In Vitro Bioluminescens Assay at karakterisere døgnrytme i Brystkirtlerne epitelceller
Summary
En in vitro- bioluminescens analyse til at bestemme cellulære døgnrytme i Brystkirtlerne epitelceller er præsenteret. Denne metode udnytter pattedyr celle reporter plasmider udtrykker destabiliseret luciferase under kontrol af periode 2 gen promotor. Det kan tilpasses til andre celletyper til at evaluere orgel-specifikke virkninger på døgnrytme.
Abstract
Døgnrytme er en grundlæggende fysiologiske proces findes i alle organismer, der regulerer biologiske processer lige fra genekspression at sove adfærd. I hvirveldyr, er døgnrytme kontrolleret af en molekylær oscillator, der fungerer i både suprachiasmatic kernen (SCN, centrale pacemaker) og individuelle celler bestående af mest perifere væv. Endnu vigtigere, er afbrydelse af døgnrytme ved udsættelse for lys om natten, miljømæssige stressfaktorer og/eller giftige stoffer forbundet med øget risiko for kroniske sygdomme og aldring. Evnen til at identificere stoffer, der kan forstyrre central og/eller perifere biologiske ure og agenter, der kan forhindre eller mildne virkningerne af døgnrytmen forstyrrelser, har stor betydning for forebyggelse af kroniske sygdomme. Selv om gnavere modeller kan bruges til at identificere engagementer og agenter, der fremkalde eller forhindre/afhjælpe døgnrytmen forstyrrelser, kræver disse eksperimenter stort antal dyr. In vivo undersøgelser også kræver betydelige ressourcer og infrastruktur, og kræver forskere til at arbejde hele natten. Således er der et presserende behov for en celletype egnede in vitro- system til at screene for miljømæssige døgnrytmen disruptorer og smagsforstærkere i celletyper fra forskellige organer og sygdomstilstande. Vi konstrueret en vektor, der driver transskription af den destabiliseret luciferase i eukaryote celler under kontrol af den menneskelige periode 2 gen promotor. Denne døgnrytmen reporter konstruktion var stabilt transfekteret i humane brystkirtler epitelceller, og døgnrytmen lydhør reporter celler blev udvalgt til at udvikle in vitro- bioluminescens assay. Vi præsenterer her, en detaljeret protokollen for at oprette og validere analysen. Vi giver yderligere detaljer om bevis for konceptet eksperimenter viser vores i vitro assay evne til at sammenfatte i vivo -virkningerne af forskellige kemikalier på det cellulære biologiske ur. Resultaterne viser, at analysen kan tilpasses til en lang række celletyper til at screene for både miljømæssige disruptorer og chemopreventive smagsforstærkere af døgnrytmen ure.
Introduction
Døgnrytmen uret regulerer en bred vifte af biologiske processer fra temperaturprofil udtryk af gener at sove adfærd i en forudsigelige rytme med en hyppighed på ca 24 h. Epidemiological undersøgelser stærkt tyder på, at kronisk afbrydelse af døgnrytmen rytme øger risikoen for brystkræft og prostatakræft i skifteholdsarbejde, herunder sygeplejersker og flight besætninger1,2,3. Disse fund er bekræftet af gnaver undersøgelser, viser, at eksponering for konstant lys, lys om natten, eller lys-cyklusser, der efterligner jetlag stigning tumor forekomsten og accelererer tumor vækst4,5. Baseret på data fra undersøgelser af både menneskelige og gnaver, klassificeret den internationale agentur for kræftforskning Skift-arbejde som en sandsynlig kræftfremkaldende (Type 2A) i 20106.
