Summary
Ved anvendelse af en lipofil 1,1'-dioctadecy-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyaninperchlorat (DiI) farvningsteknik kan Ambystoma-mexicanum gennemgå vaskulær perfusion for at muliggøre let visualisering af vaskulaturen.
Abstract
Perfusionsteknikker er blevet brugt i århundreder for at visualisere vævscirkulationen. Axolotl (Ambystoma mexicanum) er en art af salamander, der er opstået som en væsentlig model for regenereringsundersøgelser. Lidt er kendt om, hvordan revaskularisering sker i forbindelse med regenerering i disse dyr. Her rapporteres en enkel metode til visualisering af vaskulaturen i axolotl via perfusion af 1,1'-dioctadecy-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyaninperchlorat (DiI). DiI er et lipofilt carbocyaninfarvestof, der øjeblikkeligt indsætter i plasmamembranen af endotelceller. Perfusion udføres ved hjælp af en peristaltisk pumpe, således at DiI går ind i kredsløbet gennem aorta. Under perfusion strømmer farvestoffet gennem axolotl's blodkar og inkorporerer i lipid-dobbeltlaget af vaskulære endotelceller ved kontakt. Perfusionsproceduren tager cirka en time for en otte-tommer axolotl. Umiddelbart efter perfusion wiTh DiI, kan axolotl visualiseres med et konfokal fluorescerende mikroskop. DiI udsender lys i rød-orange rækkevidden, når du er begejstret med et grønt fluorescerende filter. Denne DiI-perfusionsprocedure kan anvendes til at visualisere den vaskulære struktur af axolotler eller at demonstrere mønstre af revaskularisering i regenererende væv.
Introduction
Visualisering af vaskulatur spiller en afgørende rolle i forståelsen af organismernes struktur og funktion i mange arter. Fra det 16. århundrede med Leonardo da Vinci er modeller og grafiske fremstillinger af cirkulationen blevet undersøgt 1 . Ved hjælp af voks og gummiforme blev vævene perfuseret for at skabe tredimensionelle modeller af vaskulaturen, hvilket tillod undersøgelsen af organogenese og patogenese 1 , 2 . Harpikser og voks blev farvet med farvestoffer såsom Indien Ink eller carmine rød for at tillade deres nemme visualisering 1 , 2 . Disse teknikker forårsagede imidlertid mange problemer, fordi deres høje viskositeter forhindrede fuld perfusion af vævet af interesse 1 . Da feltet blev mere sofistikeret, kom brugen af konfokale og elektronmikroskoper i spil, og bevægede perfusionsteknik Ues væk fra støbeforme og mod væskeformige perfusioner af vaskulaturen, hvoraf nogle tillod perfusion og billeddannelse af blodkar uden at ødelægge det oprindelige væv 3 . DiI, et fluorescerende carbocyaninfarvestof, er en sådan plet, som tillader perfusion af dyr uden beskadigelse af det vaskulære væv.
Carbocyaninfarvestoffer er lipofile farvestoffer, som indarbejder i cellemembraner ved kontakt. Disse farvestoffer tillader let og øjeblikkelig farvning af vaskulære endotelceller, der derefter kan ses under et fluorescerende konfokalt mikroskop. DiI bevæger sig via lateral diffusion i lipidmembranen af celler, som vist i mærkning og sporing af neuroner 4 . Kemisk giver de to alkylkæder af DiI farvestoffet dets høje affinitet for cellemembraner, mens to konjugerede ringe fra en fluorochrom, der er ansvarlig for udgivelse af en rød bølgelængde, når de er spændt af grønne fluorescerende lysfiltre> 4. DiI er blevet udnyttet i mange kapaciteter, herunder vellykket mærkning af plasmamembranen og både anterograd og retrograd mærkning i neuroner 5 , 6 . DiI er tidligere blevet anvendt i perfusionsprotokoller, mens visualisering af muskulaturen 7 .
