Summary
我们开发了一种成功去除，处理，切片和染色的方法，用于组织病理学评估，原始固定在载玻片上的乳腺组织作为整体。这种方法可以促进生殖发育试验指南研究中乳腺整体的收集和评估。
Abstract
正常的乳腺发育可能因暴露于环境有毒物质和药物产品，过度暴露于激素和遗传改变而改变。乳腺全身是一种廉价的方法来捕获暴露后可能出现的形态变化的进展。然而，在后来的生活中，当异常更容易发展时，仅依靠这一种方法可能不总是提供足够的信息来正确诊断异常。历史上，在化学测试指南研究中，在尸检时除去单个乳腺，并制备为苏木精和伊红（H＆E）染色部分。对侧乳腺整体收集和分析的并入减少了假阴性评估的可能性。整个安装座的评估受到幻灯片上一个或两个整个乳腺的存在的限制，在某些情况下，在整个安装座上观察到的异常不是在H＆E部分统一表示。这项研究的目的是制定一个方案，将覆盖乳房的整体安装转换为H＆E染色部分，以便可以识别否则将被遗漏或难以诊断的病变。在这里，我们详细介绍了一种从最初准备为整体的乳腺产生高品质，石蜡包埋的H＆E切片的方法。与有意为H＆E切片制备的组织相比，整个安装件需要额外的组织去除和加工准备。然而，这种方法被认为是便宜的，因为它需要常见的实验室试剂和少量额外的时间。因此，这种方法可以提供关于化学和环境暴露如何改变正常乳腺发育以及显示由于遗传修饰而发生的变化的宝贵信息。
Introduction
乳腺整体是一种有用和便宜的方法，在许多老鼠和小鼠研究中实现，以了解正常和化学诱导的异常发育。通常，在啮齿动物发育（ 即青春期，青春期，中期至晚期妊娠和退行期）各个阶段收集的乳腺将显示受旁分泌，内分泌和自分泌因素影响的组织和细胞结构的形态学变化1 。在衰老大鼠中，腺体的上皮和间质部分变得越来越致密，这使得测量形态参数在整体上难以测量。因此，通常的做法是收集用于组织学评估的腺体以鉴别微观水平上的变化。这两种方法在涉及化学暴露（ 即环境或药物）的研究中尤其有用，或者检查伴随遗传改变的形态学变化ations。
使用乳腺进行风险评估的技术和能力不断发展。虽然整个贴装制备是常规的和标准的，修改切片继续2,3。来自不同背景（ 即学术界，政府和行业）的许多研究小组已经将乳腺组织的冠状/纵向切片作为首选方法，而一些实验室仍然使用通过皮肤的横切部分4 。后一种方法导致表皮（皮肤）的过分表示，而不是感兴趣的组织：乳腺上皮2 。冠状或纵向切片对于表征正常组织5更有用，并且由于增加的表面积和存在的结构数量而大大改善了异常和损伤的检测。总的来说，这使整个人对于乳腺1，2的比较组织病理学评估UNT的合适方法。强制推荐使用小鼠或大鼠，检索和保存第4和第 5 个腹股沟腺体，以便将整个安全架与对侧H＆E部分进行比较。
当组合使用时，H＆E部分和整个安装座提供了由环境暴露引起的细胞和形态变化的准确描述。在特定的啮齿动物菌株中尤其如此，其中模型对肿瘤形成的敏感性低或肿瘤不是很明显。在某些情况下，使用两种技术（ 即，组织数量不足，资源不足或意外的实验结果）获得所需的组织可能并不总是可能的。在我们的情况下，在乳房整体上观察到异常，而组织病理学对侧H＆E腺的合理发现主要是正常的。对侧腺体之间的压倒性差异导致我们开发了一种经济有效的方法来识别整体的异常。使用改进的加工和嵌入程序，从石蜡包埋的整体安装中制备高质量的H＆E染色切片。我们设想这个协议成为化学暴露效应的强大的检测工具，增强了实验室间的比较。
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Protocol
本研究的所有动物使用和手术均由NIEHS实验动物批准
护理和使用委员会，并在一个评估和认证协会进行
实验动物护理认证设施。
1.乳腺全安装制备例2，3，6，7
- 如参考文献3所述，从非怀孕的CD-1雌性小鼠的一侧取下腹股沟乳腺，并将它们放在带静电的载玻片上。
