في المختبر فحص الإضاءة الحيوية تميز إيقاع سيركاديان في الخلايا الظهارية الثديية
Summary
ويرد في المختبر الإضاءة الحيوية فحص لتحديد إيقاع circadian الخلوية في الخلايا الظهارية الثديية. ويستخدم هذا الأسلوب خلية الثدييات مراسل والبلازميدات معربا عن زعزعة استقرار لوسيفراس الخاضعة لسيطرة المروج الجينات الفترة 2 . فإنه يمكن تكييفها لأنواع الخلايا الأخرى لتقييم التأثيرات الخاصة بالجهاز على إيقاع سيركاديان.
Abstract
إيقاع سيركاديان هو عملية فسيولوجية أساسية موجودة في جميع الكائنات الحية التي تنظم العمليات البيولوجية التي تتراوح بين التعبير الجيني النوم السلوك. في الفقاريات، يسيطر إيقاع circadian مذبذب جزيئي الذي يعمل في كل من نواة suprachiasmatic (اللجنة الفرعية للتغذية؛ ووسط تنظيم ضربات القلب) والخلايا الفردية التي تضم الأنسجة الأكثر هامشية. الأهم من ذلك، واضطراب إيقاع circadian بالتعرض للضوء في الليل، وعوامل الإجهاد البيئي و/أو سميات يرتبط مع زيادة خطر الأمراض المزمنة والشيخوخة. القدرة على تحديد العوامل التي يمكن أن تخل بالساعات البيولوجية المركزية و/أو هامشية، والعوامل التي يمكن أن تمنع أو التخفيف من آثار الاضطراب الإيقاعية، آثار كبيرة على الوقاية من الأمراض المزمنة. على الرغم من أن يمكن استخدام نماذج القوارض لتحديد التعرض والعوامل التي تحفز أو الحيلولة دون تخفيف اضطراب الإيقاعية، هذه التجارب تتطلب أعدادا كبيرة من الحيوانات. في فيفو الدراسات أيضا تتطلب موارد كبيرة، والبنية التحتية، وتتطلب الباحثين على العمل طوال الليل. وبالتالي، هناك حاجة ملحة لنظام مناسب في المختبر من نوع خلية إلى الشاشة معطلات الإيقاعية البيئية والقدرة على في أنواع الخلايا من الأجهزة المختلفة والحالات المرضية. نحن شيدت موجه الذي يقود نسخ لوسيفراس زعزعة استقرار في الخلايا حقيقية النواة تحت سيطرة المروج الفترة 2 الجينات البشرية. كان ستابلي transfected هذا بناء مراسل الإيقاعية في الخلايا الظهارية الثديية البشرية، واختيرت الإيقاعية مراسل استجابة الخلايا لتطوير التحليل الإضاءة الحيوية في المختبر . نقدم هنا، بروتوكول مفصل لإنشاء والتحقق من صحة المقايسة. ونحن كذلك تقديم تفاصيل لإثبات مفهوم التجارب مما يدل على قدرة الإنزيم لدينا في المختبر أن الخص في فيفو آثار المواد الكيميائية المختلفة على مدار الساعة البيولوجية الخلوية. وتبين النتائج أن المقايسة يمكن تكييفها لمجموعة متنوعة من أنواع الخلايا الشاشة لكل من المواد المسببة لاختلال البيئية والقدرة على تشيموبريفينتيفي من الساعات الإيقاعية.
Introduction
على مدار الساعة الإيقاعية ينظم مجموعة واسعة نطاق من العمليات البيولوجية من التعبير الدافيء للجينات النوم السلوك في إيقاع يمكن التنبؤ بها مع تواتر من حوالي 24 h. الوبائية الدراسات تشير بقوة إلى أن اضطراب مزمن الإيقاعية إيقاع يزيد من خطر سرطان الثدي وسرطان البروستاتا في التحول والعمال، بما في ذلك الممرضات وهروب الأطقم1،،من23. هذه النتائج هي تؤكدها دراسات القوارض، مما يدل على أن التعرض للضوء المستمر، دورات الضوء في الليل، أو الخفيفة التي تحاكي زيادة اضطراب حدوث الورم ويعجل بنمو الورم4،5. استناداً إلى البيانات المستمدة من الدراسات البشرية والقوارض، صنفت الوكالة الدولية لبحوث السرطان تحول العمل كمسرطن بشري محتمل (نوع 2A) في 20106.
