Summary
Межклеточные соединения являются реквизитами для специфических функций и развития молочной железы. В этой рукописи содержится подробный протокол изучения белково-белковых взаимодействий (ИЦП) и совместной локализации с использованием мышиных молочных желез. Эти методы позволяют исследовать динамику физической связи между межклеточными переходами на разных стадиях развития.
Abstract
Клеточные клетки играют ключевую роль в сохранении целостности тканей и барьера между различными отделениями молочной железы. Эти взаимодействия обеспечивают взаимодействующие белки, которые образуют нексусы между соседними клетками. Неправильная локализация белка и снижение физических ассоциаций с их партнерами по связыванию могут привести к потере функции и, следовательно, к дисфункции органов. Таким образом, идентификация локализации белка и белково-белковых взаимодействий (ИЦП) в нормальных и связанных с заболеванием тканях имеет важное значение для поиска новых доказательств и механизмов, ведущих к прогрессированию заболеваний или изменений в статусе развития. Эта рукопись представляет собой двухэтапный метод оценки ИПП в мышечных молочных железах. В разделе 1 протокола описывается способ проведения совместной иммунофлуоресценции (co-IF) с использованием антител, выращенных против представляющих интерес белков, с последующими вторичными антителами, меченными флуорохромами. Хотя со-IF всеДля демонстрации близости белков, это позволяет изучать их физические взаимодействия. Поэтому подробный протокол для совместного иммунопреципитации (со-IP) предоставляется в разделе 2 протокола. Этот метод используется для определения физических взаимодействий между белками, не подтверждая, являются ли эти взаимодействия прямыми или косвенными. В последние несколько лет методы совместного ИФ и со-IP продемонстрировали, что некоторые компоненты межклеточных соединений совместно локализуются и взаимодействуют друг с другом, создавая сценические взаимосвязи, которые изменяются в процессе развития молочной железы.
Introduction
Рост и развитие молочной железы происходит в основном после рождения. Этот орган постоянно реконструируется в течение всей репродуктивной жизни млекопитающего 1 . Эпителий молочной железы взрослых состоит из внутреннего слоя эпителиальных клеток просвета и внешнего слоя базальных клеток, в основном состоящих из миоэпителиальных клеток, окруженных подвальной мембраной 2 . Для хорошего обзора структуры и развития молочной железы читатель может обратиться к Sternlicht 1 . Для нормального развития и функции железы 1 , 3 , 4 , 5 , 6 необходимы клеточные взаимодействия через щелевые (GJ), тесные (TJ) и адгезивные (AJ) переходы. Основными компонентами этих соединений в мышечной молочной железе являются Cx26, Cx30, Cx32 и Cx43 (GJ); Claudin-1, -3, -4 и -7 иZO-1 (TJ); И E-кадгерин, P-кадгерин и β-катенин (AJ) 7,8 . Уровни экспрессии этих различных белков-мишеней изменяются в зависимости от стадии в процессе развития молочной железы, что предполагает дифференциальное взаимодействие клеток с клетками 9 . GJ, TJ и AJ связаны структурно и функционально и связывают другие структурные или регуляторные белки с соседними сайтами соседних клеток, создавая, таким образом, функциональную связь 10 . Состав соединительной связи может влиять на мостик с основным цитоскелетом, а также на проницаемость и стабильность связи и может, следовательно, влиять на функцию железы 8 , 9 , 10 , 11 . Компоненты межклеточных соединений, находящихся в узловых связях или взаимодействующих друг с другом при разныхНедавно были проанализированы первые стадии развития развития молочной железы с использованием совместной иммунофлуоресценции (co-IF) и совместного иммунопреципитации (со-IP) 9 . В то время как другие методы позволяют оценить функциональную связь между белками, эти методы не представлены в этой рукописи.
Поскольку белки действуют только один, чтобы работать, изучение белково-белковых взаимодействий (ИЦП), таких как трансдукция сигналов и биохимические каскады, важно для многих исследователей и может предоставить значительную информацию о функции белков. Co-IF и микроскопический анализ помогают оценить несколько белков, которые разделяют одно и то же субклеточное пространство. Однако количество мишеней ограничено антителами, которые должны быть выращены у разных животных, а также доступом к конфокальному микроскопу, оснащенному различными лазерными волнами длины и спектральным детектором для мультиплексирования. Co-IP подтверждает или показывает физическое взаимодействие с высоким сродством betwEen два или более белка, находящихся в белковом комплексе. Несмотря на разработку новых методов, таких как флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET) 12 и анализ лигирования близости (PLA) 13 , который может одновременно обнаруживать локализацию и взаимодействие белков, со-IP остается подходящим и доступным методом для изучения взаимодействий между Эндогенных белков.
Пошаговый метод, описанный в этой рукописи, облегчит изучение локализации белка и ИЦП и укажет на ловушки, чтобы избежать изучения эндогенных ИЦП в молочных железах. Методология начинается с представления различных процедур консервации тканей, необходимых для каждого метода. В части 1 показано, как изучать совместную локализацию белка в три этапа: i) секционирование молочных желез, ii) двойную или тройную маркировку различных белков с использованием метода co-IF, и iii) визуализациюЛокализация белка. В части 2 показано, как осадить эндогенный белок и идентифицировать его взаимодействующие белки в три этапа: i) препарат лизата, ii) иммунопреципитацию непрямого белка и iii) идентификацию связывающего партнера с помощью SDS-PAGE и Вестерн-блоттинга. Каждый шаг этого протокола оптимизирован для тканей молочной железы грызунов и генерирует высококачественные, специфичные и воспроизводимые результаты. Этот протокол также может быть использован в качестве отправной точки для исследований PPI в других тканях или клеточных линиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все протоколы животных, используемые в этом исследовании, были одобрены Комитетом по уходу за животными в университете (INRS-Institut Armand-Frappier, Laval, Canada).
1. Идентификация ко-локализации белка
- От ткани до микроскопических слайдов
ПРИМЕЧАНИЕ. Ткани и секции следует обрабатывать на сухом льду.- Акцизируйте молочные железы у животного (полное описание этой процедуры см. Plante et al. ). 14 .
- Вставьте вырезанную ткань в морозильную / крепежную среду на сухом льду. Добавьте достаточно среды, чтобы покрыть железу. Когда среда затвердевает, переносите ткани в морозильную камеру при -80 ° C для последующего использования. 9 .
- Используя криомикротома, установленную при ≤ -35 ° C, разрежьте ткани в секции толщиной 7-10 мкм и поместите их на слайды микроскопа.