Tidligere var vi vist, at en enkelt kræftfremkaldende dosis af brystkirtler tumor specifikke kræftfremkaldende, N– nitroso-N– methylurea (NMU), forstyrret døgnrytmen udtryk for store døgnrytmen gener (CGs) (fx, periode 2 , Per2) og flere døgnrytmen-kontrollerede gener (samlekortspil), herunder key DNA skader lydhør og reparation (DDRR) gener i mælkekirtlen mål (men ikke i leveren). Derudover nulstille døgnrytmen udtryk for både Per2 og DDRR gener mod normale ved en chemopreventive regime af kosten L-methyl-selenocystein (MSC) reduceret forekomsten af tumor med 63%. Disse resultater var først til at vise en mekanistisk link mellem døgnrytme, kemiske carcinogenese og naturstoffers7,8. Engagementer med andre miljømæssige giftige stoffer vist sig at forstyrre døgnrytmen gen udtryk i vivo er også forbundet med øget risiko for miljømæssige sygdomme9,10. Forstå de mekanismer, der knytter døgnrytmen forstyrrelser af miljømæssige giftstoffer og patogenese kan føre til mekanisk baserede tilgange til sygdomsforebyggelse. Men undersøgelser sigter mod at definere interaktioner mellem engagementer og døgnrytme er normalt udføres in vivo. En typisk i vivo eksperiment undersøger indvirkningen på døgnrytme kræver stort antal dyr, som væv fra mindst tre kontrollere og tre udsatte dyr skal være indsamlet hver 3-4 h en 24 eller 48 h periode. Udvikling af et valideret in vitro- system, der sammenfatter i vivo observationer og mekanismer ville derfor ikke blot reducere antallet af dyr kræves, men også dramatisk reducere eksperimentelle omkostningerne og kravet om at forskere arbejder kontinuerligt over en periode på 24-48 h. Derudover kunne en valideret in vitro- system anvendes til high throughput screening af forbindelser og/eller genetisk ændring, der påvirker døgnrytme, eller dens reaktion på miljømæssige stressfaktorer eller giftige stoffer. Derfor, den strategiske kombination af in vitro- og i vivo modeller og eksperimenter er nødvendig for at opnå forskellige indsigter med forskelligt fokus.
I pattedyr findes døgnrytmen oscillatorer ikke kun i specialiserede neuroner i SCN, men også i mest perifere celletyper. Disse molekylære ure er svarende til de fastlagte fibroblast cellelinjer og primære fibroblaster fra embryoner eller voksne dyr; der er imidlertid behov for væv type-specifikke cellulære modeller11. Derfor, traditionelle undersøgelser af bevægeapparatet aktivitet i vivo, SCN explants ex vivo, og celle-baserede in vitro- assays i udødeliggjort fibroblastceller er meget udbredt at studere celle-selvstændig døgnrytmen defekter. Men der er ingen tegn på, at en in vitro- fibroblast celle-baserede analyse kan sammenfatte døgnrytmen mekanismer og svar til stede i celler af andre perifere organer i vivo. Forskellige celletyper kan have forskellige mønstre af genekspression, xenobiotiske metabolisme og DDRR, og forbindelserne mellem toksicitet og døgnrytmen genekspression kan være celletype specifikke og/eller moduleret af forskellige fysiologiske parametre. Derudover er døgnrytmen oscillatorer i fibroblast-baserede systemer ikke blevet fuldt vurderet for svar til miljømæssige giftstoffer, stressfaktorer og forebyggende agenter, der linker engagementer med mekanismer for udvikling af sygdom og forebyggelse. Der er således behov for letkøbt, validerede celletype specifikke, in vitro- bioluminescens assays til at studere orgel specifikke miljømæssige døgnrytmen disruptorer. Selv om en række forskellige cellulære ur modeller (f.eks.i leveren, keratinocytter, og fedtceller samt en osteosarkom cellelinje) er blevet udviklet i de seneste år12,13,14, 15, analysen beskrevet her er den første cellulære ur model i bryst epitelceller, og den første demonstration at sammenfatte i vivo svar til miljømæssige stressfaktorer, giftstoffer, stoffer og chemopreventive agenter.