سابقا، أثبتنا أن جرعة وحيدة مسرطنة من مسرطن محددة الأورام الثديية، N-نيتروزو-N-ميثيلوريا (نمو)، تعطلت الإيقاعية التعبير عن الجينات الإيقاعية الكبرى (CGs) (مثلاً، الفترة 2 ، Per2) ومفتاح تلف الحمض النووي استجابة عدة تسيطر عليها الإيقاعية الجينات (ككجس)، بما في ذلك وإصلاح الجينات (التسريح) في الغدة الثديية المستهدفة (ولكن ليس في الكبد). وعلاوة على ذلك، إعادة تعيين التعبير الإيقاعية الجينات Per2 والتسريح نحو العادي بنظام تشيموبريفينتيفي الغذائية لالميثيل-سيلينوسيستيني (MSC) انخفاض حالات الإصابة بالأورام بنسبة 63 في المائة. كانت هذه النتائج الأولى لإظهار ارتباط آليا بين التسرطن الكيميائية وإيقاع circadian، تشيموبريفينشن،من78. التعرض سميات البيئية الأخرى أظهرت أن تعطيل الجينات الإيقاعية التعبير في فيفو ترتبط أيضا بزيادة خطر الإصابة بالأمراض البيئية9،10. فهم الآليات التي تربط بين انقطاع الإيقاعية سميات البيئية والمرضية قد تؤدي إلى النهج القائم على ميتشانيستيكالي للوقاية من الأمراض. بيد أن الدراسات تهدف إلى تحديد التفاعلات بين التعرض وإيقاع circadian عادة ما تتم المجراة في. نموذجي في فيفو تجربة التحقيق أثر على إيقاع circadian يتطلب أعدادا كبيرة من الحيوانات، التحكم في الأنسجة من ثلاثة على الأقل، ويجب أن يكون ثلاثة من الحيوانات المعرضة التي جمعت كل ح 3-4 على مدى فترة 24 أو 48 ساعة. تطوير نظام مصادق عليه في المختبر ويجمل في فيفو الملاحظات والآليات سوف ولذلك ليس فقط تقليل عدد الحيوانات اللازمة، ولكن أيضا كبير تخفيض تكاليف التجريبية والشرط أن ويعمل هؤلاء الباحثون بشكل مستمر على مدى فترة 24-48 h. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام نظام تم التحقق من صحتها في المختبر لفحص إنتاجية عالية للمركبات و/أو التعديلات الوراثية التي تؤثر على إيقاع circadian، أو ردها لعوامل الإجهاد البيئي أو سميات. ولذلك، يلزم المزيج الاستراتيجي من تجارب ونماذج في المختبر و في فيفو الحصول على رؤى مختلفة مع تركيز مختلفة.