ПРИМЕЧАНИЕ. Если возможно, поместите две секции на каждый слайд; Левая часть будет использоваться какНапример, для проверки специфичности антител и аутофлуоресценции ткани, тогда как правая сторона будет мечены антителами. - Держите секции при -80 ° C для последующего использования.
- Краска Co-IF
- Извлеките подходящие микроскопические слайды из морозильника и сразу же зафиксируйте секции, погрузив их в формальдегид 4% в течение 15 мин при комнатной температуре (RT).
- Затем погрузите слайды в забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) при комнатной температуре. Оставьте слайды в PBS при RT до перехода к следующему шагу.
- Обведите кружочком каждую секцию слайда, используя коммерчески доступный гидрофобный барьер или водоотталкивающее лабораторное перо (см. Таблицу материалов ). Будьте осторожны, чтобы не коснуться ткани. Сразу же добавьте капли PBS в ткань и поместите слайд во влажную гистологическую камеру на оставшуюся часть процедуры.
ПРИМЕЧАНИЕ. Секции тканей должны оставаться увлажненными. альтернативаИспользуйте коробку с крышкой и поместите влажные бумажные полотенца на дно. - Заблокируйте каждую секцию ткани 100-200 мкл 3% -ного буфера для сывороточного альбумина (BSA) -Tris-забуференного (TBS) -0,1% полисорбата 20 (см. Таблицу материалов ) в течение 30 минут при комнатной температуре . В то время как образцы блокируют, подготавливают первичные и вторичные растворы антител путем разбавления антител в TBS-0,1% полисорбате 20.
ПРИМЕЧАНИЕ. Требуемая концентрация для антитела предоставляется изготовителем; См. Таблицу материалов и рисунки 1 и 2 для примеров, а также Dianati et al. 9 . Хотя нет необходимости работать в темноте при использовании большинства конъюгированных с флуорофором антител, избегайте подвергать растворы антител или окрашенные ткани интенсивному яркому свету. - Удалите блокирующий раствор путем аспирации и инкубируйте секции в 100-200 мкл разбавленного первичного антитела в течение 60 мин при комнатной температуре. AlternativelY, инкубируют с первичным антителом в течение ночи при 4 ° C.
- Удалите исходный раствор антитела путем аспирации и промойте секции 250-500 мкл TBS-0,1% полисорбата 20 в течение 5 мин. Удалите промывочный раствор путем аспирации и дважды повторите промывку.
- Удалите промывочный раствор путем аспирации и инкубируйте секции со 100-200 мкл подходящего вторичного антитела, конъюгированного с флуорофором, в течение 60 мин при комнатной температуре.
- Удалите раствор вторичного антитела путем аспирации и промойте секции 250-500 мкл TBS-0,1% полисорбата 20 в течение 5 мин. Удалите промывочный раствор и повторите дважды.
- Повторите шаг 2.5-2.8 с использованием соответствующей комбинации первичных и вторичных антител для последующего белка (ов), представляющих интерес.
- Удаляют промывочный раствор путем аспирации и проводят окрашивание ядер путем инкубации секции с 100-200 мкл 4 мг, 4-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) 1 мг / мл в TBS-0,1% полисорбате 20 в течение 5 мин приRT.
- Удалите раствор DAPI путем аспирации и смонтируйте слайды с использованием водорастворимой, не флуоресцирующей монтажной среды (см. Таблицу материалов ) и покровных. Выполните одно слайд за раз.
ПРИМЕЧАНИЕ. Инкубация пятна ядра более 5 мин не изменит интенсивность окрашивания. Альтернативно, удалите раствор DAPI на всех слайдах и инкубируйте ткани в PBS при установке слайдов. - Поместите слайды в холодильник с температурой 4 ° C не менее 8 часов. Перейдите к флуоресцентной микроскопической визуализации (см. Рисунки 1 и 2 ).
- Микроскопическое изображение
- Визуализируйте вторичные антитела, конъюгированные с флуорофорами, с использованием конфокального микроскопа, оборудованного различными лазерами, необходимыми для возбуждения флуорофоров на их конкретных длинах волн.
Примечание. Чтобы иметь возможность визуализировать каналы и альвеолы, предлагается объектив 40X с числовой апертурой 0,95. ПримерE конкретных настроек приведена на рисунке 1 . - Проверьте локализацию каждого белка индивидуально, сканируя изображение на одну длину волны в то время.
Примечание. На этом этапе важно критически проанализировать локализацию соединительных белков. Чтобы иметь возможность образовывать узловые связи, эти белки должны локализоваться на плазматической мембране. - Определите совместную локализацию белков путем слияния изображений, отсканированных с лазерами на разных длинах волн.
Примечание. Совместная локализация белка может быть визуализирована путем изменения цвета в результате выброса двух или более флуорофоров в одном месте и может быть измерена с использованием соответствующего программного обеспечения ( рис. 1 и 2, а также см. Ссылку 9).
- Визуализируйте вторичные антитела, конъюгированные с флуорофорами, с использованием конфокального микроскопа, оборудованного различными лазерами, необходимыми для возбуждения флуорофоров на их конкретных длинах волн.
2. Изучение ИЦП
ПРИМЕЧАНИЕ. Брюшные молочные железы должны использоваться для изучения ИЦП, поскольку грудные железы находятся в тесной связи с грудныммышцы. Акцизируйте молочные железы (для полного описания этой процедуры, см. Plante et al .) 14 и держите их при -80 ° C для последующего использования.
- Подготовка лизата
- Поместите взвешивающую бумагу и 2 мл микроцентрифужные пробирки на сухой лед, чтобы предварительно охладить их, прежде чем приступать к следующим шагам.
- Возьмите ткань молочной железы с -80 ° C и держите их на сухом льду.
- Взвесьте ткани на предварительно охлажденную взвешивающую бумагу, а затем перенесите ткань в 2 мл микроцентрифужные пробирки (ручка на сухом льду). Используйте от 50 до 100 мг ткани на образец. Держите ткань на сухом льду до стадии 2.1.5.
- Подготовьте необходимое количество тройного моющего лизисного буфера, дополненного NaF, NaVO 3 и ингибитором протеазы / фосфатазы, как указано в таблице материалов , с использованием следующих формул. Мыши: требуемый буфер (мкл) = масса мышиной массы (мг) х 3; Крыса: требуетсяБуфер (мкл) = масса ткани крысы (мг) х 5.
- Добавьте необходимое количество ледяного буфера для лизиса (рассчитанное на этапе 2.1.4) в пробирку объемом 2 мл, содержащую ткань.
