Manovrare la combinazione di aghi-ago in modo tale che l'ago corre lungo la lunghezza dell'arto, rivolto verso la testa. Inserire l'ago durante l'uso della pinza per il supporto dietro l'aorta.
Nota: L'ago deve essere inserito abbastanza profondamente nell'aorta per assicurarsi che non scivoli durante la perfusione. Questo può essere di circa 5 mm per un axolotl da 15 cm. Assicurarsi che l'ago sia perfettamente in linea con l'aorta per evitare la completa foratura del vaso. Le puncture attraverso-e-through possono causare emorragie massicce e diminuire i tassi di successo della perfusione. L'inserimento riuscito può essere confermato dall'allargamento visibile dell'atria del cuore.
- Rapidamente lacerate un atrio con la sciSsors e consentire il sangue di scarico.
- Sciacquare con la soluzione tricaina per prevenire l'accumulo di sangue e la formazione di coaguli nella cavità toracica.
- Perfuse l'axolotl con circa 20-30 mL di PBS. L'animale dovrebbe cambiare da rosa chiaro in colore a bianco in una perfusione di successo.
- Sospendi la pompa peristaltica e sposta l'estremità libera del tubo nel tubo da 15 ml di soluzione DiI. Riavviare la pompa, fai attenzione a non creare delle bolle d'aria nel tubo.
- Perfuse l'axolotl con l'intero stock di DiI.
Nota: in una perfetta perfusione, l'axolotl con colore cambiato al rosa brillante della DiI. Questo sarà più evidente nelle cavità. - Sospendi la pompa dopo la perfusione con DiI è completa e metta l'estremità libera del tubo in soluzione 4% di paraformaldeide (PFA) per fissare il tessuto. Riavviare la pompa e perfezionare almeno 10 mL di PFA.
Attenzione: il PFA è tossico e deve essere manipolato e dispoSed di appropriato. Guanti e occhiali di protezione devono essere indossati e soluzioni devono essere fatte all'interno di un cappuccio. La perfusione dell'assolotl con PFA per fissare i tessuti provoca la morte dell'animale.
4. Terminare la preparazione della perfusione e della visualizzazione
- Arrestare la pompa peristaltica e rimuovere l'ago dall'alettone axolotl.
- Posizionare l'axolotl su una piastra di plastica.
Nota: Utilizzando una metà di un grande piatto di Petri funziona bene e permette di versare una piccola quantità di Tricaine o PBS sull'assolotl per mantenere la pelle bagnata e migliorare la qualità della visualizzazione. - Smaltire tutti i materiali utilizzati nei contenitori idonei. Pulire gli attrezzi chirurgici con il 70% di etanolo, disinfettare con uno sterilizzatore di vetro tra gli animali e sterilizzare mediante autoclave seguendo la procedura. Infilare il tubo con la soluzione PBS e quindi scolare, asciugare completamente e conservare per ulteriori impieghi.
5. Visualizzare l'Axolotl Perfuso
Nota: Per ottenere un'immagine di alta qualità, è possibile utilizzare i seguenti parametri: esposizione per 1,1 s, guadagno di 1x, saturazione di 1,0, ingrandimento di 2X.
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Representative Results
Con la colorazione DiI, la vasculatura dell'assolotl può essere facilmente visualizzata. I vasi sanguigni di animali perfusi con il colorante lipofile sono immediatamente visibili sotto un microscopio confocale fluorescente. La Figura 1 .1-1.5 è una rappresentazione schematica del protocollo di perfusione. Dopo la perfusione con il colorante rosa brillante, un axolotl perfuso perfettamente apparirà rosa. Usando un filtro fluorescente verde su un microscopio confocale apparirà un'emissione rossa della rete vascolare. La colorazione DiI si verifica in tutti i tessuti del corpo quando la perfusione ha successo, tra cui la coda, gli arti, le ghiandole e gli occhi ( Figura 2A , Figura 2B , Figura 2C , Figura 2D , in modo retto). Perfusioni non riuscite provocano una mancanza di vascolarizzazione rossa o in macchie colorate delle vasi.
