Summary
细胞间连接是乳腺阶段特异性功能和发育的必需条件。该手稿提供了一个详细的方法，用于研究蛋白质 - 蛋白质相互作用（PPI）和使用鼠乳腺的共定位。这些技术允许调查不同发育阶段的细胞间连接之间的物理联系的动力学。
Abstract
细胞间的相互作用在保持组织完整性和乳腺不同隔室之间的屏障方面发挥关键作用。这些相互作用由在相邻细胞之间形成核酸的连接蛋白提供。功能蛋白质错位和与其结合配偶体的物理缔合减少可导致功能丧失，从而导致器官功能障碍。因此，在正常和疾病相关组织中鉴定蛋白质定位和蛋白质 - 蛋白质相互作用（PPI）对于找到导致疾病发展或发育状态改变的新证据和机制是至关重要的。该手稿提供了两步法评估鼠乳腺中的PPI。在方案1中，描述了使用针对感兴趣的蛋白质产生的抗体，随后用荧光染料标记的二抗进行共免疫荧光（co-IF）的方法。虽然共同所有为了证明蛋白质的接近程度，它确实有可能研究其物理相互作用。因此，在协议第2节中提供了共免疫沉淀（co-IP）的详细方案。该方法用于确定蛋白质之间的物理相互作用，而不确认这些相互作用是直接还是间接的。在过去几年中，共同中心和共同IP技术已经证明，细胞间连接的某些组成部分共同定位并相互作用，从而在乳腺发育过程中产生不同阶段依赖的连接性核酸。
Introduction
乳腺生长发育主要发生于出生后。这种器官在整个哺乳动物的生殖生活中不断地改造自己1 。成年乳腺上皮由腔内上皮细胞的内层和由基底膜2包围的主要由肌上皮细胞组成的基底细胞外层组成。为了对乳腺结构和发育的良好综述，读者可以参考Sternlicht 1 。通过间隙（GJ），紧密（TJ）和粘附（AJ）结的细胞 - 细胞相互作用对于腺体1,3,4,5,6的正常发育和功能是必需的。这些小鼠乳腺结节的主要成分是Cx26，Cx30，Cx32和Cx43（GJ）;紧密连接-1，-3，-4和-7和ZO-1（TJ）;和E-钙粘蛋白，P-钙粘蛋白和β-连环蛋白（AJ） 7,8 。这些不同连接蛋白的表达水平在乳腺发育过程中以阶段依赖的方式变化，这表明差异细胞 - 细胞相互作用的要求9 。 GJ，TJ和AJ在结构和功能上相互连接并将其他结构或调节蛋白连接到相邻细胞的相邻位点，从而产生连接性连接10 。连接关系的组成可以影响与下面的细胞骨架的桥接，以及连接通透性和稳定性，因此可以影响腺体8,9,10,11的功能。细胞间连接的组成部分存在于连接核酸中，或者彼此相互作用最近使用共免疫荧光（co-IF）和共免疫沉淀（co-IP） 9分析了乳腺发育的不同发育阶段。虽然其他技术允许评估蛋白质之间的功能关联，但这些方法在本手稿中没有提出。
由于蛋白质仅仅单独起作用，研究蛋白质 - 蛋白质相互作用（PPI），如信号转导和生物化学级联，对许多研究人员来说是必不可少的，可以提供关于蛋白质功能的重要信息。 Co-IF和微观分析有助于评估一些共享相同亚细胞空间的蛋白质。然而，目标的数量受到必须在不同动物中提高的抗体以及通过使用配备有不同波长激光器的共聚焦显微镜和用于复用的光谱检测器的抗体的限制。 Co-IP确认或揭示高亲和力的物理相互作用een两个或更多的蛋白质位于蛋白质复合物内。尽管开发了诸如荧光共振能量转移（FRET） 12和邻近连接测定（PLA） 13等新技术 ，其可以同时检测蛋白质的定位和相互作用，但共有IP仍然是一种适当和可负担的技术来研究内源蛋白。
本手册中描述的逐步方法将有助于蛋白质定位和PPI的研究，并指出在研究乳腺中的内源PPI时应避免的缺陷。该方法从对每种技术所需组织的不同保存程序的介绍开始。第1部分介绍了如何在三个步骤中研究蛋白质共定位：i）乳腺切片，ii）使用co-IF技术对不同蛋白质的双重或三重标记，以及iii）成像蛋白质定位。第2部分显示如何沉淀内源性蛋白质并以三个步骤鉴定其相互作用的蛋白质：i）裂解物制备，ii）间接蛋白质免疫沉淀，以及iii）通过SDS-PAGE和Western印迹结合配偶体鉴定。该方案的每一步都针对啮齿动物乳腺组织进行了优化，并产生了高质量，特异性和可重复的结果。该方案也可用作其他组织或细胞系中PPI研究的起点。
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Protocol
本研究中使用的所有动物方案均由大学动物护理委员会（INRS-Institut Armand-Frappier，Laval，Canada）批准。
识别蛋白质共定位
- 从组织到显微镜片
注意：组织和部分应在干冰上处理。- 从动物上清除乳腺（有关此程序的完整描述，请参阅Plante 等人 ）。
- 将切除的组织嵌入冷冻/安装介质中的干冰上。添加足够的培养基覆盖腺体。当培养基固化时，将组织转移到-80℃的冷冻箱中供以后使用9 。
- 使用设置在-35°C的冷冻切片机，将组织切成7-10μm厚的切片并将其放置在显微镜载玻片上。
注意：尽可能在每张幻灯片上放置两个部分;左侧部分将被用作特异性对照以验证抗体的特异性和组织的自发荧光，而右侧将用抗体标记。 - 将部分保持在-80°C以备后用。
- Co-IF染色
- 从冷冻箱中取出适当的微观载玻片，并在室温（RT）下将其浸入4％甲醛中15分钟立即固定切片。
- 然后在室温下将载玻片浸入磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。将幻灯片放在PBS中，直到进入下一步。
- 使用市售的疏水屏障或防水实验笔（参见“材料表” ）圈住滑块的每个部分。小心不要接触组织。立即向组织中加入一滴PBS，并将载玻片置于潮湿的组织学室中，以进行剩余的操作。
注意：组织切片必须保持保湿。替代请使用带盖的盒子，并将湿纸巾放在底部。 - 使用100-200μL3％牛血清白蛋白（BSA）-Tris缓冲盐水（TBS）-0.1％聚山梨醇酯20（参见材料表 ）将每个组织切片封闭 30分钟。当样品阻塞时，通过在TBS-0.1％聚山梨醇酯20中稀释抗体来制备一抗和二次抗体溶液。