Axolotls ( Ambystoma Mexicanes ) er salamanders, der udelukkende bor i brakede søer nær Mexico City, Mexico. Disse dyr er blevet en vigtig model for at forstå regenerative processer, da de kan regenerere fulde lemmer, hale (herunder nerve ledning), dele af hjertet og andre indre organer og dele af øjet som voksne 8 , 9 . Derudover er det nu muligt med den nylige anvendelse af genetiske værktøjer i axolotter at få enestående indsigt i molekylerne og cellerne, der driver disse processer 8 . Den succesfulde regenRation af en hel lem kræver en omfattende revaskularisering proces, som kan spille en vigtig rolle i regenerering ud over blot de traditionelle funktioner blodkar i at yde ilt og næringsstoffer. Forståelse af revaskularisering i forbindelse med vævsregenerering er afgørende. Axolotl blodkar er tidligere blevet visualiseret ved hjælp af Indien Ink, og mens resultaterne var spændende, er denne proces ikke blevet revideret i de efterfølgende årtier 10 . Vi forsøgte at tilpasse en DiI-perfusionsprotokol udviklet til anvendelse i pattedyr for at muliggøre fuldstændig perfusion og visualisering af axolotl vaskulaturen 7 . Denne protokol beskriver de trin, der er taget for at lykkes perfekt, og efterfølgende visualiserer axolotl-cirkulationen med en DiI-farvningsteknik. Denne procedure vil muliggøre præcis visualisering af patent blodkar i homeostatiske væv såvel som i regenererende væv og giver en ny metode til visualizatioN og analyse af revascularization processen i axolotl.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle axolotl-eksperimenter blev udført i overensstemmelse med Brigham og Women's Hospital's (BWH) Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Opsæt Perfusion Experiment
- Anbring en voksen axolotl i en plastbeholder fyldt med 0,1% tricinopløsning (MS222) i 15-20 minutter eller indtil den er bedøvet fuldstændigt. Sørg for, at beholderen er fyldt med tilstrækkelig tricinopløsning, således at aksolotlen er helt nedsænket.
Bemærk: Alle procedurer skal udføres i overensstemmelse med retningslinjer for institutionel dyresundhed. Ved BWH betragtes en axolotl som helbedøvet, når den ikke fejler en fodnypeprøve, hvilket betyder, at der ikke er nogen refleksiv bevægelse, når foden er forsigtigt presset.
Forsigtig: Selvom tricin er et bedøvelsesmiddel, der specifikt anvendes til vandorganismer, bør direkte hudkontakt med tricinopløsningen undgås. - Indstil axolotl perfusion station.
- PlacerAbsorberende pude på en plan, plan overflade med den absorberende side opad.
- Skær et hul i polystyrenskumrammen, der er den passende størrelse og form for den bedøvede axolotl at ligge i ryglinjen. Placer rammen på absorberingspuden.
Bemærk: Nogle ekstra papirhåndklæder kan placeres straks under rammen for ekstra absorption. - Læg peristaltiske pumpe med perfusionsslangen. Indstil pumpen til en flowhastighed på 0,7 ml / min, der strømmer i urets retning.
- Lav fortyndingsopløsningen med 0,7x PBS og 5% glucose i en 1: 4-blanding.
- Bland 10 ml fortyndingsopløsning med 200 μl af DiI-stamopløsningen i et 50 ml konisk rør. Hætte og bland ved inversion. Dæk dette rør med aluminiumfoliepapir for at beskytte arbejdsløsningen mod udsættelse for lys.
Bemærk: Volumen skal ændres i forhold til aksolotlens størrelse proportionalt. Disse værdier er for en ca. 15 cm axolotl (snout til hale længde). ENNimaler af denne størrelse må ikke have nået fuld seksuel modenhed, så dyresyn kan ikke bestemmes på dette tidspunkt. - Fyld et 50 ml konisk rør med 0,7 x PBS.
Bemærk: PBS vil blive brugt til priming af loop og axolotl exsanguination. - Vedhæft 27-gauge-butterflynålen til udgangsenden af perfusionsrøret. Fold sommerfuglens vinger på hinanden og sæt dem i klemstativet.
- Placer den frie ende af perfusionsrøret i det 50 ml koniske rør fyldt med 0,7 x PBS og kør perfusionspumpen, indtil hele slangen er fyldt med opløsning. Pause pumpen, når hele slangen er fyldt med PBS.
Bemærk: Sørg for, at slangen altid er fri for luftbobler, da disse vil medføre luftemboli i axolotl og forhindre fuld perfusion. - Anbring et papirhåndklæde i den aksolotformede form i polystyrenskumrammen. Brug en overførselspipette, blød håndklædet med tricainopløsning.
