Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

In Vitro Dosaggio di bioluminescenza per caratterizzare il ritmo circadiano in cellule epiteliali mammarie

doi: 10.3791/55832 Published: September 28, 2017

Summary

Un'analisi di bioluminescenza in vitro per determinare il ritmo circadiano cellulare in cellule epiteliali mammarie è presentata. Questo metodo utilizza plasmidi di reporter di cellule di mammifero che esprimono destabilizzato luciferasi sotto il controllo del promotore del gene di periodo 2 . Può essere adattato ad altri tipi di cella per valutare gli effetti di organo-specific il ritmo circadiano.

Abstract

Il ritmo circadiano è un processo fisiologico fondamentale presente in tutti gli organismi che regola i processi biologici che vanno dall'espressione genica di dormire comportamento. Nei vertebrati, ritmo circadiano è controllato da un oscillatore molecolare che funziona sia nel nucleo soprachiasmatico (SCN; centrale dello stimolatore cardiaco) e singole celle che comprende tessuti più periferici. Più importante, la rottura del ritmo circadiano di esposizione alla luce di notte, fattori di stress ambientale e/o sostanze tossiche è associata a un aumentato rischio di malattie croniche e l'invecchiamento. La capacità di identificare gli agenti che possono interferire con orologi biologici centrali e/o periferici e gli agenti che possono impedire o attenuare gli effetti della perturbazione circadiana, ha implicazioni significative per la prevenzione delle malattie croniche. Anche se i modelli del roditore possono essere utilizzati per identificare le esposizioni e gli agenti che inducono o prevenire/ridurre la rottura circadiana, questi esperimenti richiedono un numero elevato di animali. In vivo gli studi inoltre richiedono infrastrutture e risorse significative e i ricercatori a lavorare tutta la notte. Così, c'è un urgente bisogno di un sistema appropriato in vitro di cellula-tipo di schermo per ambientali interferenti circadiani e rinforzatori in tipi cellulari da diversi organi e Stati di malattia. Abbiamo costruito un vettore che guida la trascrizione della luciferasi destabilizzato in cellule eucariotiche, sotto il controllo del promotore del gene umano di periodo 2 . Questa costruzione del reporter circadiano era trasfettata stabilmente in cellule epiteliali mammarie umane e cellule circadiano reattivo reporter sono state selezionate per sviluppare il saggio in vitro bioluminescenza. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per stabilire e convalidare il dosaggio. Forniamo ulteriori dettagli per prova degli esperimenti di concetto che dimostra la capacità della nostra analisi in vitro di ricapitolare gli effetti in vivo di vari prodotti chimici sul cellulare orologio biologico. I risultati indicano che il dosaggio può essere adattato ad una varietà di tipi cellulari per lo screening sia ambientali interferenti e chemopreventive esaltatori di orologi circadiani.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

L'orologio circadiano regola una vasta gamma di processi biologici da diurni espressione dei geni per dormire il comportamento in un ritmo prevedibile con una periodicità di circa 24 h. epidemiologico gli studi suggeriscono fortemente che rottura cronica del circadiano ritmo aumenta il rischio di cancro al seno e alla prostata nei turnisti, tra cui gli infermieri e gli equipaggi di volo1,2,3. Questi risultati sono confermati dagli studi del roditore, che dimostrano che l'esposizione a cicli di luce di notte, o luce di luce costante, che imitano il jet lag aumento l'incidenza del tumore e accelera la crescita del tumore4,5. Basato su dati provenienti da studi sia umani e del roditore, l'Agenzia internazionale per ricerca sul cancro classificati turni di lavoro come agente cancerogeno umano probabile (tipo 2A) in 20106.

Precedentemente, abbiamo dimostrato che una singola dose cancerogena dell'agente cancerogeno specifico tumore mammario, N- nitroso-N- methylurea (NMU), interrotto l'espressione circadiana dei principali geni circadiani (CGs) (ad es., periodo 2 , Per2) e parecchi geni circadiani controllato (GCC), tra cui chiave reattivo il danno del DNA e ripristino geni (DDRR) nella ghiandola mammaria di destinazione (ma non nel fegato). Inoltre, reimpostare l'espressione circadiana dei geni sia Per2 e DDRR verso il normale da un regime chemopreventive dell'alimentari L-metil-selenocisteina (MSC) ha ridotto l'incidenza del tumore del 63%. Questi risultati sono stati i primi a mostrare un collegamento meccanicistico tra ritmo circadiano, carcinogenesi chimica e chemoprevention7,8. Esposizioni verso altri tossici ambientali indicate per interrompere gene circadiano espressione in vivo inoltre sono associate con un rischio aumentato di malattie ambientali9,10. La comprensione dei meccanismi che collegano la rottura circadiana di tossici ambientali e patogenesi può portare a meccanicistico approcci alla prevenzione della malattia. Tuttavia, gli studi volti a definire le interazioni tra le esposizioni e ritmo circadiano sono di solito eseguite in vivo. Un tipico in vivo esperimento studiando che l'impatto sul ritmo circadiano richiede grandi quantità di animali, tessuti da almeno tre di controllo e tre animali esposti devono essere raccolti ogni 3-4 ore su un periodo di 24 o 48 h. Sviluppo di un sistema convalidato in vitro che ricapitola in vivo osservazioni e meccanismi sarebbe quindi non solo riducono il numero di animali necessari, ma anche drasticamente ridurre i costi sperimentali e il requisito che i ricercatori lavorano continuativamente per un periodo di 24-48 h. Inoltre, un sistema convalidato in vitro potrebbe essere usato per screening su vasta scala di composti e/o alterazioni genetiche che influenzano il ritmo circadiano, o la sua risposta a fattori di stress ambientale o sostanze tossiche. Pertanto, la combinazione strategica di modelli in vitro e in vivo e gli esperimenti sono necessari per ottenere diverse intuizioni con diversa attenzione.

Nei mammiferi, oscillatori circadiani esistano non solo nei neuroni specializzati del SCN, ma anche in diversi tipi di cellule più periferiche. Questi orologi molecolari sono simili a quelli nelle linee cellulari stabilite del fibroblasto e nei fibroblasti primari da embrioni o animali adulti; Tuttavia, c'è una necessità per tessuto modelli cellulari di tipo-specific11. Di conseguenza, gli studi tradizionali di attività locomotrice in vivo, SCN espianti ex vivoe saggi basati su cellule in vitro in cellule immortalizzate del fibroblasto sono ampiamente usati per studiare i difetti circadiani cella-autonoma. Tuttavia, non ci sono prove che indicano che un in vitro dei fibroblasti basati su cellule test può ricapitolare meccanismi circadiani e risposte presentano in cellule di altri organi periferici in vivo. Diversi tipi di cellule possono avere modelli distinti di espressione genica, metabolismo xenobiotico e DDRR, e i legami tra tossicità ed espressione genica circadiana possono essere cellula-tipo specifico e/o modulata da diversi parametri fisiologici. Inoltre, oscillatori circadiani nei sistemi basati su fibroblasti non sono stati completamente valutati per risposte a tossici ambientali, fattori di stress e agenti preventivi che collegano le esposizioni ai meccanismi di prevenzione e lo sviluppo della malattia. Così, c'è una necessità per facile, convalidato cellula-tipo specifico, le analisi in vitro bioluminescenza per studiare gli interferenti circadiano ambientali specifici di organo. Anche se una varietà di modelli di orologio cellulare (ad es., nel fegato, cheratinociti e le cellule di grasso, nonché una linea di cellule di osteosarcoma) sono state sviluppate in anni recenti12,13,14, 15, il dosaggio descritto qui è il primo modello di orologio cellulare in cellule epiteliali del seno e la prima dimostrazione in vivo risposte a fattori di stress ambientale, sostanze tossiche, farmaci e agenti chemopreventive di ricapitolare.

