Summary
細胞間接合部は、乳腺段階特異的機能および発達のための必要条件である。この写本は、タンパク質 - タンパク質相互作用（PPI）の研究およびマウス乳腺を用いた共局在のための詳細なプロトコールを提供する。これらの技術は、異なる発達段階での細胞間接合間の物理的関連の動態の調査を可能にする。
Abstract
細胞 - 細胞相互作用は、組織の完全性および乳腺の異なる区画間の障壁を保存する中枢的役割を果たす。これらの相互作用は、隣接する細胞間の連結を形成する結合タンパク質によって提供される。接合タンパク質の位置の誤った局在化およびそれらの結合パートナーとの物理的関連の低下は、機能の喪失をもたらし、その結果、器官の機能不全をもたらし得る。したがって、正常および疾患関連組織におけるタンパク質局在化およびタンパク質 - タンパク質相互作用（PPI）の同定は、発症状態の疾患または変化の進行につながる新しい証拠およびメカニズムを見出すために不可欠である。この原稿は、マウス乳腺におけるPPIを評価するための2段階の方法を提示している。プロトコルセクション1では、目的のタンパク質に対して生じた抗体、続いて蛍光色素で標識された二次抗体を用いて共免疫蛍光（co-IF）を行う方法が記載されている。 co-IF allタンパク質の接近を実証するために、物理的な相互作用を研究することが可能です。したがって、共免疫沈降（co-IP）のための詳細なプロトコールがプロトコールセクション2に提供される。この方法は、これらの相互作用が直接的であるか間接的であるかを確認することなく、タンパク質間の物理的相互作用を決定するために使用される。ここ数年、co-IFおよびco-IP技術は、細胞間接合のある種の成分が共に局在化し、相互作用し、乳腺発達中に変化する段階依存的接合結合を生じることを実証している。
Introduction
乳腺の成長と発達は、主に出生後に起こる。この臓器は、哺乳動物の生殖生涯を通して常にそれ自体を改造する1 。成体乳腺上皮は内腔上皮細胞の内層と基底細胞の外層（主に筋上皮細胞から構成され、基底膜2で囲まれている）からなる。乳腺の構造と発達に関する良いレビューのために、読者はSternlicht 1を参照することができます。腺1、3、4、5、6の正常な発達および機能のためには、ギャップ（GJ）、タイト（TJ）およびアフェレン（AJ）ジャンクションを介した細胞 - 細胞相互作用が必要である。マウス乳腺におけるこれらの接合部の主成分は、Cx26、Cx30、Cx32、およびCx43（GJ）である。 Claudin-1、-3、-4、-7およびZO-1（TJ）; E-カドヘリン、P-カドヘリンおよびβ-カテニン（AJ） 7,8 。これらの異なる接合タンパク質の発現レベルは、乳腺発達中に段階依存的に変化し、異なる細胞 - 細胞相互作用要件を示唆している9 。 GJ、TJ、およびAJは、構造的および機能的に連結され、隣接する細胞の隣接する部位に他の構造または調節タンパク質をつなぎ合わせることにより、接合的連結体10を生成する。結合接合の組成は、根底にある細胞骨格との架橋、ならびにネクサスの透過性および安定性に影響を及ぼし得、その結果、腺8,9,10,11の機能に影響を及ぼし得る。接合部接合部に存在するか、または相互に相互作用する細胞間接合部の成分は、乳がん発達の最近の発達段階を、共免疫蛍光（co-IF）および同時免疫沈降（co-IP） 9を用いて最近解析した。他の技術はタンパク質間の機能的関連性の評価を可能にするが、これらの方法はこの原稿には示されていない。
タンパク質は機能するだけで単独で作用するため、シグナル伝達や生化学カスケードなどのタンパク質 - タンパク質相互作用（PPI）の研究は多くの研究者にとって不可欠であり、タンパク質の機能に関する重要な情報を提供することができます。 Co-IFおよび顕微鏡分析は、同じ細胞下の空間を共有するいくつかのタンパク質を評価するのに役立ちます。しかしながら、標的の数は、異なる動物において惹起されなければならない抗体によって、および異なる波長レーザーを備える共焦点顕微鏡および多重化のためのスペクトル検出器にアクセスすることによって制限される。 Co-IPは、親和性の高い物理的相互作用を確認または明らかにするタンパク質複合体内に存在する2つ以上のタンパク質を含む。タンパク質の局在化および相互作用を同時に検出することができる蛍光共鳴エネルギー移動（FRET） 12および近接ライゲーションアッセイ（PLA） 13などの新規技術の開発にもかかわらず、co-IPは、間の相互作用を研究するための適切かつ手頃な技術である内在性タンパク質。
この原稿で説明されている段階的方法は、乳腺の内在性PPIを研究する際に避けるために、タンパク質の局在化およびPPIの研究を容易にし、落とし穴を指摘するでしょう。この方法論は、各技術に必要な組織の異なる保存手順の提示から始まる。第1部では、i）乳腺の切片化、ii）co-IF法を用いた異なるタンパク質の二重標識または三重標識、およびiii）タンパク質の局在化。パート2は、内因性タンパク質を沈降させ、その相互作用タンパク質をi）溶解産物調製、ii）間接タンパク質免疫沈降、およびiii）SDS-PAGEおよびウェスタンブロットによる結合パートナー同定の3つのステップで同定する方法を示す。このプロトコールの各ステップは、げっ歯類の乳腺組織に対して最適化され、高品質で特異的かつ再現性のある結果を生じる。このプロトコールは、他の組織または細胞系におけるPPI研究の出発点として使用することもできる。
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Protocol
この研究で使用された全ての動物プロトコールは、University Animal Care Committee（INRS-Institut Armand-Frappier、Laval、Canada）によって承認された。
1.タンパク質共局在の同定
- 組織から顕微鏡スライドまで
注記：組織や切片はドライアイスで取り扱う必要があります。- 動物から乳腺を摘出する（この手順の完全な説明については、Plante らを参照のこと） 14 。
- 切除した組織をドライアイス上の凍結/マウント培地に包埋する。腺を覆うのに十分な培地を加える。培地が凝固したら、組織を冷凍庫に移し、後で使用するために-80℃で保存する。
- 凍結ミクロトームを-35℃以下に設定して、組織を7-10μmの厚さの切片に切断し、顕微鏡スライド上に置く。
注：可能であれば、各スライドに2つのセクションを配置してください。左のセクションは抗体の特異性および組織の自己蛍光を確認するための通常の制御、右側は抗体で標識される。 - 後で使用するためにセクションを-80°Cに保ちます。
- Co-IF染色
- 冷凍庫から適切な顕微鏡スライドを回収し、室温（RT）でホルムアルデヒド4％中に15分間浸漬することにより、セクションを直ちに固定する。
- 次に、スライドをリン酸緩衝生理食塩水（PBS）に室温で浸します。次のステップに進むまで、RTでPBS中にスライドを放置する。
