Summary
Interzelluläre Übergänge sind Requisiten für Brustdrüsen-Bühnenspezifische Funktionen und Entwicklung. Dieses Manuskript liefert ein detailliertes Protokoll für die Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPIs) und Co-Lokalisierung mit Hilfe von murinen Brustdrüsen. Diese Techniken erlauben die Untersuchung der Dynamik der physikalischen Assoziation zwischen interzellulären Übergängen in verschiedenen Entwicklungsstadien.
Abstract
Zell-Zell-Interaktionen spielen eine zentrale Rolle bei der Erhaltung der Gewebeintegrität und der Barriere zwischen den verschiedenen Kompartimenten der Brustdrüse. Diese Wechselwirkungen werden durch junctionale Proteine bereitgestellt, die Nexus zwischen benachbarten Zellen bilden. Junctional Protein-Mislocalisierung und reduzierte physikalische Assoziationen mit ihren Bindungspartnern können zum Verlust der Funktion und damit zur Organ-Dysfunktion führen. Somit ist die Identifizierung von Proteinlokalisierung und Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPIs) in normalen und krankheitsbezogenen Geweben unerlässlich, um neue Beweise und Mechanismen zu finden, die zum Fortschreiten von Krankheiten oder Veränderungen im Entwicklungsstatus führen. Dieses Manuskript stellt eine zweistufige Methode zur Beurteilung von PPIs in murinen Brustdrüsen dar. Im Protokollabschnitt 1 wird ein Verfahren zur Durchführung von Co-Immunfluoreszenz (Co-IF) unter Verwendung von Antikörpern, die gegen die interessierenden Proteine angehoben werden, gefolgt von sekundären Antikörpern, die mit Fluorochromen markiert sind, beschrieben. Obwohl Co-IF alleOws für die Demonstration der Nähe der Proteine, macht es möglich, ihre physikalischen Wechselwirkungen zu studieren. Daher wird im Protokollabschnitt 2 ein detailliertes Protokoll zur Co-Immunpräzipitation (Co-IP) bereitgestellt. Dieses Verfahren wird verwendet, um die physikalischen Wechselwirkungen zwischen Proteinen zu bestimmen, ohne zu bestätigen, ob diese Wechselwirkungen direkt oder indirekt sind. In den letzten Jahren haben Co-IF- und Co-IP-Techniken gezeigt, dass bestimmte Komponenten von interzellulären Knotenpunkten zusammen lokalisieren und miteinander interagieren, wodurch stadienabhängige Junction-Nexusen entstehen, die während der Brustdrüsenentwicklung variieren.
Introduction
Mamma-Drüsenwachstum und -entwicklung erfolgt vor allem nach der Geburt. Dieses Organ umgibt sich ständig während des Fortpflanzungslebens eines Säugetiers 1 . Das erwachsene Brustdrüsenepithel besteht aus einer inneren Schicht von luminalen Epithelzellen und einer äußeren Schicht von Basalzellen, die hauptsächlich aus Myoepithelzellen besteht und von einer Basalmembran 2 umgeben ist. Für eine gute Übersicht über die Brustdrüsenstruktur und -entwicklung kann sich der Leser auf Sternlicht 1 beziehen. Für die normale Entwicklung und Funktion der Drüse 1 , 3 , 4 , 5 , 6 sind Zell-Zell-Wechselwirkungen über Lücke (GJ), enge (TJ) und Adhärens (AJ) -Knoten erforderlich. Die Hauptbestandteile dieser Übergänge in der Mäuse-Brustdrüse sind Cx26, Cx30, Cx32 und Cx43 (GJ); Claudin-1, -3, -4 und -7 undZO-1 (TJ); Und E-Cadherin, P-Cadherin und β-Catenin (AJ) 7 , 8 . Die Expressionsniveaus dieser verschiedenen junctionalen Proteine variieren in einer stadienabhängigen Weise während der Brustdrüsenentwicklung, was auf differentielle Zell-Zell-Interaktionsanforderungen hindeutet. GJ, TJ und AJ sind strukturell und funktionell verknüpft und fesseln andere strukturelle oder regulatorische Proteine an die benachbarten Stellen benachbarter Zellen und schaffen so einen Junction-Nexus 10 . Die Zusammensetzung des Junction-Nexus kann die Überbrückung mit dem darunter liegenden Zytoskelett sowie die Nexus-Permeabilität und -Stabilität beeinflussen und kann folglich die Funktion der Drüse 8 , 9 , 10 , 11 beeinflussen. Die Bestandteile von interzellulären Übergängen, die sich in junctionalen Nexusionen befinden oder miteinander in difDie Entwicklungsstadien der Entwicklung der Brustdrüsen wurden vor kurzem mit Co-Immunfluoreszenz (Co-IF) und Co-Immunpräzipitation (Co-IP) 9 analysiert. Während andere Techniken die Auswertung der funktionalen Assoziation zwischen Proteinen erlauben, werden diese Methoden in diesem Manuskript nicht dargestellt.
Da Proteine nur alleine funktionieren, ist das Studium von Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPIs), wie Signaltransduktionen und biochemischen Kaskaden, für viele Forscher von wesentlicher Bedeutung und kann signifikante Informationen über die Funktion von Proteinen liefern. Co-IF und mikroskopische Analyse helfen, einige Proteine zu bewerten, die denselben subzellulären Raum teilen. Allerdings ist die Anzahl der Ziele durch die Antikörper begrenzt, die bei verschiedenen Tieren angehoben werden müssen, und durch den Zugang zu einem konfokalen Mikroskop, das mit verschiedenen Wellenlängenlasern und einem Spektraldetektor zum Multiplexen ausgestattet ist. Co-IP bestätigt oder zeigt hochaffine physikalische Wechselwirkungen zwischenZwei oder mehr Proteine, die sich innerhalb eines Proteinkomplexes befinden Trotz der Entwicklung neuartiger Techniken wie der Fluoreszenz-Resonanz-Energieübertragung (FRET) 12 und dem Proximity-Ligation Assay (PLA) 13 , die gleichzeitig die Lokalisierung und Interaktionen von Proteinen nachweisen können, bleibt Co-IP eine geeignete und erschwingliche Technik, um Wechselwirkungen zwischen ihnen zu untersuchen Endogene Proteine.
Die Schritt-für-Schritt-Methode, die in diesem Manuskript beschrieben wird, erleichtert das Studium der Proteinlokalisierung und der PPIs und weist auf Fallstricke hin, um beim Studium endogener PPIs in den Brustdrüsen zu vermeiden. Die Methodik beginnt mit der Präsentation der verschiedenen Konservierungsverfahren für die für jede Technik benötigten Gewebe. Teil 1 präsentiert, wie man die Protein-Co-Lokalisation in drei Schritten untersucht: i) die Sektion von Milchdrüsen, ii) die Doppel- oder Dreifachmarkierung verschiedener Proteine unter Verwendung der Co-IF-Technik und iii) die Abbildung vonProteinlokalisierung Teil 2 zeigt, wie man ein endogenes Protein ausfällt und seine interagierenden Proteine in drei Schritten identifiziert: i) Lysatpräparation, ii) indirekte Proteinimmunpräzipitation und iii) Bindungspartneridentifikation durch SDS-PAGE und Western Blot. Jeder Schritt dieses Protokolls ist für Nagetier-Brustdrüsengewebe optimiert und erzeugt qualitativ hochwertige, spezifische und reproduzierbare Ergebnisse. Dieses Protokoll kann auch als Ausgangspunkt für PPI-Studien in anderen Geweben oder Zelllinien verwendet werden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle Tierprotokolle, die in dieser Studie verwendet wurden, wurden vom Universitäts-Tierpflege-Komitee (INRS-Institut Armand-Frappier, Laval, Kanada) genehmigt.
1. Identifizierung der Protein-Co-Lokalisation
- Vom Gewebe bis zu mikroskopischen Objektträgern
HINWEIS: Gewebe und Abschnitte sollten auf Trockeneis gehandhabt werden.- Heben Sie die Brustdrüsen von einem Tier an (für eine vollständige Beschreibung dieses Verfahrens, siehe Plante et al. ) 14 .
