Summary
Les jonctions inter-cellulaires sont indispensables pour les fonctions et le développement de la glande mammaire. Ce manuscrit fournit un protocole détaillé pour l'étude des interactions protéines-protéines (IPP) et la co-localisation à l'aide de glandes mammaires murines. Ces techniques permettent d'étudier la dynamique de l'association physique entre les jonctions intercellulaires à différents stades de développement.
Abstract
Les interactions cellule-cellule jouent un rôle central dans la préservation de l'intégrité tissulaire et la barrière entre les différents compartiments de la glande mammaire. Ces interactions sont fournies par des protéines de jonction qui forment des liens entre des cellules adjacentes. La délocalisation des protéines jonctionnelles et la réduction des associations physiques avec leurs partenaires de liaison peuvent entraîner une perte de fonction et, par conséquent, une dysfonction organique. Ainsi, l'identification de la localisation des protéines et des interactions protéines-protéines (IPP) dans les tissus normaux et liés à la maladie est essentielle pour trouver de nouvelles preuves et des mécanismes conduisant à la progression des maladies ou des altérations du statut de développement. Ce manuscrit présente une méthode en deux étapes pour évaluer les IPP dans les glandes mammaires murines. Dans la section de protocole 1, on décrit un procédé pour effectuer une co-immunofluorescence (co-IF) en utilisant des anticorps dirigés contre les protéines d'intérêt, suivi d'anticorps secondaires marqués avec des fluorochromes. Bien que co-IF tousPour la démonstration de la proximité des protéines, il permet d'étudier leurs interactions physiques. Par conséquent, un protocole détaillé pour la co-immunoprécipitation (co-IP) est fourni dans la section de protocole 2. Cette méthode est utilisée pour déterminer les interactions physiques entre les protéines, sans confirmer si ces interactions sont directes ou indirectes. Au cours des dernières années, les techniques de co-IF et co-IP ont démontré que certaines composantes des jonctions intercellulaires co-localisent et interagissent ensemble, créant des liens de jonction dépendant de la scène qui varient au cours du développement de la glande mammaire.
Introduction
La croissance et le développement des glande mammaire surviennent principalement après la naissance. Cet organe se remodèle constamment tout au long de la vie reproductive d'un mammifère 1 . L'épithélium de la glande mammaire adulte est constitué d'une couche interne de cellules épithéliales luminescentes et d'une couche externe de cellules basales, principalement composée de cellules myo-épithéliales, entourée d'une membrane basale 2 . Pour une bonne évaluation de la structure et du développement des glandes mammaires, le lecteur peut se référer à Sternlicht 1 . Les interactions cellule-cellule via l'intervalle (GJ), les contraintes (TJ) et les adhérences (AJ) sont nécessaires pour le développement normal et le fonctionnement de la glande 1 , 3 , 4 , 5 , 6 . Les principaux composants de ces jonctions dans la glande mammaire murine sont Cx26, Cx30, Cx32 et Cx43 (GJ); Claudin-1, -3, -4 et -7 etZO-1 (TJ); Et E-cadhérine, P-cadhérine et β-caténine (AJ) 7 , 8 . Les niveaux d'expression de ces différentes protéines de jonction varient d'une manière dépendant de la phase pendant le développement de la glande mammaire, suggérant des besoins différentiels d'interaction cellule-cellule 9 . GJ, TJ et AJ sont liés structurellement et fonctionnellement et attachent d'autres protéines structurales ou réglementaires aux sites voisins des cellules adjacentes, créant ainsi un lien de jonction 10 . La composition du lien de jonction peut influer sur le pontage avec le cytosquelette sous-jacent, ainsi que sur la perméabilité et la stabilité du nexus et peut influencer la fonction de la glande 8 , 9 , 10 , 11 . Les composants des jonctions intercellulaires résidant dans les nexus de jonction ou interagissent les uns avec les autres à la différenceDes stades de développement importants du développement de la glande mammaire ont été analysés récemment en utilisant une co-immunofluorescence (co-IF) et une co-immunoprécipitation (co-IP) 9 . Bien que d'autres techniques permettent d'évaluer l'association fonctionnelle entre les protéines, ces méthodes ne sont pas présentées dans ce manuscrit.
Comme les protéines fonctionnent simplement pour fonctionner, l'étude des interactions protéine-protéine (IPP), telles que les transductions de signaux et les cascades biochimiques, est essentielle pour de nombreux chercheurs et peut fournir des informations importantes sur la fonction des protéines. La co-IF et l'analyse microscopique permettent d'évaluer quelques protéines qui partagent le même espace sous-cellulaire. Cependant, le nombre de cibles est limité par les anticorps, qui doivent être élevés chez différents animaux et par l'accès à un microscope confocal équipé de différents lasers à longueurs d'onde et un détecteur spectral pour le multiplexage. Co-IP confirme ou révèle des interactions physiques à haute affinité entreDeux protéines ou plus résidant dans un complexe protéique. Malgré le développement de nouvelles techniques, telles que le transfert d'énergie de résonance de fluorescence (FRET) 12 et le test de ligature de proximité (PLA) 13 , qui peuvent simultanément détecter la localisation et les interactions des protéines, la co-IP reste une technique appropriée et abordable pour étudier les interactions entre Protéines endogènes.
La méthode étape par étape décrite dans ce manuscrit facilitera l'étude de la localisation des protéines et des IPP et soulignera les pièges à éviter lors de l'étude des PPI endogènes dans les glandes mammaires. La méthodologie commence par la présentation des différentes procédures de conservation des tissus requis pour chaque technique. La partie 1 présente comment étudier la co-localisation des protéines en trois étapes: i) la section des glandes mammaires, ii) l'étiquetage double ou triple de différentes protéines utilisant la technique co-IF, et iii) l'imagerie deLocalisation des protéines. La partie 2 montre comment précipiter une protéine endogène et identifier ses protéines qui interagissent en trois étapes: i) préparation de lysat, ii) immunoprécipitation indirecte de protéines, et iii) identification de partenaire de liaison par SDS-PAGE et Western Blot. Chaque étape de ce protocole est optimisée pour les tissus de glandes mammaires des rongeurs et génère des résultats de haute qualité, spécifiques et reproductibles. Ce protocole peut également être utilisé comme point de départ pour les études de PPI dans d'autres tissus ou lignées cellulaires.
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Protocol
Tous les protocoles d'animaux utilisés dans cette étude ont été approuvés par le Comité universitaire de soins animaux (INRS-Institut Armand-Frappier, Laval, Canada).