- 市販の疎水性バリアーまたは撥水ラボペン（ 表の表を参照 ）を使用してスライドの各セクションを囲みます。組織に触れないように注意してください。直ちに、PBSの滴を組織に加え、手順の残りの間、湿った組織学的チャンバー内にスライドを置く。
注記：組織切片は湿ったままでなければなりません。オルタナティブ蓋が付いた箱を使用し、底に濡れた紙タオルを置きます。 - 3％ウシ血清アルブミン（BSA） - トリス緩衝生理食塩水（TBS）-0.1％ポリソルベート20（材料の表参照）の100-200μLで各組織切片をRTで30分間ブロックする。サンプルがブロッキングしている間に、抗体をTBS-0.1％ポリソルベート20で希釈することにより、一次および二次抗体溶液を調製する。
注：抗体に必要な濃度は製造業者によって提供される。実施例については、 表 1および2ならびにDianati et al。を参照のこと。 9 。ほとんどのフルオロフォア結合抗体を使用する場合、暗所で作業する必要はありませんが、抗体溶液や染色組織を強い光にさらさないようにしてください。 - 吸引によってブロッキング溶液を除去し、希釈した一次抗体100〜200μL中の切片をRTで60分間インキュベートする。代替4℃で一晩、一次抗体と共にインキュベートする。
- 一次抗体溶液を吸引により除去し、切片をTBS-0.1％ポリソルベート20250-500μLで5分間洗浄する。吸引によって洗浄液を除去し、洗浄を2回繰り返す。
- 洗浄液を吸引して除去し、切片を適切なフルオロフォア結合二次抗体100〜200μLと共に室温で60分間インキュベートする。
- 二次抗体溶液を吸引除去し、TBS-0.1％ポリソルベート20250-500μLで切片を5分間洗浄する。洗浄溶液を除去し、2回繰り返す。
- 目的の次のタンパク質に一次抗体と二次抗体の適切な組み合わせを使用して、ステップ2.5-2.8を繰り返します。
- 洗浄液を吸引除去し、TBS-0.1％ポリソルベート20中の1mg / mLの4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）を100-200μLで5分間インキュベートすることにより核染色を行う。RT。
- 吸引によりDAPI溶液を除去し、水溶性で非蛍光性のマウント媒体（ 表の表を参照 ）およびカバーガラスを用いてスライドをマウントする。一度に1つのスライドを進めます。
注：核染色を5分間以上インキュベートしても、染色の強度は変わりません。あるいは、すべてのスライド上のDAPI溶液を除去し、スライドをマウントしながらPBSで組織をインキュベートする。 - 少なくとも8時間4℃の冷蔵庫に平らにスライドを置きます。蛍光顕微鏡イメージングに進みます（ 図1と図2を参照）。
- 顕微鏡イメージング
- 特定の波長でフルオロフォアを励起するのに必要な様々なレーザーを備えた共焦点顕微鏡を使用して、フルオロフォア結合二次抗体を視覚化する。
注：ダクトおよび肺胞を視覚化するためには、0.95の開口数を有する40倍の対物レンズが提案される。 explpleを図1に示します。 - 1つの波長で画像をスキャンすることにより、各タンパク質の局在を個々に確認する。
注：この段階では、接合タンパク質の局在を批判的に分析することが重要です。ジャンクショナルネクサスを形成することができるためには、これらのタンパク質は原形質膜に局在していなければならない。 - 異なる波長でレーザーでスキャンされた画像をマージすることにより、タンパク質の共局在を決定する。
注：タンパク質共局在は、同じ場所で2つ以上のフルオロフォアが放出されることに起因する色の変化によって視覚化することができ、適切なソフトウェア（ 図1および図2 ;参考文献9も参照）を用いて測定することができる。
- 特定の波長でフルオロフォアを励起するのに必要な様々なレーザーを備えた共焦点顕微鏡を使用して、フルオロフォア結合二次抗体を視覚化する。
2. PPIの勉強
注：腹部乳腺は、胸部腺が胸部と密接に関連しているため、PPIを研究するために使用する必要があります筋肉。 （この手順の完全な説明については、Plante et al 。を参照してください） 14乳腺を摘出し、後で使用するために-80℃に保ちます。
- ライセートの調製
- 次のステップに進む前に、秤量紙と2 mLのマイクロ遠心チューブをドライアイスに置き、あらかじめ冷却してください。
- -80℃から乳腺組織を取り出し、ドライアイス上に保ちます。
- あらかじめ冷却した秤量紙上で組織の重量を測り、組織を2 mLのマイクロ遠心チューブ（ドライアイスで処理）に移す。サンプルあたり50〜100mgの組織を使用する。ステップ2.1.5まで組織をドライアイス上に保つ。
- NaF、NaVO 3 、およびプロテアーゼ/ホスファターゼ阻害剤を補充したトリプル界面活性剤溶解バッファーの必要量を、次の式を使用して表の表に示すように調製する 。マウス：必要な緩衝液（μL）=マウス組織重量（mg）×3;ラット：必須緩衝液（μL）=ラット組織重量（mg）×5。
- 必要量の氷冷溶解緩衝液（ステップ2.1.4で計算）を組織を含む2mLチューブに加える。
注記：ステップ2.1.5-2.1.6では、一度に1本のチューブで作業を進めます。 - 組織粉砕機で連続ホモジナイゼーションを用いて30〜40秒間組織をホモジナイズする;常にチューブを氷上に置いてください。組織ホモジナイザーを中速に調整し、グラインダーをチューブ内で静かに上下に動かします。
- 他のチューブでステップ1.6と1.7を繰り返します。
- 溶解物を氷上で10〜30分間インキュベートする。
- 4℃で10分間170 xgでチューブを遠心分離する。
- 一方、各サンプルについて6〜10個のマイクロ遠心チューブ（0.6 mL）を特定し、氷上に保ちます。
- 遠心分離が完了したら、チューブを点検する。それらが、脂肪、透明、黄色〜ピンクの溶解物（発育段階に依存する）およびペレットの最上層を含有することを確認する。
- 脂質層に穴を作る200μLのピペットチップを用いて液相にアクセスする。チップを交換し、ペレットを乱すことなく、または脂質層を吸引することなく溶解物を収集する。ライセートを氷上で予め標識したチューブに分注し（ステップ2.1.11）、-80℃で保存します。
- アリコートを使用して、適切な市販キット（ 表の表を参照 ）を使用してタンパク質濃度を定量する。
- 間接免疫沈降
- 氷上で、前に調製した総乳腺溶解物の2つのアリコートを解凍する。
注：1つのアリコートは標的タンパク質のIPに使用され、もう1つはネガティブコントロールとして使用されます。 - 500-1,000μgのライセートを集め、PBSで希釈して各1.5 mLチューブで200μLの最終容量に達する。
注記：使用するライセートの量は、目的のタンパク質の存在量および抗体の効率に依存します（ 図3のanの例、および材料の表 ）。各標的に対して最適化するために、異なる量の溶解産物（ すなわち 、500,750、および1,000μg）および抗体（ すなわち 、5,10、および20μg）を使用すべきである。次の手順（2.2.3-2.3.7.4）を実行します。 - 目的の抗原に対する抗体をライセートの最初のチューブに加え、氷上に保ちます。