注意：抗体所需的浓度由制造商提供;参见材料表和图1和图2 ，以及Dianati 等人 9 。尽管在使用大多数荧光团缀合的抗体时不需要在黑暗中工作，但避免将抗体溶液或染色的组织暴露于强烈的明亮的光线下。 - 通过抽吸去除封闭溶液，并在室温下将100-200μL稀释的一抗孵育切片60分钟。 Alternatively，在4℃下与第一抗体孵育过夜。
- 通过抽吸去除一级抗体溶液，并用250-500μLTBS-0.1％聚山梨醇酯20洗涤切片5分钟。通过抽吸去除洗涤液，重复洗涤两次。
- 通过抽吸去除洗涤溶液，并在室温下用100-200μL适当的荧光团缀合的二抗孵育切片60分钟。
- 通过抽吸去除第二抗体溶液，并用250-500μLTBS-0.1％聚山梨醇酯20洗涤切片5分钟。取出洗液并重复两次。
- 重复步骤2.5-2.8，使用适当的初级和次级抗体组合，用于感兴趣的后续蛋白质。
- 通过抽吸去除洗涤溶液并通过将部分与100-200μL的1mg / mL 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）在TBS-0.1％聚山梨醇酯20中孵育5分钟进行核染色，并进行细胞核染色RT。
- 通过抽吸去除DAPI溶液，并使用水溶性，非荧光的安装介质（参见材料表 ）和盖玻片安装载玻片。一次进行一张幻灯片。
注意：孵育核染色超过5分钟不会改变染色强度。或者，移除所有载玻片上的DAPI溶液，并在安装载玻片的同时孵育PBS中的组织。 - 将幻灯片平放在4°C冰箱中至少8小时。继续进行荧光显微镜成像（参见图1和图2 ）。
- 显微成像
- 使用配备有在其特定波长处激发荧光团所需的各种激光器的共聚焦显微镜来观察荧光团缀合的二次抗体。
注意：为了能够可视化管道和肺泡，建议使用数值孔径为0.95的40X物镜。例如e的具体设置如图1所示 。 - 通过在当时扫描一幅波长的图像来单独验证每种蛋白质的定位。
注意：在这个阶段，重要的是严格分析连接蛋白的定位。为了能够形成连接核酸，这些蛋白质必须位于质膜上。 - 通过合并在不同波长的激光扫描的图像来确定蛋白质的共定位。
注意：蛋白质共定位可以通过在相同位置发射两个或更多个荧光团而产生的颜色变化来显现，并且可以使用适当的软件测量（ 图1和2 ;也参见参考文献9）。
- 使用配备有在其特定波长处激发荧光团所需的各种激光器的共聚焦显微镜来观察荧光团缀合的二次抗体。
2.学习PPI
注意：腹部乳腺应用于研究PPI，因为胸腺与胸部紧密相关肌肉。消毒乳腺（有关此程序的完整说明，请参阅Plante 等人 ） 14并将其保持在-80°C以备后用。
- 裂解液制备
- 将称重纸和2 mL微量离心管放在干冰上预先冷却，然后再进行下一步骤。
- 从-80°C取乳腺组织，并将其保存在干冰上。
- 称重预冷计量纸上的组织，然后将组织转移到2 mL微量离心管（干冰处理）上。每个样品使用50至100 mg的组织。将组织保持在干冰上，直到步骤2.1.5。
- 使用下列公式，制备所需量的补充有NaF，NaVO 3和蛋白酶/磷酸酶抑制剂的三重洗涤剂溶解缓冲液，如材料表所示。小鼠：所需缓冲液（μL）=小鼠组织重量（mg）×3;老鼠：需要缓冲液（μL）=大鼠组织重量（mg）×5。
- 将所需量的冰冷裂解缓冲液（在步骤2.1.4中计算）加入到含有组织的2mL管中。
注意：在步骤2.1.5-2.1.6中，一次进行一根单管。 - 使用组织研磨机上的连续匀浆将组织匀化30-40秒;始终将管保持在冰上。将组织匀浆器调整至中等速度，并轻轻地将研磨机上下移动到管内。
- 与其他管重复步骤1.6和1.7。
- 将溶胞产物在冰上孵育10-30分钟。
- 在4℃下以170×g离心管10分钟。
- 同时，为每个样品确定6-10个微量离心管（0.6 mL），并将其保存在冰上。
- 离心完成后，检查管子。确保它们含有顶层脂肪，透明，黄色至粉红色的裂解物（取决于显影阶段）和颗粒。
- 在脂质层中创建一个孔使用200μL移液管吸头进入液相。改变提示并收集裂解物，而不会干扰沉淀或吸入脂质层。将裂解物在冰上预先标记的管中等分（步骤2.1.11），并将其储存在-80℃。
- 使用等分试样使用适当的市售试剂盒来定量蛋白质浓度（见材料表 ）。
- 间接免疫沉淀
- 在冰上，解冻之前制备的全部乳腺裂解物的两个等分试样。
注意：一个等分试样将用于目标蛋白质的IP，而另一个将用作阴性对照。 - 收集500-1,000μg裂解物，并在PBS中稀释至每个1.5 mL管中达到最终体积200μL。
注意：使用的裂解物的量取决于感兴趣的蛋白质的丰度和抗体的效率（参见图3的例如，以及材料表 ）。为了优化每个靶，应使用不同量的裂解物（ 即 500,750和1,000μg）和抗体（ 即 5,10和20μg）。继续执行以下步骤（2.2.3-2.3.7.4）。 - 将针对感兴趣的抗原的抗体添加到第一个裂解物管中并保持在冰上。
注意：所需金额通常由每家公司提供的说明书中提出（见材料表 ）。 - 在第二管中，通过加入与步骤2.2.3中使用的抗体相同的同种型IgG对照浓度来制备阴性对照。
- 在管式辊式混合器中以4℃低速孵育管过夜。
- 第二天，将50μL磁珠加入新的1.5 mL管中进行预洗。
- 基于对抗体的相对亲和力，选择蛋白A或蛋白G磁珠。 避免使用聚集的珠子是很重要的;轻轻混合珠悬浮液，直至将其均匀地重新悬浮，然后再加入管中。
- 将含有珠粒的管放在磁性支架上，使珠子迁移到磁体上。使用200μL移液管从珠中取出储存缓冲液。
- 通过加入500μLPBS-0.1％聚山梨醇酯20洗涤珠子，并将管子剧烈旋转10秒。
- 将管子放回到磁性支架上，让珠子移动到磁铁上。
- 用200μL移液管移液多余的洗涤缓冲液。