1. Identification de la co-localisation des protéines
- Du tissu aux glissières microscopiques
REMARQUE: Les tissus et les sections doivent être manipulés sur de la glace carbonique.- Accepter les glandes mammaires d'un animal (pour une description complète de cette procédure, se référer à Plante et al. ) 14 .
- Incorporer le tissu excisé dans un milieu de congélation / montage sur de la glace sèche. Ajoutez suffisamment de milieu pour couvrir la glande. Lorsque le milieu est solidifié, transférer les tissus dans un congélateur à -80 ° C pour une utilisation ultérieure 9 .
- À l'aide d'un cryomicrotome réglé à ≤ -35 ° C, couper les tissus dans des sections de 7-10 μm d'épaisseur et les placer sur des lames de microscope.
REMARQUE: chaque fois que possible, placez deux sections sur chaque diapositive; La section de gauche sera utilisée commeContrôle négatif pour vérifier la spécificité des anticorps et l'autofluorescence du tissu, tandis que le côté droit sera marqué avec les anticorps. - Conservez les sections à -80 ° C pour une utilisation ultérieure.
- Co-IF coloration
- Récupérez les glissières microscopiques appropriées du congélateur et réparez immédiatement les sections en les immergeant dans du formaldéhyde 4% pendant 15 minutes à température ambiante (RT).
- Ensuite, immergez les glissières dans une solution salée tamponnée au phosphate (PBS) à la température ambiante. Laissez les diapositives dans PBS à RT jusqu'à ce que vous passiez à l'étape suivante.
- Encerclez chaque section de la glissière à l'aide d'une barrière hydrophobe disponible dans le commerce ou d'un stylo de laboratoire hydrofuge (voir la Table des matières ). Veillez à ne pas toucher le tissu. Ajoutez immédiatement des gouttes de PBS au tissu et placez la glissière dans une chambre d'histologie humide pour le reste de la procédure.
REMARQUE: Les sections de tissus doivent rester hydratées. AlternativeUtilisez une boîte avec un couvercle et placez des serviettes en papier humide sur le fond. - Bloquer chaque section de tissu avec 100-200 μL d'albumine de sérum bovin (BSA) à 3% -Tris-tampon de solution saline (TBS) -0,1% de polysorbate 20 (voir la Table des matières ) pendant 30 minutes à la RT. Alors que les échantillons bloquent, préparent les solutions d'anticorps primaires et secondaires en diluant les anticorps dans du TBS-0,1% de polysorbate 20.
NOTE: La concentration requise pour l'anticorps est fournie par le fabricant; Voir le tableau des matériaux et les figures 1 et 2 pour des exemples, ainsi que Dianati et al. 9 . Bien qu'il ne soit pas nécessaire de travailler dans le noir lors de l'utilisation de la plupart des anticorps conjugués au fluorophore, évitez d'exposer les solutions d'anticorps ou les tissus colorés à une lumière intense et intense. - Enlever la solution de blocage par aspiration et incuber les coupes dans 100-200 μL de l'anticorps primaire dilué pendant 60 minutes à la RT. AlternativelY, incuber avec l'anticorps primaire pendant une nuit à 4 ° C.
- Retirez la solution d'anticorps primaire par aspiration et lavez les sections avec 250-500 μL de TBS-0,1% de polysorbate 20 pendant 5 minutes. Enlever la solution de lavage par aspiration et répéter le lavage deux fois.
- Retirer la solution de lavage par aspiration et incuber les sections avec 100-200 μL de l'anticorps secondaire conjugué fluorophore approprié pendant 60 minutes à la RT.
- Enlever la solution d'anticorps secondaire par aspiration et laver les sections avec 250-500 μL de TBS-0,1% de polysorbate 20 pendant 5 min. Retirer la solution de lavage et répéter deux fois.
- Répétez l'étape 2.5-2.8 en utilisant la combinaison appropriée d'anticorps primaires et secondaires pour la protéine (s) subséquente (s) d'intérêt.
- Retirez la solution de lavage par aspiration et effectuez la coloration des noyaux en incubant la section avec 100-200 μL de 4 ', 6-diamidino-2-phénylindol (DAPI) 1 mg / mL dans du TBS-0,1% de polysorbate 20 pendant 5 min àRT.
- Retirez la solution DAPI par aspiration et montez les diapositives à l'aide d'un milieu de montage hydrosoluble et non fluorescent (voir la Table des matériaux ) et des lamelles. Procédez à une diapositive à la fois.
REMARQUE: l'incubation de la tache du noyau pendant plus de 5 minutes ne changera pas l'intensité de la coloration. Alternativement, retirez la solution DAPI sur toutes les glissières et incupez les tissus dans PBS tout en montant les glissières. - Placez les diapositives à plat dans un réfrigérateur à 4 ° C pendant au moins 8 h. Passez à l'imagerie microscopique à fluorescence (voir figures 1 et 2 ).
- Imagerie microscopique
- Visualiser les anticorps secondaires conjugués au fluorophore à l'aide d'un microscope confocal équipé des différents lasers nécessaires pour exciter les fluorophores à leurs longueurs d'onde spécifiques.
Remarque: Pour pouvoir visualiser les conduits et les alvéoles, on suggère un objectif 40X avec une ouverture numérique de 0,95. Un exempleE des réglages spécifiques est fourni à la figure 1 . - Vérifiez la localisation de chaque protéine individuellement en analysant l'image en une seule longueur d'onde.
Note: À ce stade, il est important d'analyser de manière critique la localisation des protéines de jonction. Pour pouvoir former des liens de jonction, ces protéines doivent être localisées à la membrane plasmique. - Déterminer la co-localisation des protéines en fusionnant les images numérisées avec les lasers aux différentes longueurs d'onde.
Remarque: La co-localisation des protéines peut être visualisée par le changement de couleur résultant de l'émission de deux ou plusieurs fluorophores au même endroit et peut être mesurée à l'aide du logiciel approprié ( figures 1 et 2 , voir également la référence 9).
- Visualiser les anticorps secondaires conjugués au fluorophore à l'aide d'un microscope confocal équipé des différents lasers nécessaires pour exciter les fluorophores à leurs longueurs d'onde spécifiques.
2. Étudier les PPI
NOTE: Les glandes mammaires abdominales devraient être utilisées pour étudier les PPI, car les glandes thoraciques sont en étroite association avec le pectoralmuscles. Acceptez les glandes mammaires (pour une description complète de cette procédure, reportez-vous à Plante et al .) 14 et conservez-les à -80 ° C pour une utilisation ultérieure.
- Préparation du lysat
- Placez du papier de pesage et 2 mL de tubes de microcentrifugeuse sur de la glace sèche pour les pré-refroidir avant de procéder aux prochaines étapes.
