Summary

In Vitro Dosaggio di bioluminescenza per caratterizzare il ritmo circadiano in cellule epiteliali mammarie

Published: September 28, 2017
doi:

Summary

Un’analisi di bioluminescenza in vitro per determinare il ritmo circadiano cellulare in cellule epiteliali mammarie è presentata. Questo metodo utilizza plasmidi di reporter di cellule di mammifero che esprimono destabilizzato luciferasi sotto il controllo del promotore del gene di periodo 2 . Può essere adattato ad altri tipi di cella per valutare gli effetti di organo-specific il ritmo circadiano.

Abstract

Il ritmo circadiano è un processo fisiologico fondamentale presente in tutti gli organismi che regola i processi biologici che vanno dall’espressione genica di dormire comportamento. Nei vertebrati, ritmo circadiano è controllato da un oscillatore molecolare che funziona sia nel nucleo soprachiasmatico (SCN; centrale dello stimolatore cardiaco) e singole celle che comprende tessuti più periferici. Più importante, la rottura del ritmo circadiano di esposizione alla luce di notte, fattori di stress ambientale e/o sostanze tossiche è associata a un aumentato rischio di malattie croniche e l’invecchiamento. La capacità di identificare gli agenti che possono interferire con orologi biologici centrali e/o periferici e gli agenti che possono impedire o attenuare gli effetti della perturbazione circadiana, ha implicazioni significative per la prevenzione delle malattie croniche. Anche se i modelli del roditore possono essere utilizzati per identificare le esposizioni e gli agenti che inducono o prevenire/ridurre la rottura circadiana, questi esperimenti richiedono un numero elevato di animali. In vivo gli studi inoltre richiedono infrastrutture e risorse significative e i ricercatori a lavorare tutta la notte. Così, c’è un urgente bisogno di un sistema appropriato in vitro di cellula-tipo di schermo per ambientali interferenti circadiani e rinforzatori in tipi cellulari da diversi organi e Stati di malattia. Abbiamo costruito un vettore che guida la trascrizione della luciferasi destabilizzato in cellule eucariotiche, sotto il controllo del promotore del gene umano di periodo 2 . Questa costruzione del reporter circadiano era trasfettata stabilmente in cellule epiteliali mammarie umane e cellule circadiano reattivo reporter sono state selezionate per sviluppare il saggio in vitro bioluminescenza. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per stabilire e convalidare il dosaggio. Forniamo ulteriori dettagli per prova degli esperimenti di concetto che dimostra la capacità della nostra analisi in vitro di ricapitolare gli effetti in vivo di vari prodotti chimici sul cellulare orologio biologico. I risultati indicano che il dosaggio può essere adattato ad una varietà di tipi cellulari per lo screening sia ambientali interferenti e chemopreventive esaltatori di orologi circadiani.

Introduction

L’orologio circadiano regola una vasta gamma di processi biologici da diurni espressione dei geni per dormire il comportamento in un ritmo prevedibile con una periodicità di circa 24 h. epidemiologico gli studi suggeriscono fortemente che rottura cronica del circadiano ritmo aumenta il rischio di cancro al seno e alla prostata nei turnisti, tra cui gli infermieri e gli equipaggi di volo1,2,3. Questi risultati sono confermati dagli studi del roditore, che dimostrano che l’esposizione a cicli di luce di notte, o luce di luce costante, che imitano il jet lag aumento l’incidenza del tumore e accelera la crescita del tumore4,5. Basato su dati provenienti da studi sia umani e del roditore, l’Agenzia internazionale per ricerca sul cancro classificati turni di lavoro come agente cancerogeno umano probabile (tipo 2A) in 20106.

