Summary
세포 간 접합은 유선의 단계별 기능과 발달에 필수적입니다. 이 원고는 단백질 - 단백질 상호 작용 (PPIs) 연구를위한 상세한 프로토콜과 쥐 유방 땀샘을 이용한 공동 위치 파악을 제공합니다. 이러한 기술은 서로 다른 발달 단계에서 세포 간 접합 사이의 물리적 연관성의 역 동성을 조사 할 수있게 해줍니다.
Abstract
세포 - 세포 상호 작용은 조직의 보전과 유방의 여러 구획 사이의 장벽을 보존하는 데 중추적 인 역할을합니다. 이러한 상호 작용은 인접 세포간에 넥서스를 형성하는 접합 단백질에 의해 제공됩니다. Junctional protein mislocalization과 결합 파트너와의 물리적 연관성 감소는 기능 상실, 결과적으로 장기 기능 부전을 초래할 수 있습니다. 따라서 정상 및 질병 관련 조직에서 단백질 위치 파악 및 단백질 - 단백질 상호 작용 (PPI)을 확인하는 것은 발달 상태의 질병이나 변화의 진행을 유도하는 새로운 증거와 메커니즘을 찾는 데 필수적입니다. 이 원고는 마우스 유선에서 PPI를 평가하는 2 단계 방법을 제시합니다. 프로토콜 섹션 1에서는 관심있는 단백질에 대해 생성 된 항체와 형광 색소로 표지 된 2 차 항체를 사용하여 동시 면역 형광 (co-immunofluorescence) (co-IF)을 수행하는 방법을 설명합니다. co-IF all단백질의 근접성을 입증해야하기 때문에 신체적 상호 작용을 연구하는 것이 가능합니다. 따라서 co-immunoprecipitation (co-IP)에 대한 자세한 프로토콜은 프로토콜 섹션 2에 나와 있습니다.이 방법은 이러한 상호 작용이 직접적인지 간접적인지를 확인하지 않고 단백질 간의 물리적 상호 작용을 결정하는 데 사용됩니다. 지난 몇 년 동안 co-IF 및 co-IP 기술은 유 전선 발달 동안 변이성 접합부 연결을 생성하면서 세포 간 접합의 특정 구성 요소가 함께 위치하고 상호 작용한다는 것을 입증했습니다.
Introduction
유선의 성장 및 발달은 주로 출생 후 발생합니다. 이 기관은 포유류의 번식을 통해 끊임없이 변모합니다 1 . 성인 유선 선 상피는 내막 상피 세포의 내층과 기저 세포의 외층으로 이루어져 있으며, 주로 상피 세포로 이루어져 있으며 기저막으로 둘러싸여있다. 유선 구조와 발달에 대한 좋은 검토를 위해 독자는 Sternlicht 1 을 참고할 수 있습니다. 글 랜드 1 , 3 , 4 , 5 , 6 의 정상적인 발달과 기능을 위해서는 gap (GJ), tight (TJ), adherens (AJ) junction을 통한 세포 - 세포 상호 작용이 필요합니다. 쥐 유선에서 이들 접합부의 주요 구성 요소는 Cx26, Cx30, Cx32 및 Cx43 (GJ)입니다. 클로 딘 -1, -3, -4, -7 그리고ZO-1 (TJ); 및 E-cadherin, P-cadherin 및 β-catenin (AJ) 7,8 . 이러한 서로 다른 접합 단백질의 발현 수준은 유선 발달 동안 단계에 따라 달라 지므로 차별화 된 세포 - 세포 상호 작용 요구 사항을 제시합니다. GJ, TJ 및 AJ는 구조적 및 기능적으로 연결되어 있고 인접한 세포의 인접한 사이트에 다른 구조적 또는 조절 단백질을 연결하여 교차 결합 관계를 만듭니다. junctional 연결의 구성은 기본 cytoskeleton뿐만 아니라 넥서스 투자율과 안정성과 다리에 영향을 미칠 수 있으며 결과적으로 글 랜드의 기능에 영향을 줄 수 있습니다 8 , 9 , 10 , 11 . 접합부 넥서스에 있거나 서로 다른 곳에서 상호 작용하는 세포 간 접합의 구성 요소최근 유방암 발달 단계를 co-immunofluorescence (co-IF)와 co-immunoprecipitation (co-IP)을 이용하여 분석 하였다. 다른 기술은 단백질 간의 기능적 연관성을 평가할 수 있지만,이 방법은이 원고에 제시되어 있지 않습니다.
단백질은 단지 기능 만 수행하기 때문에 신호 전달 및 생화학 적 계통과 같은 단백질 - 단백질 상호 작용 (PPI)을 연구하는 것은 많은 연구자에게 필수적이며 단백질의 기능에 대한 중요한 정보를 제공 할 수 있습니다. 공동 IF 및 현미경 분석은 동일한 세포 내 공간을 공유하는 몇 가지 단백질을 평가하는 데 도움이됩니다. 그러나 다른 동물에서 키워야하는 항체와 다른 파장의 레이저가 장착 된 공 촛점 현미경 및 멀티플렉싱을위한 스펙트럼 검출기를 사용하여 표적의 수를 제한합니다. Co-IP는 친화적 인 물리적 상호 작용을 확인하거나 공개합니다.단백질 복합체 내에 존재하는 둘 이상의 단백질. 단백질의 위치와 상호 작용을 동시에 감지 할 수있는 형광 공명 에너지 전달 (FRET) 12 및 근접 연결 분석 (PLA) 13 과 같은 새로운 기술의 개발에도 불구하고, co-IP는 적절한 상호 작용을 연구하는 적절한 기술이다 내생 단백질.
이 원고에서 설명한 단계별 방법은 유방 땀샘의 내인성 PPI를 연구 할 때 피하기 위해 단백질 지방화 및 PPI의 연구를 촉진하고 함정을 지적합니다. 이 방법론은 각 기술에 필요한 조직에 대한 다양한 보존 절차를 제시하는 것으로 시작합니다. 1 부는 i) 유방 땀샘의 구분, ii) co-IF 기법을 이용한 여러 단백질의 이중 또는 삼중 표지, iii)단백질 지방화. Part 2는 내인성 단백질을 침전시키고 상호 작용하는 단백질을 i) 용 해물 준비, ii) 간접 단백질 면역 침전 및 iii) SDS-PAGE 및 Western blot에 의한 결합 파트너 식별의 세 단계로 식별하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜의 각 단계는 설치류 유선 조직에 최적화되어 있으며 고품질의 특이적이고 재현 가능한 결과를 생성합니다. 이 프로토콜은 다른 조직이나 세포주의 PPI 연구의 시작점으로 사용할 수도 있습니다.
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Protocol
이 연구에서 사용 된 모든 동물 프로토콜은 University Animal Care Committee (INRS-Institut Armand-Frappier, Laval, Canada)의 승인을 받았습니다.