- Das ausgeschnittene Gewebe im Gefrier- / Montagemedium auf Trockeneis einbetten. Füge genug Medium hinzu, um die Drüse zu bedecken. Wenn das Medium verfestigt ist, übergeben Sie das Gewebe in einen Gefrierschrank bei -80 ° C für die spätere Verwendung 9 .
- Unter Verwendung eines Kryomikrotoms bei ≤ -35 ° C schneiden Sie die Gewebe in 7-10 μm dicke Abschnitte und legen sie auf Mikroskop-Objektträger.
HINWEIS: Wenn möglich, legen Sie zwei Abschnitte auf jede Folie. Der linke Abschnitt wird als verwendetUm die Spezifität der Antikörper und die Autofluoreszenz des Gewebes zu verifizieren, während die rechte Seite mit den Antikörpern markiert wird. - Halten Sie die Abschnitte bei -80 ° C für späteren Gebrauch.
- Co-IF-Färbung
- Die entsprechenden mikroskopischen Objektträger aus dem Gefrierschrank abholen und sofort die Abschnitte durch Eintauchen in Formaldehyd 4% für 15 min bei Raumtemperatur (RT) fixieren.
- Dann tauchen Sie die Folien in phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) bei RT ein. Lassen Sie die Folien in PBS bei RT, bis Sie zum nächsten Schritt gehen.
- Umkreisen Sie jeden Abschnitt des Objektträgers mit einer handelsüblichen hydrophoben Barriere oder einem wasserabweisenden Laborstift (siehe Tabelle der Materialien ). Achten Sie darauf, das Gewebe nicht zu berühren. Fügen Sie sofort Tropfen PBS in das Gewebe und legen Sie die Folie in eine feuchte Histologie Kammer für den Rest des Verfahrens.
HINWEIS: Die Gewebeabschnitte müssen befeuchtet bleiben. AlternativeLy, verwenden Sie eine Schachtel mit einem Deckel und legen Sie nasse Papiertücher auf den Boden. - Blockieren Sie jeden Gewebeabschnitt mit 100-200 μl 3% Rinderserumalbumin (BSA) -Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) -0,1% Polysorbat 20 (siehe Tabelle der Materialien ) für 30 min bei RT. Während die Proben blockieren, werden die primären und sekundären Antikörperlösungen durch Verdünnen der Antikörper in TBS-0,1% Polysorbat 20 hergestellt.
HINWEIS: Die erforderliche Konzentration für den Antikörper wird vom Hersteller bereitgestellt; Siehe die Tabelle der Materialien und die Abbildungen 1 und 2 für Beispiele, sowie Dianati et al. 9 Obwohl es nicht notwendig ist, im Dunkeln zu arbeiten, wenn man die meisten Fluorophor-konjugierten Antikörper verwendet, vermeiden Sie, die Antikörper-Lösungen oder gefärbten Gewebe einem intensiven, hellen Licht auszusetzen. - Entfernen Sie die Blockierungslösung durch Absaugen und inkubieren Sie die Abschnitte in 100-200 & mgr; l des verdünnten primären Antikörpers für 60 min bei RT. AlternativY mit dem primären Antikörper über Nacht bei 4 ° C inkubieren.
- Entfernen Sie die primäre Antikörperlösung durch Absaugen und waschen Sie die Abschnitte mit 250-500 μl TBS-0,1% Polysorbat 20 für 5 min. Entfernen Sie die Waschlösung durch Absaugen und wiederholen Sie die Wäsche zweimal.
- Entfernen Sie die Waschlösung durch Absaugen und inkubieren Sie die Abschnitte mit 100-200 & mgr; l des geeigneten Fluorophor-konjugierten sekundären Antikörpers für 60 min bei RT.
- Entfernen Sie die sekundäre Antikörperlösung durch Absaugen und waschen Sie die Abschnitte mit 250-500 μl TBS-0,1% Polysorbat 20 für 5 min. Die Waschlösung entfernen und zweimal wiederholen.
- Wiederholen Sie Schritt 2.5-2.8 mit der entsprechenden Kombination von primären und sekundären Antikörpern für die nachfolgenden Proteine (n) von Interesse.
- Entfernen Sie die Waschlösung durch Absaugen und führen Sie die Kernfärbung durch Inkubieren des Abschnitts mit 100-200 & mgr; l 1 mg / ml 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) in TBS-0,1% Polysorbat 20 für 5 min beiRT
- Entfernen Sie die DAPI-Lösung durch Absaugen und montieren Sie die Objektträger mit einem wasserlöslichen, nicht fluoreszierenden Montagemedium (siehe Tabelle der Materialien ) und Deckgläschen. Gehen Sie jeweils eine Folie vor.
HINWEIS: Die Inkubation des Kernflecks für mehr als 5 min wird nicht die Intensität der Färbung verändern. Alternativ entfernen Sie die DAPI-Lösung auf allen Folien und inkubieren die Gewebe in PBS bei der Montage der Folien. - Legen Sie die Objektträger für mindestens 8 Stunden in einen 4 ° C-Kühlschrank. Gehen Sie zur fluoreszenzmikroskopischen Bildgebung vor (siehe Abb. 1 und 2 ).
- Mikroskopische Bildgebung
- Visualisierung der fluorophor-konjugierten sekundären Antikörper unter Verwendung eines konfokalen Mikroskops, das mit den verschiedenen Lasern ausgestattet ist, die erforderlich sind, um die Fluorophore bei ihren spezifischen Wellenlängen anzuregen.
Hinweis: Um Kanäle und Alveolen visualisieren zu können, wird ein 40X Objektiv mit einer numerischen Blende von 0,95 vorgeschlagen. Ein BeispielE der spezifischen Einstellungen ist in Abbildung 1 dargestellt . - Überprüfen Sie die Lokalisierung jedes Proteins einzeln durch Scannen des Bildes eine Wellenlänge zu der Zeit.
Anmerkung: In diesem Stadium ist es wichtig, die Lokalisation der junctionalen Proteine kritisch zu analysieren. Um junctionale Nexusse bilden zu können, müssen diese Proteine an der Plasmamembran lokalisiert werden. - Bestimmen Sie die Co-Lokalisierung von Proteinen durch Zusammenführen der mit den Lasern gescannten Bilder bei den verschiedenen Wellenlängen.
Anmerkung: Die Protein-Co-Lokalisierung kann durch die Veränderung der Farbe, die sich aus der Emission von zwei oder mehr Fluorophoren an der gleichen Stelle ergibt, visualisiert werden und kann mit der entsprechenden Software gemessen werden ( Abb. 1 und 2 , siehe auch Referenz 9).
- Visualisierung der fluorophor-konjugierten sekundären Antikörper unter Verwendung eines konfokalen Mikroskops, das mit den verschiedenen Lasern ausgestattet ist, die erforderlich sind, um die Fluorophore bei ihren spezifischen Wellenlängen anzuregen.
2. Studieren von PPIs
ANMERKUNG: Bauchdrüsendrüsen sollten verwendet werden, um PPIs zu studieren, da Thoraxdrüsen in enger Verbindung mit dem Brustkorb sindMuskeln Heben Sie die Milchdrüsen an (für eine vollständige Beschreibung dieses Verfahrens, siehe Plante et al .) 14 und halten Sie sie bei -80 ° C für spätere Verwendung.
- Lysatvorbereitung
- Legen Sie das Wägepapier und 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen auf Trockeneis, um sie vorzukühlen, bevor Sie mit den nächsten Schritten fortfahren.
- Nehmen Sie das Brustdrüsengewebe von -80 ° C und halten Sie sie auf Trockeneis.
- Die Gewebe auf den vorgekühlten Wägepapieren wiegen und dann das Gewebe auf 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen übertragen (Griff auf Trockeneis). Verwenden Sie zwischen 50 und 100 mg Gewebe pro Probe. Halten Sie das Gewebe auf Trockeneis bis Schritt 2.1.5.