- Prenez le tissu de la glande mammaire à partir de -80 ° C et conservez-les sur de la glace sèche.
- Peser les tissus sur les papiers de pesage pré-refroidis, puis transférer le tissu dans des tubes de microcentrifugeuse de 2 mL (poignée sur glace sèche). Utiliser entre 50 et 100 mg de tissu par échantillon. Garder le tissu sur de la glace sèche jusqu'à l'étape 2.1.5.
- Préparez la quantité requise de tampon de lyse à triple détergent additionné de NaF, NaVO 3 et inhibiteur de protéase / phosphatase, comme indiqué dans le Tableau des Matériaux , en utilisant les formules suivantes. Souris: tampon requis (μL) = poids du tissu de la souris (mg) x 3; Rat: requisTampon (μL) = poids du tissu du rat (mg) x 5.
- Ajouter la quantité requise de tampon de lyse glacé (calculé à l'étape 2.1.4) dans le tube de 2 ml contenant le tissu.
REMARQUE: Dans les étapes 2.1.5-2.1.6, procédez à un seul tube à la fois. - Homogénéiser le tissu pendant 30 à 40 s en utilisant une homogénéisation continue sur un broyeur à tissus; Toujours garder le tube sur la glace. Réglez l'homogénéisateur de tissu à vitesse moyenne et déplacez doucement le broyeur vers le haut et vers le bas à l'intérieur du tube.
- Répétez les étapes 1.6 et 1.7 avec les autres tubes.
- Incuber les lysats sur de la glace pendant 10-30 min.
- Centrifuger les tubes à 170 xg pendant 10 min à 4 ° C.
- Pendant ce temps, identifiez les tubes de microcentrifugeuse 6-10 (0.6 mL) pour chaque échantillon et conservez-les sur de la glace.
- Une fois la centrifugation terminée, vérifiez les tubes. Assurez-vous qu'ils contiennent une couche supérieure de lysats gras, clairs, jaune-à-rose (selon le stade de développement) et une pastille.
- Créer un trou dans la couche lipidiqueEn utilisant une pointe de pipette de 200 μl pour accéder à la phase liquide. Changez la pointe et collectez le lysat sans perturber la pastille ou aspirer la couche lipidique. Aliquotez le lysat dans des tubes pré-marqués sur de la glace (étape 2.1.11) et rangez-les à -80 ° C.
- Utilisez une aliquote pour quantifier la concentration de protéines en utilisant un kit approprié disponible dans le commerce (voir la Table des matières ).
- Immunoprécipitation indirecte
- Sur la glace, décongeler deux aliquotes du total des lysats de glande mammaire préalablement préparés.
REMARQUE: Une aliquote sera utilisée pour l'IP de la protéine cible, tandis que l'autre servira de témoin négatif. - Recueillir 500-1,000 μg du lysat et diluer dans PBS pour atteindre un volume final de 200 μL dans chaque tube de 1,5 mL.
NOTE: La quantité de lysat à utiliser dépend de l'abondance de la protéine d'intérêt et de l'efficacité de l'anticorps (voir la figure 3 pour uneN exemple, ainsi que le tableau des matériaux ). Pour optimiser pour chaque cible, il faut utiliser différentes quantités de lysat ( c.-à-d., 500, 750 et 1000 μg) et des anticorps ( c'est-à-dire 5, 10 et 20 μg). Procédez comme suit (2.2.3-2.3.7.4). - Ajouter l'anticorps contre l'antigène d'intérêt pour le premier tube de lysat et le garder sur la glace.
REMARQUE: le montant requis est habituellement suggéré dans la fiche d'instructions fournie par chaque entreprise (voir la table des matières ). - Dans le second tube, préparez un témoin négatif en ajoutant la même concentration de contrôle isotype IgG que l'anticorps utilisé à l'étape 2.2.3.
- Incuber les tubes pendant une nuit à 4 ° C sur un mélangeur à rouleaux à basse vitesse.
- Le lendemain, ajouter 50 μL de perles magnétiques à de nouveaux tubes de 1,5 mL pour pré-lavage.
- Sélectionnez soit des billes magnétiques Protein A ou Protein G en fonction de l'affinité relative de l'anticorps. Il est important d'éviter l'utilisation de perles agrégées; Mélanger doucement la suspension de talon jusqu'à ce qu'elle soit régulièrement remis en suspension avant de l'ajouter aux tubes.
- Placez les tubes contenant les perles sur le support magnétique et permettez aux perles de migrer vers l'aimant. Retirez le tampon de stockage des billes en utilisant une pipette de 200 μL.
- Laver les perles en ajoutant 500 μL de PBS-0,1% de polysorbate 20 et tourbillonner les tubes vigoureusement pendant 10 s.
- Remettre les tubes sur le support magnétique et permettre aux perles de migrer vers l'aimant.
- Enlever le tampon de lavage en excès par pipettage avec une pipette de 200 μL.
- Ajouter le complexe de réaction (lysate-anticorps) de l'étape 2.2.5 aux perles et incuber pendant 90 minutes à TA sur le mélangeur à rouleaux.
- Placez les tubes sur le support magnétique et permettez aux perles de migrer vers l'aimant. En utilisant une pipette de 200 μl, aspirer et jeter le lysat et placer les tubes sur de la glace.
- Laver le cordonS en ajoutant 500 μL de PBS, en plaçant les tubes sur le support magnétique et en enlevant le liquide à l'aide d'une pipette de 200 μL. Répétez cette étape de lavage. Pendant les étapes de lavage, éviter de tourbillonner et de garder les échantillons sur de la glace.
- Laver les perles une fois avec PBS-0,1% de polysorbate 20 sans tourbillonner et jeter le dernier tampon de lavage en utilisant une pointe de pipette de 200 μL.
- Pour éluer, ajouter 20 μL de glycine acide 0,2 M (pH = 2,5) aux tubes et les secouer pendant 7 minutes sur le mélangeur à rouleaux.
- Centrifugez à grande vitesse pendant quelques secondes (rotation rapide) et récupérez le surnageant dans un tube glacé frais.
- Répétez les étapes 2.2.14 et 2.2.15 pour chaque tube.
NOTE: Le volume final sera de 40 μL. - Ajouter 10 μL de tampon 4x Laemmli dans l'échantillon élué de 40 μL de l'étape 2.2.16.
REMARQUE: La couleur devient jaune en raison du pH acide. - Ajouter immédiatement 1 M Tris (pH = 8), une goutte à la fois, à l'échantillon élu de l'étape 2.2.18 jusqu'à sa couleurDevient bleu. Procédez aux tubes suivants.