في الثدييات، وتوجد مؤشرات التذبذب الإيقاعية ليس فقط في الخلايا العصبية المتخصصة للجنة الفرعية للتغذية، ولكن أيضا في أنواع الخلايا الأكثر هامشية. هذه الساعات الجزيئية مماثلة لتلك التي في خطوط الخلايا ثابتة تنتجها الخلايا الليفية والخلايا الليفية الأولية من الأجنة أو الحيوانات الكبار؛ ومع ذلك، هناك حاجة للأنسجة الخلوية النماذج الخاصة بنوع11. ونتيجة لذلك، explants الدراسات التقليدية للنشاط الحركي في فيفو، العقدة السابقين فيفو، ويستند إلى الخلية في المختبر فحوصات في الخلايا مخلدة تنتجها الخلايا الليفية تستخدم على نطاق واسع لدراسة العيوب الإيقاعية خلية مستقلة. ومع ذلك، لا توجد أدلة تشير إلى أن في المختبر تنتجها الخلايا الليفية المستندة إلى خلية تحليل يمكن إيجاز آليات الإيقاعية والردود موجودة في الخلايا من سائر الأجهزة الطرفية في فيفو. أنواع مختلفة من الخلايا يمكن أن أنماط متميزة من التعبير الجيني، والتمثيل الغذائي إكسينوبيوتيك، والتسريح، والروابط بين سمية والتعبير الجيني الإيقاعية قد يكون نوع من الخلايا المحددة و/أو التضمين بمعلمات فسيولوجية مختلفة. وبالإضافة إلى ذلك، لم يتم تقييم التذبذب الإيقاعية في الأنظمة المستندة إلى تنتجها الخلايا الليفية تماما للتصدي للسموم البيئية وعوامل الإجهاد والعوامل الوقائية التي تربط بين التعرض لآليات التنمية المرض والوقاية. وبالتالي، هناك حاجة إلى السطحية، وتم التحقق من صحتها من نوع الخلية المحددة، في المختبر فحوصات الإضاءة الحيوية لدراسة الجهاز معطلات الإيقاعية بيئية محددة. على الرغم من أن لديها مجموعة متنوعة من النماذج الخلوية على مدار الساعة (مثلاً، في الكبد، والخلايا الكيراتينيه، والخلايا الدهنية، فضلا عن خط خلية osteosarcoma) وضعت في السنوات الأخيرة12،،من1314، 15، مقايسة الموصوفة هنا هو أول نموذج ساعة الخلوية في الخلايا الظهارية في الثدي، وأول مظاهرة إيجاز في فيفو الاستجابات لعوامل الإجهاد البيئي وسميات، والمخدرات، ووكلاء تشيموبريفينتيفي.
لوسيفراس رينيلا (رلوك) ولوسيفراس اليراع هي 30-61 كاتشين أحادي البروتينات التي لا تتطلب المعالجة للنشاط الأنزيمي بوستترانسلاشونال ويمكن أن يعمل كمراسل وراثية فور ترجمتها. مجرد الركيزة يربط مع الإنزيم لوسيفراس، يولد رد الفعل البيوكيميائية حفزت ومضة من الضوء. وهكذا، لوسيفراس بنيات تستخدم على نطاق واسع كالجينات التعبير مراسل النظام في المختبر و في فيفو. إلا أن دراسات إيقاع circadian، محدودة الأداة المساعدة مراسل لوسيفراس بنصف عمر طويل نسبيا من البروتين لوسيفراس (تي1/2 = ح 3.68) بالقياس إلى الفترة (لا سيما لفترة قصيرة) لإجراء تغييرات في الجينات الإيقاعية التعبير؛ ومع ذلك، العديد من الدراسات على مر السنين استخدمت بنجاح الجين لوسيفراس في ناقلات pGL3، مما يشير إلى أنه قد لا يكون ضروريا للإبلاغ عن إيقاعات circadian، لا سيما بالنسبة للايقاعات مع فترة أطول، مثل لوسيفراس سريعة التحلل ح 24. ولذلك، بلازميد مراسل استخدام ناقلات لوسيفراس زعزعة استقرار، pGL [Luc2P/Neo]، الذي يحتوي على هبيست (تسلسل بروتين زعزعة استقرار) قد وضعت، مما يسمح لنا باستخدامه كناقل مراسل الإيقاعية لأعمالنا الحالية في المختبر المقايسة الإضاءة الحيوية. قد نصف عمر أقصر كثيرا من البروتينات المشفرة بواسطة Luc2P (تي1/2 = ح 0.84)، ومن ثم يستجيب بسرعة أكبر وقوته أكبر للتغيرات في النشاط الترانسكربتي من البرية من نوع، أنانديكاتينج التي يمكن أن تستخدم لرصد التعبير الإيقاعي من لوسيفراس وينظم المروج PER2 بدقة في الوقت الحقيقي16.