- Bereiten Sie die erforderliche Menge an Triple-Detergens-Lyse-Puffer, ergänzt mit NaF, NaVO & sub3 ; und Protease / Phosphatase-Inhibitor, wie in der Tabelle der Materialien , unter Verwendung der folgenden Formeln angegeben. Mäuse: erforderlicher Puffer (μL) = Mausgewebegewicht (mg) x 3; Ratte: erforderlichPuffer (μL) = Rattengewebegewicht (mg) x 5.
- Fügen Sie die erforderliche Menge an eiskaltem Lysepuffer (berechnet in Schritt 2.1.4) dem 2-ml-Röhrchen, das das Gewebe enthält, hinzu.
HINWEIS: In den Schritten 2.1.5-2.1.6 fahren Sie mit einem einzigen Schlauch zu einem Zeitpunkt fort. - Homogenisieren des Gewebes für 30-40 s unter kontinuierlicher Homogenisierung auf einer Gewebemühle; Halten Sie immer die Tube auf Eis. Stellen Sie den Gewebehomogenisator auf mittlere Geschwindigkeit ein und bewegen Sie den Schleifer vorsichtig nach oben und unten.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.6 und 1.7 mit den anderen Röhren.
- Inkubieren Sie die Lysate auf Eis für 10-30 min.
- Die Röhrchen bei 170 xg für 10 min bei 4 ° C zentrifugieren.
- Mittlerweile 6-10 Mikrozentrifugenröhrchen (0,6 ml) für jede Probe identifizieren und auf Eis aufbewahren.
- Sobald die Zentrifugation durchgeführt ist, überprüfen Sie die Röhrchen. Stellen Sie sicher, dass sie eine obere Schicht von Fett, klare, gelb-rosa-Lysate (je nach Entwicklungsstadium) und ein Pellet enthalten.
- Erstellen Sie ein Loch in der LipidschichtMit einer 200-μl-Pipettenspitze, um auf die flüssige Phase zuzugreifen. Ändern Sie die Spitze und sammeln Sie das Lysat, ohne das Pellet zu stören oder die Lipidschicht zu saugen. Aliquot das Lysat in vorbeschrifteten Röhrchen auf Eis (Schritt 2.1.11) und lagern bei -80 ° C.
- Verwenden Sie ein Aliquot, um die Proteinkonzentration mit einem geeigneten handelsüblichen Kit zu quantifizieren (siehe Tabelle der Materialien ).
- Indirekte Immunpräzipitation
- Auf Eis, Tauwetter zwei Aliquots der gesamten Brustdrüsen-Lysate vorbereitet vor.
HINWEIS: Ein Aliquot wird für die IP des Zielproteins verwendet, während das andere als Negativkontrolle dienen wird. - Sammle 500-1000 μg des Lysats und verdünne es in PBS, um ein Endvolumen von 200 & mgr; l in jedem 1,5 ml Röhrchen zu erreichen.
ANMERKUNG: Die Menge des zu verwendenden Lysats hängt von der Häufigkeit des Proteins von Interesse und der Effizienz des Antikörpers ab (siehe Abbildung 3 für aN Beispiel, sowie die Tabelle der Materialien ). Zur Optimierung für jedes Ziel sollten unterschiedliche Mengen an Lysat ( dh 500, 750 und 1.000 μg) und Antikörper ( dh 5, 10 und 20 μg) verwendet werden. Gehen Sie mit den folgenden Schritten vor (2.2.3-2.3.7.4). - Füge den Antikörper gegen das Antigen von Interesse zum ersten Röhrchen des Lysats hinzu und halte es auf Eis.
HINWEIS: Der erforderliche Betrag wird in der Regel auf dem von jedem Unternehmen zur Verfügung gestellten Gebrauchsanweisung empfohlen (siehe Tabelle der Materialien ). - In der zweiten Röhre eine negative Kontrolle durch Zugabe der gleichen Konzentration der Isotyp-IgG-Kontrolle wie der in Schritt 2.2.3 verwendete Antikörper herstellen.
- Die Röhrchen über Nacht bei 4 ° C auf einem Rohrwalzenmischer bei niedriger Geschwindigkeit inkubieren.
- Am nächsten Tag werden 50 μl magnetische Perlen zu neuen 1,5 mL Röhrchen zum Vorspülen gegeben.
- Wählen Sie entweder Protein A oder Protein G magnetische Perlen auf der Grundlage der relativen Affinität zum Antikörper. Es ist wichtig, die Verwendung von aggregierten Perlen zu vermeiden. Die Wulstsuspension vorsichtig mischen, bis sie gleichmäßig wieder suspendiert ist, bevor sie den Röhrchen zugesetzt wird.
- Legen Sie die Röhrchen mit den Perlen auf den Magnetständer und lassen Sie die Perlen auf den Magneten wandern. Entfernen Sie den Speicherpuffer aus den Perlen mit einer 200 μl Pipette.
- Waschen Sie die Kügelchen, indem Sie 500 μl PBS-0,1% Polysorbat 20 zugeben und die Röhrchen für 10 s kräftig vortexen.
- Setzen Sie die Röhren wieder auf den Magnetständer und lassen Sie die Perlen auf den Magneten wandern.
- Den überschüssigen Waschpuffer durch Pipettieren mit einer 200 μl Pipette entfernen.
- Den Reaktionskomplex (Lysat-Antikörper) aus Schritt 2.2.5 zu den Perlen zugeben und für 90 min bei RT auf dem Walzenmischer inkubieren.
- Legen Sie die Röhrchen auf den Magnetständer und lassen Sie die Perlen auf den Magneten wandern. Mit einer 200 μl Pipette aspirieren und das Lysat entsorgen und die Röhrchen auf Eis stellen.
- Waschen Sie die PerleS durch Zugabe von 500 & mgr; l PBS, Aufbringen der Röhrchen auf den Magnetständer und Entfernen der Flüssigkeit unter Verwendung einer 200 & mgr; l Pipette. Wiederholen Sie diesen Waschschritt. Während der Waschstufen vermeiden Sie Vortexen und halten die Proben auf Eis.
- Waschen Sie die Perlen einmal mit PBS-0,1% Polysorbat 20 ohne Vortexen und verwerfen Sie den letzten Waschpuffer mit einer 200 μl Pipettenspitze.
- Zur Elution werden 20 μl 0,2 M saures Glycin (pH = 2,5) zu den Röhrchen gegeben und 7 min auf dem Walzenmischer geschüttelt.
- Zentrifugieren Sie mit hoher Geschwindigkeit für ein paar Sekunden (schnelles Spin) und sammeln Sie den Überstand in einem frischen eiskalten Rohr.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.2.14 und 2.2.15 für jedes Rohr.
HINWEIS: Das Endvolumen beträgt 40 μl. - Füge 10 μl 4x Laemmli-Puffer zu der 40 μl eluierten Probe aus Schritt 2.2.16 hinzu.
HINWEIS: Die Farbe wird aufgrund des sauren pH-Werts gelb. - Fügen Sie sofort 1 M Tris (pH = 8), ein Tropfen zu einer Zeit, zu der eluierten Probe von Schritt 2.2.18 bis zu seiner Farbe hinzuWird blau. Fahren Sie zu den nächsten Röhren.
- Die Proben aus Schritt 2.2.18 bei 70-90 ° C für 10 min kochen. Gehen Sie sofort zur Gelelektrophorese vor. Alternativ die Proben in einen Gefrierschrank bei -80 ° C bis zum Beladen transportieren.
- Auf Eis, Tauwetter zwei Aliquots der gesamten Brustdrüsen-Lysate vorbereitet vor.
- Downstream Anwendung: Gelelektrophorese gefolgt von Western Blot
- Trennung und Stapelung von SDS-PAGE-Acrylamidgelen (1,5 mm Dicke) nach Standardverfahren vorbereiten 15 .