ПРИМЕЧАНИЕ. На этапах 2.1.5-2.1.6 приступайте к одной пробирке за раз. - Гомогенизируйте ткань в течение 30-40 с, используя непрерывную гомогенизацию на тканевой мельнице; Всегда держите трубку на льду. Настройте гомогенизатор ткани на среднюю скорость и осторожно перемещайте мясорубку вверх и вниз внутри трубки.
- Повторите шаги 1.6 и 1.7 с другими пробирками.
- Инкубируйте лизаты на льду в течение 10-30 мин.
- Центрифугируйте пробирки при 170 × g в течение 10 мин при 4 ° C.
- Между тем, идентифицируйте 6-10 микроцентрифужных пробирок (0,6 мл) для каждого образца и держите их на льду.
- После центрифугирования проверьте трубы. Убедитесь, что они содержат верхний слой жировых, прозрачных, желто-розовых лизатов (в зависимости от стадии разработки) и гранулы.
- Создайте отверстие в липидном слоеИспользуя наконечник пипетки 200 мкл для доступа к жидкой фазе. Измените наконечник и собирайте лизат, не нарушая осадок или не аспирируя липидный слой. Выровняйте лизат в предварительно меченых пробирках на льду (шаг 2.1.11) и храните их при -80 ° C.
- Используйте аликвоту для количественной оценки концентрации белка с использованием соответствующего коммерчески доступного набора (см. Таблицу материалов ).
- Косвенная иммунопреципитация
- На льду оттаивают две аликвоты общего лизата молочной железы, приготовленные ранее.
ПРИМЕЧАНИЕ. Одна аликвота будет использоваться для IP целевого белка, тогда как другая будет служить отрицательным контролем. - Соберите 500-1000 мкг лизата и разбавьте его в PBS, чтобы достичь конечного объема 200 мкл в каждой пробирке 1,5 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ. Количество используемого лизата зависит от обилия интересующего белка и эффективности антитела (см . Рисунок 3 дляN пример, а также таблица материалов ). Для оптимизации каждой мишени следует использовать различные количества лизата ( то есть 500, 750 и 1000 мкг) и антитела ( то есть 5, 10 и 20 мкг). Выполните следующие шаги (2.2.3-2.3.7.4). - Добавьте антитело против интересующего антигена к первой трубке лизата и держите его на льду.
ПРИМЕЧАНИЕ. Требуемая сумма обычно предлагается в инструкциях каждой компании (см . Таблицу ). - Во второй трубке подготавливают отрицательный контроль, добавляя ту же концентрацию изотипа IgG в качестве антитела, используемого на этапе 2.2.3.
- Инкубируйте трубки в течение ночи при 4 ° С на трубчатом роликовом смесителе с низкой скоростью.
- На следующий день добавьте 50 мкл магнитных шариков в новые 1,5 мл пробирки для предварительной стирки.
- Выбирайте магнитные бусины Protein A или Protein G на основе относительной аффинности к антителу. Важно избегать использования агрегированных гранул; Осторожно смешайте суспензию шариков, пока она не будет равномерно перемотана перед добавлением ее в пробирки.
- Поместите трубки, содержащие шарики, на магнитную подставку и позвольте гранулам мигрировать к магниту. Удалите буфер хранения из бусинок с помощью пипетки 200 мкл.
- Вымойте гранулы, добавив 500 мкл PBS-0,1% полисорбата 20 и энергично встряхивайте пробирки в течение 10 с.
- Поместите трубки обратно на магнитную подставку и позвольте шарикам мигрировать к магниту.
- Удалите избыточный промывочный буфер пипетированием пипеткой 200 мкл.
- Добавьте реакционный комплекс (лизат-антитело) из стадии 2.2.5 к гранулам и инкубируйте в течение 90 мин при комнатной температуре на роликовом смесителе.
- Поместите трубки на магнитную подставку и позвольте шарикам мигрировать к магниту. Используя пипетку 200 мкл, аспирируйте и отбросьте лизат и поместите трубки на лед.
- Вымойте шарикС добавлением 500 мкл PBS, помещения труб на магнитную подставку и удаления жидкости с использованием пипетки 200 мкл. Повторите эту операцию стирки. Во время стирки избегайте завихрения и держите образцы на льду.
- Вымойте гранулы один раз с помощью полисорбата 20 PBS-0,1% без завихрения и отбросьте последний промывочный буфер, используя наконечник пипетки 200 мкл.
- Для элюирования добавьте 20 мкл 0,2 М кислого глицина (pH = 2,5) в пробирки и встряхните их в течение 7 минут на роликовом смесителе.
- Центрифуга на высокой скорости в течение нескольких секунд (быстрое вращение) и собирать супернатант в свежей ледяной пробирке.
- Повторите шаги 2.2.14 и 2.2.15 для каждой трубки.
ПРИМЕЧАНИЕ. Конечный объем будет составлять 40 мкл. - Добавить 10 мкл 4x буфера Laemmli в 40-литровый элюированный образец с этапа 2.2.16.
ПРИМЕЧАНИЕ. Цвет станет желтым из-за кислотного рН. - Сразу же добавьте 1 М Трис (pH = 8), по одной капле за раз, к элюированному образцу с этапа 2.2.18 до его цветаСтановится синим. Перейдите к следующим пробиркам.
- Кипятите образцы с этапа 2.2.18 при 70-90 ° С в течение 10 мин. Немедленно приступить к гелевому электрофорезу. В качестве альтернативы, перенесите образцы в морозильную камеру при -80 ° C до загрузки.
- На льду оттаивают две аликвоты общего лизата молочной железы, приготовленные ранее.
- Нижеследующее применение: гель-электрофорез, затем вестерн-блот
- Подготовьте отделение и укладку акриламидных гелей SDS-PAGE (толщина 1,5 мм) в соответствии со стандартными процедурами 15 .
ПРИМЕЧАНИЕ. Выбор геля (8-15% акриламида, градиент: см. Таблицу материалов ) должен определяться на основе молекулярного размера осаждаемого белка и анализируемых потенциальных партнеров связывания. Эти белки должны быть разрешены друг от друга, чтобы обеспечить надлежащее иммунодетекцию. - Оттепель образцов с иммунопреципитацией (IP) (шаг 2.2.20) на льду.
- Подготовьте белковые лизаты из одних и тех же образцов (используется для процедуры IP выше). Использовать 50Мкг общего лизата и добавить буфер образца образца 4X Laemmli. Кипятите образцы при 70-90 ° С в течение 5 мин и поместите на лед до загрузки.
ПРИМЕЧАНИЕ. Эти образцы будут загружены рядом с элюированным образцом IP, чтобы продемонстрировать присутствие осажденных белков в общем лизате. - Загрузите подготовленные лизаты из стадии 2.3.3 и осажденные образцы из стадии 2.2.20 бок о бок в акриламидном геле и запустите их в бегущем буфере (10-бетонный буфер: 30,3 г Триса, 144,1 г глицина и 10 Г SDS в 1 л дистиллированной воды) при 100 В в течение приблизительно 95 мин или до тех пор, пока край мигрирующих белков не достигнет дна геля.