Renilla luciferase (rLuc) og firefly luciferase er 30-61 kDa monomere proteiner, der ikke kræver posttranslationelle behandling for enzymatisk aktivitet og kan fungere som en genetiske reporter straks efter oversættelse. Når substratet associates med enzymet luciferase, genererer biokemiske reaktionen katalyseret et lysglimt. Således er luciferase konstruktioner almindeligt anvendt som en gene expression reporter system in vitro- og in vivo. Dog i døgnrytme undersøgelser, nytten af luciferase reporter er begrænset af den relativt lange halveringstid af luciferase protein (T1/2 = 3.68 h) i forhold til perioden (især til den korte periode) for ændringer i døgnrytmen gen udtryk; men talrige undersøgelser over årene har med held brugt luciferase gen i pGL3 vektor, der angiver, at de hurtigt nedbrydeligt luciferase ikke må være nødvendig for at rapportere døgnrytmen, især for rytmer med en længere periode, som 24 h. Derfor, en reporter plasmid bruger destabiliseret luciferase vektor, pGL [Luc2Pneo], der indeholder hPEST (et protein destabilisering sekvens) er blevet udviklet, tillader os at bruge det som en døgnrytmen reporter vektor for vores nuværende in vitro- bioluminescens assay. Protein kodet af Luc2P har en meget kortere halveringstid (T1/2 = 0.84 h) og derfor reagerer hurtigere og med en større styrke på ændringer i transcriptional aktivitet end vildtype, jegndicating, at det kan bruges til at overvåge den rytmiske udtryk for luciferase reguleret af PER2 initiativtageren præcist i real-time16.
Protocol
Representative Results
Discussion
I pattedyrceller, er hyppighed af døgnrytmen uret reguleret af sammenkoblede transcriptional/translationel feedback-sløjfer. Heterodimers af Bmal1 og enten uret eller Npas2 regulere døgnrytmen transskription af binding til E-box elementer i initiativtagerne til core CGs, herunder Per2 og grædeog talrige samlekortspil4. Som de ophobes i cellen, heterodimers af Per: Cry er post-translationally ændret og transporteres til kernen til at undertrykke uret: Bmal1 transcriptional ak…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af 2012 samfund af toksikologi (SOT)-Colgate Palmolive Grant for Alterative forskning (M. Fang) og den internationale samarbejde forskning finansiere fra dyr og plante karantæne agentur, Republikken Korea (M. Fang), og NIEHS yde P30ES005022 (H. Zarbl). Vi vil gerne takke Dr. Zheng Chen (McGovern medicinsk School ved University of Texas Health Science Center i Houston) for hans hjælpsomme diskussion, Mr. Shao-An Juan for hans eksperimentelle bistand og Ms. Kimi Nakata for hendes korrekturlæsning.
Materials
| pLS[hPER2P/rLuc/Puro] vector | SwitchGear Genomics | S700000 | customized vector |
| pGL4.18[Luc2P/Neo] vector | Promega | 9PIE673 | destabilized luciferase expression vector |
| T4 DNA ligase | Invitrogen | 15224041 | For subcloning |
| TOPO TA cloning kit | Invitrogen | K4500-02 | with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli |
| Sac I | New England BioLabs | R0156S | Restriction enzyme |
| Hind III-HF | New England BioLabs | R3104S | Restriction enzyme |
| CutSmart buffer | New England BioLabs | B7204S | Restriction enzyme buffer |
| DNA gel extraction kit | Qiagen | 28704 | Purify DNA fragments from agarose gel |
| PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | DNA clean up |
| LB Miller's modification | TEKNOVA | L8600 | For transformed E. Coli culture |
| LB Agar Plate | TEKNOVA | L1902 | For white/blue selection |
| QIAprep spin miniprep Kit | Qiagen | 27104 | For extraction of plasmide DNA |
| EndoFree plasmid maxi prep Kit | Qiagen | 12362 | For extraction of plasmide DNA |
| FuGene HD | Promega | E2311 | Transfection reagent |
| Opti-MEM reduced serum medium | Invitrogen | 31985-062 | For transfection |
| MCF10A cell line | American Type Culture Collection | CRL-10317 | Mammary Epithelial Cells |
| MEGM BulletKit | Lonza | CC-3150 | Mammary Epithelial Growth Medium |
| MEBM | Lonza | CC-3151 | Mammary Epithelial Basal Medium |