- 将步骤2.2.5中的反应络合物（裂解物抗体）加入到珠中，并在辊式混合器中在室温下孵育90分钟。
- 将管放在磁性支架上，使珠子迁移到磁铁上。使用200μL移液管，吸出并丢弃裂解物，并将管置于冰上。
- 清洗珠子通过加入500μLPBS，将管置于磁性架上，并用200μL移液管除去液体。重复这个洗涤步骤。在洗涤步骤中，避免涡旋并将样品保持在冰上。
- 用PBS-0.1％聚山梨醇酯20洗涤珠子一次，不涡旋，并使用200μL移液管吸头丢弃最后的洗涤缓冲液。
- 为了洗脱，向管中加入20μL的0.2M酸性甘氨酸（pH = 2.5），并在辊式混合机上摇动7分钟。
- 以高速离心几秒钟（快速旋转），并将上清液收集在新鲜的冰冷管中。
- 对每个管重复步骤2.2.14和2.2.15。
注意：最终体积为40μL。 - 将10μL4x Laemmli缓冲液加入到步骤2.2.16的40μL洗脱样品中。
注意：由于酸性pH，颜色会变黄。 - 立即将1 M Tris（pH = 8）一次一滴加入从步骤2.2.18洗脱的样品至其颜色变蓝继续下一个管。
- 将样品从步骤2.2.18在70-90℃下煮沸10分钟。立即进行凝胶电泳。或者，将样品转移至-80°C的冷冻箱中直至加载。
- 在冰上，解冻之前制备的全部乳腺裂解物的两个等分试样。
- 下游应用：凝胶电泳，然后进行Western印迹
- 按照标准程序准备分离和堆叠SDS-PAGE丙烯酰胺凝胶（1.5 mm厚） 15 。
注意：凝胶的选择（8-15％丙烯酰胺，梯度：参见材料表 ）应根据要沉淀的蛋白质的分子大小和待分析的潜在的结合配偶体来确定。这些蛋白质必须彼此分离，以便进行适当的免疫检测。 - 在冰上解冻免疫沉淀（IP） - 样品（步骤2.2.20）。
- 从相同的样品制备蛋白质裂解物（用于上述IP程序）。使用50的总裂解物并加入4X Laemmli样品缓冲液。将样品在70-90℃下煮沸5分钟，置于冰上直至加载。
注意：这些样品将在洗脱的IP样品旁边加载，以证明在总裂解物中存在沉淀的蛋白质。 - 将来自步骤2.3.3的制备的裂解物和来自步骤2.2.20的沉淀的样品并排放在丙烯酰胺凝胶中，并将其运行在运行缓冲液（10×运行缓冲液：30.3g Tris，144.1g甘氨酸和10在1L蒸馏水中的SDS）在100V下进行近似95分钟，或者直到迁移蛋白的边缘到达凝胶的底部。
- 使用标准方案9,15将凝胶转移到硝酸纤维素或PVDF膜上。
- 在5％干牛奶-TBSBS（20mM Tris，500mM NaCl，和0.05％聚山梨醇酯20）中，在低速摇瓶上将膜封闭1小时。
- 确定降水是否成功cessful。
- 探测使用针对沉淀蛋白的第一抗体的膜，以5％干奶牛TTBS以制造商推荐的浓度稀释，在4℃下在缓慢搅动的摇摆平台上过夜。
注：有关建议，请参见材料表 。 - 第二天，用高速搅拌的摇摆平台上的TTBS洗涤膜3次，每次5分钟。
- 在慢慢搅拌的摇摆平台上，将RTT上缀合有辣根过氧化物酶（HRP）的适当的二抗体在TTBS上孵育1小时。
注意：或者，如果检测到信号的适当装置可用，则可以使用与荧光染料缀合的二抗。 - 在高搅拌的摇摆平台上进行3至6次洗涤，每次5分钟，用TTBS洗涤。通过将膜与商业化孵育来分析二抗的信号可用的鲁米诺溶液（见材料表 ），并遵循制造商说明。使用化学发光成像系统检测信号（参见材料表 ）。
注意：有关Western印迹分析的详细方案，请参见参考文献16。
- 探测使用针对沉淀蛋白的第一抗体的膜，以5％干奶牛TTBS以制造商推荐的浓度稀释，在4℃下在缓慢搅动的摇摆平台上过夜。
- 要确定相互作用的蛋白质，请执行步骤2.3.7.1-2.3.7.4在相同印迹上使用适当的抗体。
注意：如果蛋白质相互作用，结合配偶体将与靶蛋白共同免疫沉淀，因此可通过Western印迹法检测。可以用更多的抗体重复步骤2.3.8，以确定其他蛋白质是否存在于相同的蛋白质复合物中，只要蛋白质的分子量不同就足以在凝胶和膜上分离得很好。 - 要确认所识别的绑定伙伴不是工件，应执行互惠IP。
注意：这是通过重复执行的步骤2.2.1-2.2.20，其具有相同的裂解物，但沉淀步骤3.8中鉴定的结合伴侣之一。然后，使用针对目的蛋白的第一抗体重复步骤3.1-3.8。
- 按照标准程序准备分离和堆叠SDS-PAGE丙烯酰胺凝胶（1.5 mm厚） 15 。
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Representative Results
为了确定GJ，AJ和TJ组分是否可以在乳腺中相互作用，首先进行共IF测定。分别用特异性抗体探测Cx26，GJ蛋白和β-Catenin，一种AJ蛋白，分别用荧光团缀合的小鼠-647（绿色，假色）和山羊-568（红色）抗体（ 图1B和C ） 。数据显示，在哺乳期第7天（L7），它们在小鼠乳腺的上皮细胞的细胞膜上共同定位，如黄色所反映的（ 图1D ）。其次，紧密连接蛋白-7，TJ蛋白; E-钙粘蛋白，一种AJ蛋白;和连接蛋白26（Cx26），其GJ蛋白用其特异性抗体进行探针，并分别用荧光团缀合的兔-488（绿色），小鼠-555（红色）和小鼠-647（珊瑚蓝;假色）抗体揭示（ 图2B-D ）。 E-钙粘蛋白和紧密连接蛋白-7共定位是显示为黄色至浅橙色，而Cx26与E-钙粘蛋白和紧密连接蛋白-7共定位导致在怀孕第18天（P18）（ 图2E ）的小鼠乳腺中发生白色斑点染色。
为了发现哪些连接蛋白在细胞膜上相互混合和物理地束缚在一起，使用来自哺乳小鼠的乳腺组织进行共免疫沉淀（L14）。结果表明，GJ组分的Cx43与E-钙粘蛋白和紧密连接蛋白-7相互作用，但不与紧密连接蛋白-3相互作用（ 图3A和B ）。这些结果由互惠IP证实;当E-钙粘蛋白被免疫沉淀时，它与Cx43和紧密连接蛋白-7（ 图3C ）相互作用。