- 用不粘纸或胶片覆盖腺体，并在上面放置另一张幻灯片。向载玻片增加压力（ 即水重量）以将腺体平放，使腺体粘附到载玻片上进行固定。
- 将载玻片浸入固定剂（ 例如， 100％乙醇，氯仿和6:3:1比例的冰醋酸）室温过夜。
- 从固定剂中取出腺体，并在乙醇中洗涤15-30分钟。 30分钟洗涤后，倒出1/3的乙醇并加水，逐渐变成水。让洗澡每次静坐约5分钟，重复加水3次。
- 染色（ 如胭脂红明矾溶液）12-24小时。
注意：较厚的组织需要较长的染色时间。染色细节参见参考3 。 - 在分配时间后倒出污渍，并在水中冲洗30秒。通过在70％乙醇中洗涤载玻片15分钟使组织脱水，然后在95％乙醇中洗涤15分钟，最后在100％乙醇中洗涤20分钟。
- 通过将组织中的脂肪置于二甲苯中至少24小时或更长时间，如果组织较厚，则可清除组织中的脂肪，以便去除任何不透明或白色区域。
- 从二甲苯中取出组织，快速加入将unting培养液置于载玻片上避免组织脱水;在上面放置盖玻片。让载玻片干燥至少48小时。
- 评估整体组织的异常情况，如2所述 。
注意：当整体检测到病变时，切片需要确定其身份，应遵循以下步骤。
2.从玻璃片中去除乳房整体
- 将乳化整体载玻片浸入装满二甲苯的玻璃染色瓶中，将盖玻片和固定介质置于一个晚上。
注意：使用过度安装溶液的较厚组织和载玻片可能需要额外的时间才能清除盖玻片。 - 在初始过夜浸泡后，将载玻片置于新鲜的二甲苯中并浸泡6小时。在新鲜的二甲苯中一次最后浸泡过夜。
注意：最后一次浸泡后，盖玻片将很容易脱落。 - 用ag亲手握住幻灯片，并用一对镊子小心地取出盖玻片，以确保其一体移除。
注意：如果盖玻片仍然连接到玻璃滑块上，请继续浸泡，直至能够轻松移除。 - 一旦盖玻片被取出，将载玻片垂直地夹在含有二甲苯的玻璃培养皿中，小心地取出锋利的一次性剃刀刀片，并沿着幻灯片一次滑动刀片。
- 一旦组织被移除，迅速将乳房浸入二甲苯填充的玻璃培养皿中，以确保组织不会空气干燥。
注意：注意这一步。整个安装件薄（≤1mm），二甲苯加工易碎。任何印象或眼泪可能会改变组织的形态，并使后续评估复杂化。
3.组织加工
- 一旦组织在培养皿中，仔细转移到标记的组织学盒。用钝头，锯齿状的镊子抓住脂肪垫的边缘，以尽量减少组织损伤。
- 使用剃须刀将较大的组织（特别是大鼠）切成两半，并将它们放在两个分开的标签盒中，以适应组织尺寸。将组织右侧放置（使用淋巴结作为参考）。确保没有淋巴结的组织在转移到盒中时保持在相同的直立位置。
- 将纸盒放入二甲苯容器中长达2小时，然后将其放入组织处理器中。
注意：建议在样品放入盒子的同一天处理样品。在二甲苯中的延长浸泡未经测试。 - 用手将最大数量的纸盒装入纸巾处理器。
- 在开始之前，将将用于此过程的所有试剂编入处理器的试剂列表。自动运动从一个站点到另一个站点，使用菜单选项并创建一个新的程序。所有步骤完成后，选择“确定”继续。
注意：处理器将允许在启动之前检查所有工作站的详细信息。- 使处理器自动化，使其在二甲苯中在37℃下浸泡30分钟，然后在相同条件下在新鲜二甲苯中第二次浸泡。使处理器自动化以从二甲苯溶液中取出盒，并将组织转移到设置在60℃下的含有1:1二甲苯：熔融石蜡混合物的下一个工作站30分钟。
注意：处理器然后将盒子转移到含有熔融石蜡的新室中1小时。 1小时后，样品将自动转移到新的熔融石蜡室，并再加工2小时。两个步骤在60℃下进行。 - 然后处理器将盒子转移到含有熔融对位的工位ffin 1小时。然后，将样品自动转移到新鲜熔融石蜡的最终工位并再加工2小时。两个步骤在60℃下进行。
- 使处理器自动化，使其在二甲苯中在37℃下浸泡30分钟，然后在相同条件下在新鲜二甲苯中第二次浸泡。使处理器自动化以从二甲苯溶液中取出盒，并将组织转移到设置在60℃下的含有1:1二甲苯：熔融石蜡混合物的下一个工作站30分钟。