Renilla luciferasi (rLuc) e luciferasi firefly 30-61 kDa proteine monomeriche che non necessitano di posttranslational elaborazione dell'attività enzimatica e possono funzionare come un reporter genetico immediatamente dopo la traduzione. Una volta che il substrato si associa con l'enzima luciferasi, la reazione biochimica catalizzata genera un lampo di luce. Così, la luciferasi costrutti sono ampiamente usati come espressione gene reporter sistema in vitro e in vivo. Tuttavia, negli studi di ritmo circadiano, l'utilità del reporter di luciferase è limitato il tempo di dimezzamento relativamente lunga della proteina luciferasi (T1/2 = h 3,68) relativa al periodo (soprattutto per il breve periodo) per mutazioni nel gene circadiano espressione; Tuttavia, numerosi studi nel corso degli anni hanno utilizzato con successo il gene della luciferasi nel vettore pGL3, che indica che la luciferasi rapidamente degradabile potrebbero non essere necessario per aver segnalato i ritmi circadiani, soprattutto per i ritmi con un periodo più lungo, come 24 h. Pertanto, un reporter del utilizzando il vettore di luciferasi destabilizzato, pGL [Luc2P/Neo], che contiene hPEST (una sequenza di destabilizzazione della proteina) è stato sviluppato, che ci permette di usarlo come un vettore reporter circadiano per nostra attuale in vitro analisi di bioluminescenza. La proteina codificata da Luc2P ha una molto più breve emivita (T1/2 = 0,84 h) e quindi, risponde più velocemente e con un ordine di grandezza maggiore ai cambiamenti nell'attività trascrizionale che il selvaggio-tipo, hoSPI che può essere utilizzato per monitorare l'espressione ritmica della luciferasi regolato dal promotore PER2 con precisione in tempo reale16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. costruzione del PER2 promotore guidato destabilizzato Luciferase Reporter vettore

  1. acquistare un oggetto personalizzato pLS [hPER2P / rLuc / Puro] vettore che contiene il cDNA codificante rLuc e umani Frammento di promotore PER2 (hPER2P, 941 bp) presso il sito tra Sac I e Hind III a clonazione più regione 17.
  2. Tagliare il frammento di promotore PER2 umano (hPER2P, 941 bp) fuori dal vettore. Buffer di enzima di restrizione
    1. aggiungere 2,5 µ l, 10 µ l (180 ng) pLS [hPER2P / rLuc / Puro] vettore e 1 µ l di enzimi di restrizione, Sac I (10 unità / µ l) e Hind III (10 unità / µ l), in un DNA/RNA/nucleotide-gratuito tubo del microcentrifuge. Aggiungere acqua ultrapura (10,5 µ l) fino a 25 µ l e mescolare dolcemente pipettando.
    2. Incubare a 37 ° C per 90 min in un blocco di riscaldamento.
    3. Eseguire l'intero volume (25 µ l) della reazione degli enzimi di limitazione su gel di agarosio di 0,7% contenente 0,0001% etidio bromuro (EtBr) per separare il hPER2P dal vettore.
      Nota: EtBr, bromuro di 3,8-diamino-1-ethyl-6-phenylphenantridinium (numero di registrazione di CAS: 1239-45-8), è un liquido inodore rosso. È un agente intercalante che è comunemente usato come un fluorescente tag (colorante acido nucleico) nell'elettroforesi del gel di agarosio e visibile come un colore arancione sotto la luce UV. Possibili rischi di effetti mutageni irreversibili si sono verificati in animali da esperimento, anche se nessuno degli enti regolatori Classificato come un agente cancerogeno 18. Di conseguenza, abbiamo raccolto agarosio utilizzato gel ed elettroforesi tampone contenente EtBr come rifiuti rischio chimico e richiesto da Rutgers Environmental Health & sicurezza (REHS) per raccogliere e smaltire in modo sicuro.
    4. Tagliare un pezzo di gel di agarosio contenente una banda di fluorescenza di EtBr a 941 bp e purificare i frammenti hPER2P dal gel con un kit di estrazione del DNA gel, seguito da quantificazione su uno spettrofotometro misurando la densità di assorbimento (OD) a 260 Nm.
  3. Linearizzare 1,0 µ l (1 µ g) del vettore di espressione destabilizzato firefly luciferase, pGL [Luc2P / Neo] con lo stesso metodo come descritto nella procedura 1.2.1-1.2.2. Estrarre il vettore con un kit di pulizia del DNA seguito da quantificazione come descritto in precedenza utilizzando uno spettrofotometro.
  4. Legare il hPER2P nel vettore linearizzato pGL [Luc2P / Neo].
    Nota: Per il produttore ' s instruction, l'ideale rapporto molare di inserto e vettore è 2:1. Per vettore di ng 50, la quantità ideale di inserimento viene calcolata come 23,6 ng con una formula, [(50 ng vector x 1.0 kb insert)/4.242 kb vettoriale] x (2/1) = 23,6 ng inserto]. Basato sulle concentrazioni di hPER2P (7,26 ng / µ l) e pGL [Luc2P / Neo] (50 ng / µ l), i volumi di 50 ng pGL [Luc2P / Neo] e 23,6 ng hPER2P sono calcolati come 1 µ l e 3,26 µ l, rispettivamente. Reazione di
    1. ligasi del DNA T4 di aggiungere 2 µ l tampone (10 X) (50 mM Tris-HCl 10 mM MgCl 2, 1mm ATP e 10 mM DTT), 3,26 µ l (23,6 ng) hPER2P, 1 µ l (50 ng) pGL [Luc2P / Neo], e 13,74 µ l acqua fino a 20 µ l , mescolare delicatamente.
    2. Aggiungere 1 µ l T4 DNA ligasi (400 unità / µ l), mescolare delicatamente e incubare a 16 ° C durante la notte in un termociclatore e poi raffreddare il vettore legato sul ghiaccio per il produttore ' Istruzione s.
  5. Trasformare il vettore dei pGL [hPer2P / Luc2P / Neo] a chimicamente competente Escherichia coli 19.
    1. Impostare il bagno di acqua a 42 ° C, scaldare il brodo ottimale Super con il mezzo di repressione (S.O.C) dei cataboliti (2% Tryptone, 0,5%, Estratto di lievito, 10 millimetri di NaCl, 2.5 mM KCl, 10mm MgCl 2, 10mm MgSO 4 e 20 millimetri di glucosio) a temperatura ambiente , riscaldare la piastra di agar Luria-Bertani (LB) (contenente 100 µ g/mL ampicillina, 80 µ g/mL X-gal e 0,5 µM IPTG), in incubatore a 37 ° C e scongelare su ghiaccio un flaconcino di competente Escherichia coli cellule per ogni trasformazione.
    2. Aggiungere 6 µ l (21 ng) legato 1 µ l o vettoriale (30 ng) vettore (controllo negativo) per un tubo di chimicamente competenti Escherichia coli (50 µ l) vuoto e poi capovolgere delicatamente il tubo per mescolare. Incubare in ghiaccio per 30 min.
    3. Heat shock in bagnomaria a 42 ° C per 30 s senza agitazione e poi tornare alla Ice.
  6. Selezionare una colonia di Escherichia coli trasformata con un vettore dei utilizzando lo screening blu/bianco.
    1. Medie aggiungere 250 µ l S.O.C il trasformato e. coli tube e incubare per 1h a 37 ° C con agitazione a 200 giri/min.
    2. Si è diffusa in modo uniforme 10-50 µ l di trasformato Escherichia coli sulla superficie della piastra di agar LB. Mettere la piastra capovolta in incubatore a 37 ° C durante la notte.
      Nota: Una reazione efficiente clonazione dovrebbe produrre diverse colonie di centinaia. Due diversi volumi di placcatura è consigliata per garantire che almeno un piatto avrà colore chiaro grande, bianco o blu e le colonie ben distanziati. Quando le colonie sono troppo piccole e il colore non è distinguibile, utilizzando un microscopio (10 X o 50 X) è disponibile.
    3. Pick 3-6 colonie bianchi dalle piastre con dente sterilizzato bastoni e rilasciare ogni colonia nel tubo una cultura contenente 4 mL di terreno di coltura LB con ampicillina di 50 µ g/mL.
    4. Incubare le provette a 37 ° C con agitazione a 200 giri/min durante la notte. Estrarre il DNA con 2 mL di 4 mL coltivate con un plasmide DNA estrazione mini prep kit per il fabbricante l'e. coli ' Istruzione s.
  7. Verificare e analizzare l'inserto (hPER2P, 941 bp)
    1. digerire il DNA del plasmide con enzimi di restrizione ed eseguire l'elettroforesi come descritto nella procedura 1.2.1-1.2.3 per confermare se c'è un inserto.
      Nota: Controllo positivo (hPER2P purificato al punto 1.2.4) e controllo negativo (e. coli trasformate con un vettore vuoto) sono stati inclusi.
    2. Sequenza DNA plasmidico selezionato utilizzando M13 in avanti ed iniettori d'inversione M13 per confermare l'orientamento e la sequenza di inserto a plasmide 19.
      Nota: Solo una colonia che aveva un inserto con la dimensione corretta del hPER2P in elettroforesi e corretto orientamento e sequenza nel risultato sequenziamento è stato selezionato.
    3. Analizzare il frammento di promotore PER2 umano (hPER2P, 941 bp) di sequenza per gli elementi normativi circadiani, tra cui motivi di E-box (un sito di legame di Bmal1, CAT/CGTG), CCAATC, GC box e trascrizione start sito (CAGCGG) 20.
  8. Amplifica il selezionato Escherichia coli aggiungendo il rimanente da 2 mL coltivato Escherichia coli in mL 200 LB terreno di coltura contenente ampicillina di 50 µ g/mL e poi incubazione durante la notte, a 37 ° C con agitazione a 200 giri/min.
  9. Estrarre DNA con un maxi privo di endotossina plasmide prep kit per ogni il produttore ' Istruzione s e quindi di quantificarlo misurando OD a 260 Nm con uno spettrofotometro. Aliquotare e archivio il DNA del plasmide, pGL [hPer2P/Luc2P/Neo], in congelatore a-80 ° C per un uso futuro.