Bemærk: Skær et lille firkant i midten af papirtrådenEl for at tillade dræning af fluider under perfusionsproceduren. - Placer den bedøvede axolotl liggende på papirhåndklædet inde i polystyrenskumrammen.
2. Åbning af Axolotl-brystet
- Brug kirurgiske tang for at klemme huden langs aksolotlens brystkasse midt under aksen. Træk op.
- Brug en skalpel til at lave et lille snit, hvor huden er trukket.
- Fjern en firkantet patch af huden over brystet for at afsløre to bruskplader.
- Fjern huden for at åbne et vindue over thoracic hule, der er stort nok til tydeligt at se hjertet og ca. 5 mm af aortaen, der forgrener sig af hjertet.
- Forsigtigt at rive bindevævet med tang eller den lukkede saks for at undgå at skære større blodkar.
- Løft hver brusk plade individuelt med tang og punktafgifter dem wMed den kirurgiske saks.
- Klip forsigtigt perikardiet med tangene, træk op og punkter det med kirurgiske sakse; Dette snit skal være lige dybt nok til at punktere det meget tynde perikardium og bør være stort nok til at tillade fjernelse af perikardiet. Pas på ikke at skære hjertet.
- Fjern forsigtigt perikardiet for at udsætte hjertet og aorta.
Bemærk: Brug en overførselspipette med jævne mellemrum til at spule brysthulen og gyllene med trica-opløsning for at holde området klart og holde æggeløbet bedøvet.
3. Perfusion af Axolotl
- Placér klemstativet med den indlæste sommerfuglnål ved siden af polystyrenskumrammen, således at armens klemme let kan manipuleres for at indsætte nålen i aksolotl aorta. Peg nålens spids mod det rostraliske aspekt af dyret under indføring og hold nålen parallelt med aorta for at undgå at punktere den gennem opPosite side.
- Tænd den peristaltiske pumpe. 0,7x PBS bør fortsætte med at strømme gennem slanger.
- Indsæt nålen i aorta.
- Skub tangene under aortabuen og træk lidt op for at give let adgang.
- Manøvrer nåleklemmekombinationen således, at nålen løber langs aortaens længde og peger op mod hovedet. Indsæt nålen, mens du bruger tangene til støtte bag aorta.
Bemærk: Nålen skal indsættes dybt nok i aorta for at sikre, at den ikke glider ud under perfusion. Dette kan være ca. 5 mm for en 15 cm axolotl. Sørg for, at nålen er helt i overensstemmelse med aorta for at undgå fuldstændig punktering af fartøjet. Gennemgående punkteringer kan forårsage massiv blødning og nedsætte succesrate for perfusion. Succesfuld indsættelse kan bekræftes ved synlig udvidelse af hjertets atria.
- Hurtigt lacerate et atrium med sciSsorer og tillade blod at dræne.
- Skyl med tricinopløsning for at forhindre blodakkumulering og dannelse af blodpropper i brysthulen.
- Perfuse axolotl med ca. 20-30 ml PBS. Dyret skal skifte fra lyserød i farve til hvid i en vellykket perfusion.
- Pause peristaltisk pumpe og flyt den ledige ende af slangen i 15 ml rør af DiI-opløsning. Genstart pumpen, pas på at undgå at skabe luftbobler i slangen.
- Perfuse den axolotl med hele arbejdsstyrken af DiI.
Bemærk: I en vellykket perfusion, aksolotl med skift farve til lys lyserød af DiI. Dette vil være mest mærkbare i gyllene. - Pause pumpen efter perfusion med DiI er færdig og sæt den ledige ende af slangen i 4% Paraformaldehyd (PFA) opløsning for at fixere vævet. Genstart pumpen og perfusér mindst 10 ml PFA.
Forsigtig: PFA er toksisk og skal håndteres og disponeresSed af passende. Handsker og sikkerhedsbriller skal bæres, og der skal foretages løsninger inden i en dampplade. Perfusion af axolotl med PFA for at fikse vævet resulterer i dyrets død.
4. Afslutning af perfusion og visualisering
- Stop den peristaltiske pumpe og fjern nålen fra axolotl aorta.
- Placer axolotl på en plastplade.