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Figura 1: Schema del protocollo di perfusione. Axolotls perfettamente perfuso con il colorante lipofilico, DiI, dimostrano la completa colorazione della vasculatura all'immagine. 1: Full axolotl supino prima dell'esperimento di perfusione. 2: aprire il petto dell'assolotl. 2: Axolotl con una cavità aperta della cassa. 3: inserimento dell'ago della farfalla da 27 G nell'arena dell'assolotl. 4: La tubazione deve prima contenere 0.7x PBS, quindi la soluzione di lavoro DiI e, infine, il PFA del 4%. 5: gli axolotls completamente perfusi appaiono rosa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Immagini di un Axolo completamente perfezionatoTL. Le immagini della vasculatura axolotl sono state prese utilizzando un microscopio confocale fluorescente dopo una perfetta perfusione con la macchia DiI. 2A: Coda. 2B: piede. 2C: Giglie. 2D: Occhio. L'imaging viene eseguito usando un microscopio confocale con un cubo filtro a emissione di fluorescenza verde. L'ingrandimento per le immagini A, B, C e D sono rispettivamente 1.74X, 2.16X, 1.18X e 5.69X. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La visualizzazione della vasculatura dell'assolotl può essere ottenuta con perfezionamento con il colorante lipocilico di carbocyanina, DiI. In questo studio descriviamo un nuovo protocollo per la perfusione dell'assolotl con DiI usando una pompa peristaltica. Mostriamo anche la successiva visualizzazione della vasculatura axolotl utilizzando un microscopio confocale fluorescente. Questo protocollo è stato un adattamento del protocollo di perfusione di roditore DiI visto in Li et al. 7 , tuttavia le principali differenze tra il roditore e l'axolotl richiedevano una revisione del protocollo per adattarsi al modello axolotl.
Questo studio descrive un metodo di perfusione DiI dell'assolotl per poter visualizzare correttamente la vascolarizzazione. Differenze nell'anatomia e nella fisiologia tra la salamandra e le alterazioni della domanda di roditori nei principali aspetti della perfusione, inclusa la posizione dell'inserimento degli aghi, il metodo di perfusione ei reagenti utilizzati. Al fine di achUn successo perfuso, abbiamo limitato i danni alla vasculatura dell'assolotl. Durante l'apertura della cavità toracica, si è preso cura di esporre completamente il cuore e l'aorta evitando eventuali danni o lacerazioni ai vasi sanguigni più importanti. Limitare l'uso delle forbici chirurgiche impediva la caduta accidentale dei vasi principali mentre le piccole incisioni hanno mantenuto il controllo sull'esposizione del cuore e dell'arto. I tassi di successo delle perfusioni aumentarono anche quando l'ago DiI è stato inserito attraverso l'aorta, piuttosto che direttamente nelle camere del cuore. L'axolotl, a differenza del topo, ha un cuore a tre camere, contenente solo un ventricolo con una muscolatura significativamente minore di quella del topo. A causa di queste differenze, la posizione dell'inserimento dell'ago doveva essere spostata nell'aorta più stabile. L'aorta è stata determinata per essere la posizione ottimale per l'inserimento dell'ago di perfusione in quanto è abbastanza grande per la puntura da un ago da 27 G e ha un movimento limitato. Il movimento era minimoPer evitare la rimozione accidentale o lo scivolamento dell'ago di perfusione o la foratura passante dell'arte. Le perfusioni cardiache usando il ventricolo come punto di inserimento hanno dimostrato di avere un ritmo molto più basso di successo rispetto a quelli con un punto di inserzione aortica. La foratura erronea della vasculatura ha spesso provocato la formazione di embolia o la perfusione preventiva, con conseguente bassi livelli di etichettatura vascolare. Utilizzando una staffa per tenere l'ago a farfalla durante la perfusione, abbiamo diminuito il suo movimento, aumentando così il tasso di perfusioni perfette. Inoltre, a causa della delicatezza del tessuto axolotl, rispetto al topo, era necessaria una pompa di perfusione peristaltica, al contrario della perfusione manuale usata in precedenza. L'uso di questa pompa ha consentito un approccio privo di mani alla perfusione dell'assolotl per ridurre al minimo la penetrazione errata dei tessuti sottili. Le perfusioni non sono state riuscite per molte altre ragioni, tra cui il punct-through-throughUre, coagulazione e embolia. Nel caso in cui l'ago sia stato inserito nell'aorta e una seconda punzone è stata creata attraverso la parete posteriore, la soluzione DiI passerebbe direttamente nella cavità toracica anziché passare attraverso la circolazione sistemica. Inoltre, una volta che il sangue usciva dalla vasculatura, ha rapidamente formato un coagulo di sangue che potrebbe impedire la perfusione. Anche i vermi possono formare clots e bolle d'aria, causando embolie che impediscono una perfetta perfusione. Infine, questo protocollo incorpora reagenti adeguati per adattarsi all'assololabilità axolotl, che differisce significativamente da quello del mammifero. L'adattamento di questo protocollo e le significative modifiche apportate al modello axolotl contribuiranno alla ricerca della comprensione del processo di rivascolarizzazione dei tessuti durante la rigenerazione.