- Faire bouillir les échantillons à partir de l'étape 2.2.18 à 70-90 ° C pendant 10 min. Procéder immédiatement à l'électrophorèse sur gel. Sinon, transférez les échantillons à un congélateur à -80 ° C jusqu'à ce que le chargement.
- Sur la glace, décongeler deux aliquotes du total des lysats de glande mammaire préalablement préparés.
- Application en aval: électrophorèse sur gel suivie de Western Blot
- Préparer la séparation et l'empilage des gels d'acrylamide SDS-PAGE (1,5 mm d'épaisseur) selon les procédures standard 15 .
REMARQUE: Le choix du gel (8-15% d'acrylamide, gradient: voir la Table des matériaux ) doit être déterminé en fonction de la taille moléculaire de la protéine à précipiter et des partenaires de liaison potentiels à analyser. Ces protéines doivent être résolues les unes des autres pour permettre une immunodétection appropriée. - Décongeler les échantillons liés à l'immunoprécipitation (IP) (étape 2.2.20) sur de la glace.
- Préparez des lysats de protéines à partir des mêmes échantillons (utilisés pour la procédure IP ci-dessus). Utiliser 50Μg de lysat total et ajouter un tampon d'échantillon 4X Laemmli. Faites bouillir les échantillons à 70-90 ° C pendant 5 minutes et placez-les sur de la glace jusqu'à ce qu'ils le chargent.
NOTE: Ces échantillons seront chargés à côté de l'échantillon élué IP pour démontrer la présence de protéines précipitées dans le lysat total. - Charger les lysats préparés à partir de l'étape 2.3.3 et les échantillons précipités de l'étape 2.2.20 côte à côte dans un gel d'acrylamide et les exécuter dans un tampon de roulement (10x tampon courant: 30.3 g de Tris, 144.1 g de glycine et 10 G de SDS dans 1 L d'eau distillée) à 100 V pour environ 95 minutes, ou jusqu'à ce que le bord des protéines migrantes atteigne le fond du gel.
- Transférer les gels sur une membrane de nitrocellulose ou PVDF en utilisant un protocole standard 9 , 15 .
- Bloquer la membrane pendant 1 h sur une bascule à basse vitesse dans du lait sec à 5% -TTBS (20 mM de Tris, 500 mM de NaCl et 0,05% de polysorbate 20).
- Identifiez si les précipitations ont été obtenues.
- Probe de la membrane en utilisant le premier anticorps contre la protéine précipitée, dilué dans 5% de TTBS au lait sec à la concentration recommandée par le fabricant, pendant une nuit à 4 ° C sur une plate-forme basculante avec une agitation lente.
REMARQUE: voir le tableau des matériaux pour les recommandations. - Le lendemain, lavez la membrane 3 fois pendant 5 minutes chacune avec TTBS sur une plate-forme basculante avec une forte agitation.
- Incuber la membrane dans l'anticorps secondaire approprié conjugué à la peroxydase de raifort (HRP), dilué dans TTBS, pendant 1 h à la RT sur une plate-forme basculante avec une agitation lente.
NOTE: En variante, un anticorps secondaire conjugué à un fluorochrome peut être utilisé si un appareil approprié pour détecter le signal est disponible. - Effectuer 3 à 6 lavages, chacun pendant 5 min, avec TTBS sur une plate-forme basculante avec une forte agitation. Analyser le signal de l'anticorps secondaire en incubant la membrane avec un produit commercial(Voir la Table des matériaux ) et suivre les instructions du fabricant. Détecter le signal en utilisant un système d'imagerie par chimioluminescence (voir la Table des matières ).
REMARQUE: pour un protocole détaillé sur l'analyse Western Blot, voir référence 16.
- Probe de la membrane en utilisant le premier anticorps contre la protéine précipitée, dilué dans 5% de TTBS au lait sec à la concentration recommandée par le fabricant, pendant une nuit à 4 ° C sur une plate-forme basculante avec une agitation lente.
- Pour identifier les protéines qui interagissent, procédez aux étapes 2.3.7.1-2.3.7.4 en utilisant les anticorps appropriés sur le même buvard.
NOTE: Si les protéines interagissent, les partenaires de liaison seront co-immunoprécipités avec la protéine cible et seront donc détectables par Western Blot. L'étape 2.3.8 peut être répétée avec plus d'anticorps pour déterminer si d'autres protéines résident dans le même complexe de protéines, à condition que les poids moléculaires des protéines soient suffisamment différents pour être bien séparés sur le gel et la membrane. - Pour confirmer que les partenaires de liaison identifiés ne sont pas des artefacts, une IP réciproque devrait être effectuée.
REMARQUE: ceci est effectué en répétantÉtapes 2.2.1-2.2.20 avec le même lysat mais précipitant l'un des partenaires de liaison identifiés à l'étape 3.8. Ensuite, les étapes 3.1-3.8 sont répétées en utilisant l'anticorps primaire contre la première protéine d'intérêt.
- Préparer la séparation et l'empilage des gels d'acrylamide SDS-PAGE (1,5 mm d'épaisseur) selon les procédures standard 15 .
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Representative Results
Pour déterminer si les composants GJ, AJ et TJ peuvent interagir ensemble dans la glande mammaire, les analyses de co-IF ont d'abord été effectuées. Cx26, une protéine GJ et une β-Catenine, une protéine AJ, ont été sondées avec des anticorps spécifiques et ont révélé des anticorps à base de souris fluorés-647 (vert, pseudocolor) et chèvre-568 (rouge) respectivement ( figure 1B et C ) . Les données ont montré qu'ils co-localisent à la membrane cellulaire des cellules épithéliales dans la glande mammaire de la souris le jour 7 de l'allaitement (L7), reflété par la couleur jaune ( Figure 1D ). Deuxièmement, Claudin-7, une protéine TJ; E-cadhérine, une protéine AJ; Et Connexin26 (Cx26), une protéine GJ, ont été sondés avec leurs anticorps spécifiques et ont été révélés avec respectivement des anticorps fluorophores-lapidés-488 (vert), souris 555 (rouge) et souris-647 (corail bleu, pseudocolor) ( Figure 2B-D ). L'e-cadhérine et la co-localisation Claudin-7 sontAffiché sous la forme d'une couleur orange jaune-a-lumière, tandis que la co-localisation Cx26 avec E-cadhérine et Claudin-7 a entraîné une coloration ponctuée blanche dans les glandes mammaires de souris le jour 18 de la grossesse (P18) ( figure 2E ).
