体外乳腺上皮細胞の概日リズムを特徴付ける生物発光アッセイ
Summary
乳腺上皮細胞での細胞の概日リズムを決定するための in vitro生物発光アッセイが表示されます。このメソッドは、期間 2遺伝子プロモーターの制御下で不安定化ルシフェラーゼを表現する哺乳類の細胞レポーターのプラスミッドを利用しています。それは、臓器特異概日リズムに及ぼす影響を評価する他の細胞型に適応できます。
Abstract
概日リズムは動作をスリープ状態に遺伝子発現に至る生物学的プロセスを調節する基本的な生理学的なプロセスすべての生物に存在します。脊椎動物の概日リズムは、視交叉上核 (SCN; 中央ペース メーカー) とほとんどの末梢組織を構成する個々 の細胞の両方で機能する分子の発振器によって制御されます。もっと重要なは、夜の光、環境ストレスや有害物質への暴露によって概日リズムの障害は老化や慢性疾患のリスクの増加に関連付けられています。中央および/または末梢の体内時計を乱すことができるエージェントと概日リズムの中断の影響を軽減または悪意のあるエージェントを識別する機能の慢性的な病気の予防にとって重要な意義があります。齧歯動物モデルは、エクスポー ジャーとは、誘導や概日リズムの混乱を防止または軽減するためのエージェントを識別するために使用できますが、これらの実験は動物の数が多い必要があります。In vivo研究も膨大なリソースとインフラストラクチャを必要とする、すべての夜を動作するように研究者を必要とします。したがって、必要がある緊急システム適切な培養細胞型の体内の内分泌攪乱と細胞の種類のエンハンサーは、画面をさまざまな臓器や病気の状態から。真核生物細胞を人間の期間 2の遺伝子のプロモーターの制御下のドライブの不安定化ルシフェラーゼ転写ベクターを構築しました。この概記者構築された人間の乳腺上皮細胞に安定発現し、概応答レポーター細胞の in vitro生物発光アッセイを開発しました。確立およびアッセイを検証する詳細なプロトコルを紹介します。我々 はさらに細胞の生物学的時計の様々 な化学物質の生体内で効果を要約する私達の in vitroアッセイの能力を示す概念実験の証拠の詳細を提供します。示唆されたアッセイが攪乱と概日時計の化学予防剤の両方の画面に携帯各種に対応できます。
Introduction
体内時計を調節する様々 な疫学約 24 時間の周期性と予測可能なリズムでの動作をスリープ状態に遺伝子の日周発現から生物学的プロセスの研究は強くお勧め概の慢性混乱リズムは、乳房とシフト労働者、看護師、フライト クルー1,2,3などの前立腺癌のリスクを増加させます。これらの調査結果は、齧歯類での試験、時差ぼけ増加腫瘍発生を模倣し、腫瘍成長4,5を加速する一定の光、夜の光、または光サイクルへの暴露を示す裏付け。シフト勤務は、2010年6で考えられるヒト発がん性物質 (2 a) として人間と齧歯動物の研究からのデータに基づき、国際がん研究機関を分類します。
以前は、実証したNニトロソ乳腺腫瘍特定発癌物質の発癌性単回投与-モノメチルウレア (NMU)、中断 (CGs) (例えば、期間 2 主要な概日遺伝子の概日式、 Per2) いくつか概日リズム制御遺伝子 (CCGs) を含む主な DNA 損傷応答、(武装) 遺伝子ターゲット乳腺 (が肝臓ではなく) を修復します。また、食事Lの化学予防療法によって通常に向かってPer2と武装の遺伝子の概日発現をリセット-メチル-セレノシステイン (MSC) は腫瘍の発生率を 63% 減します。これらの調査結果は、概日リズム、化学発がんの化学予防7,8の機構のリンクを表示する最初でした。概日遺伝子式体内を混乱させる示されているその他の環境有害物質への暴露は、環境の病気9,10のリスクの増加に関連付けられています。環境有害物質と病態によって概日リズムの混乱をリンク機構の解明は予防する機械論的手法に可能性があります。ただし、エクスポー ジャー間の相互作用を定義することを目的とした研究と、概日リズムが行われる体内。24 または 48 時間の期間にわたってすべての 3-4 h を収集する一般的な生体内の実験調査概日リズムへの影響から、少なくとも 3 つの組織のコントロールなど、3 つの公開されている動物がある必要があります動物の大規模な番号が必要です。体内観察とメカニズムを繰り返す検証培養システムの開発したがって、必要な動物の数を減らすだけでなく、実験費用、要件も大幅に削減します。研究者は、24-48 時間にわたって継続的に動作します。さらに、検証済みの in vitroシステムは、化合物や概日リズムや環境ストレスや有害物質への応答に影響を与える遺伝の変化の高スループット スクリーニングをされる可能性があります。したがって、異なる焦点を持つさまざまな洞察を得るための in vitroとin vivoのモデルと実験の戦略的な組み合わせが必要です。
哺乳類のサーカディアン振動子集団存在、SCN の専門にされた神経細胞のみならずほとんどの末梢細胞の種類。これらの分子時計は胚または大人動物から確立された線維芽細胞株では主線維芽細胞に似ています。しかし、組織の種類に固有の細胞モデル11の必要性があります。その結果、自発運動は体内SCN の従来の調査の前のヴィヴォ、外植体し、不死化線維芽細胞の生体外の細胞ベースのアッセイは広く細胞自律的概欠陥を研究します。培養線維芽細胞セルベースのアッセイが概日リズム機構を再現することができますを示す証拠はないし、その他末梢臓器体内の細胞に存在する応答します。異なる種類の細胞は、遺伝子発現、代謝、および、武装の異なるパターンを持つことができ、毒性と体内の遺伝子発現との間のリンクは、携帯型特定および/または異なる生理学的パラメーターで変調します。さらに、レスポンス環境有害物質、ストレスと病気の発症と予防のメカニズムへの暴露にリンク予防薬の線維芽細胞系における概日振動子が完全に評価されていません。従って、安易な検証されたセルの種類によって異なります、器官特定概攪乱を研究する生物発光アッセイ培養の必要性があります。さまざまな細胞時計モデル (例えば肝臓、ケラチノ サイト、脂肪細胞と骨肉腫セルラインで) が開発されて近年12,13,14,15、ここで説明アッセイは、乳腺上皮細胞や体内環境ストレス、有害物質、薬物、および化学予防薬への応答を要約する最初のデモンストレーションの最初の細胞時計モデルです。
