Summary
Intercellulære kryds er krav til brystkirtelspecifikke funktioner og udvikling. Dette manuskript giver en detaljeret protokol til undersøgelsen af protein-protein-interaktioner (PPI'er) og co-lokalisering ved anvendelse af murine brystkirtler. Disse teknikker tillader undersøgelse af dynamikken i den fysiske forbindelse mellem intercellulære krydsninger på forskellige udviklingsstadier.
Abstract
Cellecelleinteraktioner spiller en afgørende rolle for bevarelse af vævsintegriteten og barrieren mellem de forskellige rum i brystkirtlen. Disse interaktioner tilvejebringes af forbindelsesproteiner, der danner sammenfald mellem tilstødende celler. Junctional protein mislokalisering og reducerede fysiske associationer med deres bindende partnere kan resultere i tab af funktion og følgelig til organ dysfunktion. Identifikation af proteinlokalisering og protein-protein-interaktioner (PPI'er) i normale og sygdomsrelaterede væv er således afgørende for at finde nye beviser og mekanismer, der fører til udviklingen af sygdomme eller ændringer i udviklingsstatus. Dette manuskript præsenterer en to-trins metode til evaluering af PPI'er i murine brystkirtler. I protokolafsnit 1 beskrives en fremgangsmåde til at udføre co-immunofluorescens (co-IF) ved anvendelse af antistoffer hævet mod proteiner af interesse efterfulgt af sekundære antistoffer mærket med fluorochromer. Selvom co-IF alleOws til demonstration af nærhed af proteinerne, gør det muligt at studere deres fysiske interaktioner. Derfor gives en detaljeret protokol for co-immunopræcipitation (co-IP) i protokolafsnit 2. Denne metode anvendes til at bestemme de fysiske interaktioner mellem proteiner uden at bekræfte, om disse interaktioner er direkte eller indirekte. I de sidste par år har co-IF og co-IP teknikker vist, at visse komponenter i intercellulære krydsninger samlokaliserer og interagerer sammen, hvilket skaber trinafhængige knudepunkter, der varierer under udvikling af brystkirtlen.
Introduction
Mammekirtlen vokser og udvikler sig primært efter fødslen. Dette organ ombygger sig selv hele tiden i et pattedyr 1 's reproduktive liv. Det voksne brystkirtleepitel består af et indre lag af luminale epithelceller og et ydre lag af basale celler, hovedsageligt sammensat af myopiteliale celler omgivet af en kældermembran 2 . For en god gennemgang af brystkirtels struktur og udvikling kan læseren henvise til Sternlicht 1 . Cellecelleinteraktioner via mellemrum (GJ), stramme (TJ) og adherens (AJ) krydsninger er nødvendige for den normale udvikling og funktion af kirtlen 1 , 3 , 4 , 5 , 6 . Hovedkomponenterne i disse kryds i den murine brystkirtlen er Cx26, Cx30, Cx32 og Cx43 (GJ); Claudin-1, -3, -4 og -7 ogZO-1 (TJ); Og E-cadherin, P-cadherin og β-catenin (AJ) 7 , 8 . Ekspressionsniveauerne af disse forskellige forbindelsesproteiner varierer på en trinafhængig måde under udvikling af brystkirtler, hvilket foreslår differentialcellecelleinteraktionskrav 9 . GJ, TJ og AJ er strukturelt og funktionelt forbundet og sammenkobler andre strukturelle eller regulatoriske proteiner til de tilstødende steder i tilstødende celler og derved skaber en forbindelsesnekke 10 . Sammensætningen af den forbindelsesmæssige nexus kan påvirke brodannelsen med det underliggende cytoskelet såvel som nexuspermeabilitet og stabilitet og kan følgelig påvirke funktionen af kirtlen 8 , 9 , 10 , 11 . Komponenterne i intercellulære krydsninger, der befinder sig i krydsede nexuser eller interagerer med hinanden ved difHjerteudviklingsstadier af udvikling af brystkirtler blev analyseret for nylig ved anvendelse af co-immunofluorescens (co-IF) og co-immunpræcipitation (co-IP) 9 . Mens andre teknikker tillader evaluering af den funktionelle association mellem proteiner, er disse metoder ikke præsenteret i dette manuskript.
Da proteiner kun virker alene for at fungere, er det vigtigt for mange forskere at studere protein-protein-interaktioner (PPI'er), såsom signaltransduceringer og biokemiske kaskader, og kan give væsentlig information om proteinernes funktion. Co-IF og mikroskopisk analyse hjælper med at evaluere et par proteiner, der deler det samme subcellulære rum. Antallet af mål er imidlertid begrænset af antistofferne, som skal opdrættes i forskellige dyr og ved adgangen til et konfokalt mikroskop udstyret med forskellige bølgelængderlasere og en spektral detektor til multiplexering. Co-IP bekræfter eller afslører høj affinitet fysiske interaktioner betwEn to eller flere proteiner, der ligger inden for et proteinkompleks. På trods af udviklingen af nye teknikker, såsom fluorescensresonansenergioverførsel (FRET) 12 og nærhedsligeringsassay (PLA) 13 , som samtidig kan detektere lokalisering og interaktioner af proteiner, forbliver co-IP en passende og overkommelig teknik til undersøgelse af interaktioner mellem Endogene proteiner.
Den trinvise fremgangsmåde beskrevet i dette manuskript vil lette undersøgelsen af proteinlokalisering og PPI'er og påpege faldgruber for at undgå, når man studerer endogene PPI'er i brystkirtlerne. Metoden starter med præsentationen af de forskellige bevarelsesprocedurer for de krævede væv til hver teknik. Del 1 præsenterer, hvordan man studerer protein co-lokalisering i tre trin: i) snittet af brystkirtler, ii) dobbelt- eller tredobbelt mærkning af forskellige proteiner ved hjælp af co-IF-teknikken, og iii) billeddannelsen afProtein lokalisering. Del 2 viser, hvordan man udfælder et endogent protein og identificerer dets interagerende proteiner i tre trin: i) lysatpræparation, ii) indirekte proteinimmunpræcipitation og iii) bindingspartneridentifikation ved SDS-PAGE og Western blot. Hvert trin i denne protokol er optimeret til gnavere af brystkirtler og genererer højkvalitetsspecifikke og reproducerbare resultater. Denne protokol kan også bruges som udgangspunkt for PPI-studier i andre væv eller cellelinier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreprotokoller anvendt i denne undersøgelse blev godkendt af University Animal Care Committee (INRS-Institut Armand-Frappier, Laval, Canada).
1. Identifikation af Protein Co-lokalisering
- Fra væv til mikroskopiske dias
BEMÆRK: Væv og sektioner skal håndteres på tøris.- Punk kødkirtlen fra et dyr (for en fuldstændig beskrivelse af denne procedure henvises til Plante et al. ) 14 .