Protocol
Representative Results
Discussion
في خلايا الثدييات، ودورية على مدار الساعة الإيقاعية ينظم حلقات التغذية المرتدة النسخي/متعدية مترابطة. هيتيروديميرس Bmal1 وأما ساعة أو Npas2 تنظيم النسخ الإيقاعية ملزمة بعناصر مربع ه في المروجين الأساسية كلية الدراسات العليا، بما في ذلك Per2 و صرخة، والعديد من ككجس4. كما أ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل بالمجتمع 2012 لعلم السموم (SOT)-كولجيت بالموليف منحة “بحوث بديلة” (M. فانغ) وبحث التعاون الدولي الصندوق من الحيوان والنبات وكالة الحجر الصحي، جمهورية كوريا (M. فانغ)، ومنح نيس P30ES005022 (H. زاربل). نود أن نشكر الدكتور تشنغ تشن (ماكغفرن كلية الطب في الجامعة تكساس مركز العلوم الصحية في هيوستن) لمناقشة مفيدة له، السيد شون خوان لمساعدته التجريبية، والسيدة كيمي ناكاتا للقراءة دليلاً لها.
Materials
| pLS[hPER2P/rLuc/Puro] vector | SwitchGear Genomics | S700000 | customized vector |
| pGL4.18[Luc2P/Neo] vector | Promega | 9PIE673 | destabilized luciferase expression vector |
| T4 DNA ligase | Invitrogen | 15224041 | For subcloning |
| TOPO TA cloning kit | Invitrogen | K4500-02 | with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli |
| Sac I | New England BioLabs | R0156S | Restriction enzyme |
| Hind III-HF | New England BioLabs | R3104S | Restriction enzyme |
| CutSmart buffer | New England BioLabs | B7204S | Restriction enzyme buffer |
| DNA gel extraction kit | Qiagen | 28704 | Purify DNA fragments from agarose gel |
| PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | DNA clean up |
| LB Miller's modification | TEKNOVA | L8600 | For transformed E. Coli culture |
| LB Agar Plate | TEKNOVA | L1902 | For white/blue selection |
| QIAprep spin miniprep Kit | Qiagen | 27104 | For extraction of plasmide DNA |
| EndoFree plasmid maxi prep Kit | Qiagen | 12362 | For extraction of plasmide DNA |
| FuGene HD | Promega | E2311 | Transfection reagent |
| Opti-MEM reduced serum medium | Invitrogen | 31985-062 | For transfection |
| MCF10A cell line | American Type Culture Collection | CRL-10317 | Mammary Epithelial Cells |
| MEGM BulletKit | Lonza | CC-3150 | Mammary Epithelial Growth Medium |
| MEBM | Lonza | CC-3151 | Mammary Epithelial Basal Medium |
| MEGM SingleQuot Kit | Lonza | CC-4136 | Suppliments & Growth Factors |
| ReagentPack | Lonza | CC-5034 | Reagent for subculture |
| D-PBS (10X) | Sigma | D1408 | Wash cells in culture dishes |
| UltraPure Distilled Water | Invitrogen | 10977 | Dilute 10X D-PBS |
| Tissue culture dish (35 mm) | BD/Falcon | 353001 | cell culture dish suitable to LumiCycle |
| Silicon grease | Fisher | NC9044707 | For sealing dish with recording medium |
| Round cover glass | Harvard Bioscience | 64-1500 (CS-40R) | For sealing dish with recording medium |
| Cholera toxin | Sigma | C8052 | Supplement for growth medium |
| G418 sulfate (Geniticin) | Invitrogen | 10131035 | Antibiotic for selection of stabliy transfected cells |
| Ampicillin | Sigma | A9393 | For colony selection |
| Forskolin | Sigma | F6886 | Synchronization agent |
| Melatonin | Sigma | M5250 | Synchronization agent |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Synchronization agent |
| Horse serum | Sigma | H1138 | Synchronization agent |