Renilla ルシフェラーゼ (rLuc)、ホタルのルシフェラーゼ酵素反応処理翻訳は必要ありません、翻訳時にすぐに遺伝的記者として機能することができます 30 61 kDa の単量体蛋白質。基板に関連付けますルシフェラーゼ酵素、触媒化学反応光のフラッシュを生成します。したがって、ルシフェラーゼの構造は、遺伝子発現レポーター システムの in vitroおよびin vivoとして広く使用されます。ただし、概日リズムの研究、ルシフェラーゼ レポーターのユーティリティのルシフェラーゼ蛋白質の比較的長い半減期によって制限されます (T1/2 = 3.68 h) 概日遺伝子の変化を (短い期間) に特に期間を基準にして式です。しかし、長年にわたって多くの研究では、急速分解性ルシフェラーゼができないよう特に長い期間とリズムのための概日リズムを報告するために必要なことを示す pGL3 のベクトルのルシフェラーゼ遺伝子を使用している正常に24 h。そのため、不安定化ルシフェラーゼ ベクトルを用いた記者プラスミド、pGL [Luc2P/Neo] hPEST (タンパク質の不安定化シーケンス) が含まれている、開発されている私たち私たちの現在体外の概記者ベクトルとしてそれを使用することができます。生物発光アッセイ。Luc2Pによって符号化される蛋白質は短い半減期 (T1/2 = 0.84 h) したがってより迅速かつより大きさを野生型よりも転写活性の変化に応答と私それがすることができます ndicating リズミカルなリアルタイム16で正確にPER2プロモーターによって規制ルシフェラーゼ発現を監視するために使用します。
Protocol
Representative Results
Discussion
哺乳類セルの概日時計の周期性は、相互接続された転写/翻訳フィード バック ループによって調整されます。ヘテロの Bmal1 とクロックまたは Npas2 コア CGs、 Per2と叫び、多数の CCGs4などのプロモーターで E-ボックス要素にバインドによって概日転写を調節します。セルには、ヘテロの蓄積あたり: 泣くファーストクリーニング修正およびクロック: Bmal1 の転写活?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は 2012 毒物学の社会 (SOT) によってサポートされていた-動物と植物検疫機関、大韓民国 (M. 牙) からコルゲート パルモリブ変化をもたらす研究 (M. 牙) 助成および国際共同研究に資金を供給し、NIEHS を付与P30ES005022 (H. Zarbl)。我々 は彼の役については、彼の実験的援助氏 Shao-An フアンと彼女の証拠読書のためさんキミ中田博士鄭陳 (マクガバン医科大学でテキサス州ヒューストン健康科学センター) に感謝する思います。
Materials
| pLS[hPER2P/rLuc/Puro] vector | SwitchGear Genomics | S700000 | customized vector |
| pGL4.18[Luc2P/Neo] vector | Promega | 9PIE673 | destabilized luciferase expression vector |
| T4 DNA ligase | Invitrogen | 15224041 | For subcloning |
| TOPO TA cloning kit | Invitrogen | K4500-02 | with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli |
| Sac I | New England BioLabs | R0156S | Restriction enzyme |
| Hind III-HF | New England BioLabs | R3104S | Restriction enzyme |
| CutSmart buffer | New England BioLabs | B7204S | Restriction enzyme buffer |
| DNA gel extraction kit | Qiagen | 28704 | Purify DNA fragments from agarose gel |
| PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | DNA clean up |
| LB Miller's modification | TEKNOVA | L8600 | For transformed E. Coli culture |
| LB Agar Plate | TEKNOVA | L1902 | For white/blue selection |
| QIAprep spin miniprep Kit | Qiagen | 27104 | For extraction of plasmide DNA |
| EndoFree plasmid maxi prep Kit | Qiagen | 12362 | For extraction of plasmide DNA |