HINWEIS: Die Wahl des Gels (8-15% Acrylamid, Gradient: siehe Tabelle der Materialien ) sollte auf der Grundlage der Molekulargröße des zu präzipitierenden Proteins und der zu analysierenden potentiellen Bindungspartner bestimmt werden. Diese Proteine müssen voneinander gelöst werden, um eine ordnungsgemäße Immunodetektion zu ermöglichen. - Tauen Sie die Immunopräzipitation (IP) - unvermittelten Proben (Schritt 2.2.20) auf Eis.
- Bereiten Sie Protein-Lysate aus den gleichen Proben (für die IP-Verfahren oben verwendet). Verwenden Sie 50Μg Gesamtlysat und fügt 4X Laemmli Probenpuffer hinzu. Kochen Sie die Proben bei 70-90 ° C für 5 min und legen Sie auf Eis bis zum Laden.
HINWEIS: Diese Proben werden neben der eluierten IP-Probe geladen, um das Vorhandensein von ausgefällten Proteinen im Gesamtlysat zu demonstrieren. - Laden Sie die vorbereiteten Lysate aus Schritt 2.3.3 und die ausgefällten Proben aus Schritt 2.2.20 Seite an Seite in ein Acrylamidgel und führen sie in laufenden Puffer (10x Laufpuffer: 30,3 g Tris, 144,1 g Glycin und 10 G SDS in 1 l destilliertem Wasser) bei 100 V für ca. 95 min oder bis der Rand der wandernden Proteine den Boden des Gels erreicht.
- Übertragen Sie die Gele auf eine Nitrozellulose- oder PVDF-Membran unter Verwendung eines Standardprotokolls 9 , 15 .
- Blockieren Sie die Membran für 1 h auf einer Wippe bei niedriger Geschwindigkeit in 5% Trockenmilch-TTBS (20 mM Tris, 500 mM NaCl und 0,05% Polysorbat 20).
- Identifizieren Sie, ob der Niederschlag erfolgreich warSchüchtern
- Sonde die Membran unter Verwendung des ersten Antikörpers gegen das ausgefällte Protein, verdünnt in 5% Trockenmilch-TTBS in der vom Hersteller empfohlenen Konzentration über Nacht bei 4 ° C auf einer Schaukelplattform mit langsamer Bewegung.
HINWEIS: Siehe die Tabelle der Materialien für Empfehlungen. - Am nächsten Tag die Membran 3 mal für jeweils 5 min mit TTBS auf einer Schaukelplattform mit hoher Rührung waschen.
- Inkubieren Sie die Membran in dem geeigneten sekundären Antikörper, konjugiert mit Meerrettichperoxidase (HRP), verdünnt in TTBS, für 1 h bei RT auf einer Schaukelplattform mit langsamen Rühren.
ANMERKUNG: Alternativ kann ein mit einem Fluorochrom konjugiertes sekundäres Antikörper verwendet werden, wenn eine entsprechende Vorrichtung zur Erkennung des Signals verfügbar ist. - Führen Sie 3 bis 6 Wäschen, jeweils für 5 min, mit TTBS auf einer Schaukelplattform mit hoher Bewegung. Analysieren Sie das Signal des sekundären Antikörpers durch Inkubieren der Membran mit einem kommerziellen aVailable luminol solution (siehe Tabelle der Materialien ) und folgen Sie den Anweisungen des Herstellers. Erfassen Sie das Signal mit einem Chemilumineszenz-Bildgebungssystem (siehe Tabelle der Materialien ).
HINWEIS: Für ein detailliertes Protokoll zur Western-Blot-Analyse siehe Referenz 16.
- Sonde die Membran unter Verwendung des ersten Antikörpers gegen das ausgefällte Protein, verdünnt in 5% Trockenmilch-TTBS in der vom Hersteller empfohlenen Konzentration über Nacht bei 4 ° C auf einer Schaukelplattform mit langsamer Bewegung.
- Um interagierende Proteine zu identifizieren, führen Sie die Schritte 2.3.7.1-2.3.7.4 mit den entsprechenden Antikörpern auf dem gleichen Blot durch.
HINWEIS: Wenn die Proteine interagieren, werden die Bindungspartner mit dem Zielprotein co-immunpräzipitiert und sind somit durch Western-Blotting nachweisbar. Schritt 2.3.8 kann mit mehr Antikörpern wiederholt werden, um festzustellen, ob sich andere Proteine in demselben Protein-Komplex befinden, solange sich die Molekulargewichte der Proteine so stark unterscheiden, dass sie auf dem Gel und der Membran gut getrennt sind. - Um zu bestätigen, dass die identifizierten Bindungspartner keine Artefakte sind, sollte reziproke IP durchgeführt werden.
HINWEIS: Dies wird durch Wiederholen durchgeführtSchritte 2.2.1-2.2.20 mit dem gleichen Lysat, aber Ausfällen eines der in Schritt 3.8 identifizierten Bindungspartner. Dann werden die Schritte 3.1-3.8 unter Verwendung des primären Antikörpers gegen das erste interessierende Protein wiederholt.
- Trennung und Stapelung von SDS-PAGE-Acrylamidgelen (1,5 mm Dicke) nach Standardverfahren vorbereiten 15 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Um zu bestimmen, ob GJ-, AJ- und TJ-Komponenten in der Brustdrüse zusammenwirken können, wurden zuerst Co-IF-Assays durchgeführt. Cx26, ein GJ-Protein und β-Catenin, ein AJ-Protein, wurden mit spezifischen Antikörpern untersucht und unter Verwendung von Fluorophor-konjugierten Maus-647 (Grün-, Pseudofarb-) und Ziegen-568 (roten) Antikörpern ( 1B und C ) . Die Daten zeigten, dass sie sich an der Zellmembran von Epithelzellen in der Mäuse-Brustdrüse am Laktationstag 7 (L7), wie in der gelben Farbe reflektiert, lokalisieren (Abbildung 1D ). Zweitens, Claudin-7, ein TJ-Protein; E-Cadherin, ein AJ-Protein; Und Connexin26 (Cx26), ein GJ-Protein, wurden mit ihren spezifischen Antikörpern untersucht und wurden mit fluorophor-konjugierten Kaninchen-488 (grün), Maus-555 (rot) und Maus-647 (Korallenblau, Pseudocolor) -Antikörper aufgedeckt ( Fig. 2B-D ). E-Cadherin und Claudin-7 Co-Lokalisierung istAls Gelb-zu-Licht-Orange-Farbe dargestellt, während Cx26-Co-Lokalisierung mit E-Cadherin und Claudin-7 zu einer weißen, punktierten Färbung bei Mäuse-Brustdrüsen am Schwangerschaftstag 18 (P18) führte (Abbildung 2E ).
Um herauszufinden, welche junctionalen Proteine sich an der Zellmembran zusammenschließen und physikalisch zusammenbinden, wurde die Co-Immunpräzipitation unter Verwendung von Brustdrüsengeweben aus laktierenden Mäusen (L14) durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass Cx43, eine Komponente von GJ, mit E-Cadherin und Claudin-7 wechselwirkt, aber nicht mit Claudin-3 (Abbildung 3A und B ). Diese Ergebnisse wurden durch die reziproke IP bestätigt; Als E-Cadherin immunpräzipitiert wurde, interagierte es mit Cx43 und Claudin-7 (Abbildung 3C ).