注記：必要な金額は、通常、各社が提供する指示書に示されています（材料表を参照 ）。 - 2番目のチューブでは、2.2.3で使用した抗体と同じ濃度のアイソタイプIgGコントロールを加えてネガティブコントロールを調製します。
- チューブを4℃で一晩、チューブローラーミキサーで低速でインキュベートする。
- 翌日、50μLの磁気ビーズを新たな1.5mLチューブに加えて予備洗浄します。
- 抗体に対する相対的親和性に基づいてプロテインAまたはプロテインG磁気ビーズを選択してください。 凝集ビーズの使用を避けることが重要です。ビーズ懸濁液を均一に再懸濁させてチューブに加える前に、ビーズ懸濁液を静かに混合する。
- ビーズを入れたチューブを磁気スタンドに置き、ビーズを磁石に移動させます。 200μLピペットを使用してビーズから保存バッファーを取り出します。
- 500μLのPBS-0.1％ポリソルベート20を加えてビーズを洗浄し、10秒間チューブを激しくボルテックスする。
- チューブを磁気スタンドに戻し、ビーズを磁石に移動させます。
- 過剰の洗浄バッファーをピペットで200μLピペットで取り除きます。
- ステップ2.2.5の反応複合体（ライセート - 抗体）をビーズに加え、ローラーミキサーでRTで90分間インキュベートする。
- チューブを磁気スタンドに置き、ビーズを磁石に移動させます。 200μLピペットを使用して、ライセートを吸引して廃棄し、チューブを氷上に置きます。
- ビーズを洗う500μLのPBSを添加し、チューブを磁気スタンド上に置き、200μLのピペットを用いて液体を除去することによって調製した。この洗浄ステップを繰り返します。洗浄工程中はボルテックスを避け、サンプルを氷上に置いてください。
- ボルテックスせずにPBS-0.1％ポリソルベート20でビーズを1回洗浄し、200μLピペットチップを使用して最後の洗浄バッファーを捨てる。
- 溶出するために、20μLの0.2M酸性グリシン（pH = 2.5）をチューブに加え、ローラーミキサーで7分間振盪する。
- 数秒間高速で遠心分離し（急速回転）、上清を新鮮な氷冷したチューブに集める。
- 各チューブについてステップ2.2.14と2.2.15を繰り返します。
注：最終容量は40μLになります。 - ステップ2.2.16の40μL溶出サンプルに10μLの4倍Laemmliバッファーを加えます。
注：酸性のpHのため、色は黄色に変わります。 - 直ちに、ステップ2.2.18からの溶出したサンプルに1Mトリス（pH = 8）を一度に1滴ずつその色まで加える青色に変わります。次のチューブに進んでください。
- ステップ2.2.18のサンプルを70-90℃で10分間煮沸する。すぐにゲル電気泳動に進む。あるいは、サンプルを-80℃の冷凍庫に移してローディングする。
- 氷上で、前に調製した総乳腺溶解物の2つのアリコートを解凍する。
- 下流適用：ゲル電気泳動、続いてウエスタンブロット
- SDS-PAGEアクリルアミドゲル（1.5 mm厚）を標準手順に従って分離して積み重ねる準備をする15 。
注：ゲルの選択（8-15％アクリルアミド、グラジエント：材料の表を参照 ）は、沈殿するタンパク質の分子サイズと解析される可能性のある結合パートナーの分子サイズに基づいて決定する必要があります。これらのタンパク質は、適切な免疫検出を可能にするために互いに解決されなければならない。 - 氷上で免疫沈降（IP）溶出サンプル（ステップ2.2.20）を解凍する。
- 同じサンプルからタンパク質溶解物を調製する（上記IP手順に使用）。 50を使用総溶解物μgを添加し、4X Laemmliサンプル緩衝液を添加する。試料を70〜90℃で5分間煮沸し、氷上に置く。
注：これらのサンプルは溶出されたIPサンプルの横にロードされ、全ライセート中の沈殿したタンパク質の存在を実証します。 - ステップ2.3.3から調製した溶解物およびステップ2.2.20からの沈殿したサンプルをアクリルアミドゲルに並べて入れ、ランニングバッファー（10xランニングバッファー：トリス30.3g、グリシン144.1g、および10 gのSDSを1Lの蒸留水に溶解したもの）を100Vで約95分間、または移動しているタンパク質の端部がゲルの底に達するまで攪拌する。
- 標準プロトコール9,15を使用してニトロセルロースまたはPVDF膜にゲルを移す。
- 膜を5％乾燥ミルク-TTBS（20mMトリス、500mM NaCl、および0.05％ポリソルベート20）中、低速でロッカー上で1時間ブロックする。
- 降水量が成功したかどうかを確認する無邪気な。
- 沈降したタンパク質に対する第1抗体を用いて膜をプローブし、5％ドライミルク-TTBSで希釈し、製造元が推奨する濃度で4℃で一晩、ゆっくり撹拌しながらロッキングプラットフォーム上でプローブする。
注： 推奨事項については表の表を参照してください。 - 翌日、高撹拌のロッキングプラットフォーム上でTTBSを用いてそれぞれ5分間3回膜を洗浄する。
- TTBSで希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）と結合した適切な二次抗体中の膜を、室温で1時間、ゆっくり攪拌しながらロッキングプラットフォーム上でインキュベートする。
注：あるいは、シグナルを検出するための適切な装置が利用可能であれば、蛍光色素と結合した二次抗体を使用することができます。 - 高撹拌のロッキングプラットフォーム上でTTBSを用いてそれぞれ5分間3〜6回洗浄する。メンブレンを市販のa抗体とインキュベートすることによって二次抗体のシグナルを分析する。使用可能なルミノール溶液（材料の表を参照 ）を使用し、製造元の指示に従ってください。化学発光イメージングシステムを使用してシグナルを検出します（ 表の表を参照 ）。
注：ウェスタンブロット分析に関する詳細なプロトコールについては、参考文献16を参照してください。
- 沈降したタンパク質に対する第1抗体を用いて膜をプローブし、5％ドライミルク-TTBSで希釈し、製造元が推奨する濃度で4℃で一晩、ゆっくり撹拌しながらロッキングプラットフォーム上でプローブする。
- 相互作用するタンパク質を同定するために、同じブロット上の適切な抗体を用いて2.3.7.1〜2.3.7.4のステップを実行する。
注：タンパク質が相互作用している場合、結合パートナーは標的タンパク質と免疫共沈降し、ウェスタンブロッティングによって検出可能となります。タンパク質の分子量がゲルおよび膜上で十分に分離するのに十分に異なる限り、他のタンパク質が同じタンパク質複合体に存在するかどうかを決定するために、より多くの抗体を用いてステップ2.3.8を繰り返すことができる。 - 同定された結合パートナーがアーチファクトではないことを確認するために、相反的IPを実施すべきである。
注：これは、ステップ2.2.1〜2.2.20を同じ溶解物で行うが、ステップ3.8で同定した結合パートナーの1つを沈殿させる。次いで、目的の第1のタンパク質に対する一次抗体を用いて、ステップ3.1〜3.8を繰り返す。
- SDS-PAGEアクリルアミドゲル（1.5 mm厚）を標準手順に従って分離して積み重ねる準備をする15 。