| FuGene HD | Promega | E2311 | Transfection reagent |
| Opti-MEM reduced serum medium | Invitrogen | 31985-062 | For transfection |
| MCF10A cell line | American Type Culture Collection | CRL-10317 | Mammary Epithelial Cells |
| MEGM BulletKit | Lonza | CC-3150 | Mammary Epithelial Growth Medium |
| MEBM | Lonza | CC-3151 | Mammary Epithelial Basal Medium |
| MEGM SingleQuot Kit | Lonza | CC-4136 | Suppliments & Growth Factors |
| ReagentPack | Lonza | CC-5034 | Reagent for subculture |
| D-PBS (10X) | Sigma | D1408 | Wash cells in culture dishes |
| UltraPure Distilled Water | Invitrogen | 10977 | Dilute 10X D-PBS |
| Tissue culture dish (35 mm) | BD/Falcon | 353001 | cell culture dish suitable to LumiCycle |
| Silicon grease | Fisher | NC9044707 | For sealing dish with recording medium |
| Round cover glass | Harvard Bioscience | 64-1500 (CS-40R) | For sealing dish with recording medium |
| Cholera toxin | Sigma | C8052 | Supplement for growth medium |
| G418 sulfate (Geniticin) | Invitrogen | 10131035 | Antibiotic for selection of stabliy transfected cells |
| Ampicillin | Sigma | A9393 | For colony selection |
| Forskolin | Sigma | F6886 | Synchronization agent |
| Melatonin | Sigma | M5250 | Synchronization agent |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Synchronization agent |
| Horse serum | Sigma | H1138 | Synchronization agent |
| d-Luciferin, sodium salt | Invitrogen | L2912 | Luciferase substrate |
| IC261 | Sigma | 10658 | Positive control for circadian disruptor |
| Methylnitrosourea (NMU) | Sigma | N1517 | Mammary specific carcinogen |
| Methylselenocysteine (MSC) | Sigma | M6680 | Organic selenium (chemopreventive agent) |
| EX527 | Sigma | E7034 | SIRT1 specific inhibitor |
| Cambinol | Sigma | C0494 | SIRT1 & SIRT2 inhibitor |
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 8000 | Quantify nucleotide |
| GeneAmp PCR System 9700 | Applied Biosystems | N805-0200 | For molecular biology experiment |
| CO2 Incubator | NAPCO | Series 8000 DH | For cell culture at 5% CO2 at 37 °C |
| Desktop centrifuge with refrezerator | Eppendorf | 5430R | For molecular biology experiment |
| Centrifuge with swing bucket | Eppendorf | 5810 R | For cell culture |
| Inverted microscope | Nikon | 80124 | Phase contrast optional |
| Tissue culture hood | Labconco | Class II A2 | BSL-2 certified |
| LumiCycle 32 | Actimetrics | Not Available | Luminoscence detector |
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