4.包埋加工的乳腺组织
- 将盒子放入嵌入站的58°C石蜡容器中，直到准备将组织嵌入模具中。
- 取下盒盖确定组织的最佳模具尺寸。确保模具足够大以容纳组织，并留下足够的空间以在周边具有石蜡的无组织边界。
- 向模具中加入3-4毫米的熔融石蜡，并将乳化的整体安装表面定向到与玻璃底部和药盒底部相对的模具中。
- 将模具转移到冷却板上，并根据需要快速调整组织，使其平行于模具bottom。
注意：一旦石蜡硬化，组织将被置于适当位置。 - 使用暖镊子，将带标签的下半部分放在模具顶部;用镊子牢牢地按住。
- 将额外的熔融石蜡以连续的运动方式添加到模具中以覆盖整个盒。将模具从暖板移动到冷板，以完成块体的硬化。
- 当石蜡完全固化以避免裂纹或气泡时，从模具中取出块体。
注意：将石蜡包埋的组织在室温下储存，直到准备好。
5.在切片机上切片石蜡包埋的乳腺组织
- 在切片前，将石蜡块在-20℃孵育1小时。
注意：从原来盖玻片的全贴纸组件中的块中将有残留的固定介质。冷却块改进块截面和色带。 - 准备麦克风通过打开水浴，包含新鲜的蒸馏水，并将温度调节至42-45℃。将新鲜的，低调的刀片放置在切片机上，并将其设置为4μm。
注意：由于在组织中存在残留的固定介质，部分质量会减少，厚度大于4μm。 - 将块插入切片机，蜡面朝向刀片并与垂直平面对齐。然后，在冷水中润湿一段纱布垫，并将其放在块上几分钟。
- 通过与粗轮廓轮组合，以顺时针方向转动大轮，直到获得全面或代表性块的块来切块。
注意：由于在整个安装过程中二甲苯清除，组织很薄。将刀片正确对准刀片，以最大限度地减少获得代表部件的切割次数。 - 挑丝带小心地将色带漂浮在温暖（45°C）的水浴（预先准备）中，使组织皱纹消散，并将部分小心地漂浮在干净的玻璃片上。
- 将幻灯片放在干燥架上，以清除多余的水分。在37℃下将载玻片在稍微打开的载玻片盒中孵育过夜。
6.分切乳房组织的自动和手动H＆E染色
- 在染色之前，将载玻片在室温下储存。
- 对于自动染色，请从主菜单上的染色选项中选择H＆E。脱蜡，染色和脱水都在自动染色机上完成。使用安装介质和盖玻片安装这些部分。
- 如果手工染色载玻片，则将载玻片浸入二甲苯中5分钟，使切片脱蜡。转移到新鲜的二甲苯并重复5分钟。
- 通过浸没来补充幻灯片在100％乙醇中分两次，每次3分钟，然后在新鲜的95％乙醇中重复两次，并在1X洗涤缓冲液中分别洗涤两次，每次5分钟。
- 用蒸馏水冲洗载玻片。
- 将载玻片加入苏木精1-2分钟。取出载玻片并用自来水冲洗5分钟。
注意：在每次使用前过滤苏木精。 - 将载玻片置于1％冰醋酸中30秒以促进颜色分化，然后在自来水中冲洗1分钟。
- 将幻灯片添加到1X PBS 30秒至1分钟以蓝色组织切片，然后在自来水中冲洗5分钟，然后在95％酒精中冲洗15-20秒。
- 用曙红溶液复染30秒至1分钟。然后，将其在新鲜的95％乙醇中脱水两次，然后在100％乙醇中进行两次重复。进行每次洗涤5分钟。
- 在二甲苯中清除载玻片，每次二甲苯变化5分钟。
- 盖玻片组织部分与安装介质在室温干燥过夜。
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Representative Results
如果乳房的原始对侧H＆E部分没有显示任何组织学变化，则该方法有助于协助可能会错过的诊断。然而，如果在初始整体准备过程中以及在组织学评估的组织准备过程中要注意，结果将是有用的。石蜡包埋将提供保护，并有助于保留组织以供将来切片。