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Representative Results
GJ、AJ、およびTJ成分が乳腺で相互作用できるかどうかを判定するために、最初にco-IFアッセイを行った。 GJタンパク質であるCJ26とAJタンパク質であるβ-カテニンを特異的抗体でプローブし、それぞれフルオロフォア接合マウス647（緑色、疑似色）およびヤギ568（赤色）抗体を用いて明らかにした（ 図1BおよびC ） 。データは、泌乳日7日目（L7）に乳腺のマウスの上皮細胞の細胞膜に共局在することを示し、黄色に映し出された（ 図1D ）。第二に、TJタンパク質であるClaudin-7; E-カドヘリン、AJタンパク質; GJタンパク質であるConnexin26（Cx26）を特異的抗体でプローブし、蛍光発色団結合ウサギ488（緑色）、マウス555（赤色）、およびマウス647（サンゴブルー;疑似色）抗体でそれぞれ明らかにした（ 図2B-D ）。 E-カドヘリンとClaudin-7の共局在はE-カドヘリンおよびClaudin-7とのCx26共局在化は、妊娠18日目（P18）にマウス乳腺において白抜きの染色を生じた（ 図2E ）。
どの接合蛋白質が細胞膜で相互に絡み合って物理的につながれているかを知るために、授乳マウスの乳腺組織を用いて共免疫沈降を行った（L14）。結果は、GJの成分であるCx43が、E-カドヘリンおよびClaudin-7と相互作用するが、Claudin-3とは相互作用しないことを示した（ 図3AおよびB ）。これらの結果は、相反するIPによって確認された。 E-カドヘリンが免疫沈降したとき、それはCx43およびClaudin-7と相互作用した（ 図3C ）。
図1： β-カテニンとCx26は、細胞膜で共局在するマウスの乳腺ではラーン。授乳7日目（L7）のマウスの乳腺からの凍結切片を切断し（7μm）、免疫蛍光染色のために処理した。 （ A ）核をDAPI（青色）で染色した。 （ B ）Cx26（緑色、疑似色）および（ C ）β-カテニン（赤色）は、適切なフルオロフォア標識抗体と組み合わせて示されている。 （ D ）マージされた画像。スペクトル検出器を備えた共焦点顕微鏡を用いて画像を得た。 DAPIは以下の設定を用いて視覚化した：発光波長、450.0nm;励起波長402.9nm;レーザー出力、1.2;検出器ゲイン、PMT HV 100; PMTオフセット、0.Cx26（647）は、以下の設定を用いて視覚化した：発光波長、700.0nm;励起波長637.8nm;レーザーパワー、2.1;検出器ゲイン、PMT HV 110; PMTオフセット、0β-カテニン（568）は、以下の設定を用いて視覚化した：発光波長、595.0nm;励起波長561.6nm;レーザ電力、2.1;検出器ゲイン、PMT HV 110; PMTオフセット、0スケールバー=50μm。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図2：Connexin26（Cx26）、E-カドヘリン、およびClaudin-7は、マウス乳腺の細胞膜に共局在する。 Claudin-7（緑色）、（ C ）E-カドヘリン（赤色）、および（ D ）Cx26（サンゴ）を用いて、妊娠18日目の乳腺凍結切片（P18）を切断し（7μm）、免疫蛍光染色のために処理した。青色;疑似色）を、適切なフルオロフォア標識抗体と組み合わせた。 （ A ）核をDAPI（青色）で染色した。スペクトル検出器を備えた共焦点顕微鏡を用いて画像を得た。 DAPIは、f下の設定：発光波長、450.0nm;励起波長402.9nm;レーザー出力、5.4;検出器ゲイン、PMT HV 65; PMTオフセット、0 Claudin-7（488）は、以下の設定を用いて視覚化した：発光波長、525.0nm;励起波長489.1nm;レーザー出力、5.0;検出器ゲイン、PMT HV 12; PMTオフセット、0。E-カドヘリン（568）は、以下の設定を用いて視覚化した：発光波長、595.0nm;励起波長561.6nm;レーザー出力、13.5;検出器ゲイン、PMT HV 45; PMTオフセット、0.Cx26（647）を以下の設定を用いて視覚化した：発光波長、700.0;励起波長637.8;レーザー出力、5.0;検出器ゲイン、PMT HV 55; PMTオフセット、0スケールバー=50μm。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図3：Claudin-3ではなくCx43、E-Cadherin、およびClaudin-7は、タンパク質複合体に関与しています。 Cx43（ AおよびB ）およびE-カドヘリン（ C ）を、授乳期にマウスの乳腺からの500mgの全溶解物を用いて免疫沈降させた。 IPおよび溶解産物をゲルに充填し、PVDF膜上に移した。 Claudin-7とClaudin-3は同じ分子量を持っているため、同じ膜で分析することはできませんでした。したがって、Cx43について同じ溶解物を用いて2つの平行IPを行い、2つのゲルにロードし、移した（膜AおよびB）。膜Aを最初にCx43でプローブしてIPの効率を確認した（上部パネル）。次に、膜をE-カドヘリンおよびClaudin-7で順次プローブした。ウェスタンブロット分析は、2つのタンパク質がCx43と相互作用することを示した。膜Bを最初にCx43でプローブしてIPの効率を確認し（上部パネル）、次にClaudin-3でプローブした。ウェスタンブロット分析は、Claudin-3d2つのタンパク質が相互作用しないことを証明するCx43のIPではない。膜Cを最初にE-カドヘリンでプローブしてIPの効率を確認した（上部パネル）。次に、膜をCx43およびClaudin-7で順次プローブした。ウェスタンブロット分析により、タンパク質間の相互作用が確認された。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
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Discussion
接合部を介する細胞間相互作用は、乳腺などの多くの器官の適切な機能および発達のために必要とされる。研究により、接合タンパク質は相互の機能および安定性を調節し、細胞膜10にお互いをつなぎ合わせることによってシグナル伝達を活性化することが示されている。現在の原稿で提示されたプロトコールは、正常なマウス腺の発生中のジャンクショナルタンパク質の差異発現、局在、および相互作用についての興味深い知見を提供している9 。ジャンクショナルタンパク質の局在化がタンパク質の機能にとって重要であり、スカフォールドタンパク質および多数のキナーゼ3と相互作用することが知られていることから、co-IFおよびco-IPは細胞 - 細胞相互作用の分野において有効な技術である。これらの方法は、乳腺発達における接合的結合の必要性およびそれらの疾患を啓発するために不可欠であるだけでなく他の組織や細胞株を用いた実験でも使用することができます。