- Embed det udskårne væv i fryser / monteringsmedium på tøris. Tilsæt nok medium til at dække kirtlen. Når mediet er størknet, overfør vævene til en fryser ved -80 ° C til senere anvendelse 9 .
- Ved hjælp af et kryomikrotom indstillet til ≤ -35 ° C skæres vævene i 7-10 μm tykke sektioner og placeres på mikroskop dias.
BEMÆRK: Placer to afsnit på hvert lysbillede, når det er muligt. Den venstre sektion vil blive brugt som enEgativ kontrol for at verificere antistoffernes specificitet og autofluorescens af vævet, medens højre side vil blive mærket med antistofferne. - Opbevar sektionerne ved -80 ° C til senere brug.
- Co-IF farvning
- Hent de rette mikroskopiske dias fra fryseren og reparer straks sektionerne ved at nedsænke dem i formaldehyd 4% i 15 minutter ved stuetemperatur (RT).
- Derefter sænk diaserne i fosfatbufferet saltopløsning (PBS) ved stuetemperatur. Forlad gliderne i PBS ved RT indtil du går videre til næste trin.
- Cirkle hver sektion af diaset ved hjælp af en kommercielt tilgængelig hydrofob barriere eller en vandafvisende lab pen (se Materialebordet ). Pas på ikke at røre vævet. Tilsæt omgående dråber af PBS til vævet og læg glideren i et fugtigt histologi-kammer for resten af proceduren.
BEMÆRK: Vævsektionerne skal forblive fugtede. AlternativBrug en kasse med låg og læg våde papirhåndklæder på bunden. - Bloker hver vævssektion med 100-200 μL 3% bovint serumalbumin (BSA) -Trisbufret saltvand (TBS) -0,1% polysorbat 20 (se Materialetabellen ) i 30 minutter ved stuetemperatur . Mens prøverne blokerer, fremstilles primære og sekundære antistofopløsninger ved fortynding af antistofferne i TBS-0,1% polysorbat 20.
BEMÆRK: Den krævede koncentration for antistoffet leveres af fabrikanten; Se materialebordet og figur 1 og 2 til eksempler , såvel som Dianati et al. 9 . Selvom det ikke er nødvendigt at arbejde i mørke, når man bruger de fleste fluoroforkonjugerede antistoffer, skal man undgå at udsætte antistofopløsningerne eller farvede væv til intens, skarpt lys. - Fjern blokeringsopløsningen ved aspiration og inkuber sektionerne i 100-200 μL af det fortyndede primære antistof i 60 minutter ved stuetemperatur. AlternativelY inkuberer med det primære antistof natten over ved 4 ° C.
- Fjern den primære antistofopløsning ved aspiration og vask sektionerne med 250-500 μl TBS-0,1% polysorbat 20 i 5 minutter. Fjern vaskopløsningen ved aspiration og gentag vasken to gange.
- Fjern vaskeopløsningen ved aspiration og inkuber sektionerne med 100-200 μL af det passende fluoroforkonjugerede sekundære antistof i 60 minutter ved stuetemperatur.
- Fjern den sekundære antistofopløsning ved aspiration og vask sektionerne med 250-500 μl TBS-0,1% polysorbat 20 i 5 minutter. Fjern vaskopløsningen og gentag to gange.
- Gentag trin 2.5-2.8 ved at bruge den passende kombination af primære og sekundære antistoffer til det efterfølgende protein eller proteiner af interesse.
- Fjern vaskopløsningen ved aspiration og udfør kernefarvningen ved at inkubere sektionen med 100-200 μl 1 mg / ml 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) i TBS-0,1% polysorbat 20 i 5 minutter vedRT.
- Fjern DAPI-opløsningen ved aspiration og monter gliderne ved hjælp af et vandopløseligt, ikke-fluorescerende monteringsmedium (se Materialebordet ) og dækslip. Fortsæt et billede ad gangen.
BEMÆRK: At inkubere kernens plet i mere end 5 minutter ændrer ikke farvningsintensiteten. Alternativt kan du fjerne DAPI-opløsningen på alle dias og inkubere vævene i PBS, mens du monterer diasene. - Placer gliderne i en 4 ° C køleskab i mindst 8 timer. Fortsæt til fluorescensmikroskopisk billeddannelse (se figur 1 og 2 ).
- Mikroskopisk billeddannelse
- Visualisere de fluoroforkonjugerede sekundære antistoffer ved anvendelse af et konfokalt mikroskop udstyret med de forskellige lasere, der kræves for at excitere fluorforerne ved deres specifikke bølgelængder.
Bemærk: For at kunne visualisere kanaler og alveoler, foreslås et 40X objektiv med en numerisk blænde på 0,95. En eksplE af de specifikke indstillinger findes i figur 1 . - Kontroller lokaliseringen af hvert protein individuelt ved at scanne billedet en bølgelængde på det tidspunkt.
Bemærk: På dette stadium er det vigtigt at analysere lokaliseringen af forbindelsesproteinerne kritisk. For at kunne danne krydsede nexuser skal disse proteiner lokaliseres ved plasmamembranen. - Bestem co-lokalisering af proteiner ved at fusionere billederne scannet med laserne ved de forskellige bølgelængder.
Bemærk: Protein co-lokalisering kan visualiseres ved farveændring som følge af emission af to eller flere fluoroforer på samme sted og kan måles ved hjælp af den relevante software ( figur 1 og 2 , se også reference 9).
- Visualisere de fluoroforkonjugerede sekundære antistoffer ved anvendelse af et konfokalt mikroskop udstyret med de forskellige lasere, der kræves for at excitere fluorforerne ved deres specifikke bølgelængder.
2. Studerende PPI'er
BEMÆRK: Abdominale brystkirtler bør bruges til at studere PPI'er, da brystkirtler er tæt forbundet med pectoralmuskler. Punk de brystkirtler (for en fuldstændig beskrivelse af denne procedure henvises til Plante et al .) 14 og opbevares ved -80 ° C til senere brug.
- Lysatpræparat
- Anbring vægtepapir og 2 ml mikrocentrifugerør på tøris for at afkøle dem, inden du fortsætter med de næste trin.
- Tag brystkirtlen fra -80 ° C og opbevar dem på tøris.
- Væg vævene på de forkølede vejepapirer, og overfør derefter vævet til 2 ml mikrocentrifugerør (håndtag på tøris). Brug mellem 50 og 100 mg væv pr. Prøve. Hold vævet på tøris indtil trin 2.1.5.
- Forbered den nødvendige mængde triple detergent lysis buffer suppleret med NaF, NaVO 3 og protease / phosphatase inhibitor, som angivet i Materialetabellen ved anvendelse af følgende formler. Mus: krævet buffer (μL) = mus vævsvægt (mg) x 3; Rat: krævesBuffer (μL) = rottevævsvægt (mg) x 5.