为了确定乳房组织的理想厚度，制备了4μm和6μm的切片。我们测试了在切片机上大于±1μm误差范围的深度。 6μm厚度的切片（ 图1A ）非常致密，具有紧密的细胞。总的来说，幻灯片缺少明确的细节细节，这将是必要的，以便做出正确的识别ication。最佳厚度为4μm（ 图1B ）。这些组织提供了最好的结果，其中容易区分上皮和基质区域和相应的细胞类型。
来自大型正在进行的研究的幻灯片被用来说明这种方法的简便性和实用性。在几种情况下，与来自同一动物的对侧乳腺整体相比，14个月大的原始女性CD-1后代的原始H＆E部分被发现具有矛盾的发现。病变在整体上明显，但无法进一步分割和染色。选择两种不同动物的样品作为代表性病例。在两种情况下，使用单个部分进行染色，但是进行几次切割直到得到代表性部分。由于以前的全部准备清理了，所以很少需要削减代码st的脂肪垫，离开腺体非常薄，相比于最初准备石蜡包埋的乳腺，其被厚的脂肪垫包围。 图2A 和 图 3A示出了被评估为正常腺体的组织学切片。两个腺体都显示导管结构，由强壮和均匀的富含脂肪细胞的群体包围。每个管道由一层简单的立方体上皮细胞排列，并由主要由肌上皮细胞组成的第二层基底细胞保持，但也包含茎和祖细胞群体。代表对侧整体安装（ 图2B和图 3B ）显示了不透明度增加的导管和基质。然而，难以确定不透明度是否与增生，炎症或肿瘤改变的结果是一致的具有可以提供不同细胞细节的H＆E部分。
使用相同动物的对侧整体实施本文所述的方法，可以在图 2C和D以及图3C 和D中观察到。 图2 C＆D中的样品被诊断为血管周围炎症，这是由于存在于乳腺部分大血管周围的淋巴细胞数量增加。对于第二种情况，乳腺小叶结构保持不变，但由于正常肺泡和管道（肺泡增生）的数量和大小增加，多发性扩大。肺泡上皮细胞分化良好，圆形，经常空泡化，并在通常含有蛋白质液体的内腔周围形成一个同心层。德ts被柱状细胞排列，与肺泡细胞相似，形成一个同心层的分化良好的上皮细胞。这种表型最常见于怀孕中期的小鼠和大鼠的乳腺。这不应该与成年雄性大鼠乳腺中的肺泡结构混淆8 。在成年男性乳腺中，肺泡突出，导管不频繁，但肺泡和管道由分层上皮排列，具有高空泡的立方形至短柱状上皮细胞。
图1 ： 鼠标乳腺全套安装到H＆E部分的推荐厚度 。 A）6μm，B）4μm。乳腺结构的分辨率对于组织病理学评估并不是最佳的，使用较厚的（6 - ＆＃181; m）部分，因此建议使用4μm部分。这个数字已经从Tucker 等人修改9 。 请点击此处查看此图的较大版本。
图2 ：血管周围炎症H＆E部分的整体。该图像是在发情中收集的小鼠乳腺。 A）福尔马林固定的H＆E乳腺切片，无组织病理改变。 B）对侧整体部分，不透明度增加区域（盒装区域）。 C）从乳房整体安装（盒装区域）放大20倍的H＆E部分。单核细胞簇包围血管并延伸到周围的脂肪组织。 D）Th来自乳房整体（盒装区域）的H＆E切片的40倍放大显示更多细节，大多数单核群体由淋巴细胞组成并突出显示血管周围炎症的严重程度。这个数字已经从Tucker 等人修改9 。 请点击此处查看此图的较大版本。
图3 ： 小叶肺泡增生H＆E部分整体 。该图像是在发情中收集的小鼠乳腺。 A）福尔马林固定的H＆E乳腺切片，无组织病理学改变。 B）在导管和基质区域中具有增加的不透明度的对侧整体部分（盒装一个）。 C）从乳房整体安装（盒装区域）放大20倍的H＆E部分。小叶结构保持不变，但由于正常肺泡和管道数量增多（肺泡增生），多发性扩大。 D）来自乳房整体安装（盒装区域）的H＆E部分的40倍放大显示，扩大的小叶含有更多数量的肺泡和管道，其由分化良好的，经常空泡化的上皮细胞排列，形成内含蛋白质液体。这个数字已经从Tucker 等人修改9 。 请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
乳腺整体是一个强大的工具，可用于说明暴露于化学物质（包括内分泌干扰物）后可能出现和持续的正常乳腺发育和形态学改变。当同一个动物的整个座位和H＆E部分被一起评估时，它们可以提供早期改变的准确视觉快照，这可以进入更多的疾病状态。