2. Trasfezione transiente

  1. acquisto e coltura di cellule di MCF10A
    1. acquisto un'immortalizzate, non trasformate normale umano linea cellulare epiteliale mammaria (MCF10A) da un commerciale di banca di cellule, dove le cellule sono citogeneticamente testato e autenticato con breve ripetizione in tandem analisi prima del congelamento. Scongelare e mantenere ogni flaconcino di cellule congelate in coltura per un massimo di 8 settimane.
      Nota: A differenza di altre cellule, queste cellule hanno inibizione da contatto una volta che ottengono alla confluenza di ~ 70%. Richiede quella sottocultura avviene a circa il 70%.
    2. Della coltura le cellule con il mezzo di crescita delle cellule epiteliali mammarie (MEGM), che contiene la sostanza basale epiteliale mammaria (MEBM), supplementi di crescita e tossina del colera in un'incubatrice di coltura cellulare a 37 ° C, umidità 95% e 5% CO 2.
      Nota: Acquisto di fattori di crescita di ready-to-use forniti in SingleQuot (SQ) e ottenere la tossina del colera separatamente. Le concentrazioni finali dei supplementi di crescita sono bovina estratto pituitario 0,4%, 0,1% insulina, idrocortisone 0.1%, 0,1% fattori di crescita epidermico umano, tossina del colera di 100 ng/mL e 0.05% gentamicina solfato e 0.05% amfotericina B.
    3. Dissociare le cellule nella piastra di coltura di 10 cm di incubazione con 10 mL di tripsina/EDTA per ~ 20 min e quindi neutralizzare la tripsina aggiungendo tripsina 10ml soluzione neutralizzante. Raccogliere tutte le celle con HEPES buffer soluzione salina (HBSS).
    4. Contare le celle con un emocitometro sotto un microscopio invertito e calcolare la concentrazione della sospensione unicellulare e seme poi un certo numero di cellule, come necessario. Agitare le piastre accuratamente per ottenere una distribuzione uniforme delle cellule in ogni piatto. Incubare le cellule nell'incubatore di cultura cellulare a 37 ° C, umidità 95% e 5% CO 2.
      Nota: Acquistare una confezione di reagenti di sottocultura contenente tripsina/EDTA, soluzione neutralizzante tripsina e HBSS utilizzare.
  2. Transitori di transfezione delle cellule con il vettore circadiano costruito.
    1. Seme 2 x 10 5 MCF10A cellule uniformemente in 35mm coltura piatto con MEGM e crescere fino a 20-30% confluenza (giorno successivo).
    2. Media del siero
    3. warm up ridotto (ad es., Opti-MEM) a 37 ° C acqua vasca e transfezione reagente a temperatura ambiente per 30 min. Diluire il plasmide DNA costruito (pGL [hPer2P / Luc2P / Neo]) a 30 ng / µ l con endo-tossina libera Tampone Tris-EDTA (TE) e tenerlo a temperatura ambiente.
    4. Preparare la miscela di transfezione del plasmide in una microcentrifuga da 1,5 mL aggiungendo 63,6 µ l siero riduttore caldo media prima, quindi l'aggiunta di DNA del plasmide (0,1 µ g) µ l 33,4 e mescolare delicatamente il pipettaggio, e infine aggiungendo 3 µ l di transfezione reagente direttamente nel centro del tubo senza toccare la parete. Dopo la miscelazione dolcemente pipettando, conservare a temperatura ambiente per 30 min.
    5. Cadere l'impasto intero plasmide (100 µ l) direttamente sulla superficie del centro del mezzo nel piatto e poi mescolare delicatamente agitando il piatto. Coltura le cellule in un incubatore a CO 2 per altre 48-72 h.
      Nota: Si prevede che la massima efficienza di trasfezione sarebbe alla confluenza di 40-70% di queste cellule a causa della loro inibizione da contatto a ~ 70%. Di conseguenza, la transfezione funziona migliori a partire da ~ 20% e fermata a ~ 70% confluenza.