1. 단백질 공 동화 확인
- 조직에서 현미경 슬라이드까지
참고 : 조직 및 섹션은 드라이 아이스로 처리해야합니다.- 동물에서 유선을 절단하십시오 (이 절차에 대한 완전한 설명은 Plante et al. 참조 ) . 14 .
- 드라이 아이스에 동결 / 장착 매체에 excised 조직을 삽입하십시오. 글 랜드를 덮기에 충분한 매질을 첨가하십시오. 배지가 고형화되면 나중에 -80 ℃에서 냉동실로 옮겨 조직을 만듭니다 9 .
- cryomicrotome을 -35 ° C 이하로 설정하고 조직을 7-10 μm 두께의 절편으로 자르고 현미경 슬라이드 위에 놓습니다.
참고 : 가능하면 각 슬라이드에 두 개의 섹션을 배치하십시오. 왼쪽 섹션은예를 들어 항체의 특이성과 조직의 자기 형광을 확인하기위한 예 통제. 오른쪽면은 항체로 표지됩니다. - 나중에 사용할 수 있도록 섹션을 -80 ° C에 유지하십시오.
- Co-IF 염색
- 냉동고에서 적절한 현미경 슬라이드를 검색하고 즉시 실온 (RT)에서 15 분 동안 포름 알데히드 4 %에 담가 섹션을 수정.
- 그런 다음 실온에서 인산염 완충 식염수 (PBS)에 슬라이드를 담그십시오. 다음 단계로 진행할 때까지 RT에서 PBS에 슬라이드를 남겨 둡니다.
- 시중에서 구할 수있는 소수성 벽 또는 발수성 실험용 펜을 사용하여 슬라이드의 각 부분에 동그라미를 채 웁니다 (재료 표 참조). 조직을 만지지 않도록주의하십시오. 즉시 조직에 PBS 방울을 추가하고 프로 시저의 나머지 부분에 대한 습한 조직학 챔버에 슬라이드를 놓으십시오.
참고 : 조직 절편은 보습 상태를 유지해야합니다. 대안상자에 뚜껑이 달려 있고 바닥에 젖은 종이 타월을 둡니다. - RT에서 30 분 동안 3 % 소 혈청 알부민 (BSA) - 트리스 버퍼 식염수 (TBS) -0.1 % 폴리 소르 베이트 20 ( 표 2 참조)의 100-200 μL로 각 조직 섹션을 차단하십시오. 샘플이 차단되는 동안 TBS-0.1 % 폴리 소르 베이트 20에 항체를 희석하여 1 차 및 2 차 항체 용액을 준비하십시오.
참고 : 항체에 필요한 농도는 제조자가 제공한다; 예를 들어, 표 1 및 2 와 Dianati et al. 의 표를 참조하십시오 . 9 . 대부분의 형광 단 결합 항체를 사용할 때 어둠 속에서도 작업 할 필요는 없지만 항체 용액이나 염색 된 조직을 강렬하고 밝은 빛에 노출시키지 마십시오. - 흡인하여 차단 솔루션을 제거하고 RT에서 60 분 동안 희석 기본 항체 100-200 μL의 섹션을 품어. 대안y, 일차 항체와 함께 밤새 4 ℃에서 인큐베이션하십시오.
- 흡인하여 일차 항체 솔루션을 제거하고 5 분 동안 TBS - 0.1 % 폴리 소르 베이트 20 250-500 μL와 섹션을 씻으십시오. 흡인으로 세척 용액을 제거하고 세척을 두 번 반복하십시오.
- 흡인하여 세척 솔루션을 제거하고 RT에서 60 분 동안 적절한 fluorophore - 이차 항체 100-200 μL와 섹션을 품어.
- 흡인하여 보조 항체 솔루션을 제거하고 5 분 동안 TBS - 0.1 % 폴리 소르 베이트 20 250-500 μL와 섹션을 씻으십시오. 세척 용액을 제거하고 두 번 반복하십시오.
- 관심 단백질 (들)에 대한 기본 및 보조 항체의 적절한 조합을 사용하여 2.5-2.8 단계를 반복합니다.
- 흡인하여 세척 용액을 제거하고 5 분 동안 TBS - 0.1 % 폴리 소르 베이트 20에 1 밀리그램 / ML 4 ', 6 - diamidino - 2 - phenylindole (DAPI)의 100-200 μL와 섹션 잠복하여 핵 얼룩을 수행RT.
- 흡인으로 DAPI 솔루션을 제거하고 수용성, 비 형광 마운트 매체 (자료 참조) 및 coverslips를 사용하여 슬라이드를 마운트합니다. 한 번에 한 슬라이드 씩 진행하십시오.
참고 : 핵 얼룩을 5 분 이상 배양해도 염색의 강도는 변하지 않습니다. 또는 모든 슬라이드에서 DAPI 솔루션을 제거하고 슬라이드를 장착하는 동안 PBS에서 조직을 품어. - 적어도 8 시간 동안 4 ° C의 냉장고에 슬라이드를 평평하게 놓습니다. 형광 현미경 이미징 ( 그림 1과 2 참조)로 진행하십시오.
- 현미경 이미징
- 특정 파장에서 형광 물질을 여기시키는 데 필요한 다양한 레이저가 장착 된 공 촛점 현미경을 사용하여 형광 물질이 결합 된 2 차 항체를 시각화합니다.
참고 : 덕트 및 폐포를 시각화 할 수 있도록 0.95의 개구 수를 가진 40X 대물 렌즈가 제안됩니다. example는 그림 1 에 나와 있습니다. - 한 번에 한 파장의 이미지를 스캔하여 각 단백질의 위치를 개별적으로 확인하십시오.
참고 :이 단계에서 접합 단백질의 위치를 비판적으로 분석하는 것이 중요합니다. junctional 넥서스를 형성 할 수 있으려면 이러한 단백질이 원형질막에 국한되어야합니다. - 서로 다른 파장의 레이저로 스캔 한 이미지를 병합하여 단백질의 공동 위치를 결정합니다.
참고 : 동일한 위치에서 2 개 이상의 형광체 방출로 인한 색상 변화로 단백질 공 동화를 시각화 할 수 있으며 적절한 소프트웨어를 사용하여 측정 할 수 있습니다 ( 그림 1 및 2 , 참고 자료 9 참조).
- 특정 파장에서 형광 물질을 여기시키는 데 필요한 다양한 레이저가 장착 된 공 촛점 현미경을 사용하여 형광 물질이 결합 된 2 차 항체를 시각화합니다.
2. PPI 연구
주 : 가슴 땀샘은 가슴과 밀접한 관련이 있기 때문에 복부 유방 땀샘을 사용하여 PPI를 연구해야합니다.근육. 유방 땀샘을 잘라내어 (이 절차에 대한 자세한 설명은 Plante et al . 참조) 14 나중에 사용하기 위해 -80 ° C에서 보관하십시오.
- 용 해물 준비
- 다음 단계를 진행하기 전에 드라이 아이스에 계량 종이와 2 mL 미세 원심 분리 튜브를 넣어 사전 냉각하십시오.