Precedentemente, abbiamo dimostrato che una singola dose cancerogena dell’agente cancerogeno specifico tumore mammario, N– nitroso-N– methylurea (NMU), interrotto l’espressione circadiana dei principali geni circadiani (CGs) (ad es., periodo 2 , Per2) e parecchi geni circadiani controllato (GCC), tra cui chiave reattivo il danno del DNA e ripristino geni (DDRR) nella ghiandola mammaria di destinazione (ma non nel fegato). Inoltre, reimpostare l’espressione circadiana dei geni sia Per2 e DDRR verso il normale da un regime chemopreventive dell’alimentari L-metil-selenocisteina (MSC) ha ridotto l’incidenza del tumore del 63%. Questi risultati sono stati i primi a mostrare un collegamento meccanicistico tra ritmo circadiano, carcinogenesi chimica e chemoprevention7,8. Esposizioni verso altri tossici ambientali indicate per interrompere gene circadiano espressione in vivo inoltre sono associate con un rischio aumentato di malattie ambientali9,10. La comprensione dei meccanismi che collegano la rottura circadiana di tossici ambientali e patogenesi può portare a meccanicistico approcci alla prevenzione della malattia. Tuttavia, gli studi volti a definire le interazioni tra le esposizioni e ritmo circadiano sono di solito eseguite in vivo. Un tipico in vivo esperimento studiando che l’impatto sul ritmo circadiano richiede grandi quantità di animali, tessuti da almeno tre di controllo e tre animali esposti devono essere raccolti ogni 3-4 ore su un periodo di 24 o 48 h. Sviluppo di un sistema convalidato in vitro che ricapitola in vivo osservazioni e meccanismi sarebbe quindi non solo riducono il numero di animali necessari, ma anche drasticamente ridurre i costi sperimentali e il requisito che i ricercatori lavorano continuativamente per un periodo di 24-48 h. Inoltre, un sistema convalidato in vitro potrebbe essere usato per screening su vasta scala di composti e/o alterazioni genetiche che influenzano il ritmo circadiano, o la sua risposta a fattori di stress ambientale o sostanze tossiche. Pertanto, la combinazione strategica di modelli in vitro e in vivo e gli esperimenti sono necessari per ottenere diverse intuizioni con diversa attenzione.

Nei mammiferi, oscillatori circadiani esistano non solo nei neuroni specializzati del SCN, ma anche in diversi tipi di cellule più periferiche. Questi orologi molecolari sono simili a quelli nelle linee cellulari stabilite del fibroblasto e nei fibroblasti primari da embrioni o animali adulti; Tuttavia, c’è una necessità per tessuto modelli cellulari di tipo-specific11. Di conseguenza, gli studi tradizionali di attività locomotrice in vivo, SCN espianti ex vivoe saggi basati su cellule in vitro in cellule immortalizzate del fibroblasto sono ampiamente usati per studiare i difetti circadiani cella-autonoma. Tuttavia, non ci sono prove che indicano che un in vitro dei fibroblasti basati su cellule test può ricapitolare meccanismi circadiani e risposte presentano in cellule di altri organi periferici in vivo. Diversi tipi di cellule possono avere modelli distinti di espressione genica, metabolismo xenobiotico e DDRR, e i legami tra tossicità ed espressione genica circadiana possono essere cellula-tipo specifico e/o modulata da diversi parametri fisiologici. Inoltre, oscillatori circadiani nei sistemi basati su fibroblasti non sono stati completamente valutati per risposte a tossici ambientali, fattori di stress e agenti preventivi che collegano le esposizioni ai meccanismi di prevenzione e lo sviluppo della malattia. Così, c’è una necessità per facile, convalidato cellula-tipo specifico, le analisi in vitro bioluminescenza per studiare gli interferenti circadiano ambientali specifici di organo. Anche se una varietà di modelli di orologio cellulare (ad es., nel fegato, cheratinociti e le cellule di grasso, nonché una linea di cellule di osteosarcoma) sono state sviluppate in anni recenti12,13,14, 15, il dosaggio descritto qui è il primo modello di orologio cellulare in cellule epiteliali del seno e la prima dimostrazione in vivo risposte a fattori di stress ambientale, sostanze tossiche, farmaci e agenti chemopreventive di ricapitolare.

Renilla luciferasi (rLuc) e luciferasi firefly 30-61 kDa proteine monomeriche che non necessitano di posttranslational elaborazione dell’attività enzimatica e possono funzionare come un reporter genetico immediatamente dopo la traduzione. Una volta che il substrato si associa con l’enzima luciferasi, la reazione biochimica catalizzata genera un lampo di luce. Così, la luciferasi costrutti sono ampiamente usati come espressione gene reporter sistema in vitro e in vivo. Tuttavia, negli studi di ritmo circadiano, l’utilità del reporter di luciferase è limitato il tempo di dimezzamento relativamente lunga della proteina luciferasi (T1/2 = h 3,68) relativa al periodo (soprattutto per il breve periodo) per mutazioni nel gene circadiano espressione; Tuttavia, numerosi studi nel corso degli anni hanno utilizzato con successo il gene della luciferasi nel vettore pGL3, che indica che la luciferasi rapidamente degradabile potrebbero non essere necessario per aver segnalato i ritmi circadiani, soprattutto per i ritmi con un periodo più lungo, come 24 h. Pertanto, un reporter del utilizzando il vettore di luciferasi destabilizzato, pGL [Luc2P/Neo], che contiene hPEST (una sequenza di destabilizzazione della proteina) è stato sviluppato, che ci permette di usarlo come un vettore reporter circadiano per nostra attuale in vitro analisi di bioluminescenza. La proteina codificata da Luc2P ha una molto più breve emivita (T1/2 = 0,84 h) e quindi, risponde più velocemente e con un ordine di grandezza maggiore ai cambiamenti nell’attività trascrizionale che il selvaggio-tipo, hoSPI che può essere utilizzato per monitorare l’espressione ritmica della luciferasi regolato dal promotore PER2 con precisione in tempo reale16.