乳腺は、間質と上皮の2つの主な区画で構成されています。成人の上皮は2つの細胞層でできています。このアプローチでは、潜在的結合パートナーの近接性をco-IF法を用いて決定し、それらの物理的相互作用をco-IPを用いて確認した。 Co-IFは、同じ組織、構造、細胞、または細胞内区画内のタンパク質の共局在化を実証するために、他の人によってうまく使用されている17,18。この技術の主な利点は、それが組織を構成する異なる細胞型内の各タンパク質の細胞または細胞下局在をもたらす視覚情報である。この手法は非常に簡単ですが、いくつかの推奨事項に従わなければなりません。例えば、組織損傷を避けるために、200μLのピペットまたは移送ピペットを使用して、常に溶液を1滴ずつ添加してください。これは、組織を損傷することなく組織表面を浸すことを可能にする。同様に、スライドを静かに傾けて組織の横に配置したパスツールピペットを用いて溶液を除去する。さらに、保存溶液にグリセロールが含まれている抗体の場合、バックグラウンドを減らすために洗浄バッファーを慎重に吸引する必要があります。さらに、泌乳中のカゼインなどの乳タンパク質の存在は、抗体を捕捉することによって抗体に干渉し、誤った陽性を招く可能性がある。したがって、結果として得られる画像の重要な分析が、この段階で特に必要とされる。
このco-IF技術には、一定の制限または落とし穴もあります。第一に、それは特異的抗体を必要とする。前に述べたように（ステップ1.1）、上記のステップに従って染色するために各スライド上に1つのセクション（ すなわち、右側にあるセクション）を使用し、一次抗体および二次抗体を逐次的に投与する。残りの部分（ すなわち、左側のもの）については、一次抗体溶液の代わりにTBS-ポリソルベート20 0.1％を用いて同じ手順に従う。ペプチド競合を用いて抗体の特異的結合を検証することも可能であり、さらにはより良好であるが、市販の抗体を生成するために使用されるペプチドは常に利用可能ではない。したがって、陽性対照および陰性対照（ すなわち、目的のタンパク質を発現するかどうかがわかっている組織または細胞）を用いて結合の特異性を検証することが重要である。さらに、抗原固定部位は、特にホルマリン固定組織の場合、接近できず、その結果、特異的なシグナルがない。したがって、いくつかの組織に対して抗原検索手順が必要となる可能性がある。細胞膜を浸透させるために抗原回収の前に洗剤との短時間のインキュベーションを行うこともできる。第二に、多重化のために、抗体は異なる動物で飼育されなければならない。例えば、抗ウサギを工程1.2.6で使用した場合、抗マウスを工程1.2.10で選択することができたが、ウサギで作製した別の抗体を選択することはできなかった。ほとんどの市販の抗体はウサギ、マウス、またはヤギで飼育されているため、適切な抗体がないために2つのタンパク質を同時に標的とすることが困難または不可能でさえあることがあります。これらの制限を克服するために、市販のキットを使用して、市販の、予め標識した抗体を購入するか、フルオロフォアで一次抗体を標識することができる。第3に、別の欠点は、異なるフルオロフォアの励起および放出に関連する。 2つの異なる抗体からのシグナルの重複を避けるために、各フルオロフォアの励起発光スペクトルを分離しなければならない。したがって、一度に分析できるターゲットの数は、利用可能な顕微鏡の構成に応じて変化します。最後に、分析の質は使用される顕微鏡に大きく依存します。より詳細で正確なデータは落射蛍光顕微鏡と比較して共焦点顕微鏡を用いて得ることができる。超解像顕微鏡の使用は、さらに詳細にタンパク質共局在を明らかにすることができる19 。
co-IFは、潜在的な結合パートナーの近接性に関する重要な洞察をもたらすが、タンパク質間の物理的相互作用を同定する他の方法によって補完されるべきである。入手可能な方法の中で、機器や材料に簡単にアクセスできるため、co-IPはおそらく最も手頃な価格のものの1つです。磁気ビーズに結合した抗体を用いて、タンパク質複合体を単離し、典型的なウェスタンブロット分析を用いてその複合体中に存在する成分を同定することができる。 co-IFと同様に、ベストプラクティスにはいくつかの推奨事項を守ってください。例えば、組織をホモジナイズして2.1.5と2.1.9の間の時間を短縮する場合には、サンプルを最小にすることが推奨される。経験豊富な人は、at 10時までに最大10個のサンプルを処理できますがime、初心者は4-6サンプル以上は処理しないでください。同様に、最初にIPプロトコルを実行するときは、チューブの数を制限する必要があります。陰性対照（ すなわち、 IgG）および陽性対照（ すなわち、免疫沈降されるタンパク質を含むことが知られている組織）のみから開始することが推奨される。 2回目の試行は、最適化に専念する必要があります（2.2.2項を参照）。これらのステップが満足のいく結果を与えると、分析されるサンプルを処理することができる。負のコントロールは常にこの手順に含める必要があることに注意してください。
この共IP技術にも潜在的な落とし穴があります。第1に、タンパク質間の連結を維持することができる条件下で組織をホモジナイズすることが必要である。接合タンパク質のような膜タンパク質については、タンパク質間の結合を保存し、その溶解性も可能にする緩衝液を使用することもまた重要である。第二に、co-IFと同様に、それは高親和性抗体を必要とする標的タンパク質と結合パートナーの両方についてのものである。さらに、タンパク質はそれらの3次コンフォメーションで残っており、タンパク質複合体は均質化によって解離しないので、抗体がパートナーの結合ドメインに近接しているかまたはタンパク質の天然構造の内側に隠れている標的タンパク質の一部を認識すればIPが侵害される可能性があります。したがって、結合パートナーが存在しないと結論づける前に、ウエスタンブロッティングを使用してIPの効率を常に検証することが不可欠です。第3に、co-IPは、タンパク質がビーズに直接結合するか、または複合体の一部ではなく手順中に沈殿するため、偽陽性の結果を生成する可能性がある。これらのアーチファクトを同定するために、提示された方法に記載されているように、IgG対照および逆IPが必要である。ビーズへのタンパク質の非特異的結合を避けるために、ステップ2.2.2とステップ2.2.3との間に「プレクリーニング」手順を追加することも可能である。これを行うには、ローラーミキサーで4℃で1時間、ビーズ50μgを用いて溶解する。磁気スタンドでビーズを取り出し、ステップ2.2.3に進みます。第四に、IgGの重鎖および軽鎖は、目的のタンパク質または結合パートナーと同じサイズであり得、それによりシグナルをマスキングする。 1つの解決策は、この写本に記載されているように、グリシンとIgG鎖を解離することである。また、ネイティブ抗体のみを認識し、膜にロードされた変性軽鎖および重鎖に結合しない二次抗体を購入することも可能です（ 表の表を参照 ）。 2つの方法を組み合わせなければならないことがあります。第5に、co-IPは、限られた数の結合パートナーの同定を可能にするが、その理由の1つは、膜上でプローブされ得る抗体の数のためである。また、共同IFまたは文献レビューのいずれかにより、これらの結合パートナーの事前同定が必要である。最後に、co-IPは、タンパク質presの同定を可能にする2つのタンパク質間の直接的な相互作用ではなく、