| d-Luciferin, sodium salt | Invitrogen | L2912 | Luciferase substrate |
| IC261 | Sigma | 10658 | Positive control for circadian disruptor |
| Methylnitrosourea (NMU) | Sigma | N1517 | Mammary specific carcinogen |
| Methylselenocysteine (MSC) | Sigma | M6680 | Organic selenium (chemopreventive agent) |
| EX527 | Sigma | E7034 | SIRT1 specific inhibitor |
| Cambinol | Sigma | C0494 | SIRT1 & SIRT2 inhibitor |
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 8000 | Quantify nucleotide |
| GeneAmp PCR System 9700 | Applied Biosystems | N805-0200 | For molecular biology experiment |
| CO2 Incubator | NAPCO | Series 8000 DH | For cell culture at 5% CO2 at 37 °C |
| Desktop centrifuge with refrezerator | Eppendorf | 5430R | For molecular biology experiment |
| Centrifuge with swing bucket | Eppendorf | 5810 R | For cell culture |
| Inverted microscope | Nikon | 80124 | Phase contrast optional |
| Tissue culture hood | Labconco | Class II A2 | BSL-2 certified |
| LumiCycle 32 | Actimetrics | Not Available | Luminoscence detector |
References
- Akerstedt, T., et al. Night work and breast cancer in women: a Swedish cohort study. BMJ Open. 5 (4), e008127 (2015).
- Parent, M. E., El-Zein, M., Rousseau, M. C., Pintos, J., Siemiatycki, J. Night work and the risk of cancer among men. Am J Epidemiol. 176 (9), 751-759 (2012).
- Knutsson, A., et al. Breast cancer among shift workers: results of the WOLF longitudinal cohort study. Scand J Work Environ Health. 39 (2), 170-177 (2013).
- Fu, L., Lee, C. C. The circadian clock: pacemaker and tumour suppressor. Nat Rev Cancer. 3 (5), 350-361 (2003).
- Fu, L., Kettner, N. M. The circadian clock in cancer development and therapy. Prog Mol Biol Transl Sci. 119, 221-282 (2013).
- IARC. Painting, Firefighting, and Shiftwork. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. 98, 563-764 (2010).
- Zhang, X., Zarbl, H. Chemopreventive doses of methylselenocysteine alter circadian rhythm in rat mammary tissue. Cancer Prev Res (Phila Pa). 1 (2), 119-127 (2008).
- Fang, M. Z., Zhang, X., Zarbl, H. Methylselenocysteine resets the rhythmic expression of circadian and growth-regulatory genes disrupted by nitrosomethylurea in vivo. Cancer Prev Res (Phila). 3 (5), 640-652 (2010).
- Burbulla, L. F., Kruger, R. Converging environmental and genetic pathways in the pathogenesis of Parkinson’s disease. J Neurol Sci. 306 (1-2), 1-8 (2011).
- Aitlhadj, L., Avila, D. S., Benedetto, A., Aschner, M., Sturzenbaum, S. R. Environmental exposure, obesity, and Parkinson’s disease: lessons from fat and old worms. Environ Health Perspect. 119 (1), 20-28 (2011).
- Nagoshi, E., Brown, S. A., Dibner, C., Kornmann, B., Schibler, U. Circadian gene expression in cultured cells. Methods Enzymol. 393, 543-557 (2005).
- Ramanathan, C., et al. Cell type-specific functions of period genes revealed by novel adipocyte and hepatocyte circadian clock models. PLoS Genet. 10 (4), e1004244 (2014).
- Sporl, F., et al. A circadian clock in HaCaT keratinocytes. J Invest Dermatol. 131 (2), 338-348 (2011).
- Zhang, E. E., et al. A genome-wide RNAi screen for modifiers of the circadian clock in human cells. Cell. 139 (1), 199-210 (2009).