获得这种有用信息的能力在于确保在去除组织时要注意保持并不损害腺体形态。虽然啮齿类具有位于两侧沿背壁几个乳腺部位，建议收集4和第 5的腺体，以尽量减少肌肉组织恢复。乳头附着区域和淋巴结也应存在，因为它们作为有用的形态学标志。腺体也应该传播和伸展穿过平坦表面（ 即，玻璃片，卡片纸或布），以便在原地紧密地模拟组织的天然结构。乳腺内的异常通常是不可见的，直到腺体已经在二甲苯中脱脂或已经被胭脂红染色。不同于最初准备用于组织切片的乳腺组织，从玻璃中去除的用于石蜡包埋的整个装置将是非常薄且脆弱的。应避免镊子印痕和组织撕裂，因为它们可能会改变细胞形态，并使成品的组织病理学评估变得困难。
一旦整个支架已被石蜡包埋，在切片之前，建议使块在-20°C下孵育1小时。该步骤提高了在色带中获得最佳代表性组织切片的能力。组织切片6μm（ 图1A ） 9 图1B ） 9 ，所有细胞特征，包括上皮组织和周围基质浸润，都容易被鉴定。还应注意的是，尽管这些切片先前是胭脂红染色的，但在切片后染色不可见，并且不干扰H＆E染色。因此，协议中不需要去染色步骤。虽然组织切片仅用H＆E染色，但我们预期只要稍微修改，一旦切片完成，其他组织化学和可能的免疫组织化学染色可能适用。然而，这超出了本议定书的范围，需要进一步的调查来确定这些污渍的最佳条件。
这个程序是因为我们观察到常规收集的人之间的差异发现而开发的从同一只动物身上和对侧H＆E染色的乳腺切片。类似乳腺协议存在6，10;然而，程序不详细或易于遵循。这些方法为我们的协议的制定奠定了基础。在H＆E染色的组织切片（ 图2A 和 图3A）1中观察到正常腺形态，而互补全标本揭示了许多异常的形态特征（ 图2 B和图3 B）9。通过在整个座椅上进行组织学，我们可以对异常特征进行分类。例如，在两个不同的情况下鉴定出血管周围炎症和肺泡增生，与Th在对侧的侧面（ 图2中 C和D以及图3 C和D）观察到的ËH＆E发现9。
据作者的了解，目前还没有已知的乳腺异常报告与我们正在进行的研究中观察到的乳腺不一致。然而，这可能是由于实验设计问题而不是缺乏发生的原因，因为通常仅针对不涉及形态学的一种应用或分析（例如RT-PCR或Western印迹）收集乳腺。然而，许多实验结合了需要每个端点足量的组织的多种应用。腹股沟腺体是整个安装和下游应用的首选，因为它们很少具有像胸腺（ 即肌肉污染）的周围组织污染，并且因为腹股沟乳腺淋巴结提供了价值有效的地标定位和对比腺体。因此，决定哪一个腺体和多少腺体将用于每个应用将影响检测的精度。使用乳腺的优先级应为：1）由整个第 4和第 5 个腺体组成的整体，2）包含一些淋巴结作为标志的对侧第 4腺的组织学，以及3）下游应用（ 即 RNA，DNA和蛋白质）的对侧第 5腺（无污染淋巴结）。如果在尸体剖检时出现异常现象，整个安装位置应优先进行组织学检查。
与任何协议一样，还有一些限制;例如，需要在切片期间永久地破坏整个支架并且具有有限的组织用于替代分析。因此，我们建议使用桌面广泛地记录整个安装可以产生数字图像以供将来分析和参考。此外，如果在一个月内不会发生染色，则限制切割的切片数以保留组织，以便将来进行任何分析。 H＆E剖面方法的优点超过了限制，可以普遍适用于涉及多学科，特别是毒理学的乳腺学研究。使用具有已知的内分泌效应的化学品几项研究已经包括在本协议的修改版本，展示了其适用性11，12，13。这些研究的结果可能有助于减少化学测试中的假阴性的可能性，但也可能提供可用于监管和风险评估决策的新的或其他信息。
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Disclosures
作者与本文的研究，作者和/或出版相关的利益没有任何冲突。