DiI, che è di colore rosa, perfeziona l'animale e gli darà una colorazione rosa brillante. Gli axolotls perfettamente perfusi sono diventati rosa brillante all'occhio nudo, con alta efficaciaRegioni vascolarizzate che appaiono più intensamente macchiate. Gli animali perfezionati osservati con un microscopio confocale fluorescente usando un filtro verde possono essere visualizzati nello spettro di emissione di colore rosso-arancio. La vasculatura è stata meglio visualizzata in tessuti più sottili che riducono al minimo la colorazione accidentale DiI di tessuti non vascolari. La perfusione del tessuto con 4% di paraformaldeide (PFA) immediatamente dopo la perfusione DiI dovrebbe essere fatta per fissare il tessuto.
Le perfusioni DiI sono esperimenti di end-point per l'axolotl. Durante la procedura, tutto il sangue animale è effettivamente drenato e sostituito con 0.7x PBS, seguito immediatamente dalla soluzione DiI e, infine, dal 4% PFA. Ciò sconvolge la capacità dell'assolotl di impegnarsi nell'azione vitale dello scambio di gas e perde la capacità di ossigenare i suoi tessuti corporei. A causa di questa natura end-point, ogni perfusione cattura solo un solo punto di tempo della crescita vascolare e l'animale non può essere ulteriormente perfuso in un momento successivo. A causa di questo tempo-limiTing fattore, devono essere utilizzati più animali per descrivere un tempo di sviluppo vascolare.
Questo protocollo DiI e le modifiche applicate per ottimizzarlo possono essere usate per etichettare e visualizzare la vasculatura dell'assolotl. Poiché l'axolotl è un organismo modello essenziale per lo studio della rigenerazione, perfusioni di successo aprono opportunità per interrogare il processo di angiogenesi durante la rigenerazione. L'axolotl è un organismo modello per lo studio della rigenerazione perché è un animale neotenoso e quindi conserva una notevole capacità di rigenerarsi durante l'età adulta 8 . Il processo di rivascolarizzazione dei tessuti rigeneranti, tuttavia, non è ben compreso, quindi l'adattamento della perfusione DiI al sistema axolotl presenta opportunità di comprendere la rigenerazione che non erano disponibili con il modello mammifero. La perfusione dell'assolotl usando DiI è una nuova tecnica per lo studio della revasCularizzazione del tessuto rigenerante in questo modello animale, quindi, questo protocollo può essere ulteriormente utilizzato per comprendere l'organogenesi durante lo sviluppo e l'angiogenesi durante la malattia, nonché essere utilizzato come uno strumento importante durante lo studio della rigenerazione.
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Disclosures
Gli autori non hanno niente da rivelare.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata sostenuta dal Brigham & Women's Hospital e dalla Marcia di Dimes. Gli autori vorrebbero ringraziare tutti i membri del Lab Whited per il loro supporto e consulenza.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Peristaltic Pump | Marshall Scientific | RD-RP1 | |
| Perfusion tubing | Excelon Lab & Vacuum Tubing | 436901705 | size S1A |
| 27g butterfly needle | EXELint Medical Products | 26709 | |
| NaCl | AmericanBio | 7647-14-5 | |
| KCl | AmericanBio | 7747-40-7 | |
| Na2HPO4 | AmericanBio | 7558-79-4 | |
| NaH2PO4 | AmericanBio | 10049-21-5 | |
| Distilled water | |||
| HCl | AmericanBio | 7647-01-0 | |
| Glucose | ThermoFischer | A2494001 | |
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Sigma Aldrich | 468495 | |
| Ethanol (100% vol/vol) | Sigma Aldrich | 64-17-5 | |
| Surgical foreceps | Medline | MDG0748741 | |
| Polystyrene foam frame | any polystyrene foam square with an axolotl-shaped cut out | ||
| Surgical scissors | Medline | DYND04025 | |
| Scalpel | Medline | MDS15210 | |
| Absorbent underpad | Avacare Medical | PKUFSx | |
| Paper towels | |||
| Standard disposable transfer pipette | Fisherbrand | 50216954 | |
| Clamp stand | Adafruit | 291 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma Aldrich | E10521 | Tricaine powder |
| Adult axolotl | |||
| MgSO4 | AmericanBio | 10034-99-8 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016-100G | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761-500G | |
| Plastic tanks | Varying size appropriate for the axolotl | ||
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 30525-89-4 | |
| Axolotl | |||
| Leica Microscope | Leica | M165 FC | |
| ET-CY3 Fluorescent Filter | Leica | M205FA/M165FC | |
| MS-222 |
References
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