Pour savoir quelles protéines de jonction se mêlent et s'attachent physiquement à la membrane cellulaire, une co-immunoprécipitation a été réalisée à l'aide de tissus de glandes mammaires provenant de souris en lactation (L14). Les résultats ont montré que Cx43, une composante de GJ, interagit avec E-Cadherin et Claudin-7, mais pas avec Claudin-3 ( Figure 3A et B ). Ces résultats ont été confirmés par la propriété intellectuelle réciproque; Lorsque l'E-Cadherine a été immunoprécipitée, elle a interagi avec Cx43 et Claudin-7 ( Figure 3C ).
Figure 1: co-localisation de β-Catenin et Cx26 au niveau de la celluleRane chez les souris glandes mammaires. Les cryosections provenant des glandes mammaires de la souris au jour de la lactation 7 (L7) ont été coupées (7 μm) et traitées pour la coloration immunofluorescente. ( A ) Les noyaux ont été colorés avec DAPI (bleu). ( B ) Cx26 (vert, pseudocolor) et ( C ) β-Caténine (rouge) sont combinés avec des anticorps appropriés à base de fluorophores. ( D ) Une image fusionnée. Les images ont été obtenues avec un microscope confocal équipé d'un détecteur spectral. DAPI a été visualisé en utilisant les paramètres suivants: longueur d'onde d'émission, 450,0 nm; Longueur d'onde d'excitation, 402,9 nm; Puissance laser, 1,2; Gain de détecteur, PMT HV 100; Décalage PMT, 0. Cx26 (647) a été visualisé en utilisant les paramètres suivants: longueur d'onde d'émission, 700,0 nm; Longueur d'onde d'excitation, 637,8 nm; Puissance laser, 2,1; Gain du détecteur, PMT HV 110; Offset PMT, 0. β-Catenin (568) a été visualisé en utilisant les paramètres suivants: longueur d'onde d'émission, 595,0 nm; Longueur d'onde d'excitation, 561,6 nm; laserPuissance 2,1; Gain du détecteur, PMT HV 110; Offset PMT, 0. Barres d'échelle = 50 μm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: Connexin26 (Cx26), E-cadhérine et Claudin-7 co-localisent à la membrane cellulaire dans les glandes mammaires des souris. Les cryosections des glandes mammaires lors de la grossesse 18 (P18) ont été coupées (7 μm) et traitées pour la coloration immunofluorescente en utilisant ( B ) Claudin-7 (vert), ( C ) E-Cadherine (rouge) et ( D ) Cx26 (corail Bleu; pseudocolor), combiné avec les anticorps appropriés liés au fluorophore. ( A ) Les noyaux ont été colorés avec DAPI (bleu). Les images ont été obtenues avec un microscope confocal équipé d'un détecteur spectral. DAPI a été visualisé en utilisant le fParamètres suivants: longueur d'onde d'émission, 450,0 nm; Longueur d'onde d'excitation, 402,9 nm; Puissance laser, 5,4; Gain de détecteur, PMT HV 65; Offset PMT, 0. Claudin-7 (488) a été visualisé en utilisant les paramètres suivants: longueur d'onde d'émission, 525,0 nm; Longueur d'onde d'excitation, 489,1 nm; Puissance laser, 5,0; Gain de détecteur, PMT HV 12; Décalage PMT, 0. L'E-Cadherine (568) a été visualisée en utilisant les paramètres suivants: longueur d'onde d'émission, 595,0 nm; Longueur d'onde d'excitation, 561,6 nm; Puissance laser, 13,5; Gain de détecteur, PMT HV 45; Décalage PMT, 0. Cx26 (647) a été visualisé en utilisant les paramètres suivants: longueur d'onde d'émission, 700,0; Longueur d'onde d'excitation, 637,8; Puissance laser, 5,0; Gain de détecteur, PMT HV 55; Offset PMT, 0. Barres d'échelle = 50 μm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3: Cx43, E-Cadherin et Claudin-7, mais pas Claudin-3, sont impliqués dans un complexe protéique. Cx43 ( A et B ) et E-Cadherine ( C ) ont été immunoprécipités en utilisant 500 mg de lysats totaux à partir de glandes mammaires de souris à l'allaitement. Les IP et les lysats ont été chargés dans des gels et transférés sur des membranes PVDF. Parce que Claudin-7 et Claudin-3 ont le même poids moléculaire, ils n'ont pas pu être analysés sur la même membrane. Ainsi, deux IP parallèles ont été effectuées avec le même lysat pour Cx43, chargées sur deux gels et transférées (membranes A et B). La membrane A a d'abord été sondée avec Cx43 pour confirmer l'efficacité de l'IP (panneau supérieur). Ensuite, la membrane a été sondée séquentiellement avec E-Cadherin et Claudin-7. L'analyse Western Blot a montré que les deux protéines interagissent avec Cx43. La membrane B a d'abord été sondée avec Cx43 pour confirmer l'efficacité de l'IP (panneau supérieur) et ensuite sondée avec Claudin-3. L'analyse Western Blot a montré que Claudin-3 dId non IP avec Cx43, démontrant que les deux protéines n'interagissent pas. La Membrane C a d'abord été sondée avec E-cadherine pour confirmer l'efficacité de l'IP (panneau supérieur). Ensuite, la membrane a été sondée séquentiellement avec Cx43 et Claudin-7. L'analyse Western Blot a confirmé les interactions entre les protéines. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Les interactions cellule-cellule par des jonctions sont nécessaires pour la bonne fonction et le développement de nombreux organes, comme la glande mammaire. Des études ont montré que les protéines de jonction peuvent réguler la fonction et la stabilité l'une de l'autre et activer la transduction du signal en s'attachant mutuellement à la membrane 10 de la cellule. Les protocoles présentés dans le manuscrit actuel ont fourni des résultats intéressants sur l'expression, la localisation et l'interaction différentielle des protéines jonctionnelles lors du développement normal de la glande murine 9 . Étant donné que la localisation des protéines de jonction est essentielle à la fonction des protéines, et parce qu'elles sont connues pour interagir avec les protéines d'échafaudage et de nombreuses kinases 3 , co-IF et co-IP sont des techniques efficaces dans le domaine des interactions cellule-cellule. Non seulement ces méthodes sont-elles essentielles pour éclairer la nécessité des liens de jonction dans le développement de la glande mammaire et leur dysLa régulation dans le cancer du sein, mais ils peuvent également être utilisés dans d'autres tissus et dans des expériences utilisant des lignées cellulaires.