- Tilsæt den nødvendige mængde iskold lysisbuffer (beregnet i trin 2.1.4) til det 2 ml rør indeholdende vævet.
BEMÆRK: I trin 2.1.5-2.1.6 fortsættes med et enkelt rør ad gangen. - Homogeniser vævet i 30-40 s ved hjælp af kontinuerlig homogenisering på en vævsslibemaskine; Hold altid røret på is. Juster vævshomogenisatoren til medium hastighed og bevæg forsigtigt kværnen op og ned inde i røret.
- Gentag trin 1.6 og 1.7 med de andre rør.
- Inkuber lysaterne på is i 10-30 minutter.
- Centrifuger rørene ved 170 xg i 10 minutter ved 4 ° C.
- I mellemtiden identificere 6-10 mikrocentrifugerør (0,6 ml) for hver prøve og opbevar dem på is.
- Når centrifugeringen er færdig, skal du kontrollere rørene. Sørg for, at de indeholder et øverste lag af fedt, klare, gul-til-pink lysater (afhængigt af udviklingsstadiet) og en pellet.
- Lav et hul i lipidlagetVed hjælp af en 200 μl pipettespids for at få adgang til væskefasen. Skift tip og saml lysatet uden at forstyrre pellet eller aspirere lipidlaget. Aliquot lysatet i præmærkede rør på is (trin 2.1.11) og opbevar dem ved -80 ° C.
- Brug en alikvot til at kvantificere proteinkoncentrationen ved anvendelse af et passende kommercielt tilgængeligt kit (se Materialetabellen ).
- Indirekte immunudfældning
- På is optøes to alikvoter af de samlede brystkirtellysater fremstillet tidligere.
BEMÆRK: En alikvot vil blive brugt til målproteinets IP, mens den anden vil tjene som den negative kontrol. - Saml 500-1.000 μg lysatet og fortynd det i PBS for at nå et slutvolumen på 200 μl i hvert 1,5 ml rør.
BEMÆRK: Mængden af lysat, der skal anvendes, afhænger af overfladen af proteinet af interesse og effektiviteten af antistoffet (se figur 3 for enN eksempel, samt materialetabellen ). For at optimere for hvert mål skal forskellige mængder lysat ( dvs. 500, 750 og 1000 μg) og antistof ( dvs. 5, 10 og 20 μg) anvendes. Fortsæt med de følgende trin (2.2.3-2.3.7.4). - Tilsæt antistoffet mod antigenet af interesse for det første lysisrør og hold det på is.
BEMÆRK: Det krævede beløb foreslås normalt på instruktionsarket fra hvert firma (se Materialebordet ). - I det andet rør fremstilles en negativ kontrol ved at tilsætte den samme koncentration af isotype-IgG-kontrol som antistoffet anvendt i trin 2.2.3.
- Inkubér rørene natten over ved 4 ° C på en rørrulleblander ved lav hastighed.
- Den følgende dag tilsættes 50 μl magnetiske perler til nye 1,5 ml rør til forvask.
- Vælg enten magnetiske perler af protein A eller protein G baseret på den relative affinitet til antistoffet. Det er vigtigt at undgå at bruge aggregerede perler; Bland forsigtigt pærens suspension, indtil det er ensartet genopslæmmet, før det tilsættes til rørene.
- Placer rørene, der indeholder perlerne på magnetstativet, og lad perlerne migrere til magneten. Fjern opbevaringsbufferen fra perlerne ved hjælp af en 200 μl pipette.
- Vask perlerne ved at tilsætte 500 μl PBS-0,1% polysorbat 20 og vortex rørene kraftigt i 10 s.
- Sæt rørene igen på magnetstativet og lad perlerne migrere til magneten.
- Fjern overskydende vaskebuffer ved pipettering med en 200 μl pipette.
- Tilsæt reaktionskomplekset (lysat-antistof) fra trin 2.2.5 til perlerne og inkuber i 90 minutter ved stuetemperatur på rulleblanderen.
- Placer rørene på den magnetiske stativ og lad perlerne migrere til magneten. Ved hjælp af en 200 μL pipette skal du aspirere og kassere lysatet og placere rørene på is.
- Vask perlenS ved tilsætning af 500 μl PBS, placeringen af rørene på magnetisk stativ og fjernelse af væsken ved anvendelse af en 200 μl pipette. Gentag dette vaske trin. Undgå hvirvling og hold prøverne på is under vaskningstrinene.
- Vask perlerne en gang med PBS-0,1% polysorbat 20 uden vortexing og kassér den sidste vaskebuffer ved hjælp af en 200 μl pipettespids.
- Til eluering tilsættes 20 μL 0,2 M sur glycin (pH = 2,5) til rørene og ryst dem i 7 minutter på rulleblanderen.
- Centrifuger ved høj hastighed i nogle få sekunder (hurtig spin) og opsaml supernatanten i et frisk iskoldt rør.
- Gentag trin 2.2.14 og 2.2.15 for hvert rør.
BEMÆRK: Det endelige volumen vil være 40 μL. - Tilsæt 10 μl 4x Laemmli buffer til den 40 μl eluerede prøve fra trin 2.2.16.
BEMÆRK: Farven bliver gul på grund af den sure pH. - Tilsæt straks 1 M Tris (pH = 8), en dråbe ad gangen, til den eluerede prøve fra trin 2.2.18 indtil dens farveBliver blå. Fortsæt til de næste rør.
- Kog prøverne fra trin 2.2.18 ved 70-90 ° C i 10 minutter. Fortsæt straks til gelelektroforese. Alternativt overfører prøverne til en fryser ved -80 ° C indtil påfyldning.
- På is optøes to alikvoter af de samlede brystkirtellysater fremstillet tidligere.
- Downstream applikation: gelelektroforese efterfulgt af Western blot
- Klargør adskillelse og stabling af SDS-PAGE-acrylamidgeler (1,5 mm tykkelse) efter standardprocedurer 15 .
BEMÆRK: Valget af gel (8-15% acrylamid, gradient: se materialebordet ) skal bestemmes ud fra molekylstørrelsen af det protein, der skal udfældes, og af de potentielle bindingspartnere, som skal analyseres. Disse proteiner skal løses fra hinanden for at muliggøre korrekt immunodetektion. - Optø de immunopræcipiterede (IP) -eluerede prøver (trin 2.2.20) på is.
- Forbered proteinlysater fra de samme prøver (anvendt til IP-proceduren ovenfor). Brug 50Μg total lysat og tilsæt 4X Laemmli prøvebuffer. Kog prøverne ved 70-90 ° C i 5 minutter og sæt på is indtil de lægges.