- -80 ° C에서 유선 조직을 가져 와서 드라이 아이스에 보관하십시오.
- 미리 냉각 된 계량 종이에서 조직의 무게를 측정 한 다음 조직을 2 mL 미세 원심 분리 튜브 (드라이 아이스 처리)로 옮깁니다. 시료 당 50 ~ 100mg의 조직을 사용하십시오. 단계 2.1.5까지 조직을 드라이 아이스에 보관하십시오.
- NaF, NaVO 3 및 protease / phosphatase inhibitor가 첨가 된 3 중 세제 용해 완충액을 다음 표에 나와있는 재료 표에 나와 있는대로 필요한 양으로 준비하십시오. 마우스 : 필요한 완충액 (μL) = 마우스 조직 중량 (mg) x 3; 쥐 : 필수완충액 (μL) = 래트 조직 중량 (mg) × 5.
- 조직이 들어있는 2mL 튜브에 필요한 양의 얼음처럼 차가운 용해 완충액 (단계 2.1.4에서 계산)을 첨가합니다.
참고 : 2.1.5-2.1.6 단계에서 한 번에 하나의 튜브로 진행하십시오. - 조직 분쇄기에서 연속 균질화를 사용하여 30-40 초 동안 조직을 균질화하십시오. 항상 얼음에 튜브를 유지. 조직 균질기를 중간 속도로 조정하고 부드럽게 분쇄기를 튜브 내부에서 위아래로 움직입니다.
- 다른 튜브와 함께 1.6 및 1.7 단계를 반복하십시오.
- lysate를 10-30 분 동안 얼음에 품습니다.
- 4 ° C에서 10 분 동안 170 Xg에서 튜브를 원심 분리하십시오.
- 그 사이에, 각 견본을위한 6-10의 microcentrifuge 관 (0.6 ML)를 확인하고 그들을 얼음에 붙드십시오.
- 원심 분리가 끝나면 튜브를 확인하십시오. 이 물질에 발달 단계에 따라 뚱뚱하고 깨끗한 황색에서 분홍색의 용 해물과 펠릿이 최상층에 있는지 확인하십시오.
- 지질 층에 구멍을 만듭니다.200 μL 피펫 팁을 사용하여 액상에 접근하십시오. 팁을 변경하고 펠렛을 방해하거나 지질 층을 흡입하지 않고 lysate를 수집하십시오. 얼음에 미리 라벨이 붙은 튜브 (1 단계 2.1.11 단계)에 lysate를 분주하고 -80 ° C에 보관하십시오.
- 적절한 시중에서 구입할 수있는 키트를 사용하여 단백질 농도를 정량 할 수 있습니다 (재료 표 참조).
- 간접 면역 침전
- 얼음 위에서 이전에 준비된 총 유선 lysates의 두 aliquots을 해동.
참고 : 하나의 분취 량은 목표 단백질의 IP에 사용되며, 다른 분취 량은 음성 대조군으로 사용됩니다. - 500-1,000 μg의 lysate를 모으고 각각의 1.5 mL 튜브에서 200 μL의 최종 용량에 도달하도록 PBS로 희석한다.
참고 : 사용되는 용 해물의 양은 관심있는 단백질의 양과 항체의 효율에 달려 있습니다 ( 그림 3 참조).n 예 및 재료 표 ). 각각의 표적에 대해 최적화하기 위해서는 다른 양의 lysate (500, 750, 1,000 μg)와 항체 ( 즉, 5, 10, 20 μg)를 사용해야합니다. 다음 단계를 수행하십시오 (2.2.3-2.3.7.4). - lysate의 첫 번째 튜브에 관심 항원에 대한 항체를 추가하고 얼음에 보관하십시오.
참고 : 필요한 금액은 각 회사에서 제공하는 지침서 ( Table of Materials 참조)에 제시되어 있습니다. - 두 번째 튜브에서 2.2.3 항에 사용 된 항체와 동일한 농도의 이소 타입 IgG 대조군을 첨가하여 음성 대조군을 준비한다.
- 튜브를 4 ° C에서 밤새 품어 둔다. 저속에서 튜브 롤러 믹서를 사용한다.
- 다음날, 미리 세척을위한 새로운 1.5 ML 튜브에 자기 구슬 50 μL를 추가합니다.
- 항체에 대한 상대적인 친화력을 기준으로 Protein A 또는 Protein G 자기 비드를 선택하십시오. 응집 된 구슬을 사용하지 않는 것이 중요합니다. 부드럽게 그것이 튜브에 추가하기 전에 균일하게 다시 일시 중지 될 때까지 비드 서스펜션을 섞는다.
- 자석 스탠드에 비즈가 들어있는 튜브를 놓고 비즈가 자석으로 이동하도록하십시오. 200 μL 피펫을 사용하여 구슬에서 저장 버퍼를 제거하십시오.
- PBS - 0.1 % 폴리 소르 베이트 20 500 μL를 추가하여 구슬을 씻고 10 초 동안 격렬하게 튜브를 와동시킨다.
- 튜브를 다시 자기 스탠드 위에 놓고 비즈가 자석으로 이동하도록하십시오.
- 200 μL 피펫으로 pipetting하여 초과 세척 버퍼를 제거하십시오.
- 롤러 믹서에서 RT에서 90 분 동안 비즈와 부화로 2.2.5 단계에서 반응 복합체 (lysate - 항체)를 추가합니다.
- 튜브를 자석 스탠드 위에 놓고 비즈가 자석으로 이동하도록하십시오. 200 μL 피펫을 사용하여 lysate를 대기음하고 폐기하고 얼음에 튜브를 놓습니다.
- 구슬을 씻으십시오500 μL의 PBS를 첨가하고, 자성 스탠드에 튜브를 놓고, 200 μL 피펫을 사용하여 액체를 제거합니다. 이 세척 단계를 반복하십시오. 세척 단계 동안 볼 텍싱을 피하고 샘플을 얼음에 보관하십시오.
- 소용돌이 치지 않고 PBS-0.1 % 폴리 소르 베이트 20로 비즈를 한 번 씻고 200 μL 피펫 팁을 사용하여 마지막 세척 완충액을 버립니다.
- 용리 시키려면 0.2 M 산성 글리신 (pH = 2.5) 20 μL를 튜브에 넣고 7 분 동안 롤러 믹서에서 흔들어줍니다.
- 수초 동안 빠른 속도로 원심 분리하고 (빠른 스핀) 신선한 얼음처럼 차가운 튜브에 뜨는 물을 모은다.
- 각 튜브에 대해 2.2.14 및 2.2.15 단계를 반복합니다.
참고 : 최종 볼륨은 40 μL입니다. - 단계 2.2.16에서 40 μL eluted 샘플에 4x Laemmli 버퍼 10 μL를 추가합니다.
참고 : 산성 pH로 인해 색상이 노란색으로 변합니다. - 즉시 2.2 M의 용리 된 시료에 1M Tris (pH = 8)를 한 번에 한 방울 씩파란색으로 변합니다. 다음 튜브로 진행합니다.