Protocol

1. costruzione del PER2 promotore guidato destabilizzato Luciferase Reporter vettore acquistare un oggetto personalizzato pLS [hPER2P / rLuc / Puro] vettore che contiene il cDNA codificante rLuc e umani Frammento di promotore PER2 (hPER2P, 941 bp) presso il sito tra Sac I e Hind III a clonazione più regione 17. Tagliare il frammento di promotore PER2 umano (hPER2P, 941 bp) fuori dal vettore.</str…

Representative Results

Vettore reporter circadiano bioluminescenza: espressione umana di promotore-guidato da PER2 della variante destabilizzato luciferasi La sequenza di DNA che comprende un frammento di bp 941 derivato dal promotore PER2 umano utilizzato per costruire il vettore reporter circadiano, pGL [hPer2P/Luc2P/Neo, in primo luogo è stato analizzato per la presenza di elementi regolatori conosciuta per regolar…

Discussion

In cellule di mammifero, periodicità dell’orologio circadiano è regolato da anelli di retroazione trascrizionale traslazionale interconnessi. Eterodimeri di Bmal1 e orologio o Npas2 regolare la trascrizione circadiano legandosi agli elementi di E-box nei promotori di nucleo CGs, tra cui Per2 e piangeree numerosi CCGs4. Come si accumulano nella cella, heterodimers di a: Cry traduzionalmente modificati e trasportate al nucleo di reprimere l’attività trascrizionale dell’orologio:…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato supportato da 2012 società di tossicologia (SOT)-Colgate Palmolive Grant per ricerca alterativa (M. Fang) e la ricerca di collaborazione internazionale fondo da animali e piante quarantena Agenzia, Repubblica di Corea (M. Fang), e concedere il NIEHS P30ES005022 (Zarbl H.). Vorremmo ringraziare il dottor Zheng Chen (McGovern Medical School presso l’Università di Texas Health Science Center a Houston) per la sua discussione utile, Mr. Shao-An Juan per la sua assistenza sperimentale e MS. Kimi Nakata per la prova di lettura.