BEMÆRK: Disse prøver vil blive lastet ved siden af den eluerede IP-prøve for at demonstrere tilstedeværelsen af udfældede proteiner i det totale lysat. - Indsæt de fremstillede lysater fra trin 2.3.3 og de udfældede prøver fra trin 2.2.20 side om side i en acrylamidgel og kør dem i løbende buffer (10x løbende buffer: 30,3 g Tris, 144,1 g glycin og 10 G SDS i 1 liter destilleret vand) ved 100 V i omtrent 95 minutter, eller indtil kanten af de migrerende proteiner når bunden af gelen.
- Overfør gelerne til en nitrocellulose eller PVDF membran ved hjælp af en standardprotokol 9 , 15 .
- Bloker membranen i 1 time på en rocker med lav hastighed i 5% tør mælk-TTBS (20 mM Tris, 500 mM NaCI og 0,05% polysorbat 20).
- Find ud af, om nedbørene lykkedessuccesrigt.
- Probe membranen under anvendelse af det første antistof mod det udfældede protein, fortyndet i 5% tørmælk-TTBS ved den koncentration, som fabrikanten anbefalede natten over ved 4 ° C på en gyngeplatform med langsom omrøring.
BEMÆRK: Se materialebeskrivelsen for anbefalinger. - Den følgende dag vask membranen 3 gange i 5 minutter hver med TTBS på en gyngeplatform med høj omrøring.
- Inkuber membranen i det passende sekundære antistof konjugeret med peberrodsperoxidase (HRP), fortyndet i TTBS, i 1 time ved RT på en gyngeplatform med langsom omrøring.
BEMÆRK: Alternativt kan et sekundært antistof konjugeret med et fluorochrom anvendes, hvis et passende apparat til detektion af signalet er tilgængeligt. - Udfør 3 til 6 vasker, hver i 5 minutter, med TTBS på en rockende platform med høj omrøring. Analyser signalet fra det sekundære antistof ved inkubering af membranen med et kommercielt aVailable luminol opløsning (se Materialetabellen ) og følg producentens anvisninger. Registrér signalet ved hjælp af et kemiluminescens billeddannelsessystem (se Materialetabellen ).
BEMÆRK: For en detaljeret protokol om Western blot-analyse, se Reference 16.
- Probe membranen under anvendelse af det første antistof mod det udfældede protein, fortyndet i 5% tørmælk-TTBS ved den koncentration, som fabrikanten anbefalede natten over ved 4 ° C på en gyngeplatform med langsom omrøring.
- For at identificere interagerende proteiner skal du udføre trin 2.3.7.1-2.3.7.4 ved anvendelse af de relevante antistoffer på samme blotte.
BEMÆRK: Hvis proteiner interagerer, vil bindingspartnerne co-immunpræcipiteres med målproteinet og vil således kunne detekteres ved Western blotting. Trin 2.3.8 kan gentages med flere antistoffer for at bestemme, om andre proteiner ligger i det samme proteinkompleks, så længe molekylvægten af proteinerne er forskellige nok til at være velafskilt på gelen og membranen. - For at bekræfte, at de identificerede bindingspartnere ikke er artefakter, skal gensidig IP udføres.
BEMÆRK: Dette udføres ved at gentageTrin 2.2.1-2.2.20 med det samme lysat, men udfældning af en af bindingspartnerne identificeret i trin 3.8. Derefter gentages trin 3.1-3.8 ved anvendelse af det primære antistof mod det første protein af interesse.
- Klargør adskillelse og stabling af SDS-PAGE-acrylamidgeler (1,5 mm tykkelse) efter standardprocedurer 15 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at bestemme, om GJ, AJ og TJ komponenter kan interagere sammen i brystkirtlen, blev co-IF assays først udført. Cx26, et GJ-protein og β-Catenin, et AJ-protein, blev probet med specifikke antistoffer og blev afsløret ved henholdsvis henholdsvis fluorofore-konjugerede mus-647 (grøn, pseudocolor) og gede-568 (rød) antistoffer ( figur 1B og C ) . Data viste, at de co-lokaliserer ved cellemembranen af epithelceller i muskirtlen på laktationsdag 7 (L7) som afspejlet af den gule farve ( figur 1D ). For det andet, Claudin-7, et TJ-protein; E-cadherin, et AJ protein; Og Connexin26 (Cx26), et GJ-protein, blev probet med deres specifikke antistoffer og blev afsløret med henholdsvis fluorofore-konjugeret kanin 488 (grøn), mus-555 (rød) og henholdsvis mus-647 (koralblå, pseudocolor) antistoffer ( Figur 2B-D ). E-cadherin og Claudin-7 co-lokalisering erVises som en gul-til-lys-orange farve, mens Cx26-co-lokalisering med E-cadherin og Claudin-7 resulterede i hvide punkterede farvninger i muskirtler på graviditetsdagen 18 (P18) ( Figur 2E ).
For at finde ud af, hvilke krydsende proteiner der blander sig og fysisk tæt sammen ved cellemembranen, blev co-immunpræcipitation udført ved anvendelse af brystkirtelvæv fra lakterende mus (L14). Resultater viste, at Cx43, en komponent af GJ, interagerer med E-Cadherin og Claudin-7, men ikke med Claudin-3 ( Figur 3A og B ). Disse resultater blev bekræftet af den gensidige IP; Når E-Cadherin var immunpræcipiteret, interagerede det med Cx43 og Claudin-7 ( Figur 3C ).