La glande mammaire est composée de deux compartiments principaux: le stroma et l'épithélium 4 . L'épithélium adulte est constitué de deux couches de cellules. Dans cette approche, la proximité des partenaires de liaison potentiels a été déterminée à l'aide de la technique co-IF, et leurs interactions physiques ont été confirmées à l'aide de co-IP. Le co-IF a été utilisé avec succès par d'autres pour démontrer la co-localisation des protéines dans le même tissu, la structure, la cellule ou le compartiment intracellulaire 17 , 18 . Le principal avantage de cette technique est l'information visuelle qu'il apporte sur la localisation cellulaire ou sous-cellulaire de chaque protéine dans les différents types de cellules composant le tissu. Bien que cette technique soit assez simple, certaines recommandations doivent être suivies. Par exemple, pour éviter les dommages aux tissus,Ajoutez toujours les solutions une fois par fois à l'aide d'une pipette de 200 μl ou d'une pipette de transfert. Cela permettra l'immersion de la surface du tissu sans endommager les tissus. De même, retirez les solutions à l'aide d'une pipette Pasteur placée à côté des tissus en inclinant doucement la glissière. En outre, pour les anticorps dont la solution de stockage contient du glycerol, une aspiration soigneuse des tampons de lavage est nécessaire pour réduire l'arrière-plan. En outre, la présence de protéines du lait, telles que les caséines, pendant la lactation, peut interférer avec les anticorps en les piétinant, ce qui entraîne des faux positifs. Une analyse critique de l'image résultante est donc requise, en particulier à ce stade.
Cette technique de co-IF comporte également certaines limites ou pièges. Premièrement, il faut des anticorps spécifiques. Comme indiqué précédemment (étape 1.1), il est recommandé d'utiliser une section ( c.-à-d. Celle du côté droit) sur chaque diapositive pour la coloration en suivant les étapes décrites ci-dessus, en ajoutant laPrimaires et secondaires séquentiellement. Pour la section restante ( c'est-à-dire celle du côté gauche), suivre la même procédure, en utilisant du TBS-polysorbate 20 0,1% au lieu des solutions primaires d'anticorps. Bien qu'il soit également possible, et même mieux, de vérifier la liaison spécifique de l'anticorps en utilisant une compétition peptidique, les peptides utilisés pour générer des anticorps commerciaux ne sont pas toujours disponibles. Il est donc important de vérifier la spécificité de la liaison en utilisant des contrôles positifs et négatifs ( c'est-à-dire des tissus ou des cellules connus pour exprimer ou non la protéine d'intérêt). En outre, les sites de fixation de l'antigène peuvent être inaccessibles, en particulier pour les tissus fixés au formol, ce qui entraîne l'absence de signal spécifique. Une procédure de récupération d'antigène peut donc être nécessaire pour certains tissus. Une incubation courte avec un détergent peut également être effectuée avant la récupération de l'antigène pour perméabiliser la membrane cellulaire. Deuxièmement, pour le multiplexage, les anticorps doivent être élevés chez différents animaux.Par exemple, si un anti-lapin a été utilisé à l'étape 1.2.6, on peut choisir l'anti-souris à l'étape 1.2.10, mais pas un autre anticorps soulevé chez le lapin. Comme la plupart des anticorps commerciaux sont élevés chez des lapins, des souris ou des chèvres, il est parfois difficile, voire impossible, de cibler deux protéines en même temps en raison de l'absence d'anticorps appropriés. Pour surmonter ces limites, on peut soit acheter des anticorps pré-marqués disponibles dans le commerce, soit étiqueter des anticorps primaires avec des fluorophores en utilisant des trousses disponibles dans le commerce. Troisièmement, une autre lacune est liée à l'excitation et à l'émission des différents fluorophores. Pour éviter le chevauchement des signaux à partir de deux anticorps différents, le spectre d'émission d'excitation de chaque fluorophore doit être séparé. Ainsi, le nombre de cibles qui peuvent être analysées à la fois varie en fonction de la configuration du microscope disponible. Enfin, la qualité de l'analyse dépend fortement du microscope utilisé. Des données plus détaillées et plus précises peuventÊtre obtenu à l'aide d'un microscope confocal par rapport à un microscope épifluorescent. L'utilisation d'une microscopie à super résolution peut révéler une localisation de protéines encore plus détaillée 19 .
Bien que la co-IF apporte des idées importantes sur la proximité des partenaires de liaison potentiels, elle devrait être complétée par d'autres méthodes pour identifier les interactions physiques entre les protéines. Parmi les méthodes disponibles, co-IP est probablement l'un des plus abordables à effectuer, car l'équipement et le matériel sont facilement accessibles. En utilisant un anticorps lié à des perles magnétiques, on peut isoler des complexes de protéines et identifier les composants présents dans ce complexe en utilisant une analyse Western Blot typique. À l'instar de la co-IF, certaines recommandations devraient être suivies pour les meilleures pratiques. Par exemple, il est recommandé de minimiser les échantillons lors de l'homogénéisation des tissus pour réduire le temps entre les étapes 2.1.5 et 2.1.9. Bien qu'une personne expérimentée puisse traiter jusqu'à 10 échantillons auUn débutant ne devrait pas traiter plus de 4-6 échantillons. De même, le nombre de tubes devrait être limité lors de l'exécution du protocole IP pour la première fois. Il est recommandé de commencer par un témoin négatif ( c.-à-d., IgG) et un contrôle positif ( c.-à-d., Un tissu connu pour contenir la protéine à immunoprécipiter). Le deuxième essai devrait être dédié à l'optimisation (voir étape 2.2.2). Une fois que ces étapes donnent des résultats satisfaisants, les échantillons à analyser peuvent être traités. Notez qu'un contrôle négatif doit toujours être inclus dans la procédure.