3. Istituzione del dosaggio bioluminescenza In Vitro in cellule di MCF10A transitoriamente Transfected

  1. morire di fame le cellule coltivate alla confluenza di ~ 70% (dopo la trasfezione per 48-72 h) in MEBM senza fattori di crescita per 24 h.
  2. Trattare le cellule con l'agente di sincronizzazione (ad esempio, 50% di siero equino (HS)) in MEBM per 1,5 h in incubatore a CO 2.
    Nota: Per la selezione di un agente di sincronizzazione ideale, 10 µM forskolin, 1 nM melatonina, desametasone 0,1 µM, 50% HS e 100% SQ sono stati confrontati in termini di ampiezza circadiana e periodo nelle cellule circadiano vettoriale trasfettate. Vettore vuoto transfettate le cellule sono trattate con 100% SQ come controllo negativo.
  3. Supporto di registrazione di pre-prepare 20 mL (per 10 dei piatti di cultura 30mm) aggiungendo 5 mL di MEGM, 15 mL di MEBM, 150 µ l bicarbonato di sodio, 200 µ l HEPES e luciferina 40 µ l di soluzione (50 mM) in una provetta da centrifuga 50 mL sterilizzato riserva.
    Nota: Le concentrazioni finali dei singoli componenti: 20% SQ e tossina del colera 20 ng/mL, bicarbonato di sodio 0,06%, 1% di penicillina/streptomicina e 10 mM HEPES. Riscaldamento pre-preparati registrazione medio e sterilizzato 1X PBS per 30 min a 37 ° C bagno d'acqua. Aggiungere 100 luciferina µM immediatamente prima dell'uso.
  4. Lavare le cellule con caldo 1 x Dulbecco ' s Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) per 3 volte dopo l'incubazione con l'agente di sincronizzazione e quindi aggiungere 2 mL di mezzo di registrazione.
  5. Guarnizione il piatto con una classe di copertura sterilizzato utilizzando grasso al silicone per evitare l'evaporazione e quindi apporre un'etichetta sul lato.
  6. Porre la capsula sigillata nella sede all'interno del luminometro e attivare l'opzione per salvare il percorso del file nella cartella (per il dettaglio, vedi sezione 6).

4. Selezione di cellule stabilmente trasfettate con

  1. ottimizzare una concentrazione ideale G418 (800 µ g/mL) con un'analisi della curva di uccidere secondo il produttore ' istruzione di s per la selezione delle cellule stabilmente trasfettate.
  2. Dopo trasfezione transiente per 48 o 72 ore, sottocultura e seme le cellule con MEGM in piatti più grandi alle 5.000 cellule/piatto (100 mm). Dopo 24 h cultura nell'incubatrice di coltura cellulare (37 ° C, umidità 95% e 5% CO 2), trattare le cellule con 800 µ g/mL di G418 sostituendo il vecchio mezzo con nuovo medium contenente 800 µ g/mL G418 ogni 3-4 giorni per 2 settimane.
  3. Sottocultura sopravvivente stabilmente trasfettate colonie per passaggi 1-3 con MEGM contenente 500 µ g/mL G418 per mantenere l'espressione stabile di hPer2P/Luc2P e congelato in azoto liquido per un utilizzo futuro.
  4. Trattamento di 500 µ g/mL G418 dopo la subcoltura generale per selezionare nuovamente la popolazione stabilmente trasfettata delle cellule, se l'intensità di bioluminescenza nel risultato dell'analisi di bioluminescenza in vitro diventa progressivamente più basso dopo l'uso in molti passaggi.

5. Trattamento con prodotti chimici

  1. alle 48 ore o 72 ore post-transfezione, morire di fame le cellule da fattori di crescita in MEBM per 24 h.
  2. Dopo la sincronizzazione con 50% HS per 2 h, trattare le cellule con 0,25 o 0,5 mM nitrosomethylurea (NMU), 20 nM EX527 o cambinol di 1 µM per 1 h a MEBM contenente 20% sq.
  3. Dopo il lavaggio con 1 x D-PBS, Aggiungi registrazione media contenente 12,5 µM MSC da soli o in combinazione con 20 nM EX527 o cambinol di 1 µM, alle cellule. Monitoraggio la bioluminescenza con il luminometro.
  4. Trattare il MCF10A stabilmente trasfettate / PER2-cellule dLuc con NMU a 0,5, 1 o 2 mM, EX527 a 40 nM, o Cambinol a 2,0 µM, per 1 h dopo la sincronizzazione con 50% HS e poi incubare le cellule in registrazione media contenente 12,5 µM di MSC o dosi differenti (5, 10 o 20 µM) di n-acetilcisteina (NAC). Inserire le piastre sul luminometro, record e salvare la bioluminescenza dal luminometro per 4-8 giorni come descritto nella sezione 3.6.
    Nota: NMU è una nitrosourea metilato composto con proprietà mutagene, cancerogene e teratogene. NMU è un agente alchilante ad azione diretta e ha una breve emivita (T 1/2 = ~ 30 min). È stabile alle condizioni acide (pH 4-5), ma instabile stato alcalino (pH 9-10) e a temperature oltre i 20 ° C. Di conseguenza, candeggina al 10% utilizzabile come un efficace agente di disattivazione per pulizia di superfici panca e mercanzie di laboratorio potenzialmente contaminate da Solutia NMUsu. Soluzione di riserva avanzi è prelevati e smaltiti in modo sicuro da REHS. Base alla modalità di azione di prodotti chimici, cellule sincronizzate possono essere trattate per tempi più brevi prima coltura in supporto di registrazione. Le cellule possono anche essere trattate a mezzo di registrazione per un tempo più lungo (diversi giorni).

6. Raccolta dati, analisi e presentazione

Nota: attuabilità delle cellule deve essere determinata utilizzando metodi standard (ad es., analisi di MTT) dopo il trattamento delle cellule alle stesse concentrazioni per gli stessi tempi indicati. Tutte le concentrazioni di trattamento usate per il test di bioluminescenza in vitro sono stati inferiori al 30% di concentrazione letale (LC30). Tutti gli esperimenti sono stati condotti in triplice copia e sono stati presentati i risultati rappresentativi.

  1. Dopo aver sigillato il piatto (passo 3.5), caricare i piatti su sedi nel luminometro, che viene mantenuto all'interno di un incubatore a 37 ° C senza H 2 O e CO 2 e collegato a un computer.
  2. Clic " salvare " e immettere i nomi per la cartella e il file dove verrà salvato il segnale di luminescenza registrato dal piatto corrispondente.
    Nota: Il sistema rileva il segnale di luminescenza in tempo reale dalle cellule nel piatto alle singole posizioni. I segnali vengono trasferiti al computer tramite 4-photon-counting "tubi fotomoltiplicatori" e salvati e visualizzati nel computer di software di raccolta dati.
  3. Analizzare i segnali dopo aver registrato per 4-7 giorni, che potrebbe essere seguita da cambiamento medio e registrazione continua per una seconda settimana se necessario.
    Nota: Per ottenere i parametri circadiani, tra cui fase, durata del periodo, ampiezza di ritmo e smorzamento tasso, abbiamo usato il software di analisi di luminometro per analizzare i dati di bioluminescenza.
  4. Detrend dati raw con una media in esecuzione e analizzare il meglio-si adatta a un'onda sinusoidale per ottenere periodo, fase, ampiezza e smorzamento tasso 21 , 22.
  5. Dovuto la bioluminescenza transitoria alta al momento di trattamento e di cambiamento medio, escludere il primo ciclo di dati da analisi.
  6. Per la presentazione dei dati, tracciare i dati grezzi (bioluminescenza, conteggio/s) contro il tempo (ore o giorni). Quando necessario, possono essere tracciati i dati baseline-sottratto per confrontare l'ampiezza e la fase.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Vettore reporter circadiano bioluminescenza: espressione umana di promotore-guidato da PER2 della variante destabilizzato luciferasi

La sequenza di DNA che comprende un frammento di bp 941 derivato dal promotore PER2 umano utilizzato per costruire il vettore reporter circadiano, pGL [hPer2P/Luc2P/Neo, in primo luogo è stato analizzato per la presenza di elementi regolatori conosciuta per regolare espressione genica circadiana. L'analisi bioinformatica ha mostrato che all'interno di questo frammento di promotore, esistono tre diversi siti di legame di Bmal1 (E-box) (CAT/CGTG), due siti d'aumento circadiano trascrizione (CCAATG), due caselle di GC e un sito di inizio della trascrizione (Figura 1). Quindi questo vettore reporter è stato anticipato in modo da riflettere l'espressione genica circadiana.