- Перенесите гели на нитроцеллюлозу или мембрану PVDF, используя стандартный протокол 9 , 15 .
- Заблокируйте мембрану в течение 1 часа на качалке на низкой скорости в 5% сухого молока TTBS (20 мМ Трис, 500 мМ NaCl и 0,05% полисорбата 20).
- Определите, было ли достигнуто осадковплодотворный.
- Пробейте мембрану, используя первое антитело против осажденного белка, разведенного в 5% сухого молока TTBS в концентрации, рекомендованной производителем, в течение ночи при 4 ° C на качающейся платформе с медленным перемешиванием.
ПРИМЕЧАНИЕ. См. Таблицу материалов для рекомендаций. - На следующий день промыть мембрану 3 раза в течение 5 минут каждый с помощью TTBS на качающейся платформе с высоким перемешиванием.
- Инкубируйте мембрану в соответствующем вторичном антителе, конъюгированном с пероксидазой хрена (HRP), разбавленной в TTBS, в течение 1 часа при комнатной температуре на качающейся платформе с медленным перемешиванием.
ПРИМЕЧАНИЕ. Альтернативно, вторичное антитело, конъюгированное с флуорохромом, можно использовать, если доступно соответствующее устройство для обнаружения сигнала. - Выполните от 3 до 6 промывок, каждый в течение 5 минут, с TTBS на качающейся платформе с высоким перемешиванием. Проанализируйте сигнал вторичного антитела путем инкубации мембраны с помощью(См. Таблицу материалов ) и следуйте инструкциям производителя. Обнаружение сигнала с использованием системы хемилюминесцентной визуализации (см. Таблицу материалов ).
ПРИМЕЧАНИЕ. Подробный протокол анализа вестерн-блоттинга см. В ссылке 16.
- Пробейте мембрану, используя первое антитело против осажденного белка, разведенного в 5% сухого молока TTBS в концентрации, рекомендованной производителем, в течение ночи при 4 ° C на качающейся платформе с медленным перемешиванием.
- Чтобы идентифицировать взаимодействующие белки, выполните шаги 2.3.7.1-2.3.7.4 с использованием соответствующих антител на одном и том же блоте.
ПРИМЕЧАНИЕ. Если белки взаимодействуют, партнеры по связыванию будут совместно иммунопреципитированы целевым белком и, таким образом, будут детектироваться с помощью Вестерн-блоттинга. Шаг 2.3.8 можно повторить с большим количеством антител, чтобы определить, находятся ли другие белки в одном и том же комплексе белков, если молекулярные массы белков достаточно различны, чтобы быть хорошо разделенными на геле и мембране. - Чтобы подтвердить, что идентифицированные связывающие партнеры не являются артефактами, должен выполняться обратный IP.
ПРИМЕЧАНИЕ. Это выполняется путем повторенияШаги 2.2.1-2.2.20 с тем же самым лизатом, но осаждающие один из партнеров по связыванию, определенных на этапе 3.8. Затем шаги 3.1-3.8 повторяют с использованием первичного антитела против первого представляющего интерес белка.
- Подготовьте отделение и укладку акриламидных гелей SDS-PAGE (толщина 1,5 мм) в соответствии со стандартными процедурами 15 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Чтобы определить, могут ли компоненты GJ, AJ и TJ взаимодействовать друг с другом в молочной железе, сначала выполнялись анализы ко-IF. Cx26, белок GJ и β-катенин, белок AJ, зондировали специфическими антителами и выявляли с использованием флуорофороконъюгированных антител мыши-647 (зеленый, псевдоколор) и козы-568 (красный) соответственно ( фиг.1В и С ) , Данные показали, что они локализуются на клеточной мембране эпителиальных клеток у мышей молочной железы в день лактации 7 (L7), что отражается желтым цветом ( рис. 1D ). Во-вторых, Claudin-7, TJ-белок; E-cadherin, белок AJ; И Connexin26 (Cx26), белок GJ, были исследованы с их специфическими антителами и были обнаружены с помощью конъюгированных с флуорофором антител кролика-488 (зеленый), мыши-555 (красный) и мыши-647 (коралловый синий, псевдоколор), соответственно ( Рисунок 2B-D ). Совместная локализация E-cadherin и Claudin-7В то время как совместная локализация Cx26 с E-cadherin и Claudin-7 приводила к белой пунктированной окраске в мышах молочных желез на 18-й день беременности (P18) ( рисунок 2E ).
Чтобы выяснить, какие соединительные белки смешиваются и физически связаны между собой на клеточной мембране, совместное иммунопреципитацию проводят с использованием тканей молочной железы у лактирующих мышей (L14). Результаты показали, что Cx43, компонент GJ, взаимодействует с E-Cadherin и Claudin-7, но не с Claudin-3 ( рис. 3A и B ). Эти результаты были подтверждены обратным IP; Когда E-Cadherin был иммунопреципитирован, он взаимодействовал с Cx43 и Claudin-7 ( рисунок 3C ).