Acknowledgments
作者要感谢Pam Ovwigho，Tenette Jones和NIEHS的Natasha Clayton在这个项目中的技术专长和支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| Permount | Thermo Fisher Scientific | SP15-100 | mounting media for coverslipping whole mounts and H&E sections |
| Leica automated processor | Leica Biosystems | Model # ST5020 | |
| HM 355S Automatic Microtome | Thermo Fisher Scientific | 905200 | |
| Paraffin | Leica Biosystems | EM-400 | |
| Superfrost plus microscope slides | Thermo Fisher Scientific | 4951PLUS-001 | electrostatically charged |
| Fisher Finest 24x60x1 | Thermo Fisher Scientific | 12-548-5P | coverslips |
| Varistain Gemini ES Automatic slide stainer | Thermo Fisher Scientific | A78000014 | |
| Sta-On | Leica Biosystems | 3803107 | liquid adhesive; used in water bath at sectioning |
| Modified Harris Hematoxylin 72711 | Richard-Allan Scientific (Part of Thermo Scientific) | 72711 | |
| Eosin | Leica Biosystems | 3801600 | |
| Lithium Carbonate | SkyTech Laboratories | LCQ500 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo Fisher Scientific | A38-500 | needed in Carnoy's fixative |
| Chloroform | Macron Fine Chemicals | 4440-04 | needed in Carnoy's fixative |
| 100% Ethanol | The Warner Graham Company | 6505001050000 | needed in Carnoy's fixative and washing slides |
| 95% Ethanol | The Warner Graham Company | 6505011137320190 | |
| Carmine Alum | Sigma-Aldrich | C1022-25G | |
| Aluminum potassium sulfate dodecahydrate, Sigma Ultra | Sigma-Aldrich | A7210-500G | |
| Automation wash buffer, 20X | Biocare Medical | TWB945 |
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