Ottimizzazione dell'agente di sincronizzazione

Parecchi agenti sono stati utilizzati per sincronizzare o influenzare il ritmo circadiano autonomo delle cellule dei fibroblasti in vitro studi bioluminescenza. Per selezionare un agente di sincronizzazione specifiche efficiente ed economica di tipo delle cellule in cellule epiteliali mammarie, abbiamo confrontato 10 µM forskolin, 1 nM melatonina, desametasone 0,1 µM, 50% HS e 100% SQ in cellule epiteliali mammarie (MCF10A) transfettate transitoriamente con il vettore reporter circadiano. Le cellule sincronizzate con 50% HS ha mostrato il miglior ritmo circadiano, con 3 punte di circadiano indotto luminescenza, rispetto a solo uno o due picchi in cellule sincronizzate con altri agenti. Inoltre, i profili di bioluminescenza delle cellule sincronizzate con 50% HS prodotto periodo accettabile, ampiezza e valore più appropriato durante l'analisi dei dati (Figura 2). Basato su questi risultati, abbiamo selezionato questo metodo redditizio come l'agente di sincronizzazione del cellulare per tutti i successivi esperimenti.

Interruzione e ripristino del ritmo circadiano cellulare da esposizione a sostanze chimiche

In questo modello in vitro , non trattate, transitoriamente transfected le cellule (gruppo di controllo) hanno mostrato almeno due cicli completi di luminescenza segnalazione dopo la sincronizzazione (Figura 3A). Le cellule esposte all'agente mutageno ad azione diretta, NMU, ha mostrato una perturbazione di dose-dipendente dell'espressione genica circadiana come riflesso dalla perdita dei picchi di luminescenza. Mentre il trattamento con 0,25 mM NMU non ha rovinato il ritmo circadiano cellulare, una dose di 0,5 mM NMU inizialmente in ritardo e successivamente abolito il ritmo circadiano, come indicato dalla scomparsa del secondo picco di luminescenza di post-trattamento ~ 72 h. Inibizione dell'attività di SIRT1 con 20 nM Ex257 o 1 µM cambinol allo stesso modo interrotto ritmo circadiano di bagnatura il successivo ciclo circadiano (Figura 3A-1). D'importanza, l'aggiunta di MSC (12,5 µM) al terreno di coltura restaurato verso normali cicli di primi e secondo dell'espressione genica circadiana in cellule trattate con NMU. MSC non solo ripristinare il ritmo interrotto da NMU, ma inoltre ha impedito gli effetti dirompenti della SIRT1 inibitori, Ex257 e cambinol (Figura 3A-2).

In cellule trasfettate stabilmente, inibitori sia NMU e SIRT1 interrotto il ritmo circadiano, sebbene a concentrazioni più elevate rispetto a quella osservata in trasfettanti transitoria (Figura 3B-1). MSC (12,5 µM) restaurato i ritmi circadiani nelle cellule pretrattate con 1 mM NMU (Figura 3B-2). Ancora più importante, MSC inoltre ripristinati i ritmi circadiani nelle cellule trattate con inibitori di SIRT1, compreso EX257 (40 nM) (Figura 3B-3) e cambinol (2 µM) (Figura 3B(4)), rispettivamente.

Nel confronto tra Figura 3A e 3B di figura, l'intensità di bioluminescenza era molto più alto, ma il ritmo è stato sostenuto per un tempo più breve in cellule trasfettate transientemente vs trasfettata stabilmente le cellule (~ 10 volte superiore, 2 volte più breve) in generale, anche dopo il trattamento delle cellule con NMU o MSC. Inoltre, il ritmo circadiano cellulare è stato 2 volte più sensibile all'esposizione a sostanze chimiche nelle cellule transitoriamente transfected confrontate alle cellule trasfettate stabilmente.

Cambiamento quantitativo dipendente dalla dose di ritmo circadiano cellulare da sostanze chimiche

Allo stesso modo, il ritmo circadiano cellulare interrotto delle cellule trasfettate stabilmente trattati con 1 mM NMU è stato restaurato dal trattamento di NAC in maniera dose-dipendente (0-20 µM) (Figura 4A) come osservato nei cambiamenti del periodo circadiano (Figura 4B ) e fase (Figura 4).

Figure 1
Figura 1: Sequenza del frammento di promotore umano PER2 e del vettore reporter circadiano. (A) frammento promotore umano PER2 (941 bp) è stato sequenziato, e la sequenza è stata analizzata per gli elementi del promotore circadiano funzionale. E-box, CACGTT / CATGTG; circadiano trascrizione migliorare il sito, CCAATG; Casella di GC, CGCCCC / GGGGCGGG; trascrizione a partire sito (TSS): CAGCGG. (B) diagramma schematico del vettore reporter di luciferase destabilizzato, pGL [hPer2P/Luc2P/Neo]. La trascrizione della luciferasi destabilizzato (dLuc) è sotto il diretto controllo del promotore hPER2 . Un gene di resistenza di neomicina co-espressi (Neo) facilita la selezione delle cellule infettate da G418. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: sincronizzazione di in vitro ritmo circadiano cellulare dagli agenti di sincronizzazione diversi. Dopo inedia 24h, cellule di MCF10A transfettate transitoriamente dal vettore reporter circadiano sono state trattate con ogni agente di sincronizzazione per 2 h, seguito da segnale di luminescenza di registrazione. Blu, il forskolin 10 µM; rosso, 1 melatonina nM; verde, desametasone µM 0,1; porpora; 50% di siero equino (HS); Teal, 100% SingleQuot (SQ); giallo, vuoto vettoriale (controllo negativo). Asse x, tempo (giorno); Asse y, bioluminescenza (Conte/min). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.


Figura 3: MSC restaurato cellulari ritmi circadiani interrotti dagli inibitori NMU e SIRT1 in cellule epiteliali mammarie in vitro. Bioluminescenza analisi sono state eseguite su MCF10A /PER2-dLuc reporter celle dopo la sincronizzazione con 50% HS. Asse x, tempo (h) (tempo di trattamento post-NMU); Asse y, bioluminescenza (Conte/min). (A) risultati da transitoriamente transfected le cellule. (1) le cellule sono state trattate con 0, 0,25 o 0,5 mM NMU, 20 nM EX527 o cambinol di 1 µM per 1 h dopo la sincronizzazione. Giallo: controllo; rosso: 0,25 mM NMU; verde: 0,5 mM NMU; blu: 20 nM EX527; giallo verde: cambinol di 1 µm. (2) cellule sono state trattate con 12,5 µM MSC da solo o in combinazione con 20 nM EX527 o cambinol di 1 µM in media dopo l'esposizione a 0,5 mM NMU di registrazione. Giallo: Controllo; rosso: 0,25 mM NMU; verde: 0,5 mM NMU; blu: 0,5 mM NMU + 12,5 µM MSC; giallo verde: 0,5 mM NMU + 12,5 µM MSC + 20 nM EX527; viola: 0,5 mM NMU + 12,5 µM MSC + cambinol 1 µM. (B) risultati da cellule trasfettate stabilmente. Il 3rd- 5 picchi dith che ha mostrato pulite e chiare le differenze fra i gruppi sono presentati come un risultato rappresentativo. (1) le cellule sono state trattate con 0, 0.5, 1.0 o 2.0 mM NMU, 40 nM EX527 o cambinol di 2 µM per 1 h dopo la sincronizzazione. Giallo: Controllo; rosso: 0,5 mM NMU; verde: 1,0 mM NMU; blu: 2,0 mM NMU; giallo verde: 40 nM EX527; viola: 2 µM cambinol. (2) cellule sono state trattate con 12,5 µM MSC in media dopo l'esposizione a 1,0 mM NMU di registrazione. Giallo: Controllo; rosso: 1,0 mM NMU; verde: 1,0 mM NMU + 12,5 µM MSC. (3) cellule sono state trattate con seguito di MSC 12,5 µM esposizione a 40 nM EX257. Giallo: Controllo; rosso: 40 nM EX257; verde: 40 nM EX257 + 12,5 µM MSC. (4) le cellule sono state trattate con seguito di MSC 12,5 µM esposizione a 2 µM cambinol. Giallo: Controllo; rosso: 2 µM cambinol; verde: 2 µM cambinol + 25 µM MSC. Questo risultato è stato segnalato precedentemente ed è autorizzato sotto CC BY 2.022. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: dose-dipendente di NAC ha ripristinato il ritmo circadiano cellulare perturbato da NMU. Cellule sono state trattate con 1.0 mM NMU o controllo del veicolo per 1 h dopo la sincronizzazione. (A) risultato rappresentativo della bioluminescenza (Conte/min) contro il tempo (h). Giallo: Controllo; rosso: 1,0 mM NMU; verde: 1,0 mM NMU, 5 µM NAC; blu: 1,0 mM NMU, 10 µM NAC; giallo verde: 1,0 mM NMU, 20 µM NAC. (B) periodo (ore). (C) fase (ore). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