Рисунок 1: β-Catenin и Cx26 совместно локализуются в ячейке membРан в мышах молочных желез. Криосклеины из молочных желез мышей в период лактации 7 (L7) разрезали (7 мкм) и обрабатывали для иммунофлуоресцентного окрашивания. ( A ) Ядра окрашивали DAPI (синий). ( B ) Cx26 (зеленый, псевдоколор) и ( C ) β-катенин (красный) показаны в сочетании с соответствующими мечеными флуорофорами антителами. ( D ) Объединенное изображение. Изображения были получены с помощью конфокального микроскопа, снабженного спектральным детектором. DAPI был визуализирован с использованием следующих настроек: длина волны излучения, 450,0 нм; Длина волны возбуждения - 402,9 нм; Мощность лазера, 1,2; Коэффициент усиления детектора, PMT HV 100; PMT, 0. Cx26 (647) было визуализировано с использованием следующих настроек: длина волны излучения, 700,0 нм; Длина волны возбуждения 637,8 нм; Мощность лазера, 2,1; Коэффициент усиления детектора, PMT HV 110; PMT offset, 0. β-Catenin (568) визуализировали, используя следующие настройки: длина волны излучения, 595,0 нм; Длина волны возбуждения 561,6 нм; лазерМощность, 2,1; Коэффициент усиления детектора, PMT HV 110; PMT offset, 0. Шкала шкалы = 50 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Connexin26 (Cx26), E-cadherin и Claudin-7 локализуются на клеточной мембране в мышах молочных желез. Криосекции из молочных желез на 18-й день беременности (Р18) разрезались (7 мкм) и обрабатывались для иммунофлуоресцентного окрашивания с использованием ( В ) Claudin-7 (зеленый), ( C ) E-Cadherin (красный) и ( D ) Cx26 (коралл Синий, псевдоколор) в сочетании с соответствующими мечеными флуорофорами антителами. ( A ) Ядра окрашивали DAPI (синий). Изображения были получены с помощью конфокального микроскопа, снабженного спектральным детектором. DAPI был визуализирован с использованием fПараметры настройки: длина волны излучения, 450,0 нм; Длина волны возбуждения - 402,9 нм; Мощность лазера, 5,4; Коэффициент усиления детектора, PMT HV 65; PMT offset, 0. Claudin-7 (488) был визуализирован с использованием следующих настроек: длина волны излучения, 525,0 нм; Длина волны возбуждения 489,1 нм; Мощность лазера, 5,0; Коэффициент усиления детектора, PMT HV 12; PMT offset, 0. E-Cadherin (568) был визуализирован с использованием следующих настроек: длина волны излучения, 595,0 нм; Длина волны возбуждения 561,6 нм; Мощность лазера, 13,5; Коэффициент усиления детектора, PMT HV 45; PMT offset, 0. Cx26 (647) был визуализирован с использованием следующих настроек: длина волны излучения, 700,0; Длина волны возбуждения - 637,8; Мощность лазера, 5,0; Коэффициент усиления детектора, PMT HV 55; PMT offset, 0. Шкала шкалы = 50 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Cx43, E-Cadherin и Claudin-7, но не Claudin-3, участвуют в белковом комплексе. Cx43 ( A и B ) и E-Cadherin ( C ) иммунопреципитировали, используя 500 мг общего лизата из молочных желез мышей при лактации. IP и лизаты загружали в гели и переносили на мембраны PVDF. Поскольку Claudin-7 и Claudin-3 имеют одинаковую молекулярную массу, они не могут быть проанализированы на одной и той же мембране. Таким образом, два параллельных IP были выполнены с тем же самым лизатом для Cx43, загруженным на два геля и перенесенным (мембраны A и B). Мембрана A была впервые исследована Cx43 для подтверждения эффективности IP (верхняя панель). Затем мембрану последовательно исследовали с помощью E-Cadherin и Claudin-7. Вестерн-блот-анализ показал, что два белка взаимодействуют с Cx43. Мембрану B сначала исследовали с помощью Cx43 для подтверждения эффективности IP (верхняя панель), а затем зондировали Claudin-3. Вестерн-блот-анализ показал, что Claudin-3 dId не IP с Cx43, демонстрируя, что два белка не взаимодействуют. Мембрана C была впервые исследована с помощью E-cadherin для подтверждения эффективности IP (верхняя панель). Затем мембрану последовательно исследовали с помощью Cx43 и Claudin-7. Вестерн-блот-анализ подтвердил взаимодействие между белками. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Клеточные клетки взаимодействий через соединения необходимы для правильной функции и развития многих органов, таких как молочная железа. Исследования показали, что функциональные белки могут регулировать функцию и стабильность друг друга и активировать передачу сигнала путем соединения друг с другом в клеточной мембране 10 . Протоколы, представленные в настоящей рукописи, предоставили интересные данные о дифференцированной экспрессии, локализации и взаимодействии функциональных белков в ходе развития нормальной мышиной железы. Учитывая, что локальная локализация белка имеет решающее значение для функции белков, и поскольку они, как известно, взаимодействуют с белками лесов и многочисленными киназами 3 , co-IF и со-IP являются эффективными методами в области взаимодействия клеток-клеток. Эти методы необходимы не только для того, чтобы просвечивать необходимость взаимодействия синдромов развития молочной железы и ихРегуляции при раке молочной железы, но они также могут быть использованы в других тканях и в экспериментах с использованием клеточных линий.
Молочная железа состоит из двух основных отделений: стромы и эпителия 4 . Взрослый эпителий состоит из двух слоев клеток. В этом подходе близость потенциальных партнеров по связыванию определялась с использованием метода co-IF, и их физические взаимодействия были подтверждены с использованием со-IP. Co-IF был успешно использован другими, чтобы продемонстрировать совместную локализацию белков в одной и той же ткани, структуре, клетке или внутриклеточном отделении 17 , 18 . Основным преимуществом этого метода является визуальная информация, которая приводит к клеточной или субклеточной локализации каждого белка в разных типах клеток, составляющих ткань. Хотя этот метод довольно прост, необходимо соблюдать некоторые рекомендации. Например, чтобы избежать повреждения тканей,Всегда добавляйте решения по одной капле за раз, используя пипетку 200 мкл или переносную пипетку. Это позволит погружать поверхность ткани, не повреждая ткани. Аналогичным образом удалите растворы, используя пипетку Пастера, расположенную рядом с тканями, осторожно наклоняя слайд. Более того, для антител, в хранилище которых содержится глицерин, требуется осторожное всасывание буферов для стирки для уменьшения фона. Более того, присутствие молочных белков, таких как казеины, во время лактации может влиять на антитела путем их улавливания, что приводит к ложным срабатываниям. Таким образом, необходим критический анализ полученного изображения, особенно на данном этапе.
Этот метод co-IF также имеет определенные ограничения или подводные камни. Во-первых, для этого требуются специфические антитела. Как упоминалось ранее (шаг 1.1), рекомендуется использовать одну секцию ( то есть правую сторону) на каждом слайде для окрашивания, следуя описанным выше шагам, добавляяПервичных и вторичных антител. Для оставшейся части ( то есть левой), выполните ту же процедуру, используя TBS-полисорбат 20 0,1% вместо первичных растворов антител. Хотя также возможно и даже лучше проверить специфическое связывание антитела с использованием конкуренции пептидов, пептиды, используемые для генерирования коммерческих антител, не всегда доступны. Таким образом, важно проверить специфичность связывания с использованием положительного и отрицательного контроля ( т. Е. Тканей или клеток, которые, как известно, выражают или не представляют интересующий белок). Более того, сайты фиксации антигена могут быть недоступны, особенно для фиксированных формалином тканей, что приводит к отсутствию определенного сигнала. Таким образом, для некоторых тканей может потребоваться процедура поиска антигена. Короткая инкубация с моющим средством также может быть выполнена до антиген-поиска для проницаемости клеточной мембраны. Во-вторых, для мультиплексирования необходимо вырабатывать антитела у разных животных.Например, если на стадии 1.2.6 использовали кролик, на этапе 1.2.10 можно было выбрать антимышу, но не другое антитело, выращенное у кролика. Поскольку большинство коммерческих антител вырабатываются у кроликов, мышей или коз, иногда трудно или даже невозможно нацеливать два белка одновременно из-за отсутствия соответствующих антител. Чтобы преодолеть эти ограничения, можно либо купить коммерчески доступные, предварительно маркированные антитела, либо маркировать первичные антитела флуорофорами, используя коммерчески доступные наборы. В-третьих, еще один недостаток связан с возбуждением и выбросом различных флуорофоров. Чтобы избежать перекрытия сигналов от двух разных антител, должен быть разделен спектр излучения возбуждения каждого флуорофора. Таким образом, количество целей, которые могут быть проанализированы сразу, будет варьироваться в зависимости от конфигурации доступного микроскопа. Наконец, качество анализа сильно зависит от используемого микроскопа. Более подробные и точные данные могутМожно получить с помощью конфокального микроскопа по сравнению с эпифлуоресцентным микроскопом. Использование микроскопии с высоким разрешением может еще более подробно выявить совместную локализацию белка.