Bemærk: Brug af halvdelen af en stor Petri-skål fungerer godt og giver mulighed for at hælde en lille mængde Tricaine eller PBS på axolotl for at holde huden våd og forbedre visualiseringskvaliteten. - Bortskaf alle brugte materialer i de relevante affaldsbeholdere. Rens kirurgiske værktøjer med 70% ethanol, desinficere ved hjælp af en glasperle sterilisator mellem dyr og sterilisere ved autoklavering efter proceduren. Skyl rør med PBS-opløsningen og dernæst dræne, tørre helt og opbevare til videre brug.
5. Visualisering af Perfused Axolotl
Bemærk: For at opnå et billede af høj kvalitet kan følgende parametre bruges: eksponering for 1,1 s, gevinst på 1x, mætning på 1,0, forstørrelse på 2X.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med DiI-farvning kan axolotlens vaskulatur let visualiseres. Blodkugler af dyr perfunderet med det lipofile farvestof er umiddelbart synlige under et fluorescerende konfokalt mikroskop. Figur 1 .1-1.5 er en skematisk repræsentation af perfusionsprotokollen. Efter perfusion med det lyserøde farvestof vil en vellykket perfuseret axolotl blive lyserød. Ved anvendelse af et grønt fluorescerende filter på et konfokalmikroskop vises en rød emission af det vaskulære netværk. DiI-farvningen forekommer i alle legemsvæv, når perfusion er vellykket, herunder hale, lemmer, gæller og øjne ( figur 2A , figur 2B , figur 2C , figur 2D , repektivt). Unsuccessful perfusions resulterer i mangel på rød-farvet vaskulatur eller i ujævn farvning af karrene.
Ntent "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Figur 1: Skematisk af perfusionsprotokollen. Axolotl'er med succes præpareret med det lipofile farvestof, DiI, demonstrerer fuld farvning af vaskulaturen ved billeddannelse. 1: Fuldtliggende axolotl før perfusionsforsøg. 2: Åbning af axolotlens bryst. 2: Axolotl med åbent brysthulrum. 3: Indføring af 27 G sommerfuglnålen i aorta af axolotl. 4: Tubing bør først indeholde 0,7x PBS, derefter DiI-arbejdsløsningen og endelig 4% PFA. 5: Fuldt perfuserede axolotter virker rosa. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Billeder af en fuldt perfused Axolotl. Billeder af axolotl-vaskulaturen blev taget under anvendelse af et fluorescerende konfokalt mikroskop efter vellykket perfusion med DiI-pletten. 2A: Hale. 2B: Fod. 2C: Gills. 2D: øje. Imaging er lavet ved hjælp af et konfokalmikroskop med en grøn fluorescerende emissionsfilterkube. Forstørrelse for billederne A, B, C og D er henholdsvis 1,74x, 2,16x, 1,18x og 5,69x. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Visualisering af aksolotlens vaskulat kan med succes udføres via perfusion med det lipofile carbocyaninfarvestof, DiI. I dette studie beskriver vi en ny protokol til perfusion af axolotl med DiI ved hjælp af en peristaltisk pumpe. Vi viser også den efterfølgende visualisering af axolotl vaskulaturen ved hjælp af et fluorescerende konfokalmikroskop. Denne protokol var en tilpasning af gnaver DiI-perfusionsprotokollen set i Li et al. 7 , men store forskelle mellem gnaver og aksolotl krævede en revision af protokollen for at passe til axolotl-modellen.