In cellule di mammifero, periodicità dell'orologio circadiano è regolato da anelli di retroazione trascrizionale traslazionale interconnessi. Eterodimeri di Bmal1 e orologio o Npas2 regolare la trascrizione circadiano legandosi agli elementi di E-box nei promotori di nucleo CGs, tra cui Per2 e piangeree numerosi CCGs4. Come si accumulano nella cella, heterodimers di a: Cry traduzionalmente modificati e trasportate al nucleo di reprimere l'attività trascrizionale dell'orologio: Bmal1. Questo ciclo di feedback negativo consente core CGs per regolare la loro trascrizione e impostare l'espressione ritmica dei CGs e CCGs23. Anche se le cellule di mammiferi più avere un orologio circadiano intrinseco, gli orologi in singole celle possono essere sincronizzati da entrambe le condizioni intrinseche (ad es., potenziale redox) e stimoli ambientali esterni24. Espressione genica circadiana in vivo può essere sincronizzato da melatonina, un ormone prodotto dalla ghiandola pineale in risposta ai segnali ricevuti dal pacemaker centrale (SCN). SCN integra segnali dalla luce che interferisce sulla specializzato melanospin-esprimendo le cellule ganglionari retiniche fotosensibili della retina. Rilasciato dalla ghiandola pineale la melatonina entra nel circolo e regola il ritmo circadiano di SCN e periferico la maggior parte delle cellule in vitro e in vivodi25,26. Ritmo circadiano può essere regolata anche da stress ormoni (per esempio, cortisolo e catecolamine)27,28 e fattori di crescita29,30. Deregolamentazione dei fattori di crescita è conosciuta per essere associato con rottura circadiana di crescita e differenziazione di cellule31.

Il vettore reporter circadiano che abbiamo costruito sfrutta questo meccanismo di feedback negativo biochimici. Il ciclo di feedback negativo circadiana di nucleo è costituito da attivatori trascrizionali, BMAL1 e orologio, che si legano ai motivi circadiani E/e ´-box binding in PER2 promotore e repressori PERs e CRYs, che regolano negativamente l'espressione BMAL1. Nell'attuale sistema di reporter, l'attivazione ritmica del promotore di BMAL1 e orologio PER2 facilita l'espressione circadiana della luciferasi destabilizzato, consentendo una più accurata periodicità circadiana di luminescenza segnali. Il sito di legame di BMAL1, il sito d'aumento di ritmo circadiano, GC box e il sito di inizio di trascrizione del promotore hPER2 include la costruzione di un plasmide del reporter. Il vettore consente lettura in tempo reale per il ritmo circadiano autonomo cellulare in cellule trasfettate e può essere utilizzato per identificare condizioni o specifici agenti che alterano questo modello circadiano endogeno dell'espressione genica. Tuttavia, quando le cellule sono coltivate in vitro o ex vivo, loro oscillatori circadiani rapidamente diventano desincronizzati. È pertanto necessario risincronizzare i loro ritmi prima di qualsiasi analisi circadiane possono essere eseguiti in vitro. In cellule epiteliali mammarie, abbiamo trovato che 50% HS, melatonina e 100% SQ erano ciascuno in grado di indurre efficiente sincronizzazione del ritmo circadiano in vitro. Desametasone e forskolin prodotta solo sincronizzazione parziale. Test dose-dipendente sarebbero necessarie per lo sviluppo e la selezione di nuovi agenti di sincronizzazione negli studi futuri. Dato il basso costo, efficienza e il suo ampio uso come l'agente di sincronizzazione, 50% HS è stata trovata per essere un agente di sincronizzazione efficace che ha prodotto il ritmo circadiano cellulare affidabile e riproducibile in cellule epiteliali mammarie e neurale delle cellule, come precedentemente segnalato in molti altri tipi di cellule e diverse impostazioni sperimentali24.

Per convalidare il modello in vitro di regolamento circadiano, abbiamo poi chiesto che se la risposta del ritmo circadiano a fattori di stress ambientale in vitro vorrei ricapitolare gli effetti abbiamo osservato in vivo. Precedentemente, abbiamo dimostrato che una singola dose cancerogena di NMU interrotto l'espressione circadiana dei principali CGs (ad es., Per2) e diversi CCGs nella ghiandola mammaria di destinazione. Inoltre, un regime chemopreventive del MSC Reimposta l'espressione circadiana dei geni sia Per2 e CCGs verso il normale. Abbiamo inoltre dimostrato che l'esposizione delle cellule a sostanze tossiche e fattori di stress possono alterare l'espressione genica circadiana con i loro effetti su NAD+-dipendente SIRT1 attività7,8,22. I risultati ottenuti con l'analisi in vitro circadiano reporter ha mostrato che l'esposizione a NMU causò danni di espressione di gene circadiano cellulare, e che più interessante, MSC non è solo in grado di ripristinare il ritmo circadiano cellulare interrotti da NMU, ma anche reimpostare il ritmo circadiano perturbato dagli inibitori SIRT1. Questi risultati hanno indicato che il saggio in vitro non solo riproduce gli effetti di NMU sull'espressione del gene circadiano, ma riproduce anche gli effetti delle MSC sul ritmo circadiano perturbato in vivo tramite meccanismi di SIRT1-dipendente. Il sistema circadiano reporter in vitro quindi ha il potenziale per rilevare una varietà di sostanze tossiche e fattori di stress che alterano i livelli di NAD+/NADH nella cella, inclusi gli inibitori diretti e modulatori di redox cellulare ciclismo così come genotossici gli agenti che possono esaurire il NAD+ via Poli ADP-ribosio DNA dipendente ripristino32. Questi risultati indicano che il sistema di reporter in vitro fornisce uno strumento utile alla schermata per le condizioni delle cellule e agenti chimici che possono interrompere o ripristinare regolamento circadiano genica in vivo.