- Yoo, S. H., et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (15), 5339-5346 (2004).
- Leclerc, G. M., Boockfor, F. R., Faught, W. J., Frawley, L. S. Development of a destabilized firefly luciferase enzyme for measurement of gene expression. Biotechniques. 29 (3), (2000).
- Genomics, S. . Technical Note: SwitchGear methods for gene model construction and transcription start site prediction. , (2009).
- Scientific, F. . Safety Data Sheet: Ethidium bromide, 1% Solution/Molecular Biology. , (2010).
- Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. . Current Protocols in Molecular Biology. , (1994).
- Yoo, S. H., et al. A noncanonical E-box enhancer drives mouse Period2 circadian oscillations in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (7), 2608-2613 (2005).
- Chen, Z., et al. Identification of diverse modulators of central and peripheral circadian clocks by high-throughput chemical screening. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (1), 101-106 (2012).
- Fang, M., Guo, W. R., Park, Y., Kang, H. G., Zarbl, H. Enhancement of NAD+-dependent SIRT1 deacetylase activity by methylselenocysteine resets the circadian clock in carcinogen-treated mammary epithelial cells. Oncotarget. , (2015).
- Chen-Goodspeed, M., Lee, C. C. Tumor suppression and circadian function. J Biol Rhythms. 22 (4), 291-298 (2007).
- Balsalobre, A. Clock genes in mammalian peripheral tissues. Cell Tissue Res. 309 (1), 193-199 (2002).
- Jung-Hynes, B., Huang, W., Reiter, R. J., Ahmad, N. Melatonin resynchronizes dysregulated circadian rhythm circuitry in human prostate cancer cells. J Pineal Res. 49 (1), 60-68 (2010).
- von Gall, C., et al. Melatonin plays a crucial role in the regulation of rhythmic clock gene expression in the mouse pars tuberalis. Ann N Y Acad Sci. 1040, 508-511 (2005).
- Vujovic, N., Davidson, A. J., Menaker, M. Sympathetic input modulates, but does not determine, phase of peripheral circadian oscillators. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 295 (1), R355-R360 (2008).
- Schofl, C., Becker, C., Prank, K., von zur Muhlen, A., Brabant, G. Twenty-four-hour rhythms of plasma catecholamines and their relation to cardiovascular parameters in healthy young men. Eur J Endocrinol. 137 (6), 675-683 (1997).
- Yu, H., et al. Circadian rhythm of circulating fibroblast growth factor 21 is related to diurnal changes in fatty acids in humans. Clin Chem. 57 (5), 691-700 (2011).
- Nakagawa, H., et al. Modulation of circadian rhythm of DNA synthesis in tumor cells by inhibiting platelet-derived growth factor signaling. J Pharmacol Sci. 107 (4), 401-407 (2008).
- Yang, X., Guo, M., Wan, Y. J. Deregulation of growth factor, circadian clock, and cell cycle signaling in regenerating hepatocyte RXRalpha-deficient mouse livers. Am J Pathol. 176 (2), 733-743 (2010).
- Virag, L. Structure and function of poly(ADP-ribose) polymerase-1: role in oxidative stress-related pathologies. Curr Vasc Pharmacol. 3 (3), 209-214 (2005).
- Kon, N., Sugiyama, Y., Yoshitane, H., Kameshita, I., Fukada, Y. Cell-based inhibitor screening identifies multiple protein kinases important for circadian clock oscillations. Commun Integr Biol. 8 (4), e982405 (2015).
- Ramanathan, C., Khan, S. K., Kathale, N. D., Xu, H., Liu, A. C. Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters. J Vis Exp. (67), e4234 (2012).
- Welsh, D. K., Yoo, S. H., Liu, A. C., Takahashi, J. S., Kay, S. A. Bioluminescence imaging of individual fibroblasts reveals persistent, independently phased circadian rhythms of clock gene expression. Curr Biol. 14 (24), 2289-2295 (2004).