Materials

pLS[hPER2P/rLuc/Puro] vector SwitchGear Genomics S700000 customized vector
pGL4.18[Luc2P/Neo] vector Promega 9PIE673 destabilized luciferase expression vector
T4 DNA ligase Invitrogen 15224041 For subcloning
TOPO TA cloning kit Invitrogen K4500-02 with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli
Sac I New England BioLabs R0156S Restriction enzyme
Hind III-HF New England BioLabs R3104S Restriction enzyme
CutSmart buffer New England BioLabs B7204S Restriction enzyme buffer
DNA gel extraction kit Qiagen 28704 Purify DNA fragments from agarose gel
PCR Purification Kit Qiagen 28104 DNA clean up
LB Miller's modification TEKNOVA L8600 For transformed E. Coli culture
LB Agar Plate TEKNOVA L1902 For white/blue selection
QIAprep spin miniprep Kit Qiagen 27104 For extraction of plasmide DNA
EndoFree plasmid maxi prep Kit Qiagen 12362 For extraction of plasmide DNA
FuGene HD Promega E2311 Transfection reagent
Opti-MEM reduced serum medium Invitrogen 31985-062 For transfection
MCF10A cell line American Type Culture Collection CRL-10317 Mammary Epithelial Cells
MEGM BulletKit Lonza CC-3150 Mammary Epithelial Growth Medium
MEBM Lonza CC-3151 Mammary Epithelial Basal Medium
MEGM SingleQuot Kit Lonza CC-4136 Suppliments & Growth Factors
ReagentPack Lonza CC-5034 Reagent for subculture
D-PBS (10X) Sigma D1408 Wash cells in culture dishes
UltraPure Distilled Water Invitrogen 10977 Dilute 10X D-PBS
Tissue culture dish (35 mm) BD/Falcon 353001 cell culture dish suitable to LumiCycle
Silicon grease Fisher NC9044707 For sealing dish with recording medium
Round cover glass Harvard Bioscience 64-1500 (CS-40R) For sealing dish with recording medium
Cholera toxin Sigma C8052 Supplement for growth medium
G418 sulfate (Geniticin) Invitrogen 10131035 Antibiotic for selection of stabliy transfected cells
Ampicillin Sigma A9393 For colony selection
Forskolin Sigma F6886 Synchronization agent
Melatonin Sigma M5250 Synchronization agent
Dexamethasone Sigma D4902 Synchronization agent
Horse serum Sigma H1138 Synchronization agent
d-Luciferin, sodium salt Invitrogen L2912 Luciferase substrate
IC261 Sigma 10658 Positive control for circadian disruptor
Methylnitrosourea (NMU) Sigma N1517 Mammary specific carcinogen
Methylselenocysteine (MSC) Sigma M6680 Organic selenium (chemopreventive agent)
EX527 Sigma E7034 SIRT1 specific inhibitor
Cambinol Sigma C0494 SIRT1 & SIRT2 inhibitor
NanoDrop Spectrophotometer Thermo Scientific NanoDrop 8000 Quantify nucleotide
GeneAmp PCR System 9700 Applied Biosystems N805-0200 For molecular biology experiment
CO2 Incubator NAPCO Series 8000 DH For cell culture at 5% CO2 at 37 °C
Desktop centrifuge with refrezerator Eppendorf 5430R For molecular biology experiment
Centrifuge with swing bucket Eppendorf 5810 R For cell culture
Inverted microscope Nikon 80124 Phase contrast optional
Tissue culture hood Labconco Class II A2 BSL-2 certified
LumiCycle 32 Actimetrics Not Available Luminoscence detector