Хотя co-IF дает важные сведения о близости потенциальных партнеров по связыванию, он должен дополняться другими методами идентификации физических взаимодействий между белками. Среди доступных методов co-IP, вероятно, является одним из самых доступных для выполнения, поскольку оборудование и материал легко доступны. Используя антитело, связанное с магнитными шариками, можно выделить белковые комплексы и идентифицировать компоненты, присутствующие в этом комплексе, с использованием типичного Вестерн-блот-анализа. Как и в случае со-IF, для наилучшей практики следует придерживаться некоторых рекомендаций. Например, рекомендуется минимизировать образцы при гомогенизации тканей, чтобы сократить время между этапами 2.1.5 и 2.1.9. В то время как опытный человек может обрабатывать до 10 образцов наIme, новичок не должен обрабатывать более 4-6 выборок. Аналогично, количество трубок должно быть ограничено при первом выполнении протокола IP. Рекомендуется начать с отрицательного контроля ( т.е. IgG) и положительного контроля ( т. Е. Ткани, которая , как известно, содержит белок, подлежащий иммунопреципитации). Второе исследование должно быть посвящено оптимизации (см. Шаг 2.2.2). Как только эти шаги дают удовлетворительные результаты, анализируемые образцы могут быть обработаны. Обратите внимание, что отрицательный контроль всегда должен быть включен в процедуру.
Эта технология со-IP также имеет потенциальные проблемы. Во-первых, он требует гомогенизации тканей в условиях, обеспечивающих сохранение связей между белками. Для мембранных белков, таких как соединительные белки, также важно использовать буфер, который сохранит связи между белками, а также позволит их растворимость. Во-вторых, подобно ко-IF, для этого требуются высокоаффинные антителаКак для целевого белка, так и для партнеров по связыванию. Более того, поскольку белки остаются в их третичной конформации, а белковые комплексы не диссоциируют путем гомогенизации, если антитело распознает часть целевого белка, которая находится в непосредственной близости от связывающего домена партнера или которая скрыта внутри нативной структуры белка , IP может быть скомпрометирован. Поэтому важно всегда проверять эффективность IP с использованием Вестерн-блоттинга, прежде чем заключить отсутствие партнера-связующего. В-третьих, со-IP может генерировать ложноположительные результаты из-за того, что белок либо связывается непосредственно с шариками, либо осаждается во время процедуры, не входя в комплекс. Чтобы идентифицировать эти артефакты, требуется контроль IgG, а также обратный IP, как описано в представленных методах. Также можно добавить процедуру «предварительной очистки» между этапами 2.2.2 и 2.2.3, чтобы избежать неспецифического связывания белков с шариками. Для этого инкубируйтеE лизаты с 50 мкг шариков в течение 1 часа при 4 ° C на роликовом смесителе. Удалите бусины с магнитной подставкой и перейдите к шагу 2.2.3. В-четвертых, тяжелые и легкие цепи IgG могут быть того же размера, что и представляющие интерес белки или связывающий партнер, тем самым маскируя сигнал. Одним из решений является диссоциация цепей IgG глицином, как описано в этой рукописи. Также возможно приобрести вторичные антитела, которые только распознают нативные антитела и, следовательно, не связываются с денатурированными легкими и тяжелыми цепями, загружаемыми в мембрану (см. Таблицу материалов ). Иногда эти два метода могут быть объединены. В-пятых, со-IP позволяет идентифицировать ограниченное число партнеров по связыванию, частично из-за количества антител, которые могут быть исследованы на мембране. Он также требует предварительной идентификации этих обязательных партнеров, либо путем со-IF, либо посредством обзора литературы. Наконец, co-IP позволяет идентифицировать белки presВ комплексе, а не для прямого взаимодействия между двумя белками.
Результаты со-IP могут быть проанализированы по-разному. Можно только идентифицировать взаимодействующих партнеров путем повторного зондирования той же самой мембраны с различными антителами, как описано в этой рукописи. Можно также количественно оценить это взаимодействие. Для этого количество иммунопреципитированного белка сначала определяют количественно путем зондирования мембраны антителом против этого белка. Интенсивность сигнала анализируется с использованием программного обеспечения для обработки изображений, как описано в этой рукописи. Затем мембрану повторно зондируют антителом против связывающего партнера, и интенсивность сигнала также определяется количественно. Взаимодействие между двумя белками может быть затем выражено как отношение количества связывающего партнера к количеству иммунопреципитированного белка. Однако, чтобы обеспечить сравнение, разные образцы должны обрабатываться одновременно и загружаться на одну и ту же мембрану. БиологАналогичные результаты можно проводить и анализировать, и статистический анализ может быть выполнен.