Denne undersøgelse diskuterer en metode til DiI-perfusion af axolotl for at kunne visualisere vasculaturen med succes. Forskelle i anatomien og fysiologien mellem salamander og gnaver kræver ændringer i hovedaspekter af perfusion, herunder placering af nålindsættelse, perfusionsmetode og de anvendte reagenser. For at achEn vellykket perfusion begrænsede vi den skade, der blev gjort på aksolotlens vaskulatur. Under åbningen af brysthulen blev der taget omhu for fuldt ud at udsætte hjertet og aorta, samtidig med at der undgås skader eller lacerationer i større blodkar. Begrænsning af brugen af den kirurgiske saks forhindrede utilsigtet udklipning af større fartøjer, mens små indsnit holdt kontrol over eksponeringen af hjertet og aorta. Succeshastigheder for perfusioner steg også, da DiI-nålen blev indsat gennem aorta, snarere end direkte ind i hjertets kamre. Axolotl, i modsætning til musen, har et trekammeret hjerte, der kun indeholder en ventrikel med signifikant mindre muskulatur end musens. På grund af disse forskelle måtte placeringen af nålindsættelse flyttes til den mere stabile aorta. Aorta var bestemt til at være den optimale placering til indsættelse af perfusionsnålen, da den er stor nok til punktering med en 27 G nål og har begrænset bevægelse. Bevægelsen var minimalFor at undgå utilsigtet fjernelse eller glidning af perfusionsnålen eller gennem-og-gennem-punktering af aorta. Kardiale perfusioner ved hjælp af ventriklen som et indsættelsespunkt viste sig at have en meget lavere succesrate end dem med et aortaindføringspunkt. Fejlfinding i vaskulaturen resulterede ofte i dannelse af emboli eller forhindret perfusion, hvilket resulterede i meget lave hastigheder af vellykket vaskulær mærkning. Ved at bruge en klemstativ til at holde sommerfuglnålen under perfusion, har vi nedsat sin bevægelse og derfor øget hastigheden af succesfulde perfusioner. Endvidere var en peristaltisk perfusionspumpe på grund af delikatessen af axolotlvævet i sammenligning med musen nødvendig, i modsætning til den tidligere anvendte manuelle perfusion. Brugen af denne pumpe tillod en håndfri tilgang til axolotl perfusion for at minimere fejlagtig punktering af det tynde væv. Perfusioner var mislykket af mange flere grunde, herunder gennemgående punctUre, koagulering og emboli. I tilfælde af at nålen blev indsat i aorta og en anden punktering blev skabt gennem den bageste væg, ville DiI-løsningen strømme direkte ind i brysthulen snarere end at passere gennem den systemiske cirkulation. Derudover dannede blodet en blodprop, som kunne forhindre perfusion, når blod forlod vaskulaturen. Klumper og luftbobler kan også danne sig i vaskulaturen, hvilket forårsager emboli, som udelukker vellykket perfusion. Endelig er denne protokol inkorporerede reagenser indstillet til at passe til axolotl-osmolaliteten, som adskiller sig væsentligt fra pattedyrets. Tilpasning af denne protokol og de væsentlige ændringer, der er foretaget for at passe til axolotl-modellen, vil hjælpe med at forstå processen med revaskularisering af væv under regenerering.
DiI, som er pink i farve, vil perfuse dyret og give det en lyserød nuance. Succesfyldte axolotter blev lyse lyserøde til det blotte øje med megetVaskulariserede områder forekommer mere intensivt farvede. Perfuse dyr, der ses med et fluorescerende konfokalmikroskop ved hjælp af et grønt filter, kan visualiseres i det rød-orange emissionsspektrum. Vaskulatur blev bedst visualiseret i tyndere væv, der minimerede utilsigtet DiI-farvning af ikke-vaskulært væv. Perfusion af vævet med 4% paraformaldehyd (PFA) umiddelbart efter DiI-perfusion bør gøres for at fixere vævet.
DiI-perfusioner er endepunktsforsøg for axolotl. Under proceduren drænes hele dyrets blod effektivt og erstattes med 0,7x PBS, efterfulgt umiddelbart af DiI-opløsning og endelig 4% PFA. Dette forstyrrer axolotls evne til at engagere sig i den livlige handling af gasudveksling og det taber evnen til at iltge sit kropsvæv. På grund af denne endpoint-karakter indfanger hver perfusion kun et enkelt tidspunkt for vaskulær vækst, og dyret kan ikke perfuseres yderligere på et senere tidspunkt. På grund af denne tidsbegrænsningTing faktor, skal flere dyr bruges til at beskrive et tidsforløb af vaskulær udvikling.