co-IPの結果は、さまざまな方法で分析できます。この原稿に記載されているように、同じ膜を異なる抗体で再プローブすることによって相互作用するパートナーを単独で同定することは可能である。この相互作用を定量化することも可能である。これを行うために、まず、このタンパク質に対する抗体で膜をプロービングすることによって、免疫沈降したタンパク質の量を定量する。この原稿に記載されているように、イメージングソフトウェアを用いてシグナル強度を分析する。次に、膜を結合相手に対する抗体で再プローブし、シグナル強度も定量する。次いで、2つのタンパク質間の相互作用を、免疫沈降したタンパク質の量に対する結合パートナーの量の比として表すことができる。しかし、比較を可能にするためには、異なるサンプルを同時に処理し、同じ膜にロードしなければならない。バイオ同様に複製を進めて分析することができ、統計分析を行うことができる。
ここ数年、PPIを分析するための他の技術が開発された。例えば、FRETは、タンパク質が相互作用するのに十分に近い場合にのみ、1つのタグから別のタグへのエネルギー移動を介して相互作用するタンパク質の同定を可能にする。しかし、タンパク質にタグを付ける必要があるため、この手法は組織では使用できません。同様に、細菌ビオチンリガーゼ、BirA 21と融合したタンパク質を用いてPPIを同定することが可能である。このリガーゼは、キメラタンパク質に近接して（ すなわち、相互作用する）タンパク質にビオチンを付加する。この方法は革新的かつ偏りがないが、組織内で行うことはできない。あるいは、PLAは組織において使用することができる。 co-IFと同様に、このアッセイは抗体親和性に基づく。このアッセイのために、二次抗体に、（ すなわち、 PPIに）近接しており、環状DNA分子22を形成するときに相互作用することができる。次いで、この環状DNA分子を増幅し、蛍光標識された相補的オリゴヌクレオチドを用いて検出する。このアッセイはエレガントであるが、多くの検証ステップを必要とし、依然として一次抗体親和性および潜在的相互作用パートナーの知識に依存する。最後に、PPIを特定するために伝統的なIPアッセイの不偏の代替法も開発されました。内因性タンパク質（RIME）アッセイの迅速な免疫沈降 - 質量分析において、ウェスタンブロット分析の代わりにIPサンプルを質量分析（IP / MS） 23によって分析する。このハイスループット法の主な利点は、材料をほとんど使用しない内在性相互作用タンパク質すべてについて大量の情報を提供することです。しかし、それはペプチド配列決定装置23へのアクセスを必要とする。
それはいくつかの予備試験の後、このプロトコールの各ステップが乳腺に対して最適化されていることに言及することは重要である。しかしながら、この方法は、いくつかの変更の後、他の臓器に確実に使用することができる。 co-IFについては、乳腺切片の最適温度、適切なブロッキングおよび洗浄および溶液、ならびに適切な抗体濃度をすべて試験した。 co-IPについては、種々の溶解および溶出緩衝液および抽出方法も試験され、IP成功に大きな影響を与えた。要約すると、このプロトコルの各ステップは、可能な限りバックグラウンドが低く、最も特異性の高い高品質で再現性のある結果を得るために重要です。他の方法も利用可能であるが、co-IFとそれに続くco-IPは有効であり、PPIを評価する簡単な方法である。これらの2つの技術は、組織および細胞株の両方で使用することができ、わずかな検証ステップおよび対照を必要とするだけである。
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Disclosures
著者は宣言することは何もない。
Acknowledgments
IPは、カナダ自然科学・工学研究協議会（NSERC＃418233-2012）の資金提供を受けています。ケベック・サンテ（FRQS）、ケベック乳がん財団のキャリア賞、カナダ財団のイノベーション・グラントのリーダー・ファンド・グラントなどがあります。 EDはFondationの大学のArmand-Frappierから奨学金を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice strain and stage | St. Constant, Quebec, Canada | C57BL/6 Femals; pregnancy day 18 (P18) and lactation day 14 (L14), Charles River Canada | |
| PBS 10x (stock) | 1) Dissolve 80 g NaCl (F.W.: 58.44), 2 g KCl (F.W. 74.55), 26.8 g Na2HPO4·7H2O (F.W. 268.07) and 2.4 g KH2PO4 (F.W.:136.09) in 800 mL distilled water; 2) Adjust the PH to 7.4; 3) Add water to reach to the 1 L final volume. |
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| TBS 10x (stock) | 1) Dissolve 60.5 g TRIS, 87.6 g NaCl in 800 mL distilled water; 2) Adjust the pH to 7.5; 3) Add water to reach to the 1 L final volume. |
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| Part 1: Immunofluorescence | |||
| Freezing media | VWR International, Ville Mont-Royal, QC, Canada | 95067-840 | VMR frozen sections compound |
| Microtome | Mississauga, ON, Canada | 956640 | Microm HM525, Thermo fisher scientific HM525 NX Cryostat 115 V 60 Hz |
| Blades | C.L. Sturkey, Inc. Les Produits Scientifiques ESBE St-Laurent, QC, Canada | BLM1001C | High profile gold coated blades |
| Pap pen | Cedarlane, Burlington, ON, Canada | 8899 | Super PAP Pen, Thermo fisher scientific |