Sebbene il saggio in vitro può essere impostato usando cellule transitoriamente o stabilmente trasfettate con la costruzione del reporter, sono state notate alcune differenze nella risposta al trattamento di prodotti chimici tra cellule trasfettate transitoriamente e stabile. Le cellule trasfettate stabilmente erano più resistenti al trattamento delle sostanze chimiche, specialmente inibitori NMU e SIRT1, rispetto alle cellule transitoriamente transfected. Queste differenze potrebbero riflettere sottili differenze nella regolazione del promotore vettoriale in trasfettanti stabili a causa delle influenze dalle sequenze circostanti siti specifici di integrazione. Di conseguenza, selezione di trasfettanti stabili dal trattamento antibiotico può anche selezionare cloni che sono più resistenti alla rottura circadiana. Così, individuale in vitro modelli cellulari utilizzando trasfettanti stabili o transitoria devono essere convalidati per la loro capacità di ricapitolare in vivo le risposte. Metodi di transfezione differenti anche inducono diversi livelli di stress genotossico e tossicità sulle cellule e risultato nella loro diversa suscettibilità agli effetti tossici delle sostanze chimiche. Pertanto, gli esperimenti pilota e test di citotossicità sono necessari per la selezione delle condizioni di transfezione e trattamento. Nonostante la differenza nella loro sensibilità, i risultati complessivi ottenuti con le nostre cellule mammarie epiteliali circadiano reporter per interruzione e ripristino del ritmo circadiano cellulare dalle sostanze chimiche erano coerenti e comparabili tra transitoriamente le cellule trasfettate e stabilmente trasfettate e i risultati si ricapitola gli effetti che abbiamo osservato in vivo.

Per determinare se il vettore reporter circadiano potrebbe essere utilizzato in altri tipi cellulari, cellule di glioblastoma/astrocitoma umano (U-87 MG) transfected stabile con questo vettore circadiano. I risultati preliminari usando l'analisi di bioluminescenza cellulare in vitro ha dimostrato che, dopo la sincronizzazione, queste cellule del tumore neurale-derivati hanno un regolare e forte cellulare ritmo circadiano paragonabile a quella osservata negli umani mammari cellule epiteliali. Le cellule trattate con IC261, un noto inibitore della caseina chinasi 1 δ (CK1δ) e CK1 ε, ha mostrato un prolungato periodo circadiano, ma minore ampiezza come segnalato by gli altri (dati non mostrati)33. Questi risultati indicano che l'analisi della bioluminescenza cellulare vettoriale e in vitro del reporter di luciferase circadiano sono applicabili in altre celle specifiche dell'organo, compreso le cellule neurali.

Il sistema cellulare reporter sviluppato qui potrebbe pertanto essere utilizzato ampiamente come un test in vitro per la determinazione dell'espressione genica circadiana in diversi tipi cellulari in generale. La procedura sperimentale è semplice, veloce e sicuro. Tuttavia, questo sistema cellulare reporter non può essere facilmente adattato in cellule che sono difficili a transfect, divisione cellule (per esempio, cellule di un neurone), poiché hanno un'efficienza di trasfezione notoriamente Bassi. Metodi di transfezione basati su virus (ad esempio, la transfezione di lentivirus) possono offrire una soluzione di efficienza più elevata per queste cellule34. Tuttavia, il tempo e le difficoltà associate con la produzione di vettori lentivirali rende questo metodo difficile e richiede tempo. Inoltre, un laboratorio di livello di sicurezza adeguato è necessario per la produzione e l'uso del virus. Inoltre, rivelatori di luminescenza di alta risoluzione singola cella potrebbero essere utilizzati per la determinazione dei ritmi persistente, gradualmente in modo indipendente di espressione genica circadiana in divisione cellule35.

Gli studi del ritmo circadiano dei mammiferi in vivo sono non solo di lavoro intensivo e costose, ma richiedono anche l'uso di un gran numero di animali. La disponibilità di sistemi in vitro potrebbe ridurre significativamente il numero di animali necessari per testare le associazioni tra rottura della espressione genica circadiana e lo sviluppo di malattie croniche, tra cui carcinogenesi e metabolica sindrome. Dati quantitativi sui parametri circadiani, compreso periodo, ampiezza e fase, possono informare dose - effetti e/o tempo-dipendente delle sostanze chimiche sul ritmo circadiano cellulare. Ad esempio, abbiamo osservato che l'antiossidante che NAC può ripristinare la dose-dipendente il periodo e la fase del ritmo circadiano cellulare perturbato da NMU. Il modello in vitro potrebbe essere utilizzato anche allo schermo e classificare ambientali interferenti circadiani e di studiare l'impatto del ritmo circadiano perturbato sul danno della funzione cellulare, fornendo approfondimenti meccanicistici per lo sviluppo di strategie di intervento per coorti al rischio aumentato per cancro al seno, sindromi metaboliche e disturbi neurofisiologici, a causa di orari di lavoro anormali.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato supportato da 2012 società di tossicologia (SOT)-Colgate Palmolive Grant per ricerca alterativa (M. Fang) e la ricerca di collaborazione internazionale fondo da animali e piante quarantena Agenzia, Repubblica di Corea (M. Fang), e concedere il NIEHS P30ES005022 (Zarbl H.). Vorremmo ringraziare il dottor Zheng Chen (McGovern Medical School presso l'Università di Texas Health Science Center a Houston) per la sua discussione utile, Mr. Shao-An Juan per la sua assistenza sperimentale e MS. Kimi Nakata per la prova di lettura.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pLS[hPER2P/rLuc/Puro] vector SwitchGear Genomics S700000 customized vector
pGL4.18[Luc2P/Neo] vector Promega 9PIE673 destabilized luciferase expression vector
T4 DNA ligase Invitrogen 15224041 For subcloning
TOPO TA cloning kit Invitrogen K4500-02 with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli
Sac I New England BioLabs R0156S Restriction enzyme
Hind III-HF New England BioLabs R3104S Restriction enzyme
CutSmart buffer New England BioLabs B7204S Restriction enzyme buffer
DNA gel extraction kit Qiagen 28704 Purify DNA fragments from agarose gel
PCR Purification Kit Qiagen 28104 DNA clean up
LB Miller's modification TEKNOVA L8600 For transformed E. Coli culture
LB Agar Plate TEKNOVA L1902 For white/blue selection
QIAprep spin miniprep Kit Qiagen 27104 For extraction of plasmide DNA
EndoFree plasmid maxi prep Kit Qiagen 12362 For extraction of plasmide DNA
FuGene HD Promega E2311 Transfection reagent
Opti-MEM reduced serum medium Invitrogen 31985-062 For transfection
MCF10A cell line American Type Culture Collection CRL-10317 Mammary Epithelial Cells
MEGM BulletKit Lonza CC-3150 Mammary Epithelial Growth Medium
MEBM Lonza CC-3151 Mammary Epithelial Basal Medium
MEGM SingleQuot Kit Lonza CC-4136 Suppliments & Growth Factors
ReagentPack Lonza CC-5034 Reagent for subculture
D-PBS (10X) Sigma D1408 Wash cells in culture dishes
UltraPure Distilled Water Invitrogen 10977 Dilute 10X D-PBS
Tissue culture dish (35 mm) BD/Falcon 353001 cell culture dish suitable to LumiCycle
Silicon grease Fisher NC9044707 For sealing dish with recording medium
Round cover glass Harvard Bioscience 64-1500 (CS-40R) For sealing dish with recording medium
Cholera toxin Sigma C8052 Supplement for growth medium
G418 sulfate (Geniticin) Invitrogen 10131035 Antibiotic for selection of stabliy transfected cells
Ampicillin Sigma A9393 For colony selection
Forskolin Sigma F6886 Synchronization agent
Melatonin Sigma M5250 Synchronization agent
Dexamethasone Sigma D4902 Synchronization agent
Horse serum Sigma H1138 Synchronization agent
d-Luciferin, sodium salt Invitrogen L2912 Luciferase substrate
IC261 Sigma 10658 Positive control for circadian disruptor
Methylnitrosourea (NMU) Sigma N1517 Mammary specific carcinogen
Methylselenocysteine (MSC) Sigma M6680 Organic selenium (chemopreventive agent)
EX527 Sigma E7034 SIRT1 specific inhibitor
Cambinol Sigma C0494 SIRT1 & SIRT2 inhibitor
NanoDrop Spectrophotometer Thermo Scientific NanoDrop 8000 Quantify nucleotide
GeneAmp PCR System 9700 Applied Biosystems N805-0200 For molecular biology experiment
CO2 Incubator NAPCO Series 8000 DH For cell culture at 5% CO2 at 37 °C
Desktop centrifuge with refrezerator Eppendorf 5430R For molecular biology experiment
Centrifuge with swing bucket Eppendorf 5810 R For cell culture
Inverted microscope Nikon 80124 Phase contrast optional
Tissue culture hood Labconco Class II A2 BSL-2 certified
LumiCycle 32 Actimetrics Not Available Luminoscence detector