图1： β-连环蛋白和Cx26在细胞膜共定位在小鼠乳腺中发作。在哺乳期7（L7）的小鼠乳腺切片，切割（7μm），进行免疫荧光染色。 （ A ）用DAPI（蓝色）染色核。 （ B ）Cx26（绿色，假色）和（ C ）β-连环蛋白（红色）显示与合适的荧光团标记的抗体组合。 （ D ）合并图像。用配有光谱检测器的共焦显微镜获得图像。 DAPI可视化使用以下设置：发射波长450.0nm;激发波长，402.9nm;激光功率，1.2;检测器增益，PMT HV 100; PMT偏移量为0.Cx26（647）使用以下设置可视化：发射波长，700.0nm;激发波长637.8nm;激光功率2.1;检测器增益，PMT HV 110; PMT偏移，0.β-连环蛋白（568）使用以下设置可视化：发射波长，595.0nm;激发波长561.6 nm;激光权力2.1检测器增益，PMT HV 110; PMT偏移，0.比例尺=50μm。 请点击此处查看此图的较大版本。
图2：连接蛋白26（Cx26），E-钙粘蛋白和紧密连接蛋白-7共同定位于小鼠乳腺的细胞膜。 （ B ）紧密连接蛋白-7（绿色），（ C ）E-钙粘蛋白（红色）和（ D ）Cx26（珊瑚）处理妊娠18天（P18）的乳腺切片（7μm），进行免疫荧光染色蓝色;假色），与适当的荧光团标记的抗体组合。 （ A ）用DAPI（蓝色）染色核。用配有光谱检测器的共焦显微镜获得图像。使用f可视化DAPI以下设置：发射波长450.0nm;激发波长，402.9nm;激光功率，5.4;检测器增益，PMT HV 65; PMT偏移，0.使用以下设置可见紧密连接-7（488）：发射波长525.0nm;激发波长489.1nm;激光功率5.0检测器增益，PMT HV 12; PMT偏移，0.E-钙粘蛋白（568）可视化使用以下设置：发射波长为595.0nm;激发波长561.6 nm;激光功率13.5;检测器增益，PMT HV 45; PMT偏移量为0.Cx26（647）使用以下设置可视化：发射波长700.0;激发波长637.8;激光功率5.0检测器增益，PMT HV 55; PMT偏移，0.比例尺=50μm。 请点击此处查看此图的较大版本。
图3：Cx43，E-钙粘蛋白和紧密连接蛋白-7，但不是紧密连接蛋白-3参与蛋白复合物。使用500mg来自哺乳期小鼠乳腺的总裂解液免疫沉淀Cx43（ A和B ）和E-钙粘蛋白（ C ）。将IP和裂解物装入凝胶中并转移到PVDF膜上。由于紧密连接蛋白-7和紧密连接蛋白3具有相同的分子量，因此不能在同一膜上进行分析。因此，使用相同的Cx43裂解物进行两个平行的IP，负载在两个凝胶上并转移（膜A和B）。首先用Cx43探测膜A，以确认IP的效率（上图）。然后，依次用E-钙粘蛋白和紧密连接蛋白-7检测膜。蛋白质印迹分析显示两种蛋白质与Cx43相互作用。首先用Cx43检测膜B，以确认IP的效率（上图），然后用Claudin-3探测。 Western印迹分析显示，Claudin-3 did不是Cx43的IP，表明两种蛋白质不相互作用。首先用E-cadherin检测膜C，以确认IP的效率（上图）。然后，用Cx43和Claudin-7依次检测膜。蛋白质印迹分析证实蛋白质之间的相互作用。 请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
通过连接的细胞 - 细胞相互作用是许多器官（如乳腺）的正常功能和发育所必需的。研究表明，连接蛋白可以调节彼此的功能和稳定性，并通过在细胞膜10处彼此束缚来激活信号转导。目前手稿中提出的方案提供了有关连接蛋白差异表达，定位和正常鼠腺发育相互作用的有趣发现9 。鉴于连接蛋白定位对于蛋白质的功能至关重要，并且由于已知其与支架蛋白和许多激酶3相互作用，所以co-IF和co-IP是细胞 - 细胞相互作用领域中的有效技术。这些方法不仅对于在乳腺发育及其功能障碍中开辟连接关系的必要性至关重要在乳腺癌中的调节，但也可以用于其他组织和使用细胞系的实验中。
乳腺由两个主要部分组成：基质和上皮细胞4 。成年上皮由两层细胞制成。在这种方法中，使用co-IF技术确定了潜在的结合配偶体的接近程度，并且使用co-IP确认了它们的物理相互作用。 Co-IF已被其他人成功地用于证明蛋白质在同一组织，结构，细胞或细胞内区室17,18 内的 共定位 。这种技术的主要优点是其对构成组织的不同细胞类型中的每种蛋白质的细胞或亚细胞定位带来的视觉信息。虽然这种技术非常简单，但必须遵循一些建议。例如，为了避免组织损伤，始终使用200μL移液器或移液器一次一滴加液。这将允许组织表面的浸没而不损坏组织。类似地，使用放置在组织旁边的巴斯德吸管移除溶液，轻轻地倾斜滑块。此外，对于其储存溶液含有甘油的抗体，需要小心吸取洗涤缓冲液以减少背景。此外，在哺乳期间乳蛋白（例如酪蛋白）的存在可能通过捕获它们而干扰抗体，导致假阳性。因此需要对所得到的图像进行关键分析，特别是在此阶段。
这种联合中频技术也有一定的局限性或陷阱。首先，它需要特异性抗体。如前所述（步骤1.1），建议按照上述步骤，在每张幻灯片上使用一个部分（ 即右边的一个）进行染色，添加一级和二级抗体。对于剩余部分（ 即左侧的部分），按照相同的程序，使用TBS-聚山梨酯20 0.1％而不是一级抗体溶液。尽管使用肽竞争来验证抗体的特异性结合也是可能的，甚至更好，但是用于产生商业抗体的肽并不总是可用的。因此，使用阳性和阴性对照（ 即已知表达或不表达感兴趣的蛋白质的组织或细胞）来验证结合的特异性是重要的。此外，抗原固定位点是不可接近的，特别是对于福尔马林固定的组织，因此导致不存在特定的信号。因此，一些组织可能需要抗原检索程序。还可以在抗原恢复之前进行与洗涤剂的短暂孵育以使细胞膜透化。第二，为了复用，必须在不同的动物中培养抗体。例如，如果在步骤1.2.6中使用抗兔，则可以在步骤1.2.10中选择抗小鼠，但不能在兔中产生另外的抗体。由于大多数商业抗体在兔子，小鼠或山羊中产生，因为缺乏适当的抗体，有时难以甚至不可能同时靶向两种蛋白质。为了克服这些限制，可以使用市售的试剂盒购买市售的预标记抗体或用荧光团标记一级抗体。第三，另一个缺点与不同荧光团的激发和发射有关。为了避免来自两种不同抗体的信号重叠，必须分离每个荧光团的激发发射光谱。因此，可以立即分析的目标数量将根据可用显微镜的配置而变化。最后，分析的质量高度依赖于使用的显微镜。更详细和精确的数据可以使用共聚焦显微镜与荧光显微镜相比获得。超分辨率显微镜的使用可以更详细地揭示蛋白质共定位。
虽然共同IF对潜在的结合性伴侣的接近度提供了重要的见解，但还应该通过其他方法来补充蛋白质之间的物理相互作用。在可用的方法中，协同IP可能是最便宜的一种，因为设备和材料很容易访问。使用与磁珠结合的抗体，可以使用典型的Western印迹分析来分离蛋白质复合物并鉴定该复合物中存在的成分。与共同IF类似，应遵循最佳做法的一些建议。例如，建议在组织匀浆时最小化样品，以减少步骤2.1.5和2.1.9之间的时间。有经验的人可以处理多达10个样品ime，初学者不应该处理超过4-6个样本。类似地，当首次执行IP协议时，应限制管的数量。建议从阴性对照（ 即 IgG）和阳性对照（ 即已知含有待免疫沉淀蛋白的组织）开始。第二个试验应该专门用于优化（见第2.2.2节）。一旦这些步骤得到令人满意的结果，可以处理待分析的样品。请注意，过程中应始终包含负控制。
这种共同IP技术也有潜在的陷阱。首先，它要求组织在允许保持蛋白质之间的连接的条件下进行均质化。对于膜蛋白，例如连接蛋白，使用缓冲液也是至关重要的，该缓冲液将保持蛋白质之间的键，同时也允许其溶解。第二，类似于共IF，它需要高亲和力抗体用于靶蛋白和结合配偶体。此外，由于蛋白质保留在其三级构象中，并且蛋白质复合物不通过均质解离，如果抗体识别出与配偶体的结合域非常接近或隐藏在蛋白质的天然结构内的靶蛋白的部分，IP可能会受到影响。因此，在结束不存在结合配偶体之前，必须始终使用蛋白质印迹验证IP的效率。第三，共同IP可以产生假阳性结果，因为蛋白质直接结合珠粒或在手术过程中沉淀而不是复合物的一部分。为了识别这些伪影，需要IgG控制，以及所提供的方法中所述的互惠IP。还可以在步骤2.2.2和2.2.3之间添加“预清洗”程序，以避免蛋白质与珠子的非特异性结合。这样做，孵化在辊式混合器中，在4℃下用50μg珠子溶解裂解物1小时。用磁力支架取下珠子，继续步骤2.2.3。第四，IgG的重链和轻链可以与感兴趣的蛋白质或结合配偶体的大小相同，从而掩蔽信号。一个解决方案是用甘氨酸解离IgG链，如本手稿所述。也可以购买仅识别天然抗体并因此不与负载在膜中的变性轻链和重链结合的第二抗体（参见材料表 ）。这两种方法有时可能需要组合。第五，共同IP允许鉴定有限数量的结合伴侣，部分是因为可以在膜上探测的抗体的数量。它还需要通过联合IF或通过文献综述来预先确定这些具有约束力的合作伙伴。最后，共同IP允许鉴定蛋白质在一个复合物内，而不是两种蛋白质之间的直接相互作用。
来自共同IP的结果可以通过不同的方式进行分析。如本手稿所述，可以通过用不同抗体重新检测相同的膜来仅识别相互作用的伴侣。也可以量化这种相互作用。为了做到这一点，首先通过用针对该蛋白的抗体探测膜定量免疫沉淀的蛋白质的量。使用成像软件分析信号强度，如本手稿中所述。然后，用针对结合配偶体的抗体重新检测膜，并且信号强度也被定量。然后可以将两种蛋白质之间的相互作用表示为结合配偶体的量与免疫沉淀的蛋白质的量的比例。然而，为了进行比较，必须同时处理不同的样品并加载到同一膜上。 BIOLOG可以进行类似的重复进行分析，并进行统计分析。
在过去几年中，开发了其他技术来分析PPI。例如，FRET允许通过从一个标签到另一个标签的能量转移来鉴定相互作用的蛋白质，只有当蛋白质足够接近以进行相互作用时才能进行。然而，因为它需要标记蛋白质，所以这种技术不能在组织中使用。类似地，可以使用与细菌生物素连接酶BirA 21融合的蛋白质来鉴定PPI。这种连接酶将生物素添加到与嵌合蛋白紧密接近（ 即相互作用）的蛋白质中。虽然这种方法是创新和无偏的，但它不能在组织中进行。或者，PLA可用于组织。与共IF相似，该测定法基于抗体亲和力。对于该测定，第二抗体用DNA序列标记当它们接近（ 即，在PPI上）时，t可以相互作用并形成环状的DNA分子22 。然后使用荧光标记的互补寡核苷酸扩增和检测该环状DNA分子。尽管该测定法优雅，但它需要许多验证步骤，仍然依赖于初级抗体亲和力以及潜在的相互作用的合作伙伴的一些知识。最后，还开发了一种不偏不倚的传统IP测定方法来识别PPI。在内源性蛋白质（RIME）测定的快速免疫沉淀 - 质谱法中，通过质谱（IP / MS） 23分析IP样品，而不是Western印迹分析。这种高通量方法的主要优点是它使用少量材料提供关于所有内源性相互作用蛋白质的大量信息。然而，它需要进入肽测序仪23 。
它是重要的是，经过几次初步测试，本协议的每个步骤都针对乳腺进行了优化。然而，该方法可以在几个修改后可以用于其他器官。对于co-IF，乳腺切片的最佳温度，适合的阻断和洗涤以及溶液以及适当的抗体浓度都进行了测试。对于共同IP，还测试了各种裂解和洗脱缓冲液和提取方法，并对IP成功产生重大影响。总而言之，本协议的每个步骤对于获得具有最低背景和最特异性的高质量和可重复的结果是重要的。虽然有其他方法可用，但共同IF后跟共同IP仍然是有效和简单的方法来评估PPI。这两种技术可以在组织和细胞系中使用，只需要几个验证步骤和控制。
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Disclosures
作者没有任何声明。
Acknowledgments
知识产权由加拿大自然科学与工程研究理事会资助（NSERC＃418233-2012）资助;魁北克省魁北克省圣诞老人（FRQS），魁北克省乳腺癌基金会职业生涯奖，以及加拿大创新基金会授予的领导者资助。 ED获得了Fondation大学生Armand-Frappier奖学金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice strain and stage | St. Constant, Quebec, Canada | C57BL/6 Femals; pregnancy day 18 (P18) and lactation day 14 (L14), Charles River Canada | |
| PBS 10x (stock) | 1) Dissolve 80 g NaCl (F.W.: 58.44), 2 g KCl (F.W. 74.55), 26.8 g Na2HPO4·7H2O (F.W. 268.07) and 2.4 g KH2PO4 (F.W.:136.09) in 800 mL distilled water; 2) Adjust the PH to 7.4; 3) Add water to reach to the 1 L final volume. |
||
| TBS 10x (stock) | 1) Dissolve 60.5 g TRIS, 87.6 g NaCl in 800 mL distilled water; 2) Adjust the pH to 7.5; 3) Add water to reach to the 1 L final volume. |
||
| Part 1: Immunofluorescence | |||
| Freezing media | VWR International, Ville Mont-Royal, QC, Canada | 95067-840 | VMR frozen sections compound |
| Microtome | Mississauga, ON, Canada | 956640 | Microm HM525, Thermo fisher scientific HM525 NX Cryostat 115 V 60 Hz |
| Blades | C.L. Sturkey, Inc. Les Produits Scientifiques ESBE St-Laurent, QC, Canada | BLM1001C | High profile gold coated blades |
| Pap pen | Cedarlane, Burlington, ON, Canada | 8899 | Super PAP Pen, Thermo fisher scientific |
| Microscopic slides | Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada | 12-550-15 | Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides |
| Formaldehyde | BioShop Canada Inc, Burlington, ON, Canada | FOR201.1 | Forlmadehyde |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA | ||
| Blocking solution | 3% BSA in TBS | ||
| Wash solution | TBS-Tween 20 0.1% | ||
| Polysorbate 20 | Oakville, ON, Canada | P 9416 | Tween 20, Sigma-Aldrich |
| Mounting media | Cedarlane, Burlington, ON | 17984-25(EM) | Fluoromount-G |
| First & secondary antibodies | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | See Comments | E-Cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) 1/50 (Cell Signaling) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 555 (#4409s), Cell Signaling |
| First & secondary antibodies | Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USA | See Comments | Claudin-7 (#34-9100) 1/100 (Life Technologies) with anti-rabbit IgG Fab2 Alexa Fluor 488 (#4412s) (Cell Signaling) |
| First & secondary antibodies | Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA; Fischer Scientific, Burlington, ON, Canada | See Comments | β-Catenin Antibody (C-18): sc-1496 (SANTA CRUZ) with anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 (#A11057), Molecular Probe (Fisher Scientific) |
| First & secondary antibodies | Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USA | See Comments | Connexin26 (#33-5800) 1/75 (Life Technologies) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 647 (#4410s) |
| Nuclei stain | Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada | D1306 | DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) 1/1,000 in PBS |
| Fluorescent microscope | Nikon Canada, Mississauga, On, Canada | Nikon A1R+ confocal microscopic laser equipped with a spectral detector | |
| Software of IF images analysis | Nikon Canada, Mississauga, On, Canada | NIS-elements software (version 4) | |
| Part 2: Immunoprecipitation | |||
| Triple-detergent Lysis buffer (100 mL) pH=8.0 | 1) Mix 50 mM TRIS (F.W.: 121.14), 150 mM NaCl (F.W.: 58.44), 0.02% Sodium Azide, 0.1% SDS, 1% NONIdET P40, 0.5% Sodium Deoxycholate in 80 mL distilled H2O. 2) Adjust the pH to 8.0 with HCl 6 N (~0.5 mL). 3) Adjust the volume to 100 mL. Keep it in fridge. At the day of protein extraction, use 1/100 NaVo3, 1/100 protease/phosphatase inhibitor and 1/25 NAF in calculated amount of Triple detergent lysis buffer: Sodium Fluoride (stock) solution 1.25 M (F.W.: 41.98), Sodium Orthovanadate (stock) Solution 1 M (F.W.: 183.9) |
||
| Protease/phosphatase inhibitor | Fisher Scientific, Burlington, ON | 78441 | Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100x) |
| Protein dosage | Thermo Scientific, Rockford, Illinois, USA | 23225 | Pierce BCA protein assay kit |
| Tissue grinder | Fisher Scientific, Burlington, ON | FTH-115 | Power 125, Model FTH-115 |
| Magnetic beads and stand | Millipore, Etobicoke, ON, Canada | PureProteome Protein G Magnetic Bead System (LSKMAGG02) | |
| Wash solution for IP | PBS or PBS-Tween20 0.1% depending to the step | ||
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | See Comments | IgG Rabbit (rabbit (DA1E) mAb IgG Isotype control (#3900s) (Cell Signaling) 0.5 µL/200 µL |
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | See Comments | IgG Mouse mouse (G3A1) mAb IgG Isotype control (#5415s) (Cell Signaling) 0.5 µL/200 µL |
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada | See Comments | Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 4 µL/200 µL |
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | See Comments | E-cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) (Cell Signaling) 1 µL/200 µL |
| Laemmli buffer | BIO-RAD, Mississauga, Ontario, Canada | 1610747 | 4x Laemmli Sample Buffer (Add β-mercaptoethanol following manufacturer recommendation) |
| Acidic glycine | Fisher Scientific, Burlington, ON | PB381-5 | 0.2 M glycine; adjust pH=2.5 with HCl |
| Tris | Fisher Scientific, Burlington, ON | BP152-1 | 1 M (pH=8) |
| SDS-PAGE acrylamide gels | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1610180 -5 | TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Solutionss (7.8%, 10%, 12%) |
| Running buffer 10x | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1704272 | Tris 30.3 g/glycine 144.1 g /SDS 10 g in 1 L distilled water |
| Membranes | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1704272 | PVDF membranes, Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit |
| Transfer method | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1704155 | Trans-Blot Turbo Transfer System |
| Dry Milk | Smucker Food of Canada Co, Markham, ON, Canada | Fat Free Instant Skim Milk Powder, Carnation | |
| Blocking solution for blots | 5% dry milk in TBS-Tween 20 0.1% | ||
| Washing solutions for blots | TBS-Tween 20 0.1% | ||
| Primary and secondary antibodies for blots (10 mL) | Sigma-Aldrich, Oakville, Ontario & Abcam, Toronto, ON, Canada | See Comments | Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 1/2,500 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Primary and secondary antibodies for blots (10 mL) | Cell Signaling, Beverly, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada | See Comments | E-cadherin (24E10) rabbit mAb 1/1,000 (#3195s) (Cell Signaling) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Primary and secondary antibodies for blots (10 mL) | Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada | See Comments | Claudin-7 (#34-9100) (Life technologies) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Primary and secondary antibodies for blots (10 mL) | Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada | See Comments | Claudin3 (#34-1700) (Life technologies) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Luminol solution for signal detection on blots | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1705061 | Clarity Western ECL Blotting Substrate |
| Imaging blots | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1708280 | ChemiDoc MP imaging system |
| Analayzing blots | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | ImageLab 5.2 software | |
References
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