Cette technique co-IP comporte également des pièges potentiels. Premièrement, il faut que les tissus soient homogénéisés dans des conditions permettant la préservation des liaisons entre les protéines. Pour les protéines membranaires, telles que les protéines de jonction, il est également crucial d'utiliser un tampon qui préservera les liens entre les protéines tout en permettant leur solubilité. Deuxièmement, semblable à la co-IF, il nécessite des anticorps à forte affinitéPour les protéines cibles et les partenaires de liaison. En outre, étant donné que les protéines restent dans leur conformation tertiaire et que les complexes de protéines ne sont pas dissociés par homogénéisation, si l'anticorps reconnaît une partie de la protéine cible qui se trouve à proximité immédiate du domaine de liaison d'un partenaire ou qui est caché à l'intérieur de la structure native de la protéine , L'IP peut être compromise. Il est donc essentiel de vérifier toujours l'efficacité de l'IP en utilisant Western Blot avant de conclure l'absence d'un partenaire de liaison. Troisièmement, co-IP peut générer des résultats faussement positifs en raison de la protéine soit liant directement aux perles ou précipiter pendant la procédure sans faire partie du complexe. Pour identifier ces artefacts, un contrôle IgG est nécessaire, ainsi qu'une IP réciproque, comme décrit dans les méthodes présentées. Il est également possible d'ajouter une procédure "pré-nettoyage" entre les étapes 2.2.2 et 2.2.3 pour éviter la liaison non spécifique des protéines aux perles. Pour ce faire, incuberE lysats avec 50 μg de perles pendant 1 h à 4 ° C sur un mélangeur à rouleaux. Retirez les perles avec le support magnétique et passez à l'étape 2.2.3. Quatrièmement, les chaînes lourdes et légères d'IgG peuvent être de la même taille que les protéines d'intérêt ou le partenaire de liaison, masquant ainsi le signal. Une solution consiste à dissocier les chaînes d'IgG avec la glycine, comme décrit dans ce manuscrit. Il est également possible d'acheter des anticorps secondaires qui ne reconnaissent que les anticorps indigènes et ne se lient donc pas à la lumière dénaturé et aux chaînes lourdes chargées dans la membrane (voir la Table des matériaux ). Les deux méthodes peuvent parfois être combinées. Cinquièmement, co-IP permet d'identifier un nombre limité de partenaires de liaison, en partie en raison du nombre d'anticorps qui peuvent être sondés sur la membrane. Il nécessite également la pré-identification de ces partenaires de liaison, soit par co-IF, soit par une revue de la littérature. Enfin, co-IP permet l'identification des protéines présDans un complexe, et non pour l'interaction directe entre deux protéines.
Les résultats de co-IP peuvent être analysés de différentes façons. Il est possible d'identifier uniquement les partenaires en interaction en réexpétant la même membrane avec différents anticorps, comme décrit dans ce manuscrit. Il est également possible de quantifier cette interaction. Pour ce faire, la quantité de protéine immunoprécipitée est d'abord quantifiée en sondant la membrane avec un anticorps contre cette protéine. L'intensité du signal est analysée à l'aide d'un logiciel d'imagerie, tel que décrit dans ce manuscrit. Ensuite, la membrane est re-sondée avec un anticorps contre le partenaire de liaison, et l'intensité du signal également quantifiée. Les interactions entre les deux protéines peuvent alors être exprimées en un rapport de la quantité du partenaire de liaison à la quantité de protéine immunoprécipitée. Cependant, pour permettre la comparaison, les différents échantillons doivent être traités en même temps et chargés sur la même membrane. BiologLes répliques sexuelles peuvent être effectuées et analysées de manière similaire, et une analyse statistique peut être effectuée.
Au cours des dernières années, d'autres techniques ont été développées pour analyser les PPI. Par exemple, FRET permet d'identifier des protéines interagissant par transfert d'énergie d'une étiquette à l'autre, seulement lorsque les protéines sont assez proches pour interagir 20 . Cependant, comme cela nécessite que les protéines soient étiquetées, cette technique ne peut pas être utilisée dans les tissus. De même, il est possible d'identifier les PPI en utilisant une protéine fusionnée avec une biotine ligase bactérienne, BirA 21 . Cette ligase ajoutera de la biotine à des protéines qui viennent à proximité ( c.-à-d., Interagissent) avec la protéine chimère. Bien que cette méthode soit novatrice et impartiale, elle ne peut être effectuée dans les tissus. Alternativement, le PLA peut être utilisé dans les tissus. De manière similaire à la co-IF, ce dosage est basé sur l'affinité des anticorps. Pour ce dosage, les anticorps secondaires sont marqués avec des séquences d'ADN thaT peuvent interagir lorsqu'ils sont à proximité immédiate ( c.-à-d. Sur les PPI) et forment une molécule d'ADN circulaire 22 . Cette molécule d'ADN circulaire est ensuite amplifiée et détectée en utilisant des oligonucléotides complémentaires marqués par fluorescence. Bien que ce test soit élégant, il requiert de nombreuses étapes de validation et repose toujours sur l'affinité primaire des anticorps et une certaine connaissance des partenaires potentiels en interaction. Enfin, une alternative impartiale au test traditionnel de propriété intellectuelle a également été développée pour identifier les IPP. En spectrométrie de masse rapide d'immunoprécipitation des tests de protéines endogènes (RIME), les échantillons IP sont analysés par spectrométrie de masse (IP / MS) 23 au lieu de l'analyse Western Blot. Le principal avantage de cette méthode à haut débit est qu'il fournit des informations massives sur toutes les protéines intergénérales qui utilisent peu de matériaux. Cependant, il nécessite l'accès à un instrument peptidique-séquençage 23 .
C'estImportant de mentionner que, après plusieurs essais préliminaires, chaque étape de ce protocole a été optimisée pour la glande mammaire. Cependant, la méthode peut certainement être utilisée pour d'autres organes après quelques modifications. Pour la co-IF, la température optimale pour la coupe des glandes mammaires, le blocage et le lavage et les solutions appropriés, et les concentrations d'anticorps appropriées ont tous été testées. Pour la co-IP, différents tampons de lyse et d'élution et méthodes d'extraction ont également été testés et ont un impact majeur sur la réussite de l'IP. En résumé, chaque étape de ce protocole est importante pour obtenir des résultats de haute qualité et reproductibles avec le moins d'arrière-plan possible et la plus spécificité. Bien que d'autres méthodes soient disponibles, la co-IF suivie d'une co-IP reste valide et des méthodes simples pour évaluer les IPP. Ces deux techniques peuvent être utilisées à la fois dans les tissus et dans les lignées cellulaires et ne nécessitent que quelques étapes et contrôles de validation.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à déclarer.