- 단계 2.2.18의 시료를 70-90 ° C에서 10 분간 끓여줍니다. 즉시 겔 전기 영동으로 진행하십시오. 또는 시료를 -80 ° C에서 냉동실로 옮길 때까지 시료를 옮깁니다.
- 얼음 위에서 이전에 준비된 총 유선 lysates의 두 aliquots을 해동.
- 다운 스트림 적용 : 겔 전기 영동 후 Western blot
- 표준 절차에 따라 SDS-PAGE 아크릴 아마이드 젤 (1.5 mm 두께)을 분리하고 쌓아서 준비하십시오 15 .
참고 : 겔 (8-15 % 아크릴 아미드, 그라디언트 : 재료 표 참조)의 선택은 침전 될 단백질의 분자 크기와 잠재적 결합 파트너를 분석하여 결정해야합니다. 이러한 단백질은 적절한 면역 검출을 위해 서로 분리되어야합니다. - 얼음 위에서 면역 침전 (IP) 용출 시료 (단계 2.2.20)를 해동합니다.
- 동일한 샘플 (단백질 IP 절차에 사용)에서 단백질 용 해물을 준비하십시오. 50 사용총 용 해물 μg을 첨가하고 4X Laemmli 샘플 버퍼를 첨가한다. 샘플을 70-90 ° C에서 5 분간 끓여 얼음이 칠 때까지 올려 놓습니다.
참고 :이 샘플은 전체 용 해물에 침전 된 단백질의 존재를 설명하기 위해 용출 IP 샘플 옆에로드됩니다. - 아크릴 아미드 겔에서 단계 2.3.3의 준비된 용 해물과 단계 2.2.20의 침전 된 시료를 나란히 놓고 달리기 완충액 (10x 달리기 완충액 : Tris 30.3g, 글리신 144.1g 및 10 g의 SDS를 1L의 증류수에) 약 95 분 동안 또는 이동하는 단백질의 가장자리가 겔의 바닥에 도달 할 때까지.
- 표준 프로토콜 9 , 15 를 사용하여 젤을 니트로 셀룰로오스 또는 PVDF 멤브레인으로 옮기십시오.
- 5 % 건조 우유 -TTBS (20 MM 트리스, 500 MM NaCl 및 0.05 % 폴리 소르 베이트 20)에서 저속으로 로커에서 막을 차단한다.
- 강수량이 suc인지 확인하십시오그만.
- 느린 교반과 함께 흔들 플랫폼에서 4 ° C 밤새 제조 업체가 권장 농도에서 5 % 건조 우유 TTBS로 희석 된 침전 된 단백질에 대한 첫 번째 항체를 사용하여 막을 프로브하십시오.
참고 : 권장 사항 은 재료 표를 참조하십시오. - 다음날, 높은 교반과 함께 흔들 플랫폼에서 TTBS로 막을 5 분씩 3 회 세척한다.
- 천천히 교반과 함께 흔들 플랫폼에서 RT에서 1 H를 위해 TTBS로 희석 한 고추 냉이 과산화 효소 (HRP)와 함께 적절한 보조 항체에 막을 품어.
주 : 또는 신호를 검출하기위한 적절한 장치가 이용 가능하다면 형광 색소와 접합 된 2 차 항체를 사용할 수있다. - 높은 교반과 함께 흔들어 놓는 플랫폼에서 TTBS로 3 분에서 6 분 동안 5 분씩 씻어냅니다. 상용 멤브레인과 함께 멤브레인을 배양하여 보조 항체의 신호를 분석사용 가능한 루미놀 용액 ( 재료 표 참조)을 따르고 제조업체의 지침을 따르십시오. 화학 발광 이미징 시스템을 사용하여 신호를 검출합니다 ( 재료 표 참조).
참고 : Western blot 분석에 대한 자세한 프로토콜은 참고 자료 16을 참조하십시오.
- 느린 교반과 함께 흔들 플랫폼에서 4 ° C 밤새 제조 업체가 권장 농도에서 5 % 건조 우유 TTBS로 희석 된 침전 된 단백질에 대한 첫 번째 항체를 사용하여 막을 프로브하십시오.
- 상호 작용하는 단백질을 확인하기 위해 동일한 블롯에서 적절한 항체를 사용하여 2.3.7.1-2.3.7.4 단계를 수행하십시오.
참고 : 단백질이 상호 작용하는 경우, 결합 파트너는 표적 단백질과 공 - 면역 침전 될 것이며, 따라서 웨스턴 블 랏팅에 의해 검출 될 것이다. 단백질의 분자량이 젤과 막에서 잘 분리되기에 충분하다면 다른 단백질이 같은 단백질 복합체에 존재 하는지를 결정하기 위해 더 많은 항체로 단계 2.3.8을 반복 할 수 있습니다. - 확인 된 바인딩 파트너가 아티팩트가 아닌지 확인하려면 상호 IP를 수행해야합니다.
참고 : 이것은 반복하여 수행됩니다.단계 2.2.1-2.2.20을 동일한 용 해물로 수행하지만 단계 3.8에서 확인 된 결합 파트너 중 하나를 침전시킨다. 그런 다음 관심있는 첫 번째 단백질에 대한 1 차 항체를 사용하여 3.1-3.8 단계를 반복합니다.
- 표준 절차에 따라 SDS-PAGE 아크릴 아마이드 젤 (1.5 mm 두께)을 분리하고 쌓아서 준비하십시오 15 .
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Representative Results
유방 내에서 GJ, AJ 및 TJ 성분이 상호 작용할 수 있는지를 결정하기 위해 co-IF 분석이 먼저 수행되었습니다. GJ 단백질 인 Cx26과 AJ 단백질 인 β-Catenin을 각각 특정 항체로 탐침하고 fluorophore-conjugated 마우스 -647 (녹색, pseudocolor) 및 염소 -568 (적색) 항체를 사용하여 나타냈다 ( 그림 1B 및 C ) . 데이터는 노란 색 ( 그림 1D )에 의해 반영된 바와 같이, 수유 일 7 일 (L7)에 생쥐 유선에서 상피 세포의 세포막에 공동 위치하는 것으로 나타났다. 둘째, TJ 단백질 인 Claudin-7; E-cadherin, AJ 단백질; 및 GJ 단백질 인 Connexin26 (Cx26)을 각각 특이 적 항체로 탐침하고 형광 발색 된 토끼 -488 (녹색), 마우스 -555 (적색) 및 마우스 -647 (산호 블루, 의사 색) 항체로 각각 나타냈다 ( 도 2B-D ). E-cadherin과 Claudin-7 co-localization은 다음과 같습니다.E-cadherin 및 Claudin-7과의 Cx26 동시 위치 측정은 임신 18 일 (P18)에 생쥐 유선 덩어리에서 흰 색 점을 찍은 염색을 나타냈다 ( 그림 2E ).