Denne DiI-protokol og de ændringer, der anvendes for at forbedre den, kan bruges til at mærke og visualisere aksolotlens vaskulator med succes. Da axolotl er en væsentlig modelorganisme til undersøgelse af regenerering, giver succesfulde perfusioner mulighed for at forhøre angiogeneseprocessen under regenerering. Axolotl er en modelorganisme til undersøgelse af regenerering, fordi det er et neotagtigt dyr og derfor bevarer en bemærkelsesværdig evne til at regenerere gennem voksenalderen 8 . Revasculariseringsprocessen for regenererende væv er imidlertid ikke godt forstået, og derfor giver tilpasningen af DiI-perfusion til axolotl-systemet muligheder for at forstå regenerering, som ikke var tilgængelig med pattedyrsmodellen. Perfusion af axolotl ved hjælp af DiI er en ny teknik til undersøgelse af revasCularisering af regenereringsvæv i denne dyremodel. Denne protokol kan derfor yderligere anvendes til at forstå organogenese under udvikling og angiogenese under sygdom såvel som blive anvendt som et vigtigt værktøj under undersøgelsen af regenerering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af Brigham & Women's Hospital og March of Dimes. Forfatterne vil gerne takke alle medlemmer af det hvide lab for deres støtte og rådgivning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Peristaltic Pump | Marshall Scientific | RD-RP1 | |
| Perfusion tubing | Excelon Lab & Vacuum Tubing | 436901705 | size S1A |
| 27g butterfly needle | EXELint Medical Products | 26709 | |
| NaCl | AmericanBio | 7647-14-5 | |
| KCl | AmericanBio | 7747-40-7 | |
| Na2HPO4 | AmericanBio | 7558-79-4 | |
| NaH2PO4 | AmericanBio | 10049-21-5 | |
| Distilled water | |||
| HCl | AmericanBio | 7647-01-0 | |
| Glucose | ThermoFischer | A2494001 | |
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Sigma Aldrich | 468495 | |
| Ethanol (100% vol/vol) | Sigma Aldrich | 64-17-5 | |
| Surgical foreceps | Medline | MDG0748741 | |
| Polystyrene foam frame | any polystyrene foam square with an axolotl-shaped cut out | ||
| Surgical scissors | Medline | DYND04025 | |
| Scalpel | Medline | MDS15210 | |
| Absorbent underpad | Avacare Medical | PKUFSx | |
| Paper towels | |||
| Standard disposable transfer pipette | Fisherbrand | 50216954 | |
| Clamp stand | Adafruit | 291 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma Aldrich | E10521 | Tricaine powder |
| Adult axolotl | |||
| MgSO4 | AmericanBio | 10034-99-8 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016-100G | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761-500G | |
| Plastic tanks | Varying size appropriate for the axolotl | ||
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 30525-89-4 | |
| Axolotl | |||
| Leica Microscope | Leica | M165 FC | |
| ET-CY3 Fluorescent Filter | Leica | M205FA/M165FC | |
| MS-222 |
References
- Giuvarasteanu, I. Scanning electron microscopy of vascular corrosion casts - standard method for studying microvessels. Rom J Morphol Embryo. 48 (3), 257-261 (2007).
- Hasan, M. R., Herz, J., Hermann, D. M., Doeppner, T. R. Intravascular perfusion of carbon black ink allows reliable visualization of cerebral vessels. J Vis Exp. (71), e4374 (2013).
- Minnich, B., Lametschwandtner, A. Scanning electron microscopy and vascular corrosion casting for the characterization of microvascular networks in human and animal tissues. Microscopy: Science, Technology, Applications, and Education. 1, 29-39 (2010).
- Honig, M., Hume, R. I. DiI and DiO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends Neurosci. 13, 333-335 (1989).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Fluorescent carbocyanine dyes allow living neurons of identified origin to be studied in long-term cultures. J Cell Biol. 103 (1), 171-187 (1986).
- Schwartz, M., Agranoff, B. W. Outgrowth and maintenance of neurites from cultured goldfish retinal ganglion cells. Brain Res. 206 (2), 331-343 (1981).
- Li, Y., Song, Y., Zhao, L., Gaidosh, G., Laties, A. M., Wen, R. Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI. Nat Protoc. 3 (11), 1703-1708 (2008).
- Kuo, T. H., Kowalko, J. E., DiTommaso, T., Nyambi, M., Montoro, D. T., Essner, J. J., Whited, J. L. Evidence of TALEN-mediated gene editing of an endogenous locus in axolotl. Regeneration. 2 (1), 37-43 (2015).
- Brockes, J. P., Kumar, A. Appendage Regeneration in Adult Vertebrates and Implications for Regenerative Medicine. Science. 310 (5756), 1919-1923 (2005).
- Smith, A. R., Wolpert, L. Nerves and angiogenesis in amphibian limb regeneration. Nature. 257 (5523), 224-225 (1975).