В последние несколько лет были разработаны другие методы анализа ИЦП. Например, FRET позволяет идентифицировать взаимодействующие белки посредством переноса энергии из одного тега в другой, только когда белки достаточно близки для взаимодействия 20 . Однако, поскольку он требует, чтобы метки были помечены, этот метод не может быть использован в тканях. Аналогичным образом, можно идентифицировать ИЦП, используя белок, слитый с бактериальной биотин-лигазой, BirA 21 . Эта лигаза добавит биотин к белкам, которые находятся в непосредственной близости ( т.е. взаимодействуют) с химерным белком. Хотя этот метод новаторский и беспристрастный, он не может быть выполнен в тканях. Альтернативно, PLA может использоваться в тканях. Подобно co-IF, этот анализ основан на сродстве к антителу. Для этого анализа вторичные антитела помечены последовательностями ДНК thaT могут взаимодействовать, когда они находятся в непосредственной близости ( т. Е. При ИЦП), и образуют круговую молекулу 22 ДНК. Затем эту круговую молекулу ДНК амплифицируют и детектируют с использованием флуоресцентно меченных комплементарных олигонуклеотидов. Хотя этот анализ является изящным, он требует много шагов валидации и по-прежнему зависит от первичной близости антител и некоторых знаний о потенциальных взаимодействующих партнерах. Наконец, была разработана объективная альтернатива традиционному анализу ИС для идентификации ИЦП. При быстрой иммунопреципитации-масс-спектрометрии анализов эндогенного белка (RIME) образцы IP анализируют с помощью масс-спектрометрии (IP / MS) 23, а не вестерн-блот-анализа. Основным преимуществом этого метода с высокой пропускной способностью является то, что он обеспечивает массивную информацию обо всех эндогенных взаимодействующих белках с использованием нескольких материалов. Однако он требует доступа к инструменту 23 секвенирования пептидов.
этоВажно отметить, что после нескольких предварительных испытаний каждый шаг этого протокола был оптимизирован для молочной железы. Тем не менее, этот метод, безусловно, может быть использован для других органов после нескольких модификаций. Для co-IF оптимальная температура для секреции молочной железы, подходящая блокировка, промывка и растворы и правильные концентрации антител были протестированы. Для со-IP были также протестированы различные буферы для лизиса и элюции и методы экстракции, которые оказывают большое влияние на успех IP. В целом, каждый шаг этого протокола важен для получения высококачественных и воспроизводимых результатов с наименьшим возможным фоном и самой спецификой. В то время как доступны другие методы, co-IF, за которым следует со-IP, остаются действительными и простыми методами для оценки ИЦП. Эти два метода могут использоваться как в тканях, так и в клеточных линиях и требуют лишь нескольких этапов проверки и контроля.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего объявлять.
Acknowledgments
ИС финансируется Советом по научным исследованиям в области естественных наук и инженерных исследований Канады (NSERC # 418233-2012); Fonds de Recherche du Québec-Santé (FRQS), карьера в области рака молочной железы в Квебеке и грант Лидера на получение гранта Канадского фонда поддержки инноваций. ED получил стипендию от Universidire Fandation Armand-Frappier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice strain and stage | St. Constant, Quebec, Canada | C57BL/6 Femals; pregnancy day 18 (P18) and lactation day 14 (L14), Charles River Canada | |
| PBS 10x (stock) | 1) Dissolve 80 g NaCl (F.W.: 58.44), 2 g KCl (F.W. 74.55), 26.8 g Na2HPO4·7H2O (F.W. 268.07) and 2.4 g KH2PO4 (F.W.:136.09) in 800 mL distilled water; 2) Adjust the PH to 7.4; 3) Add water to reach to the 1 L final volume. |
||
| TBS 10x (stock) | 1) Dissolve 60.5 g TRIS, 87.6 g NaCl in 800 mL distilled water; 2) Adjust the pH to 7.5; 3) Add water to reach to the 1 L final volume. |
||
| Part 1: Immunofluorescence | |||
| Freezing media | VWR International, Ville Mont-Royal, QC, Canada | 95067-840 | VMR frozen sections compound |
| Microtome | Mississauga, ON, Canada | 956640 | Microm HM525, Thermo fisher scientific HM525 NX Cryostat 115 V 60 Hz |
| Blades | C.L. Sturkey, Inc. Les Produits Scientifiques ESBE St-Laurent, QC, Canada | BLM1001C | High profile gold coated blades |
| Pap pen | Cedarlane, Burlington, ON, Canada | 8899 | Super PAP Pen, Thermo fisher scientific |
| Microscopic slides | Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada | 12-550-15 | Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides |
| Formaldehyde | BioShop Canada Inc, Burlington, ON, Canada | FOR201.1 | Forlmadehyde |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA | ||
| Blocking solution | 3% BSA in TBS | ||
| Wash solution | TBS-Tween 20 0.1% | ||
| Polysorbate 20 | Oakville, ON, Canada | P 9416 | Tween 20, Sigma-Aldrich |
| Mounting media | Cedarlane, Burlington, ON | 17984-25(EM) | Fluoromount-G |
| First & secondary antibodies | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | See Comments | E-Cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) 1/50 (Cell Signaling) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 555 (#4409s), Cell Signaling |
| First & secondary antibodies | Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USA | See Comments | Claudin-7 (#34-9100) 1/100 (Life Technologies) with anti-rabbit IgG Fab2 Alexa Fluor 488 (#4412s) (Cell Signaling) |
| First & secondary antibodies | Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA; Fischer Scientific, Burlington, ON, Canada | See Comments | β-Catenin Antibody (C-18): sc-1496 (SANTA CRUZ) with anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 (#A11057), Molecular Probe (Fisher Scientific) |
| First & secondary antibodies | Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USA | See Comments | Connexin26 (#33-5800) 1/75 (Life Technologies) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 647 (#4410s) |
| Nuclei stain | Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada | D1306 | DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) 1/1,000 in PBS |
| Fluorescent microscope | Nikon Canada, Mississauga, On, Canada | Nikon A1R+ confocal microscopic laser equipped with a spectral detector | |
| Software of IF images analysis | Nikon Canada, Mississauga, On, Canada | NIS-elements software (version 4) | |
| Part 2: Immunoprecipitation | |||
| Triple-detergent Lysis buffer (100 mL) pH=8.0 | 1) Mix 50 mM TRIS (F.W.: 121.14), 150 mM NaCl (F.W.: 58.44), 0.02% Sodium Azide, 0.1% SDS, 1% NONIdET P40, 0.5% Sodium Deoxycholate in 80 mL distilled H2O. 2) Adjust the pH to 8.0 with HCl 6 N (~0.5 mL). 3) Adjust the volume to 100 mL. Keep it in fridge. At the day of protein extraction, use 1/100 NaVo3, 1/100 protease/phosphatase inhibitor and 1/25 NAF in calculated amount of Triple detergent lysis buffer: Sodium Fluoride (stock) solution 1.25 M (F.W.: 41.98), Sodium Orthovanadate (stock) Solution 1 M (F.W.: 183.9) |
||
| Protease/phosphatase inhibitor | Fisher Scientific, Burlington, ON | 78441 | Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100x) |
| Protein dosage | Thermo Scientific, Rockford, Illinois, USA | 23225 | Pierce BCA protein assay kit |
| Tissue grinder | Fisher Scientific, Burlington, ON | FTH-115 | Power 125, Model FTH-115 |