어느 junctional 단백질이 세포막에서 서로 섞여 있고 물리적으로 결합되어 있는지 알아보기 위해 lactating mice (L14)의 유선 조직을 사용하여 동시 면역 침전을 수행했습니다. 결과는 GJ의 구성 요소 인 Cx43이 E-Cadherin 및 Claudin-7과 상호 작용하지만 Claudin-3과는 상호 작용하지 않음을 보여줍니다 ( 그림 3A 및 B ). 이러한 결과는 상호 IP에 의해 확인되었다. E-Cadherin이 면역 침전 될 때, Cx43 및 Claudin-7과 상호 작용했다 ( 도 3C ).
그림 1 : β-Catenin과 Cx26은 세포막에서 공존한다생쥐의 유방 땀샘에서 수유 일 7 일 (L7)에 생쥐의 유선에서 Cryosections은 (7 μm의) 잘라내어 immunofluorescent 얼룩에 대한 처리되었습니다. ( A ) 핵은 DAPI (청색)로 염색되었다. ( B ) Cx26 (녹색, pseudocolor) 및 ( C ) β-Catenin (적색)은 적절한 형광 단 표지 항체와 함께 표시됩니다. ( D ) 병합 된 이미지. 스펙트럼 검출기가 장착 된 공 촛점 현미경으로 이미지를 얻었다. DAPI는 다음 설정을 사용하여 가시화되었다 : 방출 파장, 450.0 nm; 여기 파장 402.9 nm; 레이저 출력, 1.2; 검출기 이득, PMT HV 100; PMT 오프셋, 0. Cx26 (647)은 다음 설정을 사용하여 가시화되었다 : 방출 파장, 700.0 nm; 여기 파장 637.8 nm; 레이저 파워, 2.1; 검출기 이득, PMT HV 110; PMT 오프셋, 0. β- 카테닌 (568)은 다음 설정을 사용하여 시각화 하였다 : 방출 파장, 595.0 nm; 여기 파장 561.6 nm; 원자 램프전력, 2.1; 검출기 이득, PMT HV 110; PMT 오프셋, 0 스케일 바 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : Connexin26 (Cx26), E-cadherin 및 Claudin-7은 생쥐의 유방 땀샘에서 세포막과 공 유화됩니다. Claudin-7 (녹색), ( C ) E-Cadherin (적색) 및 ( D ) Cx26 (산호)을 사용하여 임신 18 일 (P18) 유방 괄약근을 절단 (7 μm)하고 면역 형광 염색을 위해 처리 하였다. 파란색, pseudocolor), 적절한 형광체 - 라벨 항체와 결합. ( A ) 핵은 DAPI (청색)로 염색되었다. 스펙트럼 검출기가 장착 된 공 촛점 현미경으로 이미지를 얻었다. DAPI는 f백열 설정 : 방출 파장, 450.0 nm; 여기 파장 402.9 nm; 레이저 출력, 5.4; 검출기 이득, PMT HV 65; PMT 오프셋, 0. Claudin-7 (488)은 다음 설정을 사용하여 가시화되었다 : 방출 파장, 525.0 nm; 여기 파장 489.1 nm; 레이저 파워, 5.0; 검출기 이득, PMT HV 12; PMT 오프셋, 0. E-Cadherin (568)은 다음 설정을 사용하여 가시화되었다 : 방출 파장, 595.0 nm; 여기 파장 561.6 nm; 레이저 출력, 13.5; 검출기 게인, PMT HV 45; PMT 오프셋, 0. Cx26 (647)은 다음 설정을 사용하여 가시화되었다 : 방출 파장, 700.0; 여기 파장 637.8; 레이저 파워, 5.0; 검출기 게인, PMT HV 55; PMT 오프셋, 0 스케일 바 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : Claudin-3이 아닌 Cx43, E-Cadherin 및 Claudin-7은 단백질 복합체에 관여합니다. Cx43 ( A 와 B )와 E-Cadherin ( C )은 lactation에서 유방 쥐의 총 용 해물 500 mg을 사용하여 면역 침전시켰다. IP 및 용 해물을 겔에 넣고 PVDF 멤브레인으로 옮겼다. Claudin-7과 Claudin-3는 같은 분자량을 가지고 있기 때문에 동일한 막에서 분석 할 수 없습니다. 따라서, 두 개의 병렬 IP는 Cx43에 대한 동일한 lysate와 함께 수행되었고, 두 개의 젤에 적재되어 전달되었다 (막 A와 B). 멤브레인 A는 IP (상단 패널)의 효율성을 확인하기 위해 Cx43으로 처음 프로빙되었습니다. 이어서, 막을 E-Cadherin 및 Claudin-7로 순차적으로 조사 하였다. Western blot 분석은 두 단백질이 Cx43과 상호 작용 함을 보여 주었다. 멤브레인 B는 먼저 Cx43으로 프로빙되어 IP (상단 패널)의 효율을 확인한 다음 클라우딘 -3로 프로빙되었습니다. Western blot 분석 결과 Claudin-3d두 단백질이 상호 작용하지 않는다는 것을 증명하는 Cx43의 IP는 아니다. 멤브레인 C는 먼저 E-cadherin으로 IP (상부 패널)의 효율을 확인하기 위해 조사되었습니다. 그 다음, 막을 Cx43 및 Claudin-7로 순차적으로 조사 하였다. Western blot 분석은 단백질 간의 상호 작용을 확인했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
접합부를 통한 세포 - 세포 상호 작용은 유방샘과 같은 많은 기관의 적절한 기능과 발달에 필요합니다. 연구 결과 junctional 단백질은 서로의 기능과 안정성을 조절할 수 있고 세포막에서 서로 연결되어 신호 전달을 활성화 할 수 있습니다. 현재의 원고에 제시된 프로토콜은 접합 단백질의 차별화 된 발현, 위치 및 정상적인 쥐의 혈관 발달 중 상호 작용에 대한 흥미있는 발견을 제공했다. junctional 단백질의 위치가 단백질의 기능에 중요하며, scaffolding 단백질 및 수많은 kinase와 상호 작용하는 것으로 알려져 있기 때문에, co-IF 및 co-IP는 세포 - 세포 상호 작용 분야에서 효과적인 기술이다. 이러한 방법은 유선 개발과 관절 연접에서 연결 관절의 필요성을 계몽하는 데 필수적 일뿐만 아니라유방암의 조절에도 도움이되지만 다른 조직이나 세포주를 이용한 실험에서도 사용할 수 있습니다.