References

  1. Akerstedt, T., et al. Night work and breast cancer in women: a Swedish cohort study. BMJ Open. 5 (4), e008127 (2015).
  2. Parent, M. E., El-Zein, M., Rousseau, M. C., Pintos, J., Siemiatycki, J. Night work and the risk of cancer among men. Am J Epidemiol. 176 (9), 751-759 (2012).
  3. Knutsson, A., et al. Breast cancer among shift workers: results of the WOLF longitudinal cohort study. Scand J Work Environ Health. 39 (2), 170-177 (2013).
  4. Fu, L., Lee, C. C. The circadian clock: pacemaker and tumour suppressor. Nat Rev Cancer. 3 (5), 350-361 (2003).
  5. Fu, L., Kettner, N. M. The circadian clock in cancer development and therapy. Prog Mol Biol Transl Sci. 119, 221-282 (2013).
  6. IARC. Painting, Firefighting, and Shiftwork. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. 98, 563-764 (2010).
  7. Zhang, X., Zarbl, H. Chemopreventive doses of methylselenocysteine alter circadian rhythm in rat mammary tissue. Cancer Prev Res (Phila Pa). 1 (2), 119-127 (2008).
  8. Fang, M. Z., Zhang, X., Zarbl, H. Methylselenocysteine resets the rhythmic expression of circadian and growth-regulatory genes disrupted by nitrosomethylurea in vivo. Cancer Prev Res (Phila). 3 (5), 640-652 (2010).
  9. Burbulla, L. F., Kruger, R. Converging environmental and genetic pathways in the pathogenesis of Parkinson’s disease. J Neurol Sci. 306 (1-2), 1-8 (2011).
  10. Aitlhadj, L., Avila, D. S., Benedetto, A., Aschner, M., Sturzenbaum, S. R. Environmental exposure, obesity, and Parkinson’s disease: lessons from fat and old worms. Environ Health Perspect. 119 (1), 20-28 (2011).
  11. Nagoshi, E., Brown, S. A., Dibner, C., Kornmann, B., Schibler, U. Circadian gene expression in cultured cells. Methods Enzymol. 393, 543-557 (2005).
  12. Ramanathan, C., et al. Cell type-specific functions of period genes revealed by novel adipocyte and hepatocyte circadian clock models. PLoS Genet. 10 (4), e1004244 (2014).
  13. Sporl, F., et al. A circadian clock in HaCaT keratinocytes. J Invest Dermatol. 131 (2), 338-348 (2011).
  14. Zhang, E. E., et al. A genome-wide RNAi screen for modifiers of the circadian clock in human cells. Cell. 139 (1), 199-210 (2009).
  15. Yoo, S. H., et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (15), 5339-5346 (2004).
  16. Leclerc, G. M., Boockfor, F. R., Faught, W. J., Frawley, L. S. Development of a destabilized firefly luciferase enzyme for measurement of gene expression. Biotechniques. 29 (3), (2000).
  17. Genomics, S. . Technical Note: SwitchGear methods for gene model construction and transcription start site prediction. , (2009).
  18. Scientific, F. . Safety Data Sheet: Ethidium bromide, 1% Solution/Molecular Biology. , (2010).
  19. Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. . Current Protocols in Molecular Biology. , (1994).
  20. Yoo, S. H., et al. A noncanonical E-box enhancer drives mouse Period2 circadian oscillations in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (7), 2608-2613 (2005).
  21. Chen, Z., et al. Identification of diverse modulators of central and peripheral circadian clocks by high-throughput chemical screening. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (1), 101-106 (2012).
  22. Fang, M., Guo, W. R., Park, Y., Kang, H. G., Zarbl, H. Enhancement of NAD+-dependent SIRT1 deacetylase activity by methylselenocysteine resets the circadian clock in carcinogen-treated mammary epithelial cells. Oncotarget. , (2015).
  23. Chen-Goodspeed, M., Lee, C. C. Tumor suppression and circadian function. J Biol Rhythms. 22 (4), 291-298 (2007).
  24. Balsalobre, A. Clock genes in mammalian peripheral tissues. Cell Tissue Res. 309 (1), 193-199 (2002).
  25. Jung-Hynes, B., Huang, W., Reiter, R. J., Ahmad, N. Melatonin resynchronizes dysregulated circadian rhythm circuitry in human prostate cancer cells. J Pineal Res. 49 (1), 60-68 (2010).
  26. von Gall, C., et al. Melatonin plays a crucial role in the regulation of rhythmic clock gene expression in the mouse pars tuberalis. Ann N Y Acad Sci. 1040, 508-511 (2005).
  27. Vujovic, N., Davidson, A. J., Menaker, M. Sympathetic input modulates, but does not determine, phase of peripheral circadian oscillators. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 295 (1), R355-R360 (2008).
  28. Schofl, C., Becker, C., Prank, K., von zur Muhlen, A., Brabant, G. Twenty-four-hour rhythms of plasma catecholamines and their relation to cardiovascular parameters in healthy young men. Eur J Endocrinol. 137 (6), 675-683 (1997).
  29. Yu, H., et al. Circadian rhythm of circulating fibroblast growth factor 21 is related to diurnal changes in fatty acids in humans. Clin Chem. 57 (5), 691-700 (2011).
  30. Nakagawa, H., et al. Modulation of circadian rhythm of DNA synthesis in tumor cells by inhibiting platelet-derived growth factor signaling. J Pharmacol Sci. 107 (4), 401-407 (2008).
  31. Yang, X., Guo, M., Wan, Y. J. Deregulation of growth factor, circadian clock, and cell cycle signaling in regenerating hepatocyte RXRalpha-deficient mouse livers. Am J Pathol. 176 (2), 733-743 (2010).
  32. Virag, L. Structure and function of poly(ADP-ribose) polymerase-1: role in oxidative stress-related pathologies. Curr Vasc Pharmacol. 3 (3), 209-214 (2005).
  33. Kon, N., Sugiyama, Y., Yoshitane, H., Kameshita, I., Fukada, Y. Cell-based inhibitor screening identifies multiple protein kinases important for circadian clock oscillations. Commun Integr Biol. 8 (4), e982405 (2015).
  34. Ramanathan, C., Khan, S. K., Kathale, N. D., Xu, H., Liu, A. C. Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters. J Vis Exp. (67), e4234 (2012).
  35. Welsh, D. K., Yoo, S. H., Liu, A. C., Takahashi, J. S., Kay, S. A. Bioluminescence imaging of individual fibroblasts reveals persistent, independently phased circadian rhythms of clock gene expression. Curr Biol. 14 (24), 2289-2295 (2004).

Play Video

Cite This Article
Fang, M., Kang, H., Park, Y., Estrella, B., Zarbl, H. In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (127), e55832, doi:10.3791/55832 (2017).

View Video