Abbildung 1: β-Catenin und Cx26 co-lokalisieren an der ZellmembranRange in Mäuse Brustdrüsen. Kryoschen von Milchdrüsen von Mäusen am Laktationstag 7 (L7) wurden geschnitten (7 μm) und zur Immunfluoreszenzfärbung verarbeitet. ( A ) Die Kerne wurden mit DAPI (blau) gefärbt. ( B ) Cx26 (grün, pseudocolor) und ( C ) β-Catenin (rot) werden mit geeigneten Fluorophor-markierten Antikörpern kombiniert. ( D ) Ein zusammengeführtes Bild. Bilder wurden mit einem konfokalen Mikroskop mit einem Spektraldetektor erhalten. DAPI wurde anhand folgender Einstellungen visualisiert: Emissionswellenlänge, 450,0 nm; Anregungswellenlänge, 402,9 nm; Laserleistung, 1.2; Detektorverstärkung, PMT HV 100; PMT-Offset, 0. Cx26 (647) wurde mit den folgenden Einstellungen visualisiert: Emissionswellenlänge, 700,0 nm; Anregungswellenlänge, 637,8 nm; Laserleistung, 2.1; Detektorverstärkung, PMT HV 110; PMT-Offset, 0. β-Catenin (568) wurde unter Verwendung der folgenden Einstellungen visualisiert: Emissionswellenlänge, 595,0 nm; Anregungswellenlänge, 561,6 nm; Laser-Macht, 2.1; Detektorverstärkung, PMT HV 110; PMT-Offset, 0. Maßstabsstäbe = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Connexin26 (Cx26), E-Cadherin und Claudin-7 co-lokalisieren sich an der Zellmembran in Mäuse-Brustdrüsen. Kryoschen aus den Milchdrüsen am Schwangerschaftstag 18 (P18) wurden geschnitten (7 μm) und zur Immunfluoreszenzfärbung unter Verwendung von ( B ) Claudin-7 (grün), ( C ) E-Cadherin (rot) und ( D ) Cx26 (Koralle) Blau, pseudocolor), kombiniert mit den entsprechenden fluorophor-markierten Antikörpern. ( A ) Die Kerne wurden mit DAPI (blau) gefärbt. Bilder wurden mit einem konfokalen Mikroskop mit einem Spektraldetektor erhalten. DAPI wurde mit dem fOllowing-Einstellungen: Emissionswellenlänge, 450,0 nm; Anregungswellenlänge, 402,9 nm; Laserleistung, 5.4; Detektorverstärkung, PMT HV 65; PMT-Offset, 0. Claudin-7 (488) wurde mit folgenden Einstellungen visualisiert: Emissionswellenlänge, 525,0 nm; Anregungswellenlänge, 489,1 nm; Laserleistung, 5.0; Detektorverstärkung, PMT HV 12; PMT-Offset, 0. E-Cadherin (568) wurde unter Verwendung der folgenden Einstellungen visualisiert: Emissionswellenlänge, 595,0 nm; Anregungswellenlänge, 561,6 nm; Laserleistung, 13,5; Detektorverstärkung, PMT HV 45; PMT-Offset, 0. Cx26 (647) wurde mit den folgenden Einstellungen visualisiert: Emissionswellenlänge, 700,0; Anregungswellenlänge, 637,8; Laserleistung, 5.0; Detektorverstärkung, PMT HV 55; PMT-Offset, 0. Maßstabsstäbe = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Cx43, E-Cadherin und Claudin-7, aber nicht Claudin-3, sind an einem Proteinkomplex beteiligt. Cx43 ( A und B ) und E-Cadherin ( C ) wurden unter Verwendung von 500 mg Gesamtlysaten aus Milchdrüsen von Mäusen bei der Laktation immunpräzipitiert. IPs und Lysate wurden in Gelen geladen und auf PVDF-Membranen übertragen. Weil Claudin-7 und Claudin-3 das gleiche Molekulargewicht haben, konnten sie nicht auf derselben Membran analysiert werden. So wurden zwei parallele IPs mit dem gleichen Lysat für Cx43 durchgeführt, auf zwei Gele geladen und transferiert (Membranen A und B). Membrane A wurde zuerst mit Cx43 untersucht, um die Effizienz der IP (Top Panel) zu bestätigen. Dann wurde die Membran sequentiell mit E-Cadherin und Claudin-7 untersucht. Western-Blot-Analyse zeigte, dass die beiden Proteine mit Cx43 wechselwirken. Membrane B wurde zuerst mit Cx43 untersucht, um die Effizienz der IP (Top Panel) zu bestätigen und dann mit Claudin-3 zu untersuchen. Western-Blot-Analyse zeigte, dass Claudin-3 dId nicht IP mit Cx43, was zeigt, dass die beiden Proteine nicht interagieren. Membran C wurde zuerst mit E-Cadherin untersucht, um die Effizienz der IP (Top-Panel) zu bestätigen. Dann wurde die Membran nacheinander mit Cx43 und Claudin-7 untersucht. Western Blot Analyse bestätigt die Wechselwirkungen zwischen den Proteinen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zell-Zell-Interaktionen über Kreuzungen sind für die richtige Funktion und Entwicklung von vielen Organen, wie die Brustdrüse erforderlich. Studien haben gezeigt, dass junctionale Proteine die Funktion und Stabilität voneinander regulieren und die Signaltransduktion durch die Bindung an der Zellmembran 10 aktivieren können. Die Protokolle, die in der aktuellen Manuskript präsentiert wurden, haben interessante Ergebnisse über die junctionale Protein-Differential-Expression, Lokalisierung und Interaktion während der normalen murinen Drüsenentwicklung 9 gegeben . Angesichts der Tatsache, dass die projizierte Proteinlokalisierung für die Funktion der Proteine entscheidend ist und weil sie bekannt sind, dass sie mit Gerüstproteinen und zahlreichen Kinasen 3 zusammenwirken, sind Co-IF und Co-IP wirksame Techniken auf dem Gebiet der Zell-Zell-Wechselwirkungen. Nicht nur diese Methoden sind wesentlich, um die Notwendigkeit von junctionalen Nexusen in der Brustdrüsenentwicklung und ihren Dys aufzuklärenRegulierung bei Brustkrebs, aber sie können auch in anderen Geweben und in Experimenten mit Zelllinien verwendet werden.
Die Milchdrüse besteht aus zwei Hauptfächern: das Stroma und das Epithel 4 . Das erwachsene Epithel besteht aus zwei Schichten von Zellen. Bei diesem Ansatz wurde die Nähe der potentiellen Bindungspartner unter Verwendung der Co-IF-Technik bestimmt und ihre physikalischen Wechselwirkungen wurden unter Verwendung von Co-IP bestätigt. Co-IF wurde erfolgreich von anderen verwendet, um die Co-Lokalisierung von Proteinen innerhalb des gleichen Gewebes, der Struktur, der Zelle oder des intrazellulären Kompartiments 17 , 18 zu demonstrieren. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die visuelle Information, die die zelluläre oder subzelluläre Lokalisierung jedes Proteins in den verschiedenen Zelltypen, die das Gewebe bilden, bewirkt. Obwohl diese Technik ganz einfach ist, müssen einige Empfehlungen beachtet werden. Zum Beispiel, um Gewebe Schäden zu vermeiden,Fügen Sie die Lösungen immer mit einer 200 μl Pipette oder einer Transferpipette zu einem Zeitpunkt hinzu. Dies ermöglicht das Eintauchen der Gewebeoberfläche, ohne das Gewebe zu beschädigen. Ebenso entfernen Sie die Lösungen mit einer Pasteur-Pipette, die neben dem Gewebe platziert wird, indem Sie die Folie vorsichtig kippen. Darüber hinaus ist für Antikörper, deren Speicherlösung Glycerin enthält, ein sorgfältiges Absaugen der Waschpuffer erforderlich, um den Hintergrund zu reduzieren. Darüber hinaus kann das Vorhandensein von Milchproteinen, wie Caseinen, während der Laktation die Antikörper durch Einfangen von ihnen stören, was zu falschen Positiven führt. Daher ist eine kritische Analyse des resultierenden Bildes erforderlich, und zwar in diesem Stadium.