Figur 1: β-Catenin og Cx26 co-lokaliseres ved cellemembranenRane i mus mammakirtler. Kryosektioner fra mammakirtler fra mus på lactationsdag 7 (L7) blev skåret (7 μm) og behandlet til immunofluorescerende farvning. ( A ) Nuclei blev farvet med DAPI (blå). ( B ) Cx26 (grøn, pseudocolor) og ( C ) P-Catenin (rød) er vist kombineret med passende fluorophore-mærkede antistoffer. ( D ) Et flettet billede. Billeder blev opnået med et konfokalt mikroskop udstyret med en spektral detektor. DAPI blev visualiseret ved hjælp af følgende indstillinger: emissionsbølgelængde, 450,0 nm; Excitationsbølgelængde, 402,9 nm; Laser kraft, 1,2; Detektorforstærkning, PMT HV 100; PMT-forskydning, 0. Cx26 (647) blev visualiseret under anvendelse af følgende indstillinger: emissionsbølgelængde, 700,0 nm; Excitationsbølgelængde, 637,8 nm; Laser effekt, 2,1; Detektorforstærkning, PMT HV 110; PMT-forskydning, blev 0β-Catenin (568) visualiseret under anvendelse af følgende indstillinger: emissionsbølgelængde, 595,0 nm; Excitationsbølgelængde, 561,6 nm; laserMagt, 2,1; Detektorforstærkning, PMT HV 110; PMT-forskydning, 0. Skalestænger = 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Connexin26 (Cx26), E-cadherin og Claudin-7 co-lokaliseres ved cellemembranen i mus-mammakirtler. Kryosektioner fra mammakirtler på graviditetsdag 18 (P18) blev skåret (7 μm) og behandlet til immunfluorescerende farvning under anvendelse af ( B ) Claudin-7 (grøn), ( C ) E-Cadherin (rød) og ( D ) Cx26 Blå; pseudocolor) kombineret med de passende fluorophore-mærkede antistoffer. ( A ) Nuclei blev farvet med DAPI (blå). Billeder blev opnået med et konfokalt mikroskop udstyret med en spektral detektor. DAPI blev visualiseret ved hjælp af fOllowing indstillinger: emissionsbølgelængde, 450,0 nm; Excitationsbølgelængde, 402,9 nm; Laser effekt, 5,4; Detektor forstærkning, PMT HV 65; PMT-forskydning, 0. Claudin-7 (488) blev visualiseret under anvendelse af følgende indstillinger: emissionsbølgelængde, 525,0 nm; Excitationsbølgelængde, 489,1 nm; Laser effekt, 5,0; Detektor forstærkning, PMT HV 12; PMT-forskydning, 0. E-Cadherin (568) blev visualiseret under anvendelse af følgende indstillinger: emissionsbølgelængde, 595,0 nm; Excitationsbølgelængde, 561,6 nm; Laserkraft, 13,5; Detektorforstærkning, PMT HV 45; PMT-forskydning, 0. Cx26 (647) blev visualiseret ved anvendelse af følgende indstillinger: emissionsbølgelængde, 700,0; Excitationsbølgelængde, 637,8; Laser effekt, 5,0; Detektor forstærkning, PMT HV 55; PMT-forskydning, 0. Skalestænger = 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Cx43, E-Cadherin og Claudin-7, men ikke Claudin-3, er involveret i et proteinkompleks. Cx43 ( A og B ) og E-Cadherin ( C ) immunpræcipiteredes under anvendelse af 500 mg totale lysater fra mammakirtler fra mus ved lactation. IP'er og lysater blev fyldt i geler og overført på PVDF membraner. Fordi Claudin-7 og Claudin-3 har samme molekylvægt, kunne de ikke analyseres på den samme membran. Således blev to parallelle IP'er udført med det samme lysat til Cx43, påfyldt på to geler og overført (membraner A og B). Membran A blev først probet med Cx43 for at bekræfte effektiviteten af IP (toppanel). Derefter blev membranen undersøgt sekventielt med E-Cadherin og Claudin-7. Western blot-analyse viste, at de to proteiner interagerer med Cx43. Membran B blev først probet med Cx43 for at bekræfte effektiviteten af IP (toppanel) og derefter probet med Claudin-3. Western blot-analyse viste, at Claudin-3 dId ikke IP med Cx43, hvilket viser at de to proteiner ikke interagerer. Membran C blev først probet med E-cadherin for at bekræfte effektiviteten af IP'en (toppanel). Derefter blev membranen undersøgt sekventielt med Cx43 og Claudin-7. Western blot-analyse bekræftede interaktionerne mellem proteinerne. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cell-celle interaktioner via kryds er nødvendige for den korrekte funktion og udvikling af mange organer, såsom brystkirtlen. Undersøgelser har vist, at forbindelsesproteiner kan regulere funktionen og stabiliteten af hinanden og aktivere signaltransduktion ved at tinde hinanden ved cellemembranen 10 . De protokoller, der er præsenteret i det nuværende manuskript, har givet interessante fund om sammenfaldende protein-differentialekspression, lokalisering og interaktion under normal udvikling af myrkirtlen 9 . I betragtning af at forbindelsesproteinlokalisering er kritisk for proteinernes funktion, og fordi de er kendt for at interagere med stilladsproteiner og mange kinaser 3 , er co-IF og co-IP effektive teknikker inden for cellecelleinteraktioner. Ikke alene er disse metoder afgørende for at oplyse nødvendigheden af sammenfaldende nexuser i udviklingen af brystkirtlen og deres dyserRegulering i brystkræft, men de kan også anvendes i andre væv og i forsøg med anvendelse af cellelinjer.
Brystkirtlen består af to hovedrum: Stroma og epitel 4 . Det voksne epitel er lavet af to lag celler. I denne tilgang blev nærheden af de potentielle bindingspartnere bestemt ved anvendelse af co-IF-teknikken, og deres fysiske interaktioner blev bekræftet under anvendelse af co-IP. Co-IF er blevet anvendt af andre til at demonstrere samlokalisering af proteiner inden for samme væv, struktur, celle eller intracellulært rum 17 , 18 . Den største fordel ved denne teknik er den visuelle information, som det medfører cellulær eller subcellulær lokalisering af hvert protein inden for de forskellige celletyper, der komponerer vævet. Selvom denne teknik er ret enkel, skal nogle anbefalinger følges. For eksempel for at undgå vævskader,Tilføj altid opløsningerne en gang ad gangen ved hjælp af en 200 μL pipette eller en overførselspipette. Dette vil muliggøre nedsænkning af vævsoverfladen uden at skade vævene. Tilsvarende fjerner du løsningerne ved hjælp af en Pasteur pipette placeret ved siden af vævet ved forsigtigt at vippe glideren. For antistoffer, hvis opbevaringsopløsning indeholder glycerol, kræves der desuden omhyggelig sugning af vaskebufferne for at reducere baggrunden. Endvidere kan tilstedeværelsen af mælkeproteiner, såsom caseiner, under lactation forstyrre antistofferne ved at fælde dem, hvilket resulterer i falske positive. En kritisk analyse af det resulterende billede er således påkrævet, specifikt på dette stadium.