| MEGM SingleQuot Kit | Lonza | CC-4136 | Suppliments & Growth Factors |
| ReagentPack | Lonza | CC-5034 | Reagent for subculture |
| D-PBS (10X) | Sigma | D1408 | Wash cells in culture dishes |
| UltraPure Distilled Water | Invitrogen | 10977 | Dilute 10X D-PBS |
| Tissue culture dish (35 mm) | BD/Falcon | 353001 | cell culture dish suitable to LumiCycle |
| Silicon grease | Fisher | NC9044707 | For sealing dish with recording medium |
| Round cover glass | Harvard Bioscience | 64-1500 (CS-40R) | For sealing dish with recording medium |
| Cholera toxin | Sigma | C8052 | Supplement for growth medium |
| G418 sulfate (Geniticin) | Invitrogen | 10131035 | Antibiotic for selection of stabliy transfected cells |
| Ampicillin | Sigma | A9393 | For colony selection |
| Forskolin | Sigma | F6886 | Synchronization agent |
| Melatonin | Sigma | M5250 | Synchronization agent |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Synchronization agent |
| Horse serum | Sigma | H1138 | Synchronization agent |
| d-Luciferin, sodium salt | Invitrogen | L2912 | Luciferase substrate |
| IC261 | Sigma | 10658 | Positive control for circadian disruptor |
| Methylnitrosourea (NMU) | Sigma | N1517 | Mammary specific carcinogen |
| Methylselenocysteine (MSC) | Sigma | M6680 | Organic selenium (chemopreventive agent) |
| EX527 | Sigma | E7034 | SIRT1 specific inhibitor |
| Cambinol | Sigma | C0494 | SIRT1 & SIRT2 inhibitor |
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 8000 | Quantify nucleotide |
| GeneAmp PCR System 9700 | Applied Biosystems | N805-0200 | For molecular biology experiment |
| CO2 Incubator | NAPCO | Series 8000 DH | For cell culture at 5% CO2 at 37 °C |
| Desktop centrifuge with refrezerator | Eppendorf | 5430R | For molecular biology experiment |
| Centrifuge with swing bucket | Eppendorf | 5810 R | For cell culture |
| Inverted microscope | Nikon | 80124 | Phase contrast optional |
| Tissue culture hood | Labconco | Class II A2 | BSL-2 certified |
| LumiCycle 32 | Actimetrics | Not Available | Luminoscence detector |
References
- Akerstedt, T., et al. Night work and breast cancer in women: a Swedish cohort study. BMJ Open. 5 (4), e008127 (2015).
- Parent, M. E., El-Zein, M., Rousseau, M. C., Pintos, J., Siemiatycki, J. Night work and the risk of cancer among men. Am J Epidemiol. 176 (9), 751-759 (2012).
- Knutsson, A., et al. Breast cancer among shift workers: results of the WOLF longitudinal cohort study. Scand J Work Environ Health. 39 (2), 170-177 (2013).
- Fu, L., Lee, C. C. The circadian clock: pacemaker and tumour suppressor. Nat Rev Cancer. 3 (5), 350-361 (2003).
- Fu, L., Kettner, N. M. The circadian clock in cancer development and therapy. Prog Mol Biol Transl Sci. 119, 221-282 (2013).
- IARC. Painting, Firefighting, and Shiftwork. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. 98, 563-764 (2010).
- Zhang, X., Zarbl, H. Chemopreventive doses of methylselenocysteine alter circadian rhythm in rat mammary tissue. Cancer Prev Res (Phila Pa). 1 (2), 119-127 (2008).
- Fang, M. Z., Zhang, X., Zarbl, H. Methylselenocysteine resets the rhythmic expression of circadian and growth-regulatory genes disrupted by nitrosomethylurea in vivo. Cancer Prev Res (Phila). 3 (5), 640-652 (2010).
- Burbulla, L. F., Kruger, R. Converging environmental and genetic pathways in the pathogenesis of Parkinson’s disease. J Neurol Sci. 306 (1-2), 1-8 (2011).
- Aitlhadj, L., Avila, D. S., Benedetto, A., Aschner, M., Sturzenbaum, S. R. Environmental exposure, obesity, and Parkinson’s disease: lessons from fat and old worms. Environ Health Perspect. 119 (1), 20-28 (2011).
- Nagoshi, E., Brown, S. A., Dibner, C., Kornmann, B., Schibler, U. Circadian gene expression in cultured cells. Methods Enzymol. 393, 543-557 (2005).
- Ramanathan, C., et al. Cell type-specific functions of period genes revealed by novel adipocyte and hepatocyte circadian clock models. PLoS Genet. 10 (4), e1004244 (2014).