| Microscopic slides | Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada | 12-550-15 | Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides |
| Formaldehyde | BioShop Canada Inc, Burlington, ON, Canada | FOR201.1 | Forlmadehyde |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA | ||
| Blocking solution | 3% BSA in TBS | ||
| Wash solution | TBS-Tween 20 0.1% | ||
| Polysorbate 20 | Oakville, ON, Canada | P 9416 | Tween 20, Sigma-Aldrich |
| Mounting media | Cedarlane, Burlington, ON | 17984-25(EM) | Fluoromount-G |
| First & secondary antibodies | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | See Comments | E-Cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) 1/50 (Cell Signaling) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 555 (#4409s), Cell Signaling |
| First & secondary antibodies | Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USA | See Comments | Claudin-7 (#34-9100) 1/100 (Life Technologies) with anti-rabbit IgG Fab2 Alexa Fluor 488 (#4412s) (Cell Signaling) |
| First & secondary antibodies | Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA; Fischer Scientific, Burlington, ON, Canada | See Comments | β-Catenin Antibody (C-18): sc-1496 (SANTA CRUZ) with anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 (#A11057), Molecular Probe (Fisher Scientific) |
| First & secondary antibodies | Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USA | See Comments | Connexin26 (#33-5800) 1/75 (Life Technologies) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 647 (#4410s) |
| Nuclei stain | Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada | D1306 | DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) 1/1,000 in PBS |
| Fluorescent microscope | Nikon Canada, Mississauga, On, Canada | Nikon A1R+ confocal microscopic laser equipped with a spectral detector | |
| Software of IF images analysis | Nikon Canada, Mississauga, On, Canada | NIS-elements software (version 4) | |
| Part 2: Immunoprecipitation | |||
| Triple-detergent Lysis buffer (100 mL) pH=8.0 | 1) Mix 50 mM TRIS (F.W.: 121.14), 150 mM NaCl (F.W.: 58.44), 0.02% Sodium Azide, 0.1% SDS, 1% NONIdET P40, 0.5% Sodium Deoxycholate in 80 mL distilled H2O. 2) Adjust the pH to 8.0 with HCl 6 N (~0.5 mL). 3) Adjust the volume to 100 mL. Keep it in fridge. At the day of protein extraction, use 1/100 NaVo3, 1/100 protease/phosphatase inhibitor and 1/25 NAF in calculated amount of Triple detergent lysis buffer: Sodium Fluoride (stock) solution 1.25 M (F.W.: 41.98), Sodium Orthovanadate (stock) Solution 1 M (F.W.: 183.9) |
||
| Protease/phosphatase inhibitor | Fisher Scientific, Burlington, ON | 78441 | Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100x) |
| Protein dosage | Thermo Scientific, Rockford, Illinois, USA | 23225 | Pierce BCA protein assay kit |
| Tissue grinder | Fisher Scientific, Burlington, ON | FTH-115 | Power 125, Model FTH-115 |
| Magnetic beads and stand | Millipore, Etobicoke, ON, Canada | PureProteome Protein G Magnetic Bead System (LSKMAGG02) | |
| Wash solution for IP | PBS or PBS-Tween20 0.1% depending to the step | ||
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | See Comments | IgG Rabbit (rabbit (DA1E) mAb IgG Isotype control (#3900s) (Cell Signaling) 0.5 µL/200 µL |
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | See Comments | IgG Mouse mouse (G3A1) mAb IgG Isotype control (#5415s) (Cell Signaling) 0.5 µL/200 µL |
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada | See Comments | Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 4 µL/200 µL |
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | See Comments | E-cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) (Cell Signaling) 1 µL/200 µL |
| Laemmli buffer | BIO-RAD, Mississauga, Ontario, Canada | 1610747 | 4x Laemmli Sample Buffer (Add β-mercaptoethanol following manufacturer recommendation) |
| Acidic glycine | Fisher Scientific, Burlington, ON | PB381-5 | 0.2 M glycine; adjust pH=2.5 with HCl |
| Tris | Fisher Scientific, Burlington, ON | BP152-1 | 1 M (pH=8) |
| SDS-PAGE acrylamide gels | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1610180 -5 | TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Solutionss (7.8%, 10%, 12%) |
| Running buffer 10x | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1704272 | Tris 30.3 g/glycine 144.1 g /SDS 10 g in 1 L distilled water |
| Membranes | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1704272 | PVDF membranes, Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit |
| Transfer method | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1704155 | Trans-Blot Turbo Transfer System |
| Dry Milk | Smucker Food of Canada Co, Markham, ON, Canada | Fat Free Instant Skim Milk Powder, Carnation | |
| Blocking solution for blots | 5% dry milk in TBS-Tween 20 0.1% | ||
| Washing solutions for blots | TBS-Tween 20 0.1% | ||
| Primary and secondary antibodies for blots (10 mL) | Sigma-Aldrich, Oakville, Ontario & Abcam, Toronto, ON, Canada | See Comments | Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 1/2,500 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Primary and secondary antibodies for blots (10 mL) | Cell Signaling, Beverly, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada | See Comments | E-cadherin (24E10) rabbit mAb 1/1,000 (#3195s) (Cell Signaling) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Primary and secondary antibodies for blots (10 mL) | Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada | See Comments | Claudin-7 (#34-9100) (Life technologies) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Primary and secondary antibodies for blots (10 mL) | Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada | See Comments | Claudin3 (#34-1700) (Life technologies) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Luminol solution for signal detection on blots | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1705061 | Clarity Western ECL Blotting Substrate |
| Imaging blots | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1708280 | ChemiDoc MP imaging system |
| Analayzing blots | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | ImageLab 5.2 software | |
References
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