유선은 2 개의 주요 구획으로 이루어져 있습니다 : 간질과 상피 4 . 성인 상피 세포는 두 개의 층으로 이루어져 있습니다. 이 접근법에서 잠재적 인 바인딩 파트너의 근접성은 co-IF 기술을 사용하여 결정되었고, 그들의 물리적 상호 작용은 co-IP를 사용하여 확인되었습니다. Co-IF는 다른 조직에 의해 동일한 조직, 구조, 세포 또는 세포 내 구획 내의 단백질의 공존을 입증하는데 성공적으로 사용되었습니다 17 , 18 . 이 기술의 주요 이점은 조직을 구성하는 다른 세포 유형 내에서 각 단백질의 세포 또는 세포 내 위치를 확인하는 시각 정보입니다. 이 기술은 매우 간단하지만 몇 가지 권장 사항을 따라야합니다. 예를 들어, 조직 손상을 피하기 위해,항상 200 μL 피펫 또는 전송 피펫을 사용하여 한 번에 한 방울씩 용액을 첨가하십시오. 이것은 조직을 손상시키지 않으면 서 조직 표면을 담그는 것을 허용 할 것이다. 마찬가지로, 슬라이드를 부드럽게 기울여서 조직 옆에 파스퇴르 피펫을 사용하여 용액을 제거하십시오. 또한 저장 용액에 글리세롤이 포함 된 항체의 경우 백그라운드를 줄이기 위해 세제 완충액을주의 깊게 흡입해야합니다. 또한, 젖 분비 중 카제인과 같은 우유 단백질의 존재는 항체를 포획하여 항체를 간섭하여 오 탐률을 초래할 수 있습니다. 따라서 결과 이미지의 중요한 분석이 특히이 단계에서 필요합니다.
이 co-IF 기술에는 또한 특정 제한 사항이나 함정이 있습니다. 첫째, 특정 항체가 필요합니다. 이전에 언급했듯이 (1.1 단계), 위에서 설명한 단계에 따라 염색을 위해 각 슬라이드에서 한 섹션 ( 즉, 오른쪽에있는 섹션)을 사용하는 것이 좋습니다.일차 항체 및 이차 항체를 순차적으로 투여한다. 나머지 섹션 ( 즉, 왼쪽에있는 섹션)의 경우, 일차 항체 솔루션 대신 TBS - 폴리 솔 베이트 20 0.1 %를 사용하여 동일한 절차를 따르십시오. 펩티드 경쟁을 이용하여 항체의 특이 적 결합을 검증하는 것이 가능하고, 더 좋지만, 상업적 항체를 생성하는데 사용되는 펩타이드는 항상 이용 가능하지는 않다. 따라서 양성 및 음성 대조 ( 즉, 관심 단백질을 발현하는 세포 또는 아는 세포)를 사용하여 결합의 특이성을 확인하는 것이 중요합니다. 더욱이, 항원 고정 부위는 특히 포르말린 고정 조직에 대해서는 접근 할 수 없으므로 특정 신호가 부재하게된다. 따라서 일부 조직에서는 항원 검색 절차가 필요할 수 있습니다. 세포막을 permeabilize하기 위해 항원 검색 이전에 세제와의 짧은 인큐베이션을 수행 할 수도 있습니다. 둘째, 다중화를 위해 항체를 다른 동물에서 키워야합니다.예를 들어, 항 토끼가 단계 1.2.6에서 사용 된 경우, 항 마우스는 단계 1.2.10에서 선택 될 수 있지만 토끼에서 생성 된 다른 항체는 선택 될 수 없다. 대부분의 상업적 항체가 토끼, 생쥐 또는 염소에서 자라기 때문에 적절한 항체가 부족하기 때문에 동시에 두 단백질을 표적으로하는 것이 때때로 어렵거나 심지어 불가능합니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 상업적으로 입수 할 수있는 사전 표지 된 항체를 구입하거나 시판용 키트를 사용하여 형광 물질로 1 차 항체를 표지 할 수 있습니다. 셋째, 또 다른 단점은 다른 형광체의 여기 및 방출과 관련이있다. 두 개의 다른 항체로부터 신호의 중복을 피하기 위해 각 형광 물질의 여기 방출 스펙트럼을 분리해야합니다. 따라서 한 번에 분석 할 수있는 대상의 수는 사용 가능한 현미경의 구성에 따라 달라집니다. 마지막으로, 분석의 품질은 사용 된 현미경에 크게 의존합니다. 보다 자세하고 정확한 데이터는epifluorescent 현미경에 비해 공 촛점 현미경을 사용하여 얻을 수 있습니다. 수퍼 - 해상도 현미경을 사용하면 훨씬 더 자세하게 단백질 공 - 위치 측정이 가능합니다 19 .
co-IF가 잠재적 결합 파트너의 근접성에 대한 중요한 통찰력을 제공하지만, 단백질 간의 물리적 상호 작용을 확인하는 다른 방법으로 보완되어야합니다. 이용 가능한 방법들 중 하나 인 co-IP는 장비 및 재료에 쉽게 접근 할 수 있기 때문에 아마도 가장 수행하기 쉬운 것 중 하나 일 것입니다. 자성 비드에 결합 된 항체를 사용하여, 단백질 복합체를 단리하고 전형적인 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 그 복합체에 존재하는 성분을 확인할 수있다. co-IF와 유사하게 모범 사례에 대한 몇 가지 권고 사항을 따라야합니다. 예를 들어, 단계 2.1.5와 2.1.9 사이의 시간을 줄이기 위해 조직을 균질화 할 때 샘플을 최소화하는 것이 좋습니다. 숙련 된 인력이 at에서 최대 10 개의 샘플을 처리 할 수 있지만예, 초심자는 4-6 개 이상의 표본을 다룰 수 없습니다. 마찬가지로 처음으로 IP 프로토콜을 수행 할 때 튜브 수는 제한되어야합니다. 음성 대조군 ( 즉, IgG)과 양성 대조군 ( 즉, 면역 침전 될 단백질을 포함하는 것으로 알려진 조직)으로 시작하는 것이 좋습니다. 두 번째 시험은 최적화에 전념해야한다 (2.2.2 절 참조). 이러한 단계를 통해 만족스러운 결과를 얻으면 분석 할 샘플을 처리 할 수 있습니다. 부정적인 컨트롤은 항상 프로 시저에 포함되어야합니다.