Denne co-IF-teknik har også visse begrænsninger eller faldgruber. For det første kræver det specifikke antistoffer. Som nævnt tidligere (trin 1.1) anbefales det at bruge en sektion ( dvs. den på højre side) på hvert dias til farvning ved at følge de ovenfor beskrevne trin og tilføjePrimære og sekundære antistoffer sekventielt. For den resterende del ( dvs. den på venstre side), følg samme fremgangsmåde ved at anvende TBS-polysorbat 20 0,1% i stedet for de primære antistofopløsninger. Selvom det også er muligt, og endnu bedre, at verificere den specifikke binding af antistoffet ved anvendelse af peptidkonkurrence, er peptider, der anvendes til dannelse af kommercielle antistoffer, ikke altid tilgængelige. Det er således vigtigt at verificere bindingens specificitet ved hjælp af positive og negative kontroller ( dvs. væv eller celler, der vides at udtrykke, eller ej, proteinet af interesse). Endvidere kan antigenfiksationssteder være utilgængelige, især for formalin-fikserede væv, hvilket således resulterer i fravær af et specifikt signal. En antigen-hentningsprocedure kan således være nødvendig for nogle væv. En kort inkubation med detergent kan også udføres forud for antigen-hentning for at permeabilisere cellemembranen. For det andet, for multipleksering, skal antistoffer opdrættes i forskellige dyr.Hvis for eksempel anti-kanin blev anvendt i trin 1.2.6, kunne anti-mus udvælges i trin 1.2.10, men ikke et andet antistof hævet i kanin. Da de fleste kommercielle antistoffer er opdrættet hos kaniner, mus eller geder, er det nogle gange vanskeligt eller endog umuligt at målrette to proteiner samtidigt på grund af manglen på egnede antistoffer. For at overvinde disse begrænsninger kan man enten købe kommercielt tilgængelige, præmærkede antistoffer eller mærke primære antistoffer med fluoroforer ved anvendelse af kommercielt tilgængelige kits. For det tredje er en anden mangel forbundet med excitation og emission af de forskellige fluoroforer. For at undgå overlapning af signalerne fra to forskellige antistoffer skal excitationsemissionsspektret for hver fluorofor separeres. Antallet af mål, som kan analyseres på en gang, varierer således alt efter konfigurationen af det tilgængelige mikroskop. Endelig er kvaliteten af analysen stærkt afhængig af det anvendte mikroskop. Mere detaljerede og præcise data kanOpnås ved anvendelse af et konfokalt mikroskop sammenlignet med et epifluorescerende mikroskop. Anvendelsen af superopløsningsmikroskopi kan afsløre protein co-lokalisering i endnu mere detaljeret 19 .
Selvom co-IF bringer vigtige indsigter om nærhed af potentielle bindende partnere, bør den suppleres med andre metoder til at identificere fysiske interaktioner mellem proteiner. Blandt de tilgængelige metoder er co-IP nok en af de mest overkommelige at udføre, da udstyret og materialet er let tilgængeligt. Ved anvendelse af et antistof bundet til magnetiske perler kan man isolere proteinkomplekser og identificere de komponenter, der er til stede i det kompleks under anvendelse af typisk Western blot-analyse. På samme måde som co-IF bør der følges nogle anbefalinger for bedste praksis. For eksempel anbefales det at minimere prøverne ved homogenisering af vævene for at reducere tiden mellem trin 2.1.5 og 2.1.9. Mens en erfaren person kan behandle op til 10 prøver på atIme, en nybegynder bør ikke klare mere end 4-6 prøver. Tilsvarende bør antallet af rør begrænses, når IP-protokollen udføres for første gang. Det anbefales at starte med en negativ kontrol ( dvs. IgG) og en positiv kontrol ( dvs. et væv, der vides at indeholde proteinet, der skal immunoprecipiteres). Det andet forsøg skal være dedikeret til optimering (se trin 2.2.2). Når disse trin giver tilfredsstillende resultater, kan prøver, som skal analyseres, behandles. Bemærk, at en negativ kontrol altid skal medtages i proceduren.
Denne co-IP-teknik har også potentielle faldgruber. For det første kræver det, at væv homogeniseres under betingelser, der muliggør bevarelsen af forbindelserne mellem proteiner. For membranproteiner, såsom forbindelsesproteiner, er det også afgørende at anvende en buffer, som vil bevare bindingerne mellem proteinerne samtidig med at de tillader deres opløselighed. For det andet, der ligner co-IF, kræver det højaffinitetsantistofferFor både målproteinet og bindingspartnerne. Da proteinerne forbliver i deres tertiære konformation, og proteinkomplekser ikke dissocieres ved homogenisering, hvis antistoffet genkender en del af målproteinet, som er tæt på bindingsdomænet for en partner, eller som er skjult inde i proteinets native struktur , Kan IP'en blive kompromitteret. Det er således afgørende at altid verificere effektiviteten af IP'en ved hjælp af Western blotting, før man afslutter fraværet af en bindingspartner. For det tredje kan co-IP generere falske positive resultater på grund af proteinet, enten at binde direkte til perlerne eller udfælde under proceduren uden at være en del af komplekset. For at identificere disse artefakter kræves en IgG-kontrol, såvel som en gensidig IP, som beskrevet i de fremlagte metoder. Det er også muligt at tilføje en "forrensning" procedure mellem trin 2.2.2 og 2.2.3 for at undgå uspecifik binding af proteiner til perlerne. For at gøre det skal du inkubere thE lyserer med 50 μg perler i 1 time ved 4 ° C på en rulleblander. Fjern perlerne med magnetstativet og fortsæt til trin 2.2.3. For det fjerde kan de tunge og lette kæder af IgG være af samme størrelse som proteiner af interesse eller bindingspartner, hvorved signalet maskeres. En løsning er at dissociere IgG-kæderne med glycin som beskrevet i dette manuskript. Det er også muligt at købe sekundære antistoffer, der kun genkender native antistoffer og derfor ikke binder til den denaturerede lys og tunge kæder, der er lagt i membranen (se Materialetabellen ). De to metoder må undertiden kombineres. For det femte tillader co-IP identifikationen af et begrænset antal bindingspartnere, dels på grund af antallet af antistoffer, der kan probes på membranen. Det kræver også forudidentifikation af disse bindende partnere, enten ved co-IF eller gennem en litteraturvurdering. Endelig giver co-IP mulighed for identifikation af proteintrykketEnt i et kompleks, og ikke for den direkte interaktion mellem to proteiner.
Resultater fra co-IP kan analyseres på forskellige måder. Det er muligt udelukkende at identificere interaktive partnere ved at genprøve den samme membran med forskellige antistoffer, som beskrevet i dette manuskript. Det er også muligt at kvantificere denne interaktion. For at gøre det kvantificeres mængden af proteinet, der immunoprecipiteres, først ved at probere membranen med et antistof mod dette protein. Signalintensiteten analyseres ved hjælp af en billedbehandling software, som beskrevet i dette manuskript. Derefter genprøves membranen med et antistof mod bindingspartneren, og signalintensiteten kvantificeres også. Interaktionerne mellem de to proteiner kan derefter udtrykkes som et forhold af mængden af bindingspartneren til mængden af det immunpræcipiterede protein. For at tillade sammenligning skal de forskellige prøver imidlertid behandles samtidigt og lægges på samme membran. BiologIcal replikater kan videreføres og analyseres tilsvarende, og statistisk analyse kan udføres.
I de sidste par år er der udviklet andre teknikker til analyse af PPI'er. FRET tillader f.eks. Identifikation af interagerende proteiner ved overførsel af energi fra et mærke til et andet, kun når proteinerne er tæt nok til at interagere 20 . Men fordi det kræver proteiner, kan denne teknik ikke anvendes i væv. På samme måde er det muligt at identificere PPI'er ved anvendelse af et protein fusioneret med en bakteriel biotinligase, BirA 21 . Denne ligase vil tilføje biotin til proteiner, der kommer i nærheden ( dvs. interagerer) med det kimære protein. Mens denne metode er innovativ og upartisk, kan den ikke udføres i væv. Alternativt kan PLA anvendes i væv. På samme måde som co-IF, er denne analyse baseret på antistofaffinitet. Til dette assay er sekundære antistoffer mærket med DNA-sekvenser thaT kan interagere, når de er i nærheden ( dvs. på PPI'er) og danner et cirkulært DNA-molekyle 22 . Dette cirkulære DNA-molekyle amplificeres derefter og detekteres under anvendelse af fluorescensmærkede komplementære oligonukleotider. Selv om denne analyse er elegant, kræver den mange valideringstrin og afhænger stadig af primær antistofaffinitet og en vis viden om potentielle interaktive partnere. Endelig er et uafhængigt alternativ til det traditionelle IP-assay blevet udviklet for at identificere PPI'er. Ved hurtig immunpræcipitationsmassespektrometri af endogene proteinanalyser (RIME) analyseres IP-prøver ved massespektrometri (IP / MS) 23 i stedet for Western blot-analyse. Den største fordel ved denne high-throughput-metode er, at den giver massive oplysninger om alle de endogene interaktionsproteiner ved brug af få materialer. Det kræver imidlertid adgang til et peptidsekvenseringsinstrument 23 .
det erDet er vigtigt at nævne, at hvert trin i denne protokol efter flere foreløbige tests er blevet optimeret til brystkirtlen. Metoden kan dog sikkert bruges til andre organer efter nogle få ændringer. For co-IF blev den optimale temperatur for brystkirtelsektion, passende blokering og vask og opløsninger og de korrekte antistofkoncentrationer alle testet. Til co-IP blev forskellige lysis- og elueringsbuffere og ekstraktionsmetoder også testet og har stor indflydelse på IP-succes. Sammenfattende er hvert trin i denne protokol vigtigt for at opnå højkvalitets- og reproducerbare resultater med den mindst mulige baggrund og mest specificitet. Mens andre metoder er tilgængelige, forbliver co-IF efterfulgt af co-IP gyldige og enkle metoder til evaluering af PPI'er. Disse to teknikker kan bruges både i væv og i cellelinjer og kræver kun et par valideringstrin og kontrol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at erklære.
Acknowledgments
IP finansieres af et stipendium fra naturvidenskab og ingeniørforskning fra Canada (NSERC # 418233-2012); Et Fonds de Recherche du Québec-Santé (FRQS), en Quebec Breast Cancer Foundation karrierepris og et Leader Founds-tilskud fra Canadian Foundation for Innovation grant. ED modtog et stipendium fra Fondation Universitaire Armand-Frappier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice strain and stage | St. Constant, Quebec, Canada | C57BL/6 Femals; pregnancy day 18 (P18) and lactation day 14 (L14), Charles River Canada | |
| PBS 10x (stock) | 1) Dissolve 80 g NaCl (F.W.: 58.44), 2 g KCl (F.W. 74.55), 26.8 g Na2HPO4·7H2O (F.W. 268.07) and 2.4 g KH2PO4 (F.W.:136.09) in 800 mL distilled water; 2) Adjust the PH to 7.4; 3) Add water to reach to the 1 L final volume. |
||
| TBS 10x (stock) | 1) Dissolve 60.5 g TRIS, 87.6 g NaCl in 800 mL distilled water; 2) Adjust the pH to 7.5; 3) Add water to reach to the 1 L final volume. |
||
| Part 1: Immunofluorescence | |||
| Freezing media | VWR International, Ville Mont-Royal, QC, Canada | 95067-840 | VMR frozen sections compound |
| Microtome | Mississauga, ON, Canada | 956640 | Microm HM525, Thermo fisher scientific HM525 NX Cryostat 115 V 60 Hz |
| Blades | C.L. Sturkey, Inc. Les Produits Scientifiques ESBE St-Laurent, QC, Canada | BLM1001C | High profile gold coated blades |
| Pap pen | Cedarlane, Burlington, ON, Canada | 8899 | Super PAP Pen, Thermo fisher scientific |
| Microscopic slides | Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada | 12-550-15 | Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides |
| Formaldehyde | BioShop Canada Inc, Burlington, ON, Canada | FOR201.1 | Forlmadehyde |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA | ||
| Blocking solution | 3% BSA in TBS | ||
| Wash solution | TBS-Tween 20 0.1% | ||
| Polysorbate 20 | Oakville, ON, Canada | P 9416 | Tween 20, Sigma-Aldrich |
| Mounting media | Cedarlane, Burlington, ON | 17984-25(EM) | Fluoromount-G |
| First & secondary antibodies | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | See Comments | E-Cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) 1/50 (Cell Signaling) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 555 (#4409s), Cell Signaling |
| First & secondary antibodies | Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USA | See Comments | Claudin-7 (#34-9100) 1/100 (Life Technologies) with anti-rabbit IgG Fab2 Alexa Fluor 488 (#4412s) (Cell Signaling) |
| First & secondary antibodies | Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA; Fischer Scientific, Burlington, ON, Canada | See Comments | β-Catenin Antibody (C-18): sc-1496 (SANTA CRUZ) with anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 (#A11057), Molecular Probe (Fisher Scientific) |
| First & secondary antibodies | Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USA | See Comments | Connexin26 (#33-5800) 1/75 (Life Technologies) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 647 (#4410s) |
| Nuclei stain | Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada | D1306 | DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) 1/1,000 in PBS |
| Fluorescent microscope | Nikon Canada, Mississauga, On, Canada | Nikon A1R+ confocal microscopic laser equipped with a spectral detector | |
| Software of IF images analysis | Nikon Canada, Mississauga, On, Canada | NIS-elements software (version 4) | |
| Part 2: Immunoprecipitation | |||
| Triple-detergent Lysis buffer (100 mL) pH=8.0 | 1) Mix 50 mM TRIS (F.W.: 121.14), 150 mM NaCl (F.W.: 58.44), 0.02% Sodium Azide, 0.1% SDS, 1% NONIdET P40, 0.5% Sodium Deoxycholate in 80 mL distilled H2O. 2) Adjust the pH to 8.0 with HCl 6 N (~0.5 mL). 3) Adjust the volume to 100 mL. Keep it in fridge. At the day of protein extraction, use 1/100 NaVo3, 1/100 protease/phosphatase inhibitor and 1/25 NAF in calculated amount of Triple detergent lysis buffer: Sodium Fluoride (stock) solution 1.25 M (F.W.: 41.98), Sodium Orthovanadate (stock) Solution 1 M (F.W.: 183.9) |
||
| Protease/phosphatase inhibitor | Fisher Scientific, Burlington, ON | 78441 | Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100x) |
| Protein dosage | Thermo Scientific, Rockford, Illinois, USA | 23225 | Pierce BCA protein assay kit |
| Tissue grinder | Fisher Scientific, Burlington, ON | FTH-115 | Power 125, Model FTH-115 |
| Magnetic beads and stand | Millipore, Etobicoke, ON, Canada | PureProteome Protein G Magnetic Bead System (LSKMAGG02) | |