| Magnetic beads and stand | Millipore, Etobicoke, ON, Canada | PureProteome Protein G Magnetic Bead System (LSKMAGG02) | |
| Wash solution for IP | PBS or PBS-Tween20 0.1% depending to the step | ||
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | See Comments | IgG Rabbit (rabbit (DA1E) mAb IgG Isotype control (#3900s) (Cell Signaling) 0.5 µL/200 µL |
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | See Comments | IgG Mouse mouse (G3A1) mAb IgG Isotype control (#5415s) (Cell Signaling) 0.5 µL/200 µL |
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada | See Comments | Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 4 µL/200 µL |
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | See Comments | E-cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) (Cell Signaling) 1 µL/200 µL |
| Laemmli buffer | BIO-RAD, Mississauga, Ontario, Canada | 1610747 | 4x Laemmli Sample Buffer (Add β-mercaptoethanol following manufacturer recommendation) |
| Acidic glycine | Fisher Scientific, Burlington, ON | PB381-5 | 0.2 M glycine; adjust pH=2.5 with HCl |
| Tris | Fisher Scientific, Burlington, ON | BP152-1 | 1 M (pH=8) |
| SDS-PAGE acrylamide gels | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1610180 -5 | TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Solutionss (7.8%, 10%, 12%) |
| Running buffer 10x | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1704272 | Tris 30.3 g/glycine 144.1 g /SDS 10 g in 1 L distilled water |
| Membranes | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1704272 | PVDF membranes, Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit |
| Transfer method | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1704155 | Trans-Blot Turbo Transfer System |
| Dry Milk | Smucker Food of Canada Co, Markham, ON, Canada | Fat Free Instant Skim Milk Powder, Carnation | |
| Blocking solution for blots | 5% dry milk in TBS-Tween 20 0.1% | ||
| Washing solutions for blots | TBS-Tween 20 0.1% | ||
| Primary and secondary antibodies for blots (10 mL) | Sigma-Aldrich, Oakville, Ontario & Abcam, Toronto, ON, Canada | See Comments | Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 1/2,500 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Primary and secondary antibodies for blots (10 mL) | Cell Signaling, Beverly, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada | See Comments | E-cadherin (24E10) rabbit mAb 1/1,000 (#3195s) (Cell Signaling) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Primary and secondary antibodies for blots (10 mL) | Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada | See Comments | Claudin-7 (#34-9100) (Life technologies) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Primary and secondary antibodies for blots (10 mL) | Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada | See Comments | Claudin3 (#34-1700) (Life technologies) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Luminol solution for signal detection on blots | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1705061 | Clarity Western ECL Blotting Substrate |
| Imaging blots | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1708280 | ChemiDoc MP imaging system |
| Analayzing blots | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | ImageLab 5.2 software | |
References
- Sternlicht, M. D. Key stages in mammary gland development: the cues that regulate ductal branching morphogenesis. Breast Cancer Res. 8 (1), 201 (2006).
- Oakes, S. R., Hilton, H. N., Ormandy, C. J. The alveolar switch: coordinating the proliferative cues and cell fate decisions that drive the formation of lobuloalveoli from ductal epithelium. Breast Cancer Res. 8 (2), 207 (2006).
- Stein, T., Hilton, H. N., Ormandy, C. J. The alveolar switch: coordinating the proliferative cues and cell fate decisions that drive the formation of lobuloalveoli from ductal epithelium. Breast Cancer Res. 8 (2), 207 (2006).
- El-Sabban, M. E., Abi-Mosleh, L. F., Talhouk, R. S. Developmental regulation of gap junctions and their role in mammary epithelial cell differentiation. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 8 (4), 463-473 (2003).
- Hennighausen, L., Robinson, G. W. Information networks in the mammary gland. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (9), 715-725 (2005).
- Gudjonsson, T., Adriance, M. C., Sternlicht, M. D., Petersen, O. W., Bissell, M. J. Myoepithelial cells: their origin and function in breast morphogenesis and neoplasia. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 10 (3), 261-272 (2005).
- Nguyen, D. A., Neville, M. C. Tight junction regulation in the mammary gland. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 3 (3), 233-246 (1998).
- Stewart, M. K., Simek, J., Laird, D. W. Insights into the role of connexins in mammary gland morphogenesis and function. Reproduction. 149 (6), R279-R290 (2015).
- Dianati, E., Poiraud, J., Weber-Ouellette, A., Connexins Plante, I., E-cadherin, Claudin-7 and beta-catenin transiently form junctional nexuses during the post-natal mammary gland development. Dev Biol. 416 (1), 52-68 (2016).
- Derangeon, M., Spray, D. C., Bourmeyster, N., Sarrouilhe, D., Herve, J. C. Reciprocal influence of connexins and apical junction proteins on their expressions and functions. Biochim Biophys Acta. 1788 (4), 768-778 (2009).
- Hernandez-Blazquez, F. J., Joazeiro, P. P., Omori, Y., Yamasaki, H. Control of intracellular movement of connexins by E-cadherin in murine skin papilloma cells. Exp Cell Res. 270 (2), 235-247 (2001).
- Kiyokawa, E., Hara, S., Nakamura, T., Matsuda, M. Fluorescence (Forster) resonance energy transfer imaging of oncogene activity in living cells. Cancer Sci. 97 (1), 8-15 (2006).
- Gustafsdottir, S. M., et al. Proximity ligation assays for sensitive and specific protein analyses. Anal Biochem. 345 (1), 2-9 (2005).
- Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of mammary gland development and function in mouse models. J Vis Exp. (53), (2011).
- Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. , 4th ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
- Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A defined methodology for reliable quantification of Western blot data. Mol Biotechnol. 55 (3), 217-226 (2013).
- Oxford, E. M., et al. Molecular composition of the intercalated disc in a spontaneous canine animal model of arrhythmogenic right ventricular dysplasia/cardiomyopathy. Heart Rhythm. 4 (9), 1196-1205 (2007).
- Wang, X., Li, S. Protein mislocalization: mechanisms, functions and clinical applications in cancer. Biochim Biophys Acta. 1846 (1), 13-25 (2014).
- Bertocchi, C., et al. Nanoscale architecture of cadherin-based cell adhesions. Nat Cell Biol. 19 (1), 28-37 (2017).
- Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs. Sensors (Basel). 16 (9), (2016).
- Fredriksson, K., et al. Proteomic analysis of proteins surrounding occludin and claudin-4 reveals their proximity to signaling and trafficking networks. PLoS One. 10 (3), e0117074 (2015).
- Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Rev Proteomics. 7 (3), 401-409 (2010).
- Malovannaya, A., et al. Streamlined analysis schema for high-throughput identification of endogenous protein complexes. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (6), 2431-2436 (2010).