이 co-IP 기술에는 잠재적 인 함정이 있습니다. 첫째, 조직 간에는 단백질 간의 연결을 유지할 수있는 조건에서 균질화해야합니다. 접합 단백질 (junctional proteins)과 같은 막 단백질의 경우, 용해도를 허용하면서 단백질 간의 결합을 보존하는 완충액을 사용하는 것도 중요합니다. 둘째, co-IF와 유사하게 고친 화성 항체가 필요하다.표적 단백질 및 결합 파트너 모두에 대해. 또한, 단백질은 제 3 고형 구조로 유지되고 단백질 복합체는 균질화에 의해 해리되지 않기 때문에, 항체가 파트너의 결합 도메인에 매우 근접하거나 단백질의 고유 구조 내부에 감추어 진 표적 단백질의 일부를 인식한다면 IP가 손상 될 수 있습니다. 따라서 바인딩 파트너가 없다는 결론을 내리기 전에 웨스턴 블 롯팅을 사용하여 IP의 효율성을 항상 확인하는 것이 필수적입니다. 셋째, co-IP는 비드에 직접 결합하거나 복잡한 과정에 참여하지 않고 침전하는 단백질 때문에 오탐 (false-positive) 결과를 생성 할 수 있습니다. 이러한 아티팩트를 확인하기 위해 제시된 방법에 설명 된대로 상호 IP뿐만 아니라 IgG 컨트롤이 필요합니다. 비드에 단백질이 비특이적으로 결합하는 것을 피하기 위해 2.2.2 단계와 2.2.3 단계 사이에 "사전 세정"절차를 추가하는 것도 가능합니다. 그렇게하기 위해,롤러 믹서로 4 ℃에서 1 시간 동안 구슬 50 μg을 첨가하여 용해시켰다. 자성 스탠드로 비드를 제거하고 2.2.3 단계로 진행합니다. 넷째, IgG의 중쇄 및 경쇄는 관심있는 단백질 또는 결합 파트너와 크기가 같아 신호를 마스킹 할 수 있습니다. 한 가지 해결책은이 원고에 설명 된대로 글리신과 IgG 쇄를 분리하는 것입니다. 또한 천연 항체만을 인식하는 이차 항체를 구입할 수 있으므로 막에로드 된 변성 빛 및 중쇄에 결합하지 않습니다 ( 재료 표 참조). 때때로 두 가지 방법을 결합해야 할 수도 있습니다. 다섯째, co-IP는 제한된 수의 결합 파트너의 확인을 가능하게하는데, 부분적으로 멤브레인에서 프로브 될 수있는 항체의 수 때문입니다. 또한 공동 IF 또는 문헌 검토를 통해 이러한 바인딩 파트너의 사전 식별이 필요합니다. 마지막으로, co-IP는 단백질 pres의 동정을 허용한다.2 개의 단백질 사이의 직접적인 상호 작용을위한 것이 아니라 복합체 내에 존재한다.
co-IP의 결과는 다른 방식으로 분석 될 수 있습니다. 이 원고에 설명 된 것처럼 서로 다른 항체로 동일한 막을 다시 프로빙하여 상호 작용하는 파트너를 유일하게 확인할 수 있습니다. 이 상호 작용을 정량화하는 것도 가능합니다. 그렇게하기 위해, 먼저이 단백질에 대한 항체로 막을 조사함으로써 면역 침강 된 단백질의 양을 정량화한다. 신호 원은이 원고에 설명 된대로 이미징 소프트웨어를 사용하여 분석됩니다. 그런 다음, 멤브레인을 결합 파트너에 대한 항체로 재 프로빙하고 신호 강도도 정량화합니다. 두 단백질 간의 상호 작용은 면역 침강 단백질의 양에 대한 결합 파트너의 양의 비율로 나타낼 수 있습니다. 그러나, 비교를 위해, 상이한 샘플은 동일한 시간에 처리되고 동일한 막에 적재되어야한다. 생물학복제는 유사하게 진행되고 분석 될 수 있고, 통계 분석이 수행 될 수있다.
지난 몇 년 동안 PPI를 분석하기위한 다른 기술이 개발되었습니다. 예를 들어, FRET는 하나의 태그에서 다른 태그로의 에너지 전달을 통해 상호 작용하는 단백질의 식별을 허용합니다. 단, 단백질이 상호 작용하기에 충분히 근접한 경우에만 가능합니다. 그러나 단백질에 태그를 지정해야하므로이 기술을 조직에 사용할 수 없습니다. 유사하게, 세균성 바이오틴 리가 제 (BirA 21) 와 융합 된 단백질을 사용하여 PPI를 동정 할 수있다. 이 리가 아제는 키메라 단백질과 아주 근접하게 ( 즉, 상호 작용하는) 단백질에 바이오틴을 첨가합니다. 이 방법은 혁신적이고 편견이 있지만 조직에서는 수행 할 수 없습니다. 또는 PLA는 조직에서 사용할 수 있습니다. co-IF와 유사하게,이 분석은 항체 친 화성을 기반으로합니다. 이 분석을 위해 이차 항체에는 DNA 염기 서열이 표시되어 있습니다( 즉, PPI에) 근접하여 원형 DNA 분자를 형성 할 때 상호 작용할 수있다. 이 원형 DNA 분자는 형광 표지 된 상보 적 올리고 뉴클레오타이드를 사용하여 증폭되고 검출된다. 이 분석은 우아하지만 많은 검증 단계가 필요하며 여전히 일차 항체 친 화성과 잠재적 인 상호 작용 파트너에 대한 지식에 의존합니다. 마지막으로 전통적인 IP 분석에 대한 편견없는 대안이 또한 PPI를 확인하기 위해 개발되었습니다. 내인성 단백질 (RIME) 분석의 신속한 면역 침강 - 질량 분석에서 IP 샘플은 Western blot 분석 대신 질량 분광법 (IP / MS) 23으로 분석됩니다. 이 고효율 방법의 주요 이점은 거의 모든 물질을 사용하지 않고 모든 내인성 상호 작용 단백질에 대한 방대한 정보를 제공한다는 것입니다. 그러나, 그것은 펩타이드 시퀀싱 도구 23에 대한 액세스가 필요합니다.
그것은몇 가지 예비 시험 후에이 프로토콜의 각 단계가 유선에 맞게 최적화되었음을 언급하는 것이 중요합니다. 그러나이 방법은 몇 가지 수정 작업을 거쳐 다른 기관에 확실히 사용될 수 있습니다. co-IF의 경우, 유선 단면 절단, 적정 차단 및 세척 및 용액 및 적정 항체 농도에 대한 최적 온도가 모두 테스트되었습니다. co-IP의 경우 다양한 용해 및 용리 완충액과 추출 방법도 시험되었으며 IP 성공에 큰 영향을 미쳤습니다. 요약하면,이 프로토콜의 각 단계는 배경이 적고 특이성이 높은 고품질의 재현 가능한 결과를 얻는 데 중요합니다. 다른 방법을 사용할 수있는 반면, co-IF와 co-IP는 PPI를 평가하는 유효하고 간단한 방법으로 남아 있습니다. 이 두 기술은 조직과 세포주에서 모두 사용할 수 있으며 몇 가지 유효성 검사 단계와 컨트롤 만 필요합니다.
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Disclosures
저자는 선언 할 것이 없다.