| Wash solution for IP | PBS or PBS-Tween20 0.1% depending to the step | ||
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | See Comments | IgG Rabbit (rabbit (DA1E) mAb IgG Isotype control (#3900s) (Cell Signaling) 0.5 µL/200 µL |
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | See Comments | IgG Mouse mouse (G3A1) mAb IgG Isotype control (#5415s) (Cell Signaling) 0.5 µL/200 µL |
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada | See Comments | Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 4 µL/200 µL |
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | See Comments | E-cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) (Cell Signaling) 1 µL/200 µL |
| Laemmli buffer | BIO-RAD, Mississauga, Ontario, Canada | 1610747 | 4x Laemmli Sample Buffer (Add β-mercaptoethanol following manufacturer recommendation) |
| Acidic glycine | Fisher Scientific, Burlington, ON | PB381-5 | 0.2 M glycine; adjust pH=2.5 with HCl |
| Tris | Fisher Scientific, Burlington, ON | BP152-1 | 1 M (pH=8) |
| SDS-PAGE acrylamide gels | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1610180 -5 | TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Solutionss (7.8%, 10%, 12%) |
| Running buffer 10x | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1704272 | Tris 30.3 g/glycine 144.1 g /SDS 10 g in 1 L distilled water |
| Membranes | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1704272 | PVDF membranes, Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit |
| Transfer method | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1704155 | Trans-Blot Turbo Transfer System |
| Dry Milk | Smucker Food of Canada Co, Markham, ON, Canada | Fat Free Instant Skim Milk Powder, Carnation | |
| Blocking solution for blots | 5% dry milk in TBS-Tween 20 0.1% | ||
| Washing solutions for blots | TBS-Tween 20 0.1% | ||
| Primary and secondary antibodies for blots (10 mL) | Sigma-Aldrich, Oakville, Ontario & Abcam, Toronto, ON, Canada | See Comments | Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 1/2,500 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Primary and secondary antibodies for blots (10 mL) | Cell Signaling, Beverly, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada | See Comments | E-cadherin (24E10) rabbit mAb 1/1,000 (#3195s) (Cell Signaling) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Primary and secondary antibodies for blots (10 mL) | Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada | See Comments | Claudin-7 (#34-9100) (Life technologies) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Primary and secondary antibodies for blots (10 mL) | Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada | See Comments | Claudin3 (#34-1700) (Life technologies) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Luminol solution for signal detection on blots | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1705061 | Clarity Western ECL Blotting Substrate |
| Imaging blots | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1708280 | ChemiDoc MP imaging system |
| Analayzing blots | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | ImageLab 5.2 software | |
References
- Sternlicht, M. D. Key stages in mammary gland development: the cues that regulate ductal branching morphogenesis. Breast Cancer Res. 8 (1), 201 (2006).
- Oakes, S. R., Hilton, H. N., Ormandy, C. J. The alveolar switch: coordinating the proliferative cues and cell fate decisions that drive the formation of lobuloalveoli from ductal epithelium. Breast Cancer Res. 8 (2), 207 (2006).
- Stein, T., Hilton, H. N., Ormandy, C. J. The alveolar switch: coordinating the proliferative cues and cell fate decisions that drive the formation of lobuloalveoli from ductal epithelium. Breast Cancer Res. 8 (2), 207 (2006).
- El-Sabban, M. E., Abi-Mosleh, L. F., Talhouk, R. S. Developmental regulation of gap junctions and their role in mammary epithelial cell differentiation. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 8 (4), 463-473 (2003).
- Hennighausen, L., Robinson, G. W. Information networks in the mammary gland. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (9), 715-725 (2005).
- Gudjonsson, T., Adriance, M. C., Sternlicht, M. D., Petersen, O. W., Bissell, M. J. Myoepithelial cells: their origin and function in breast morphogenesis and neoplasia. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 10 (3), 261-272 (2005).
- Nguyen, D. A., Neville, M. C. Tight junction regulation in the mammary gland. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 3 (3), 233-246 (1998).
- Stewart, M. K., Simek, J., Laird, D. W. Insights into the role of connexins in mammary gland morphogenesis and function. Reproduction. 149 (6), R279-R290 (2015).
- Dianati, E., Poiraud, J., Weber-Ouellette, A., Connexins Plante, I., E-cadherin, Claudin-7 and beta-catenin transiently form junctional nexuses during the post-natal mammary gland development. Dev Biol. 416 (1), 52-68 (2016).
- Derangeon, M., Spray, D. C., Bourmeyster, N., Sarrouilhe, D., Herve, J. C. Reciprocal influence of connexins and apical junction proteins on their expressions and functions. Biochim Biophys Acta. 1788 (4), 768-778 (2009).
- Hernandez-Blazquez, F. J., Joazeiro, P. P., Omori, Y., Yamasaki, H. Control of intracellular movement of connexins by E-cadherin in murine skin papilloma cells. Exp Cell Res. 270 (2), 235-247 (2001).
- Kiyokawa, E., Hara, S., Nakamura, T., Matsuda, M. Fluorescence (Forster) resonance energy transfer imaging of oncogene activity in living cells. Cancer Sci. 97 (1), 8-15 (2006).
- Gustafsdottir, S. M., et al. Proximity ligation assays for sensitive and specific protein analyses. Anal Biochem. 345 (1), 2-9 (2005).
- Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of mammary gland development and function in mouse models. J Vis Exp. (53), (2011).
- Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. , 4th ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
- Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A defined methodology for reliable quantification of Western blot data. Mol Biotechnol. 55 (3), 217-226 (2013).
- Oxford, E. M., et al. Molecular composition of the intercalated disc in a spontaneous canine animal model of arrhythmogenic right ventricular dysplasia/cardiomyopathy. Heart Rhythm. 4 (9), 1196-1205 (2007).
- Wang, X., Li, S. Protein mislocalization: mechanisms, functions and clinical applications in cancer. Biochim Biophys Acta. 1846 (1), 13-25 (2014).
- Bertocchi, C., et al. Nanoscale architecture of cadherin-based cell adhesions. Nat Cell Biol. 19 (1), 28-37 (2017).
- Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs. Sensors (Basel). 16 (9), (2016).
- Fredriksson, K., et al. Proteomic analysis of proteins surrounding occludin and claudin-4 reveals their proximity to signaling and trafficking networks. PLoS One. 10 (3), e0117074 (2015).
- Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Rev Proteomics. 7 (3), 401-409 (2010).
- Malovannaya, A., et al. Streamlined analysis schema for high-throughput identification of endogenous protein complexes. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (6), 2431-2436 (2010).