- Sporl, F., et al. A circadian clock in HaCaT keratinocytes. J Invest Dermatol. 131 (2), 338-348 (2011).
- Zhang, E. E., et al. A genome-wide RNAi screen for modifiers of the circadian clock in human cells. Cell. 139 (1), 199-210 (2009).
- Yoo, S. H., et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (15), 5339-5346 (2004).
- Leclerc, G. M., Boockfor, F. R., Faught, W. J., Frawley, L. S. Development of a destabilized firefly luciferase enzyme for measurement of gene expression. Biotechniques. 29 (3), (2000).
- Genomics, S. . Technical Note: SwitchGear methods for gene model construction and transcription start site prediction. , (2009).
- Scientific, F. . Safety Data Sheet: Ethidium bromide, 1% Solution/Molecular Biology. , (2010).
- Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. . Current Protocols in Molecular Biology. , (1994).
- Yoo, S. H., et al. A noncanonical E-box enhancer drives mouse Period2 circadian oscillations in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (7), 2608-2613 (2005).
- Chen, Z., et al. Identification of diverse modulators of central and peripheral circadian clocks by high-throughput chemical screening. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (1), 101-106 (2012).
- Fang, M., Guo, W. R., Park, Y., Kang, H. G., Zarbl, H. Enhancement of NAD+-dependent SIRT1 deacetylase activity by methylselenocysteine resets the circadian clock in carcinogen-treated mammary epithelial cells. Oncotarget. , (2015).
- Chen-Goodspeed, M., Lee, C. C. Tumor suppression and circadian function. J Biol Rhythms. 22 (4), 291-298 (2007).
- Balsalobre, A. Clock genes in mammalian peripheral tissues. Cell Tissue Res. 309 (1), 193-199 (2002).
- Jung-Hynes, B., Huang, W., Reiter, R. J., Ahmad, N. Melatonin resynchronizes dysregulated circadian rhythm circuitry in human prostate cancer cells. J Pineal Res. 49 (1), 60-68 (2010).
- von Gall, C., et al. Melatonin plays a crucial role in the regulation of rhythmic clock gene expression in the mouse pars tuberalis. Ann N Y Acad Sci. 1040, 508-511 (2005).
- Vujovic, N., Davidson, A. J., Menaker, M. Sympathetic input modulates, but does not determine, phase of peripheral circadian oscillators. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 295 (1), R355-R360 (2008).
- Schofl, C., Becker, C., Prank, K., von zur Muhlen, A., Brabant, G. Twenty-four-hour rhythms of plasma catecholamines and their relation to cardiovascular parameters in healthy young men. Eur J Endocrinol. 137 (6), 675-683 (1997).
- Yu, H., et al. Circadian rhythm of circulating fibroblast growth factor 21 is related to diurnal changes in fatty acids in humans. Clin Chem. 57 (5), 691-700 (2011).
- Nakagawa, H., et al. Modulation of circadian rhythm of DNA synthesis in tumor cells by inhibiting platelet-derived growth factor signaling. J Pharmacol Sci. 107 (4), 401-407 (2008).
- Yang, X., Guo, M., Wan, Y. J. Deregulation of growth factor, circadian clock, and cell cycle signaling in regenerating hepatocyte RXRalpha-deficient mouse livers. Am J Pathol. 176 (2), 733-743 (2010).
- Virag, L. Structure and function of poly(ADP-ribose) polymerase-1: role in oxidative stress-related pathologies. Curr Vasc Pharmacol. 3 (3), 209-214 (2005).
- Kon, N., Sugiyama, Y., Yoshitane, H., Kameshita, I., Fukada, Y. Cell-based inhibitor screening identifies multiple protein kinases important for circadian clock oscillations. Commun Integr Biol. 8 (4), e982405 (2015).
- Ramanathan, C., Khan, S. K., Kathale, N. D., Xu, H., Liu, A. C. Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters. J Vis Exp. (67), e4234 (2012).
- Welsh, D. K., Yoo, S. H., Liu, A. C., Takahashi, J. S., Kay, S. A. Bioluminescence imaging of individual fibroblasts reveals persistent, independently phased circadian rhythms of clock gene expression. Curr Biol. 14 (24), 2289-2295 (2004).