Acknowledgments
IP는 캐나다 자연 과학 및 공학 연구 협의회 (NSERC # 418233-2012)의 지원을받습니다. Frans de Recherche du Québec-Santé (FRQS), Quebec Breast Cancer Foundation 경력 상 및 캐나다 재단 혁신 재단 (Canadian Foundation for Innovation)으로부터 Leader Founds 보조금을 받았다. ED는 Fondation 유니버설 Armand-Frappier에서 장학금을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice strain and stage | St. Constant, Quebec, Canada | C57BL/6 Femals; pregnancy day 18 (P18) and lactation day 14 (L14), Charles River Canada | |
| PBS 10x (stock) | 1) Dissolve 80 g NaCl (F.W.: 58.44), 2 g KCl (F.W. 74.55), 26.8 g Na2HPO4·7H2O (F.W. 268.07) and 2.4 g KH2PO4 (F.W.:136.09) in 800 mL distilled water; 2) Adjust the PH to 7.4; 3) Add water to reach to the 1 L final volume. |
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| TBS 10x (stock) | 1) Dissolve 60.5 g TRIS, 87.6 g NaCl in 800 mL distilled water; 2) Adjust the pH to 7.5; 3) Add water to reach to the 1 L final volume. |
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| Part 1: Immunofluorescence | |||
| Freezing media | VWR International, Ville Mont-Royal, QC, Canada | 95067-840 | VMR frozen sections compound |
| Microtome | Mississauga, ON, Canada | 956640 | Microm HM525, Thermo fisher scientific HM525 NX Cryostat 115 V 60 Hz |
| Blades | C.L. Sturkey, Inc. Les Produits Scientifiques ESBE St-Laurent, QC, Canada | BLM1001C | High profile gold coated blades |
| Pap pen | Cedarlane, Burlington, ON, Canada | 8899 | Super PAP Pen, Thermo fisher scientific |
| Microscopic slides | Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada | 12-550-15 | Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides |
| Formaldehyde | BioShop Canada Inc, Burlington, ON, Canada | FOR201.1 | Forlmadehyde |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA | ||
| Blocking solution | 3% BSA in TBS | ||
| Wash solution | TBS-Tween 20 0.1% | ||
| Polysorbate 20 | Oakville, ON, Canada | P 9416 | Tween 20, Sigma-Aldrich |
| Mounting media | Cedarlane, Burlington, ON | 17984-25(EM) | Fluoromount-G |
| First & secondary antibodies | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | See Comments | E-Cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) 1/50 (Cell Signaling) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 555 (#4409s), Cell Signaling |
| First & secondary antibodies | Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USA | See Comments | Claudin-7 (#34-9100) 1/100 (Life Technologies) with anti-rabbit IgG Fab2 Alexa Fluor 488 (#4412s) (Cell Signaling) |
| First & secondary antibodies | Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA; Fischer Scientific, Burlington, ON, Canada | See Comments | β-Catenin Antibody (C-18): sc-1496 (SANTA CRUZ) with anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 (#A11057), Molecular Probe (Fisher Scientific) |
| First & secondary antibodies | Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USA | See Comments | Connexin26 (#33-5800) 1/75 (Life Technologies) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 647 (#4410s) |
| Nuclei stain | Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada | D1306 | DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) 1/1,000 in PBS |
| Fluorescent microscope | Nikon Canada, Mississauga, On, Canada | Nikon A1R+ confocal microscopic laser equipped with a spectral detector | |
| Software of IF images analysis | Nikon Canada, Mississauga, On, Canada | NIS-elements software (version 4) | |
| Part 2: Immunoprecipitation | |||
| Triple-detergent Lysis buffer (100 mL) pH=8.0 | 1) Mix 50 mM TRIS (F.W.: 121.14), 150 mM NaCl (F.W.: 58.44), 0.02% Sodium Azide, 0.1% SDS, 1% NONIdET P40, 0.5% Sodium Deoxycholate in 80 mL distilled H2O. 2) Adjust the pH to 8.0 with HCl 6 N (~0.5 mL). 3) Adjust the volume to 100 mL. Keep it in fridge. At the day of protein extraction, use 1/100 NaVo3, 1/100 protease/phosphatase inhibitor and 1/25 NAF in calculated amount of Triple detergent lysis buffer: Sodium Fluoride (stock) solution 1.25 M (F.W.: 41.98), Sodium Orthovanadate (stock) Solution 1 M (F.W.: 183.9) |
||
| Protease/phosphatase inhibitor | Fisher Scientific, Burlington, ON | 78441 | Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100x) |
| Protein dosage | Thermo Scientific, Rockford, Illinois, USA | 23225 | Pierce BCA protein assay kit |
| Tissue grinder | Fisher Scientific, Burlington, ON | FTH-115 | Power 125, Model FTH-115 |
| Magnetic beads and stand | Millipore, Etobicoke, ON, Canada | PureProteome Protein G Magnetic Bead System (LSKMAGG02) | |
| Wash solution for IP | PBS or PBS-Tween20 0.1% depending to the step | ||
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | See Comments | IgG Rabbit (rabbit (DA1E) mAb IgG Isotype control (#3900s) (Cell Signaling) 0.5 µL/200 µL |
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | See Comments | IgG Mouse mouse (G3A1) mAb IgG Isotype control (#5415s) (Cell Signaling) 0.5 µL/200 µL |
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada | See Comments | Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 4 µL/200 µL |
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | See Comments | E-cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) (Cell Signaling) 1 µL/200 µL |
| Laemmli buffer | BIO-RAD, Mississauga, Ontario, Canada | 1610747 | 4x Laemmli Sample Buffer (Add β-mercaptoethanol following manufacturer recommendation) |
| Acidic glycine | Fisher Scientific, Burlington, ON | PB381-5 | 0.2 M glycine; adjust pH=2.5 with HCl |
| Tris | Fisher Scientific, Burlington, ON | BP152-1 | 1 M (pH=8) |
| SDS-PAGE acrylamide gels | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1610180 -5 | TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Solutionss (7.8%, 10%, 12%) |
| Running buffer 10x | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1704272 | Tris 30.3 g/glycine 144.1 g /SDS 10 g in 1 L distilled water |
| Membranes | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1704272 | PVDF membranes, Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit |
| Transfer method | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1704155 | Trans-Blot Turbo Transfer System |
| Dry Milk | Smucker Food of Canada Co, Markham, ON, Canada | Fat Free Instant Skim Milk Powder, Carnation | |
| Blocking solution for blots | 5% dry milk in TBS-Tween 20 0.1% | ||
| Washing solutions for blots | TBS-Tween 20 0.1% | ||
| Primary and secondary antibodies for blots (10 mL) | Sigma-Aldrich, Oakville, Ontario & Abcam, Toronto, ON, Canada | See Comments | Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 1/2,500 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Primary and secondary antibodies for blots (10 mL) | Cell Signaling, Beverly, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada | See Comments | E-cadherin (24E10) rabbit mAb 1/1,000 (#3195s) (Cell Signaling) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Primary and secondary antibodies for blots (10 mL) | Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada | See Comments | Claudin-7 (#34-9100) (Life technologies) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Primary and secondary antibodies for blots (10 mL) | Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada | See Comments | Claudin3 (#34-1700) (Life technologies) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Luminol solution for signal detection on blots | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1705061 | Clarity Western ECL Blotting Substrate |
| Imaging blots | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1708280 | ChemiDoc MP imaging system |
| Analayzing blots | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | ImageLab 5.2 software | |
References
- Sternlicht, M. D. Key stages in mammary gland development: the cues that regulate ductal branching morphogenesis. Breast Cancer Res. 8 (1), 201 (2006).
- Oakes, S. R., Hilton, H. N., Ormandy, C. J. The alveolar switch: coordinating the proliferative cues and cell fate decisions that drive the formation of lobuloalveoli from ductal epithelium. Breast Cancer Res. 8 (2), 207 (2006).
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