Diese Co-IF-Technik hat auch gewisse Einschränkungen oder Fallstricke. Zuerst erfordert es spezifische Antikörper. Wie bereits erwähnt (Schritt 1.1), empfiehlt es sich, einen Abschnitt ( dh den einen auf der rechten Seite) auf jedem Objektträger zur Färbung nach den oben beschriebenen Schritten zu verwendenPrimäre und sekundäre Antikörper nacheinander. Für den verbleibenden Abschnitt ( dh der eine auf der linken Seite), folgen Sie dem gleichen Verfahren, mit TBS-Polysorbat 20 0,1% anstelle der primären Antikörper-Lösungen. Während es auch möglich ist und noch besser, die spezifische Bindung des Antikörpers unter Verwendung der Peptidwettbewerb zu verifizieren, sind Peptide, die zur Erzeugung von kommerziellen Antikörpern verwendet werden, nicht immer verfügbar. Es ist daher wichtig, die Spezifität der Bindung unter Verwendung von positiven und negativen Kontrollen zu verifizieren ( dh Gewebe oder Zellen, von denen bekannt ist, dass sie das Protein von Interesse exprimieren oder nicht). Darüber hinaus können Antigen-Fixierungsstellen unzugänglich sein, insbesondere für formalin-fixierte Gewebe, was zu dem Fehlen eines spezifischen Signals führt. Ein Antigen-Retrieval-Verfahren kann daher für einige Gewebe erforderlich sein. Eine kurze Inkubation mit Detergenz kann auch vor der Antigen-Retrieval durchgeführt werden, um die Zellmembran zu permeabilisieren. Zweitens müssen zum Multiplexen Antikörper in verschiedenen Tieren angehoben werden.Zum Beispiel, wenn Anti-Kaninchen in Schritt 1.2.6 verwendet wurde, konnte Anti-Maus in Schritt 1.2.10 ausgewählt werden, aber nicht ein anderer Antikörper, der in Kaninchen angehoben wurde. Da die meisten kommerziellen Antikörper in Kaninchen, Mäusen oder Ziegen angehoben werden, ist es manchmal schwierig oder sogar unmöglich, zwei Proteine gleichzeitig aufgrund des Mangels an geeigneten Antikörpern zu zielen. Um diese Einschränkungen zu überwinden, kann man entweder handelsübliche, vormarkierte Antikörper oder Etiketten-Primärantikörper mit Fluorophoren mit handelsüblichen Kits kaufen. Drittens ist ein weiteres Manko mit der Erregung und Emission der verschiedenen Fluorophore verbunden. Um eine Überschneidung der Signale von zwei verschiedenen Antikörpern zu vermeiden, muss das Anregungsemissionsspektrum jedes Fluorophors getrennt werden. Somit wird die Anzahl der Ziele, die auf einmal analysiert werden können, je nach der Konfiguration des verfügbaren Mikroskops variieren. Schließlich hängt die Qualität der Analyse stark von dem verwendeten Mikroskop ab. Detailliertere und präzisere Daten könnenUnter Verwendung eines konfokalen Mikroskops im Vergleich zu einem epifluoreszierenden Mikroskop erhalten werden. Die Verwendung von Super-Auflösungs-Mikroskopie kann die Protein-Co-Lokalisierung noch detaillierter zeigen 19 .
Obwohl Co-IF wichtige Einblicke in die Nähe von potenziellen Bindungspartnern bringt, sollte es durch andere Methoden ergänzt werden, um physikalische Wechselwirkungen zwischen Proteinen zu identifizieren. Unter den verfügbaren Methoden ist Co-IP wahrscheinlich einer der günstigste zu erfüllen, da die Ausrüstung und das Material leicht zugänglich sind. Unter Verwendung eines an magnetische Perlen gebundenen Antikörpers kann man Proteinkomplexe isolieren und die in diesem Komplex vorhandenen Komponenten unter Verwendung einer typischen Western-Blot-Analyse identifizieren. Ähnlich wie bei Co-IF sollten einige Empfehlungen für bewährte Praktiken beachtet werden. So empfiehlt es sich, die Proben bei der Homogenisierung der Gewebe zu minimieren, um die Zeit zwischen den Schritten 2.1.5 und 2.1.9 zu reduzieren. Während eine erfahrene Person kann bis zu 10 Proben bei atIme sollte ein Anfänger nicht mehr als 4-6 Samples behandeln. Ebenso sollte die Anzahl der Röhren bei der erstmaligen Durchführung des IP-Protokolls begrenzt sein. Es wird empfohlen, mit einer Negativkontrolle ( dh IgG) und einer positiven Kontrolle ( dh einem Gewebe zu beginnen , das dafür bekannt ist, dass das Protein nur immunpräzipitiert wird). Die zweite Studie sollte der Optimierung gewidmet sein (siehe Schritt 2.2.2). Sobald diese Schritte befriedigende Ergebnisse liefern, können zu analysierende Proben verarbeitet werden. Beachten Sie, dass eine Negativkontrolle immer in die Prozedur einbezogen werden sollte.
Diese Co-IP-Technik hat auch potenzielle Fallstricke. Erstens erfordert es, dass Gewebe in Bedingungen homogenisiert werden, die die Konservierung der Verbindungen zwischen Proteinen ermöglichen. Für Membranproteine wie junctionale Proteine ist es auch entscheidend, einen Puffer zu verwenden, der die Bindungen zwischen den Proteinen bewahrt und gleichzeitig ihre Löslichkeit ermöglicht. Zweitens, ähnlich wie Co-IF, erfordert es hochaffine AntikörperSowohl für das Zielprotein als auch für die Bindungspartner. Da Proteine in ihrer Tertiärkonformation verbleiben und Proteinkomplexe nicht durch Homogenisierung dissoziiert werden, wenn der Antikörper einen Teil des Zielproteins erkennt, der sich in unmittelbarer Nähe der Bindungsdomäne eines Partners befindet oder der innerhalb der nativen Struktur des Proteins verborgen ist , Die IP kann kompromittiert werden. Es ist daher unbedingt erforderlich, die Effizienz der IP mit Western Blotting zu überprüfen, bevor man das Fehlen eines Bindungspartners abschließt. Drittens kann Co-IP falsch-positive Ergebnisse erzeugen, weil das Protein entweder direkt an die Perlen bindet oder während des Verfahrens ohne Teil des Komplexes ausfällt. Um diese Artefakte zu identifizieren, ist eine IgG-Kontrolle erforderlich, ebenso wie eine reziproke IP, wie in den vorgestellten Methoden beschrieben. Es ist auch möglich, eine "Vorreinigung" -Verfahren zwischen den Schritten 2.2.2 und 2.2.3 hinzuzufügen, um die unspezifische Bindung von Proteinen an die Perlen zu vermeiden. Um dies zu tun, inkubieren thE lysiert mit 50 μg Perlen für 1 h bei 4 ° C auf einem Walzenmischer. Entfernen Sie die Perlen mit dem Magnetständer und fahren Sie mit Schritt 2.2.3 fort. Viertens können die schweren und leichten Ketten von IgG die gleiche Größe haben wie die interessierenden Proteine oder der Bindungspartner, wodurch das Signal maskiert wird. Eine Lösung besteht darin, die IgG-Ketten mit Glycin zu dissoziieren, wie in diesem Manuskript beschrieben. Es ist auch möglich, sekundäre Antikörper zu kaufen, die nur native Antikörper erkennen und daher nicht an die denaturierten leichten und schweren Ketten binden, die in die Membran geladen sind (siehe Tabelle der Materialien ). Die beiden Methoden müssen manchmal kombiniert werden. Fünftens ermöglicht Co-IP die Identifizierung einer begrenzten Anzahl von Bindungspartnern, zum Teil wegen der Anzahl der Antikörper, die auf die Membran untersucht werden können. Es bedarf auch der Voridentifizierung dieser verbindlichen Partner, entweder durch Co-IF oder durch eine Literaturrecherche. Schließlich erlaubt co-IP die Identifizierung der Proteine presInnerhalb eines Komplexes und nicht für die direkte Interaktion zwischen zwei Proteinen.
Ergebnisse aus Co-IP können auf unterschiedliche Weise analysiert werden. Es ist möglich, nur interagierende Partner zu identifizieren, indem man dieselbe Membran mit verschiedenen Antikörpern, wie in diesem Manuskript beschrieben, erneut untersucht. Es ist auch möglich, diese Wechselwirkung zu quantifizieren. Um dies zu erreichen, wird die Menge des Proteins, die immunpräzipitiert wird, zuerst quantifiziert, indem die Membran mit einem Antikörper gegen dieses Protein untersucht wird. Die Signalintensität wird mit einer Imaging-Software analysiert, wie in diesem Manuskript beschrieben. Dann wird die Membran mit einem Antikörper gegen den Bindungspartner erneut untersucht und die Signalintensität auch quantifiziert. Die Wechselwirkungen zwischen den beiden Proteinen können dann als Verhältnis der Menge des Bindungspartners zur Menge des immunpräzipitierten Proteins ausgedrückt werden. Um jedoch einen Vergleich zu ermöglichen, müssen die verschiedenen Proben gleichzeitig verarbeitet und auf dieselbe Membran geladen werden. BiologIcal-Replikate können ebenso fortgesetzt und analysiert werden, und es kann eine statistische Analyse durchgeführt werden.
In den letzten Jahren wurden andere Techniken entwickelt, um PPIs zu analysieren. Zum Beispiel ermöglicht FRET die Identifizierung von interagierenden Proteinen durch Energieübertragung von einem Tag zum anderen, nur wenn die Proteine nahe genug sind, um zu interagieren 20 . Jedoch, weil es erfordert, dass Proteine markiert werden, kann diese Technik nicht in Geweben verwendet werden. Ähnlich ist es möglich, PPIs unter Verwendung eines Proteins zu identifizieren, das mit einer bakteriellen Biotinligase, BirA 21 , fusioniert ist. Diese Ligase fügt Biotin zu Proteinen hinzu, die in unmittelbarer Nähe ( dh interagieren) mit dem chimären Protein kommen. Während diese Methode innovativ und unvoreingenommen ist, kann sie nicht in Geweben durchgeführt werden. Alternativ kann PLA in Geweben verwendet werden. Ähnlich wie bei co-IF basiert dieser Assay auf der Antikörper-Affinität. Für diesen Assay werden sekundäre Antikörper mit DNA-Sequenzen tha markiertT können interagieren , wenn sie sich in unmittelbarer Nähe befinden ( dh auf PPIs) und bilden ein kreisförmiges DNA-Molekül 22 . Dieses zirkuläre DNA-Molekül wird dann amplifiziert und unter Verwendung von fluoreszenzmarkierten komplementären Oligonukleotiden nachgewiesen. Obwohl dieser Assay elegant ist, erfordert er viele Validierungsschritte und stützt sich immer auf die primäre Antikörperaffinität und einige Kenntnisse über potenzielle interagierende Partner. Schließlich wurde auch eine unvoreingenommene Alternative zum traditionellen IP-Assay entwickelt, um PPIs zu identifizieren. Bei der schnellen Immunpräzipitations-Massenspektrometrie von endogenen Protein- (RIME-) Assays werden IP-Proben durch Massenspektrometrie (IP / MS) 23 anstelle der Western-Blot-Analyse analysiert. Der Hauptvorteil dieser High-Throughput-Methode ist, dass sie massive Informationen über alle endogenen interagierenden Proteine mit wenigen Materialien liefert. Es erfordert jedoch den Zugang zu einem Peptid-Sequenzierungsinstrument 23 .
Es istWichtig zu erwähnen, dass nach mehreren Vorversuchen jeder Schritt dieses Protokolls für die Brustdrüse optimiert wurde. Allerdings kann die Methode sicherlich für andere Organe nach einigen Modifikationen verwendet werden. Für co-IF wurden die optimale Temperatur für die Brustdrüsenabtrennung, die geeignete Blockierung und das Waschen und die Lösungen sowie die richtigen Antikörperkonzentrationen getestet. Für Co-IP wurden auch verschiedene Lyse- und Elutionspuffer und Methoden der Extraktionen getestet und haben einen großen Einfluss auf den IP-Erfolg. In Summe ist jeder Schritt dieses Protokolls wichtig, um qualitativ hochwertige und reproduzierbare Ergebnisse mit dem geringstmöglichen Hintergrund und der meisten Spezifität zu erhalten. Während andere Methoden verfügbar sind, bleibt Co-IF gefolgt von Co-IP gültig und einfache Methoden zur Bewertung von PPIs. Diese beiden Techniken können sowohl in Geweben als auch in Zelllinien verwendet werden und benötigen nur einige Validierungsschritte und Kontrollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu erklären.
Acknowledgments
IP wird von einem Naturwissenschaften und Ingenieurwissenschaftsrat von Kanada finanziert (NSERC # 418233-2012); Ein Fonds de Recherche du Québec-Santé (FRQS), ein Trainerpreis der Quebec-Brustkrebs-Stiftung und ein Leader Founds-Stipendium der kanadischen Stiftung für Innovationsträger. ED erhielt ein Stipendium der Fondation universitaire Armand-Frappier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice strain and stage | St. Constant, Quebec, Canada | C57BL/6 Femals; pregnancy day 18 (P18) and lactation day 14 (L14), Charles River Canada | |
| PBS 10x (stock) | 1) Dissolve 80 g NaCl (F.W.: 58.44), 2 g KCl (F.W. 74.55), 26.8 g Na2HPO4·7H2O (F.W. 268.07) and 2.4 g KH2PO4 (F.W.:136.09) in 800 mL distilled water; 2) Adjust the PH to 7.4; 3) Add water to reach to the 1 L final volume. |
||
| TBS 10x (stock) | 1) Dissolve 60.5 g TRIS, 87.6 g NaCl in 800 mL distilled water; 2) Adjust the pH to 7.5; 3) Add water to reach to the 1 L final volume. |
||
| Part 1: Immunofluorescence | |||
| Freezing media | VWR International, Ville Mont-Royal, QC, Canada | 95067-840 | VMR frozen sections compound |
| Microtome | Mississauga, ON, Canada | 956640 | Microm HM525, Thermo fisher scientific HM525 NX Cryostat 115 V 60 Hz |
| Blades | C.L. Sturkey, Inc. Les Produits Scientifiques ESBE St-Laurent, QC, Canada | BLM1001C | High profile gold coated blades |
| Pap pen | Cedarlane, Burlington, ON, Canada | 8899 | Super PAP Pen, Thermo fisher scientific |
| Microscopic slides | Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada | 12-550-15 | Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides |
| Formaldehyde | BioShop Canada Inc, Burlington, ON, Canada | FOR201.1 | Forlmadehyde |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA | ||
| Blocking solution | 3% BSA in TBS | ||
| Wash solution | TBS-Tween 20 0.1% | ||
| Polysorbate 20 | Oakville, ON, Canada | P 9416 | Tween 20, Sigma-Aldrich |
| Mounting media | Cedarlane, Burlington, ON | 17984-25(EM) | Fluoromount-G |
| First & secondary antibodies | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | See Comments | E-Cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) 1/50 (Cell Signaling) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 555 (#4409s), Cell Signaling |
| First & secondary antibodies | Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USA | See Comments | Claudin-7 (#34-9100) 1/100 (Life Technologies) with anti-rabbit IgG Fab2 Alexa Fluor 488 (#4412s) (Cell Signaling) |
| First & secondary antibodies | Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA; Fischer Scientific, Burlington, ON, Canada | See Comments | β-Catenin Antibody (C-18): sc-1496 (SANTA CRUZ) with anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 (#A11057), Molecular Probe (Fisher Scientific) |
| First & secondary antibodies | Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USA | See Comments | Connexin26 (#33-5800) 1/75 (Life Technologies) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 647 (#4410s) |
| Nuclei stain | Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada | D1306 | DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) 1/1,000 in PBS |
| Fluorescent microscope | Nikon Canada, Mississauga, On, Canada | Nikon A1R+ confocal microscopic laser equipped with a spectral detector | |
| Software of IF images analysis | Nikon Canada, Mississauga, On, Canada | NIS-elements software (version 4) | |
| Part 2: Immunoprecipitation | |||
| Triple-detergent Lysis buffer (100 mL) pH=8.0 | 1) Mix 50 mM TRIS (F.W.: 121.14), 150 mM NaCl (F.W.: 58.44), 0.02% Sodium Azide, 0.1% SDS, 1% NONIdET P40, 0.5% Sodium Deoxycholate in 80 mL distilled H2O. 2) Adjust the pH to 8.0 with HCl 6 N (~0.5 mL). 3) Adjust the volume to 100 mL. Keep it in fridge. At the day of protein extraction, use 1/100 NaVo3, 1/100 protease/phosphatase inhibitor and 1/25 NAF in calculated amount of Triple detergent lysis buffer: Sodium Fluoride (stock) solution 1.25 M (F.W.: 41.98), Sodium Orthovanadate (stock) Solution 1 M (F.W.: 183.9) |
||
| Protease/phosphatase inhibitor | Fisher Scientific, Burlington, ON | 78441 | Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100x) |
| Protein dosage | Thermo Scientific, Rockford, Illinois, USA | 23225 | Pierce BCA protein assay kit |
| Tissue grinder | Fisher Scientific, Burlington, ON | FTH-115 | Power 125, Model FTH-115 |
| Magnetic beads and stand | Millipore, Etobicoke, ON, Canada | PureProteome Protein G Magnetic Bead System (LSKMAGG02) | |
| Wash solution for IP | PBS or PBS-Tween20 0.1% depending to the step | ||
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | See Comments | IgG Rabbit (rabbit (DA1E) mAb IgG Isotype control (#3900s) (Cell Signaling) 0.5 µL/200 µL |
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | See Comments | IgG Mouse mouse (G3A1) mAb IgG Isotype control (#5415s) (Cell Signaling) 0.5 µL/200 µL |
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada | See Comments | Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 4 µL/200 µL |
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | See Comments | E-cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) (Cell Signaling) 1 µL/200 µL |
| Laemmli buffer | BIO-RAD, Mississauga, Ontario, Canada | 1610747 | 4x Laemmli Sample Buffer (Add β-mercaptoethanol following manufacturer recommendation) |
| Acidic glycine | Fisher Scientific, Burlington, ON | PB381-5 | 0.2 M glycine; adjust pH=2.5 with HCl |
| Tris | Fisher Scientific, Burlington, ON | BP152-1 | 1 M (pH=8) |
| SDS-PAGE acrylamide gels | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1610180 -5 | TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Solutionss (7.8%, 10%, 12%) |
| Running buffer 10x | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1704272 | Tris 30.3 g/glycine 144.1 g /SDS 10 g in 1 L distilled water |
| Membranes | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1704272 | PVDF membranes, Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit |
| Transfer method | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1704155 | Trans-Blot Turbo Transfer System |
| Dry Milk | Smucker Food of Canada Co, Markham, ON, Canada | Fat Free Instant Skim Milk Powder, Carnation | |
| Blocking solution for blots | 5% dry milk in TBS-Tween 20 0.1% | ||
| Washing solutions for blots | TBS-Tween 20 0.1% | ||
| Primary and secondary antibodies for blots (10 mL) | Sigma-Aldrich, Oakville, Ontario & Abcam, Toronto, ON, Canada | See Comments | Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 1/2,500 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Primary and secondary antibodies for blots (10 mL) | Cell Signaling, Beverly, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada | See Comments | E-cadherin (24E10) rabbit mAb 1/1,000 (#3195s) (Cell Signaling) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Primary and secondary antibodies for blots (10 mL) | Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada | See Comments | Claudin-7 (#34-9100) (Life technologies) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Primary and secondary antibodies for blots (10 mL) | Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada | See Comments | Claudin3 (#34-1700) (Life technologies) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Luminol solution for signal detection on blots | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1705061 | Clarity Western ECL Blotting Substrate |
| Imaging blots | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1708280 | ChemiDoc MP imaging system |
| Analayzing blots | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | ImageLab 5.2 software | |
References
- Sternlicht, M. D. Key stages in mammary gland development: the cues that regulate ductal branching morphogenesis. Breast Cancer Res. 8 (1), 201 (2006).
- Oakes, S. R., Hilton, H. N., Ormandy, C. J. The alveolar switch: coordinating the proliferative cues and cell fate decisions that drive the formation of lobuloalveoli from ductal epithelium. Breast Cancer Res. 8 (2), 207 (2006).
- Stein, T., Hilton, H. N., Ormandy, C. J. The alveolar switch: coordinating the proliferative cues and cell fate decisions that drive the formation of lobuloalveoli from ductal epithelium. Breast Cancer Res. 8 (2), 207 (2006).
- El-Sabban, M. E., Abi-Mosleh, L. F., Talhouk, R. S. Developmental regulation of gap junctions and their role in mammary epithelial cell differentiation. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 8 (4), 463-473 (2003).
- Hennighausen, L., Robinson, G. W. Information networks in the mammary gland. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (9), 715-725 (2005).
- Gudjonsson, T., Adriance, M. C., Sternlicht, M. D., Petersen, O. W., Bissell, M. J. Myoepithelial cells: their origin and function in breast morphogenesis and neoplasia. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 10 (3), 261-272 (2005).
- Nguyen, D. A., Neville, M. C. Tight junction regulation in the mammary gland. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 3 (3), 233-246 (1998).
- Stewart, M. K., Simek, J., Laird, D. W. Insights into the role of connexins in mammary gland morphogenesis and function. Reproduction. 149 (6), R279-R290 (2015).
- Dianati, E., Poiraud, J., Weber-Ouellette, A., Connexins Plante, I., E-cadherin, Claudin-7 and beta-catenin transiently form junctional nexuses during the post-natal mammary gland development. Dev Biol. 416 (1), 52-68 (2016).
- Derangeon, M., Spray, D. C., Bourmeyster, N., Sarrouilhe, D., Herve, J. C. Reciprocal influence of connexins and apical junction proteins on their expressions and functions. Biochim Biophys Acta. 1788 (4), 768-778 (2009).
- Hernandez-Blazquez, F. J., Joazeiro, P. P., Omori, Y., Yamasaki, H. Control of intracellular movement of connexins by E-cadherin in murine skin papilloma cells. Exp Cell Res. 270 (2), 235-247 (2001).
- Kiyokawa, E., Hara, S., Nakamura, T., Matsuda, M. Fluorescence (Forster) resonance energy transfer imaging of oncogene activity in living cells. Cancer Sci. 97 (1), 8-15 (2006).
- Gustafsdottir, S. M., et al. Proximity ligation assays for sensitive and specific protein analyses. Anal Biochem. 345 (1), 2-9 (2005).
- Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of mammary gland development and function in mouse models. J Vis Exp. (53), (2011).
- Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. , 4th ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
- Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A defined methodology for reliable quantification of Western blot data. Mol Biotechnol. 55 (3), 217-226 (2013).
- Oxford, E. M., et al. Molecular composition of the intercalated disc in a spontaneous canine animal model of arrhythmogenic right ventricular dysplasia/cardiomyopathy. Heart Rhythm. 4 (9), 1196-1205 (2007).
- Wang, X., Li, S. Protein mislocalization: mechanisms, functions and clinical applications in cancer. Biochim Biophys Acta. 1846 (1), 13-25 (2014).
- Bertocchi, C., et al. Nanoscale architecture of cadherin-based cell adhesions. Nat Cell Biol. 19 (1), 28-37 (2017).
- Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs. Sensors (Basel). 16 (9), (2016).
- Fredriksson, K., et al. Proteomic analysis of proteins surrounding occludin and claudin-4 reveals their proximity to signaling and trafficking networks. PLoS One. 10 (3), e0117074 (2015).
- Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Rev Proteomics. 7 (3), 401-409 (2010).
- Malovannaya, A., et al. Streamlined analysis schema for high-throughput identification of endogenous protein complexes. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (6), 2431-2436 (2010).