Acknowledgments
La PI est financée par une subvention du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (NSERC n ° 418233-2012); Un Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQS), une bourse de carrière de la Fondation du cancer du sein du Québec et une subvention Leader Founds de la subvention de la Fondation canadienne pour l'innovation. ED a reçu une bourse de la Fondation universitaire Armand-Frappier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice strain and stage | St. Constant, Quebec, Canada | C57BL/6 Femals; pregnancy day 18 (P18) and lactation day 14 (L14), Charles River Canada | |
| PBS 10x (stock) | 1) Dissolve 80 g NaCl (F.W.: 58.44), 2 g KCl (F.W. 74.55), 26.8 g Na2HPO4·7H2O (F.W. 268.07) and 2.4 g KH2PO4 (F.W.:136.09) in 800 mL distilled water; 2) Adjust the PH to 7.4; 3) Add water to reach to the 1 L final volume. |
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| TBS 10x (stock) | 1) Dissolve 60.5 g TRIS, 87.6 g NaCl in 800 mL distilled water; 2) Adjust the pH to 7.5; 3) Add water to reach to the 1 L final volume. |
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| Part 1: Immunofluorescence | |||
| Freezing media | VWR International, Ville Mont-Royal, QC, Canada | 95067-840 | VMR frozen sections compound |
| Microtome | Mississauga, ON, Canada | 956640 | Microm HM525, Thermo fisher scientific HM525 NX Cryostat 115 V 60 Hz |
| Blades | C.L. Sturkey, Inc. Les Produits Scientifiques ESBE St-Laurent, QC, Canada | BLM1001C | High profile gold coated blades |
| Pap pen | Cedarlane, Burlington, ON, Canada | 8899 | Super PAP Pen, Thermo fisher scientific |
| Microscopic slides | Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada | 12-550-15 | Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides |
| Formaldehyde | BioShop Canada Inc, Burlington, ON, Canada | FOR201.1 | Forlmadehyde |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA | ||
| Blocking solution | 3% BSA in TBS | ||
| Wash solution | TBS-Tween 20 0.1% | ||
| Polysorbate 20 | Oakville, ON, Canada | P 9416 | Tween 20, Sigma-Aldrich |
| Mounting media | Cedarlane, Burlington, ON | 17984-25(EM) | Fluoromount-G |
| First & secondary antibodies | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | See Comments | E-Cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) 1/50 (Cell Signaling) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 555 (#4409s), Cell Signaling |
| First & secondary antibodies | Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USA | See Comments | Claudin-7 (#34-9100) 1/100 (Life Technologies) with anti-rabbit IgG Fab2 Alexa Fluor 488 (#4412s) (Cell Signaling) |
| First & secondary antibodies | Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA; Fischer Scientific, Burlington, ON, Canada | See Comments | β-Catenin Antibody (C-18): sc-1496 (SANTA CRUZ) with anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 (#A11057), Molecular Probe (Fisher Scientific) |
| First & secondary antibodies | Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USA | See Comments | Connexin26 (#33-5800) 1/75 (Life Technologies) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 647 (#4410s) |
| Nuclei stain | Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada | D1306 | DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) 1/1,000 in PBS |
| Fluorescent microscope | Nikon Canada, Mississauga, On, Canada | Nikon A1R+ confocal microscopic laser equipped with a spectral detector | |
| Software of IF images analysis | Nikon Canada, Mississauga, On, Canada | NIS-elements software (version 4) | |
| Part 2: Immunoprecipitation | |||
| Triple-detergent Lysis buffer (100 mL) pH=8.0 | 1) Mix 50 mM TRIS (F.W.: 121.14), 150 mM NaCl (F.W.: 58.44), 0.02% Sodium Azide, 0.1% SDS, 1% NONIdET P40, 0.5% Sodium Deoxycholate in 80 mL distilled H2O. 2) Adjust the pH to 8.0 with HCl 6 N (~0.5 mL). 3) Adjust the volume to 100 mL. Keep it in fridge. At the day of protein extraction, use 1/100 NaVo3, 1/100 protease/phosphatase inhibitor and 1/25 NAF in calculated amount of Triple detergent lysis buffer: Sodium Fluoride (stock) solution 1.25 M (F.W.: 41.98), Sodium Orthovanadate (stock) Solution 1 M (F.W.: 183.9) |
||
| Protease/phosphatase inhibitor | Fisher Scientific, Burlington, ON | 78441 | Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100x) |
| Protein dosage | Thermo Scientific, Rockford, Illinois, USA | 23225 | Pierce BCA protein assay kit |
| Tissue grinder | Fisher Scientific, Burlington, ON | FTH-115 | Power 125, Model FTH-115 |
| Magnetic beads and stand | Millipore, Etobicoke, ON, Canada | PureProteome Protein G Magnetic Bead System (LSKMAGG02) | |
| Wash solution for IP | PBS or PBS-Tween20 0.1% depending to the step | ||
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | See Comments | IgG Rabbit (rabbit (DA1E) mAb IgG Isotype control (#3900s) (Cell Signaling) 0.5 µL/200 µL |
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | See Comments | IgG Mouse mouse (G3A1) mAb IgG Isotype control (#5415s) (Cell Signaling) 0.5 µL/200 µL |
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada | See Comments | Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 4 µL/200 µL |
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | See Comments | E-cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) (Cell Signaling) 1 µL/200 µL |
| Laemmli buffer | BIO-RAD, Mississauga, Ontario, Canada | 1610747 | 4x Laemmli Sample Buffer (Add β-mercaptoethanol following manufacturer recommendation) |
| Acidic glycine | Fisher Scientific, Burlington, ON | PB381-5 | 0.2 M glycine; adjust pH=2.5 with HCl |
| Tris | Fisher Scientific, Burlington, ON | BP152-1 | 1 M (pH=8) |
| SDS-PAGE acrylamide gels | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1610180 -5 | TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Solutionss (7.8%, 10%, 12%) |
| Running buffer 10x | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1704272 | Tris 30.3 g/glycine 144.1 g /SDS 10 g in 1 L distilled water |
| Membranes | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1704272 | PVDF membranes, Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit |
| Transfer method | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1704155 | Trans-Blot Turbo Transfer System |
| Dry Milk | Smucker Food of Canada Co, Markham, ON, Canada | Fat Free Instant Skim Milk Powder, Carnation | |
| Blocking solution for blots | 5% dry milk in TBS-Tween 20 0.1% | ||
| Washing solutions for blots | TBS-Tween 20 0.1% | ||
| Primary and secondary antibodies for blots (10 mL) | Sigma-Aldrich, Oakville, Ontario & Abcam, Toronto, ON, Canada | See Comments | Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 1/2,500 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Primary and secondary antibodies for blots (10 mL) | Cell Signaling, Beverly, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada | See Comments | E-cadherin (24E10) rabbit mAb 1/1,000 (#3195s) (Cell Signaling) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Primary and secondary antibodies for blots (10 mL) | Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada | See Comments | Claudin-7 (#34-9100) (Life technologies) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Primary and secondary antibodies for blots (10 mL) | Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada | See Comments | Claudin3 (#34-1700) (Life technologies) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Luminol solution for signal detection on blots | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1705061 | Clarity Western ECL Blotting Substrate |
| Imaging blots | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1708280 | ChemiDoc MP imaging system |
| Analayzing blots | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | ImageLab 5.2 software | |
References
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