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Akerstedt, T., et al. Night work and breast cancer in women: a Swedish cohort study. BMJ Open. 5, (4), e008127 (2015).
  2. Parent, M. E., El-Zein, M., Rousseau, M. C., Pintos, J., Siemiatycki, J. Night work and the risk of cancer among men. Am J Epidemiol. 176, (9), 751-759 (2012).
  3. Knutsson, A., et al. Breast cancer among shift workers: results of the WOLF longitudinal cohort study. Scand J Work Environ Health. 39, (2), 170-177 (2013).
  4. Fu, L., Lee, C. C. The circadian clock: pacemaker and tumour suppressor. Nat Rev Cancer. 3, (5), 350-361 (2003).
  5. Fu, L., Kettner, N. M. The circadian clock in cancer development and therapy. Prog Mol Biol Transl Sci. 119, 221-282 (2013).
  6. IARC. Painting, Firefighting, and Shiftwork. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. 98, 563-764 (2010).
  7. Zhang, X., Zarbl, H. Chemopreventive doses of methylselenocysteine alter circadian rhythm in rat mammary tissue. Cancer Prev Res (Phila Pa). 1, (2), 119-127 (2008).
  8. Fang, M. Z., Zhang, X., Zarbl, H. Methylselenocysteine resets the rhythmic expression of circadian and growth-regulatory genes disrupted by nitrosomethylurea in vivo. Cancer Prev Res (Phila). 3, (5), 640-652 (2010).
  9. Burbulla, L. F., Kruger, R. Converging environmental and genetic pathways in the pathogenesis of Parkinson's disease. J Neurol Sci. 306, (1-2), 1-8 (2011).
  10. Aitlhadj, L., Avila, D. S., Benedetto, A., Aschner, M., Sturzenbaum, S. R. Environmental exposure, obesity, and Parkinson's disease: lessons from fat and old worms. Environ Health Perspect. 119, (1), 20-28 (2011).
  11. Nagoshi, E., Brown, S. A., Dibner, C., Kornmann, B., Schibler, U. Circadian gene expression in cultured cells. Methods Enzymol. 393, 543-557 (2005).
  12. Ramanathan, C., et al. Cell type-specific functions of period genes revealed by novel adipocyte and hepatocyte circadian clock models. PLoS Genet. 10, (4), e1004244 (2014).
  13. Sporl, F., et al. A circadian clock in HaCaT keratinocytes. J Invest Dermatol. 131, (2), 338-348 (2011).
  14. Zhang, E. E., et al. A genome-wide RNAi screen for modifiers of the circadian clock in human cells. Cell. 139, (1), 199-210 (2009).
  15. Yoo, S. H., et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, (15), 5339-5346 (2004).
  16. Leclerc, G. M., Boockfor, F. R., Faught, W. J., Frawley, L. S. Development of a destabilized firefly luciferase enzyme for measurement of gene expression. Biotechniques. 29, (3), (2000).
  17. Genomics, S. Technical Note: SwitchGear methods for gene model construction and transcription start site prediction. (2009).
  18. Scientific, F. Safety Data Sheet: Ethidium bromide, 1% Solution/Molecular Biology. (2010).
  19. Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. Current Protocols in Molecular Biology. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience. New York. (1994).
  20. Yoo, S. H., et al. A noncanonical E-box enhancer drives mouse Period2 circadian oscillations in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, (7), 2608-2613 (2005).
  21. Chen, Z., et al. Identification of diverse modulators of central and peripheral circadian clocks by high-throughput chemical screening. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (1), 101-106 (2012).
  22. Fang, M., Guo, W. R., Park, Y., Kang, H. G., Zarbl, H. Enhancement of NAD+-dependent SIRT1 deacetylase activity by methylselenocysteine resets the circadian clock in carcinogen-treated mammary epithelial cells. Oncotarget. (2015).
  23. Chen-Goodspeed, M., Lee, C. C. Tumor suppression and circadian function. J Biol Rhythms. 22, (4), 291-298 (2007).
  24. Balsalobre, A. Clock genes in mammalian peripheral tissues. Cell Tissue Res. 309, (1), 193-199 (2002).
  25. Jung-Hynes, B., Huang, W., Reiter, R. J., Ahmad, N. Melatonin resynchronizes dysregulated circadian rhythm circuitry in human prostate cancer cells. J Pineal Res. 49, (1), 60-68 (2010).
  26. von Gall, C., et al. Melatonin plays a crucial role in the regulation of rhythmic clock gene expression in the mouse pars tuberalis. Ann N Y Acad Sci. 1040, 508-511 (2005).
  27. Vujovic, N., Davidson, A. J., Menaker, M. Sympathetic input modulates, but does not determine, phase of peripheral circadian oscillators. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 295, (1), R355-R360 (2008).
  28. Schofl, C., Becker, C., Prank, K., von zur Muhlen, A., Brabant, G. Twenty-four-hour rhythms of plasma catecholamines and their relation to cardiovascular parameters in healthy young men. Eur J Endocrinol. 137, (6), 675-683 (1997).
  29. Yu, H., et al. Circadian rhythm of circulating fibroblast growth factor 21 is related to diurnal changes in fatty acids in humans. Clin Chem. 57, (5), 691-700 (2011).
  30. Nakagawa, H., et al. Modulation of circadian rhythm of DNA synthesis in tumor cells by inhibiting platelet-derived growth factor signaling. J Pharmacol Sci. 107, (4), 401-407 (2008).
  31. Yang, X., Guo, M., Wan, Y. J. Deregulation of growth factor, circadian clock, and cell cycle signaling in regenerating hepatocyte RXRalpha-deficient mouse livers. Am J Pathol. 176, (2), 733-743 (2010).
  32. Virag, L. Structure and function of poly(ADP-ribose) polymerase-1: role in oxidative stress-related pathologies. Curr Vasc Pharmacol. 3, (3), 209-214 (2005).
  33. Kon, N., Sugiyama, Y., Yoshitane, H., Kameshita, I., Fukada, Y. Cell-based inhibitor screening identifies multiple protein kinases important for circadian clock oscillations. Commun Integr Biol. 8, (4), e982405 (2015).
  34. Ramanathan, C., Khan, S. K., Kathale, N. D., Xu, H., Liu, A. C. Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters. J Vis Exp. (67), e4234 (2012).
  35. Welsh, D. K., Yoo, S. H., Liu, A. C., Takahashi, J. S., Kay, S. A. Bioluminescence imaging of individual fibroblasts reveals persistent, independently phased circadian rhythms of clock gene expression. Curr Biol. 14, (24), 2289-2295 (2004).
<em>In Vitro</em> Dosaggio di bioluminescenza per caratterizzare il ritmo circadiano in cellule epiteliali mammarie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fang, M., Kang, H. G., Park, Y., Estrella, B., Zarbl, H. In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (127), e55832, doi:10.3791/55832 (2017).More

Fang, M., Kang, H. G., Park, Y., Estrella, B., Zarbl, H. In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (127), e55832, doi:10.3791/55832 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter