Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

В пробирке Assay биолюминесценции характеризовать Циркадный ритм в эпителиальных клеток молочной железы

doi: 10.3791/55832 Published: September 28, 2017

Summary

Представлен в vitro assay биолюминесценции для определения сотовой Циркадный ритм в эпителиальных клетках молочной железы. Этот метод использует mammalian клетки репортер плазмид, выражая дестабилизировали Люцифераза под контролем промотора гена период 2 . Она может быть адаптирована для других типов клеток, оценить эффекты органоспецифическая на суточный ритм.

Abstract

Циркадный ритм процесс основных физиологических настоящее во всех организмах что регулирует биологические процессы, начиная от экспрессии генов спать поведение. В позвоночных суточный ритм контролируется молекулярной осциллятор, который функционирует как Супрахиазмальное ядро (SCN; Центральная кардиостимулятора), так и отдельных ячеек, состоящий из наиболее периферических тканей. Что еще более важно нарушения циркадного ритма воздействием света ночью, экологических стрессоров или ядовитых веществ связаны с повышенным риском хронических заболеваний и старения. Способность определить агенты, которые могут нарушить Центральной или периферической биологические часы и агенты, которые могут предотвратить или смягчить последствия нарушения циркадного, имеет существенные последствия для профилактики хронических заболеваний. Хотя грызунов модели могут использоваться для определения воздействия и агентов, которые вызывают или предотвращения и смягчения суточного нарушения, эти эксперименты требуют большого количества животных. В vivo исследования также требуют наличия значительных ресурсов и инфраструктуры и исследователей работать всю ночь. Таким образом существует настоятельная необходимость для камерного типа соответствующие в vitro системы экран для окружающей среды суточного разрушители и усилители в типах клеток от болезни государств и различных органов. Мы построили вектор, диски транскрипции дестабилизировали Люцифераза в эукариотических клетках под контролем промотора гена человека период 2 . Эта конструкция суточного репортер был стабильно transfected в человеческих эпителиальных клеток молочной железы, и суточного реагировать репортер клетки были отобраны развивать пробирного биолюминесценции в пробирке . Здесь мы представляем подробный протокол для создания и проверки assay. Далее мы подробно для доказательства концепции экспериментов, демонстрирующих способность нашего анализа в vitro пилки в vivo воздействию различных химических веществ на клеточном биологические часы. Результаты показывают, что assay может быть адаптирована для различных типов клеток для окружающей среды разрушители и заметкой усилители суточного часов.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Суточный часов регулирует широкий круг биологических процессов от суточного экспрессии генов спать поведение в предсказуемый ритм с периодичностью около 24 ч. эпидемиологические исследования показывают, сильно, что хроническое нарушение суточного ритм увеличивает риск рака груди и рака простаты в сдвиг рабочих, включая медсестер и рейс экипажей1,2,3. Эти выводы подтверждаются грызунов исследования, демонстрируя что подверженность постоянный свет, свет ночью, или света циклов, которые имитируют биоритмов увеличение распространенности опухоли и ускоряет рост опухоли4,5. Основываясь на данных исследований, как людских, так и грызунов, международное агентство по изучению рака классифицируются посменной работы как вероятный канцероген человека (тип 2A) в 20106.

Ранее мы показали, что канцерогенные однократным введением конкретных канцерогенов молочной железы опухоль, N- нитрозосоединения-N- methylurea (НГУ), нарушается суточного выражение основных суточного генов (СГС) (например, период 2 , Per2) и несколько суточного контролируемой генов (CCGs), включая основные повреждения ДНК реагировать и ремонт генов (РДРР) в целевой молочной железы (но не в печени). Кроме того, Сброс суточного выражение генов Per2 и РДРР к нормальной с заметкой режим питания L-метил-Селеноцистеин (MSC) снижению заболеваемости опухоли на 63%. Эти выводы были первыми, чтобы показать механистический связь между Циркадный ритм, химического канцерогенеза и химиопрофилактики7,8. Воздействия других экологических токсикантов, показано сорвать суточного ген выражение в естественных условиях , также связаны с повышенным риском экологических болезней9,10. Понимание механизмов, которые связывают суточного нарушения экологических токсикантов и патогенез может привести к механически-подходов к профилактике заболеваний. Однако, исследования, направленные на определение взаимодействий между воздействия и суточный ритм обычно выполняются в vivo. Типичная в естественных условиях эксперимента расследование влияние на суточный ритм требует большого количества животных, как контролировать тканей из по меньшей мере три и три подвергаются животные должны быть собраны каждые 3-4 ч в течение 24 или 48 часов. Разработка проверенных в vitro системы, которая резюмирует наблюдений в естественных условиях и механизмов будет поэтому не только уменьшить количество животных, необходимых, но также значительно сократить расходы на экспериментальной и требование, Исследователи работают непрерывно в течение 24-48 ч. Кроме того проверенных в vitro система может использоваться для проверки высокой пропускной способности соединений и/или генетические изменения, которые влияют на суточный ритм, или его ответ на экологических стрессоров или ядовитых веществ. Поэтому стратегическое сочетание in vitro и in vivo моделей и экспериментов необходимы для получения различных идеи с другой фокус.

В млекопитающих суточного осцилляторов существуют не только в специализированных нейронов ППП, но и в самые периферийные типы клеток. Эти молекулярные часы аналогичны в установленных фибробластов клеточных линий и в первичной фибробласты из зародышей или взрослых животных; Однако есть потребность тканей конкретного типа сотовой модели11. Следовательно традиционные исследования двигательной активности в естественных условиях, SCN эксплантах ex vivo, и на основе ячеек в vitro анализов в увековечен фибробластов клетки широко используются для изучения клеток автономная суточного дефектов. Однако нет никаких свидетельств, указывающих, что в vitro фибробластов на основе ячеек assay может резюмировать суточного механизмов и ответы присутствует в клетках других периферийных органов в естественных условиях. Различных типов клеток могут иметь различные шаблоны экспрессии генов, метаболизма ксенобиотиков и РДРР, и связей между токсичности и суточного ген выражение может быть типа клеток специфического и/или модулированный в различных физиологических параметров. Кроме того суточного осцилляторов в системах на базе фибробластов еще не были полностью оценены для ответов на экологических токсикантов, стресс и превентивной агентов, которые связывают воздействия механизмы развития заболевания и профилактика. Таким образом существует необходимость для конкретных снисходительный, одобренного типа клеток, в пробирке биолюминесценции анализов для изучения конкретных экологических суточного Разрушители орган. Хотя целый ряд моделей сотовых будильник (например, в печени, кератиноциты и жировых клеток, а также линия клетки остеосаркома) были разработаны в последние годы12,13,14, 15, проба, описанные здесь это первая модель сотовой будильник в эпителиальных клеток молочной железы и первой демонстрации резюмировать в vivo ответы на экологических стрессоров, ядовитых веществ, наркотиков и заметкой агентов.

Renilla Люцифераза (rLuc) и Светлячок Люцифераза являются 30-61 кДа мономерных белков, которые не требуют Посттрансляционная обработки для ферментативной активности и может функционировать в качестве репортера генетических сразу же после перевода. После того, как субстрат связывает с Люцифераза фермента, биохимические реакции катализированные генерирует вспышка света. Таким образом Люцифераза конструкции широко используются как ген выражение репортер системы в пробирке и в естественных условиях. Однако, в исследованиях Циркадный ритм, Утилита Люцифераза репортер ограничивается относительно долгий период полураспада Люцифераза белка (T1/2 = 3,68 h) по сравнению с периодом (особенно в короткий период) для изменения в суточный гена выражение; Однако многочисленные исследования с годами успешно использовали Люцифераза гена в pGL3 вектор, указывающий, что быстро разлагаются Люцифераза не может быть необходимым для отчетности циркадные ритмы, особенно для ритмы с более длительного периода, такие как 24 ч. Поэтому репортер плазмида с использованием вектора дестабилизировали Люцифераза, pGL [Luc2P/Neo], который содержит hPEST (последовательность дестабилизации белка) был разработан, позволяя нам использовать его как вектор суточного репортер для наших текущих в пробирке пробирного биолюминесценции. Белков, кодируемых Luc2P имеет более короткий период полураспада (T1/2 = 0,84 h) и следовательно, реагирует быстрее и с большей величины изменения в транскрипционный анализ активности, чем одичал тип, яndicating, что он может быть использован для мониторинга ритмические выражения Люцифераза, регулируется PER2 промоутер точно в режиме реального времени16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Строительство PER2 промоутер Driven дестабилизировали Люцифераза репортер вектора

  1. приобрести индивидуальные pLS [hPER2P / rLuc / Puro] вектор, содержащий cDNA кодировки rLuc и человека Фрагмент PER2 промоутер (hPER2P, 941 bp) на участке между мешка I и Хинд III в несколько клонирования региона 17.
  2. Вырезать фрагмент промоутер человеческого PER2 (hPER2P, 941 bp) вне от вектора.
    1. Добавить 2,5 мкл буфера энзима ограничения, 10 мкл (180 нг) pLS [hPER2P / rLuc / Puro] вектор и 1 мкл энзимов ограничения, Sac I (10 блок/мкл) и III Хинд (10 блок/мкл), в ДНК/РНК/нуклеотидные бесплатно Microcentrifuge трубки. Добавьте ультрачистая вода (10.5 мкл) до 25 мкл и перемешать аккуратно, закупорить.
    2. Инкубировать при 37 ° C 90 мин в блоке Отопление.
    3. Выполнить весь объем (25 мкл) реакции энзима ограничения на 0,7% агарозном геле, содержащие бромид ethidium 0,0001% (бромистый этидий), чтобы отделить hPER2P от вектора.
      Примечание: Бромистый этидий, 3,8-diamino-1-ethyl-6-phenylphenantridinium бромид (регистрационный номер КАС: 1239-45-8), является красная жидкость без запаха. Это интеркалирующего агента, который часто используется как флуоресцентные метки (нуклеиновых кислот пятна) в электрофорезе геля агарозы и видно, как оранжевый цвет под ультрафиолетовым светом. Возможные риски необратимых мутагенных эффектов произошли в экспериментальных животных, хотя ни одно из нормативных учреждений классифицировать его как канцероген 18. Таким образом, мы собрали используется агарозы гель и электрофорез буфер, содержащий бромистый этидий как отходы химической опасности и просил Ратджерс санитарной & безопасности (REHS) забрать и безопасно распоряжаться.
    4. Вырезать кусок геля агарозы, содержащих бромистый этидий флуоресценции band в 941 bp и очистить hPER2P фрагменты от геля с комплектом экстракции ДНК гель, следуют количественная оценка на спектрофотометре путем измерения поглощения плотность (OD) на длине волны 260 Нм.
  3. Линеаризации 1.0 мкл (1 мкг) Люцифераза вектора выражения дестабилизировали Светлячок, pGL [Luc2P / Neo] с тем же методом, как описано в шагах 1.2.1-1.2.2. Экстракт вектор с комплектом очистке ДНК, следуют количественной оценки, как описано выше с помощью спектрофотометра.
  4. Перевязать hPER2P в pGL линеаризованного вектора [Luc2P / Neo].
    Примечание: за производителя ' s инструкция, идеальный молярное соотношение вставки и вектор-2:1. Для 50 ng вектора, идеальное количество Вставка рассчитывается как 23,6 нг с вектором КБ формула, [(50 ng vector x 1.0 kb insert)/4.242] x (2/1) = 23,6 ng вставки]. Основанный на концентрации hPER2P (7,26 нг/мкл) и pGL [Luc2P / Neo] (50 нг/мкл), объемы 50 нг pGL [Luc2P / Neo] и 23,6 нг hPER2P рассчитывается как 1 мкл и 3.26 мкл, соответственно.
    1. Добавить 2 мкл T4 ДНК лигаза реакции буфера (10 X) (50 мм трис-HCl, 10 мм MgCl 2, 1 мм СПС и 10 мм DTT), 3.26 мкл (23,6 нг) hPER2P, 1 мкл (50 нг) pGL [Luc2P / Neo], и 13.74 мкл воды до 20 мкл , осторожно перемешать.
    2. Добавление T4 ДНК лигаза 1 мкл (400 блок/мкл), осторожно перемешать и Инкубируйте на 16 ° C ночь в Термоциклер и затем охладить перевязаны вектора на льду за производителя ' s инструкция.
  5. Превратить pGL перевязаны вектор [hPer2P / Luc2P / Neo] для химически сведущее Escherichia coli 19.
    1. Установить водяной бане при 42 ° C, подогревают супер оптимального бульон с catabolite репрессий (S.O.C.) средний (2% Триптон, 0,5%, экстракт дрожжей, 10 мм NaCl, 2,5 мм KCl, 10 мм MgCl 2, 10 мм MgSO 4 и глюкозы 20 мм) при комнатной температуре , разогреть Бертани Лурия (LB) агар пластины (содержащий ампициллина 100 мкг/мл, 80 мкг/мл X-Гал и 0,5 мкм IPTG) в инкубаторе 37 ° C и оттаивания на льду один флакон сведущее Escherichia coli клетки для каждого преобразования.
    2. Добавить 6 мкл (21 нг) лигируют вектор или 1 мкл (30 нг) пустой вектор (отрицательный контроль) в одной из труб химически сведущее Escherichia coli (50 мкл) и затем осторожно перевернуть трубку смешивать. Инкубируйте на льду на 30 мин
    3. Тепловой шок в ванну воды 42 ° C за 30 s без встряхивания и затем вернуться к ice.
  6. Выберите E. coli колония преобразовано с вектором перевязаны с помощью скрининга синий/белый.
    1. Добавить 250 мкл S.O.C. среды в преобразованной кишечной трубки и проинкубируйте 1 ч при 37 ° C при встряхивании в 200 об/мин.
    2. 10-50 мкл преобразованные E. coli на поверхности плиты агара LB равномерно
    3. . Положите пластину вниз в инкубаторе 37 ° C ночь.
      Примечание: Эффективное клонирования реакции следует производить несколько сотен колоний. Покрытие двух различных томов рекомендуется обеспечить по крайней мере одна пластина будет ясно большой, белый или синий цвет и хорошо расположенные колоний. С помощью микроскопа (10 X или 50 X) полезно, когда колонии слишком малы, и цвет не различимы,.
    4. Выбрать 3-6 белых колоний от пластины палочками стерилизованные зуб и выпуск каждой колонии в одной культуре трубка, содержащая 4 мл LB питательной среды с 50 мкг/мл ампициллин.
    5. Инкубировать трубы при 37 ° C ночь встряхивании в 200 об/мин. Извлечь ДНК, используя 2 мл 4 мл культивированный E. coli с плазмида ДНК извлечения мини-приготовительная комплект за производителя ' s инструкция.
  7. Проверить и проанализировать insert (hPER2P, 941 bp)
    1. дайджест плазмида ДНК с энзимами ограничения и запустите электрофореза, как описано в 1.2.1-1.2.3 шаги для подтверждения, если есть вставки.
      Примечание: Положительный контроль (hPER2P, очищенная на шаге 1.2.4) отрицательный контроль (E. coli преобразована с пустой вектор) были включены и.
    2. Последовательность отдельных плазмида ДНК, используя M13 вперед и обратного M13 Праймеры для подтверждения ориентацию и последовательности вставки в плазмиду 19.
      Примечание: Была выбрана только одна колония, который имел инструкции insert с правильным размером hPER2P электрофореза и правильной ориентации и последовательность в результате секвенирования.
    3. Анализ фрагмента промоутер человеческого PER2 (hPER2P, 941 bp) последовательности для суточного регулирования элементов, включая E-бокс мотив (Bmal1 привязки сайта, CAT/ГКГТ), CCAATC, GC коробка и транскрипции начать сайта (CAGCGG) 20.
  8. Amplify выбранного E. coli, добавляя оставшиеся 2 мл культивированный E. coli в 200 мл LB питательной среды, содержащей 50 мкг/мл Ампициллин и затем инкубации на ночь при 37 ° C при встряхивании в 200 об/мин.
  9. Извлечь ДНК с макси бесплатно эндотоксина плазмидные Подготовьте комплект на Производитель ' s Инструкция и затем количественно измеряя ОД на 260 Нм длины волны с спектрофотометром. Алиготе и хранить плазмида ДНК, pGL [hPer2P/Luc2P/Neo], в морозильной камере-80 ° C для использования в будущем.

2. Переходных Transfection

  1. покупки и культура клетки MCF10A
    1. закупки строку увековечена, -трансформированных нормального человека молочной эпителиальных клеток (MCF10A) от коммерческого банк клеток, где клетки являются cytogenetically испытания и проверку подлинности с короткие тандемные повторить анализ перед замораживанием. Оттепель и поддерживать каждый флакон замороженных клеток в культуре для максимум 8 недель и.
      Примечание: В отличие от других клеток, эти клетки имеют контакт торможение, как только они добираются до места впадения ~ 70%. Он требует, что субкультуры проводится на ~ 70%.
    2. Культура клетки с средний рост эпителиальных клеток молочной железы (MEGM), содержащий молочной эпителиальных базальной среднего (MEBM), роста добавки и токсинного холеры в инкубатор культуры клеток при 37 ° C, влажность 95% и 5% CO 2.
      Примечание: Покупка готовых к использованию факторы роста предусмотрено в SingleQuot (SQ) и получить токсин холеры отдельно. Окончательный концентрации добавки роста являются говядину гипофиза экстракт 0,4%, 0.1% инсулина, гидрокортизона 0,1%, 0.1% человеческого эпидермиса факторы роста, 100 нг/мл холеры токсин и 0,05% гентамицина сульфат и 0,05% амфотерицин B.
    3. Разбить ячейки в 10 см культуры блюдо по инкубации с 10 мл трипсина/ЭДТА для ~ 20 мин и затем нейтрализовать трипсина, добавив 10 мл трипсина, нейтрализуя решения. Собрать все клетки с HEPES буфер солевой раствор (HBSS).
    4. Подсчитать ячейки с Горяева под инвертированным микроскопом и рассчитать концентрацию подвеска одну ячейку, затем семена определенное количество клеток, при необходимости. Вихрем пластины тщательно, чтобы получить равномерное распределение ячеек в каждой плиты. Инкубировать клетки в инкубатор культуры клеток при 37 ° C, влажность 95% и 5% CO 2.
      Примечание: Приобрести пакет реагент субкультуры, содержащих трипсина/ЭДТА, нейтрализуя раствор трипсина и HBSS использовать.
  2. Переходных transfection клеток с суточного вектор построен.
    1. Семян 2 x 10 5 MCF10A ячейки равномерно в 35 мм культуры блюдо с MEGM и расти до 20-30% слияния (на следующий день).
    2. Теплый вверх сокращение сыворотке СМИ (например, Opti-MEM) в 37 ° C водой ванны и трансфекции реагента при комнатной температуре за 30 мин разбавить плазмидной ДНК построена (pGL [hPer2P / Luc2P / Neo]) для 30 нг/мкл с Эндо токсин бесплатно Буфер Tris-ЭДТА (TE) и держать при комнатной температуре.
    3. Подготовить смесь трансфекции плазмида в пробки microcentrifuge 1,5 мл, сначала добавляя 63.6 мкл теплой сокращение сыворотке СМИ, а затем Добавление 33.4 мкл (0,1 мкг) плазмидной ДНК и осторожно перемешать, дозирование, а затем наконец добавляя 3 мкл трансфекции Реагент непосредственно в центр трубки не касаясь стены. После перемешивания аккуратно, дозирование, держать при комнатной температуре за 30 мин
    4. Падение всего плазмида смесь (100 мкл) непосредственно на поверхность центр среды в пластине и затем осторожно перемешать путем встряхивания блюдо. Культура клетки в CO 2 инкубатора для дополнительных 48-72 ч.
      Примечание: Он предсказал, что высокая эффективность трансфекции будет при впадении в 40-70% этих клеток за счет ингибирования их контакта на ~ 70%. Таким образом, transfection работает лучший начиная с ~ 20% и остановка на ~ 70% слияния.

3. Создание Assay биолюминесценции В пробирке в временно Transfected клеток MCF10A

  1. голодать культивируемых клеток при впадении ~ 70% (после трансфекции для 48-72 ч) в MEBM без факторов роста для 24 h.
  2. Лечения клетки с агентом синхронизации (например, 50% лошадь сыворотки (HS)) в MEBM для 1,5 h в инкубатор CO 2.
    Примечание: Для подбора идеальной синхронизации агент, форсколин 10 мкм, 1 Нм мелатонина, дексаметазона 0,1 мкм, 50% HS и 100% SQ были сопоставлены с точки зрения суточного амплитуда и период в суточный вектор transfected клеток. Пустой вектор transfected клеток относятся с 100% SQ как отрицательный контроль.
  3. Pre-prepare 20 мл носитель (для 10 блюд культуры 30-мм), добавив 5 мл MEGM, 15 мл MEBM, 150 мкл рабочего раствора бикарбоната натрия, 200 мкл HEPES и 40 мкл люциферин складе раствор (50 мм) в 50 мл стерилизации пластиковых пробирок.
    Примечание: Окончательный концентрации каждого компонентов: 20% SQ и 20 нг/мл холеры токсин, 0,06% бикарбоната натрия, 1% пенициллина/стрептомицина и 10 мм HEPES. Разогреть в заранее подготовленные записи средних и стерилизовать ПБС 30 мин на водяной бане 37 ° C. Добавить 100 мкм люциферин непосредственно перед употреблением.
  4. Мыть клетки с теплой 1 x Дульбекко ' s, физиологический Phosphate-Buffered (D-PBS) для 3 раза после инкубации с агентом синхронизации, а затем добавьте 2 мл записи среднего.
  5. Уплотнение блюдо с классом стерилизованные покрытия с использованием силиконовой смазкой для предотвращения испарения и затем ярлык на стороне.
  6. Место в место внутри Люминометр запечатанном блюдо и включите опцию для сохранения местоположение файла в папке (подробно см. раздел 6).

4. Выбор стабильно Transfected клеток

  1. оптимизировать идеально G418 концентрация (800 мкг/мл) с кривой assay убить по заявлению производителя ' s Инструкция для выбора стабильно transfected клеток.
  2. После переходных трансфекции за 48 ч или 72 ч, субкультуры и семян клетки с MEGM в больших блюда в 5000 клеток/блюдо (100 мм). После 24 часов культуры в инкубатор культуры клеток (37 ° C, влажность 95% и 5% CO 2), лечить клетки с 800 мкг/мл G418, заменив старый среднего новый носитель, содержащий 800 мкг/мл G418 каждые 3-4 дня за 2 недели.
  3. Субкультуры, выжившие стабильно transfected колоний для 1-3 места с MEGM, содержащих 500µg/мл G418 для поддержания стабильной выражение hPer2P/Luc2P и замораживание в жидком азоте для будущего использования.
  4. Лечения 500µg/мл G418 после общего субкультура повторно выбрать населения стабильно transfected клеток, если интенсивность биолюминесценции в результате в vitro биолюминесценции пробирного постепенно снижается после использования в многих отрывках.

5. Обращения с химическими веществами

  1. на 48 ч или 72 ч после трансфекции, голодать клетки от факторов роста в MEBM за 24 ч.
  2. После синхронизации с 50% HS 2 h, лечить клетки с 0,25 мм или 0,5 мм nitrosomethylurea (НГУ), 20 Нм EX527 или 1 мкм cambinol за 1 ч в MEBM, содержащих 20% пл
  3. После мытья с 1 x D-PBS, добавьте записи средних содержащий 12,5 мкм MSC отдельно или в сочетании с 20 Нм EX527 или 1 мкм cambinol, чтобы клетки. Мониторинг биолюминесценции с люминометра.
  4. Лечения стабильно transfected MCF10A / PER2-dLuc клеток с Мичиганского университета в 0,5, 1 или 2 мм, EX527 на 40 Нм, или Cambinol на 2,0 мкм, за 1 ч после синхронизации с 50% HS и затем инкубации клеток в записи средних содержащий 12,5 мкм MSC или различных доз (5, 10 или 20 мкм) n ацетилцистеин (NAC). Поместите пластины в Люминометр, запись и сохраните биолюминесценции, Люминометр для 4-8 дней, как описано в разделе 3.6.
    Примечание: НМУ-метилированной Нитрозомочевина соединение с канцерогенными, мутагенными и тератогенными свойствами. НМУ алкилирующий агент прямого действия и имеет короткий период полураспада (T 1/2 = ~ 30 мин). Он стабилен в кислой условие (pH 4-5), но нестабильной в щелочной (рН 9-10) и при температурах за 20 ° C. Таким образом Блич 10% может использоваться как эффективный отключение агента для очистки поверхности скамьи и лаборатории изделия, потенциально загрязненных НМУ решенио. Оставшийся раствор вывезены и безопасно утилизировать, REHS. Основываясь на действия химических веществ, синхронизированных клеток может рассматриваться для короче раз прежде чем культивирование в носителе. Клетки могут также рассматриваться в средстве записи на более длительное время (несколько дней).

6. Сбор данных, анализ и презентация

Примечание: жизнеспособность клеток должна определяться с помощью стандартных методов (например, МТТ проба) после лечения клеток в том же концентрациях же раз указано. Все концентрации лечения, используемых в assay биолюминесценции в vitro были ниже, чем 30% летальная концентрация (LC30). Все эксперименты проводились в трех экземплярах и были представлены представителем результаты.

  1. После запечатывания блюдо (шаг 3.5), загрузить блюда на места в Люминометр, который хранится внутри инкубатор набор при 37 ° C без H 2 O и CO 2 и подключен к компьютеру.
  2. Нажмите " сохранить " и введите имена для папок и файлов, где будет сохранен записанный люминесценции сигнал от соответствующего блюдо.
    Примечание: Система обнаруживает сигнал люминесценции в режиме реального времени из клетки в блюдо на отдельных позиций. Сигналы переданы на компьютер с помощью 4-Фотон подсчет фотоэлектронный умножитель трубы и сохраняются и отображаются в компьютер, программное обеспечение сбора данных.
  3. Анализировать сигналы после записи для 4-7 дней, которые могут сопровождаться среднего изменения и непрерывной записи для второй недели при необходимости.
    Примечание: Для получения суточного параметров, включая этап, длина периода, амплитуда ритма и демпфирования курс, мы использовали Люминометр анализ программного обеспечения для анализа данных о биолюминесценции.
  4. Бестрендовости необработанных данных с работающей в среднем и анализировать лучшие подходит к синусоидальной волны, чтобы получить период, фаза, амплитуда и демпфирования ставка 21 , 22.
  5. Из-за высокой временной биолюминесценции после лечения и среднего изменения, исключить из анализа первого цикла данных.
  6. Для представления данных, участок необработанных данных (биолюминесценции, / s) против время (день или h). При необходимости, вычитается базовые данные могут быть отображены для сравнения амплитуды и фазы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Суточный биолюминесценции репортер вектор: человеческого PER2 промоутер driven выражение дестабилизировали Люцифераза вариант

Последовательности ДНК, включающий фрагмент 941 bp производного от человека промоутер PER2 , используется для построения вектор суточного репортер, pGL [hPer2P/Luc2P/Neo, впервые было проанализировано на наличие нормативных элементов, известных для регулирования суточный ген выражение. Биоинформатика анализ показал, что в рамках этой промоутер фрагмент, существует три различных сайтов связывания Bmal1 (E-бокс) (CAT/ГКГТ), два суточного транскрипции расширения сайтов (CCAATG), две коробки GC и транскрипции стартовый сайт (рис. 1). Поэтому этот репортер вектор предполагалось отразить суточного ген выражение.

Оптимизация синхронизации агента

Для синхронизации или повлиять на автономных Циркадный ритм клеток фибробластов в vitro биолюминесценции исследований были использованы несколько агентов. Для выбора конкретных синхронизации агент эффективной и рентабельной типа клеток в эпителиальных клеток молочной железы, мы сравнили форсколин 10 мкм, 1 Нм мелатонина, дексаметазона 0,1 мкм, 50% HS и 100% SQ в молочной эпителиальных клеток (MCF10A) временно transfected с вектором суточного репортер. Клетки синхронизированы с 50% HS показал лучший Циркадный ритм, с 3 вершины суточного индуцированной люминесценции, по сравнению с только одной или двух пиков в клетках синхронизированы с другими агентами. Кроме того, профили биолюминесценции клеток, синхронизированы с 50% HS производится приемлемый период, амплитуда и наилучшее значение при анализе данных (Рисунок 2). Основываясь на этих выводах, мы выбрали этот эффективный метод как агент синхронизации ячейки для всех последующих экспериментов.

Нарушение и восстановление клеточных Циркадный ритм, воздействия химических веществ

В этой модели в пробирке неочищенные, временно transfected клеток (контрольная группа) показал, по крайней мере два полных цикла люминесценции, сигнализации, после синхронизации (рис. 3A). Клетки подвергаются прямой обязанности мутаген, Мичиганского университета, показали дозозависимый нарушения циркадного ген выражение как отражение потерей люминесценции пиков. Хотя лечение с 0,25 мм НМУ не нарушить сотовой Циркадный ритм, доза 0,5 мм НМУ первоначально отложено и позже отменено Циркадный ритм, как указано на исчезновение второй пик люминесценции в ~ 72 ч после лечения. Ингибирование активности SIRT1 с 20 Нм Ex257 или 1 мкм cambinol аналогичным образом подорван Циркадный ритм увлажнения последующих суточного цикла (Рисунок 3А-1). Важно отметить, что добавление MSC (12,5 мкм) на носитель культуры восстановлено к нормальной первого и второго циклов экспрессии суточного генов в клетках НМУ лечение. MSC не только восстановить ритм нарушается Мичиганского университета, но и предотвратить разрушительные эффекты ингибиторов SIRT1, Ex257 и cambinol (рис. 3а-2).

В стабильно transfected клеток ингибиторы НМУ и SIRT1 нарушается Циркадный ритм, хотя и при более высоких концентрациях, чем это наблюдается в переходных transfectants (рис. 3Б-1). MSC (12,5 мкм) восстановлен циркадные ритмы в клетках, предварительно обработанных с 1 мм Мичиганского университета (рисунок 3B-2). Что еще более важно, MSC также восстановлена циркадные ритмы в клетках, обработанных с ингибиторами SIRT1, включая EX257 (40 Нм) (рисунок 3B-3) и cambinol (2 мкм) (рисунок 3B(4)), соответственно.

В сравнении между рис 3А и 3Б, рисунок, интенсивность биолюминесценции был намного выше, но ритм был нанесен за более короткое время временно transfected клеток против стабильно transfected клеток (~ 10 раз выше, 2 раза короче) в генерал, даже после лечения клеток с НМУ или MSC. Кроме того сотовой Циркадный ритм был вдвое более чувствительны к воздействию химических веществ в временно transfected клеток, по сравнению с стабильно transfected клеток.

Количественные изменения дозозависимый сотовой циркадного ритма воздействием химических веществ

Аналогично, нарушается сотовой Циркадный ритм стабильно transfected клеток лечение с 1 мм НМУ был восстановлен лечения НАК в зависимости от дозы (0-20 мкм) (.рис. 4A) как в изменении суточного периода (Рисунок 4B ) и фазу (рис. 4 c).

Figure 1
Рисунок 1: Последовательность человеческой PER2 промоутер фрагмент и суточного репортер вектора. (A) человеческого PER2 промоутер фрагмент (941 bp) был секвенирован, и последовательность была проанализирована для элементов функциональных спать промоутера. E-коробка, CACGTT / CATGTG; суточный транскрипции, расширение сайта, CCAATG; GC коробка, CGCCCC / GGGGCGGG; Транскрипция, начиная с сайта (TSS): CAGCGG. (B) схема дестабилизировали Люцифераза репортер вектора, pGL [hPer2P/Luc2P/Neo]. Транскрипция дестабилизировали Люцифераза (dLuc) находится под прямым контролем промотора hPER2 . Ген сопротивления совместно выразили неомицин (нео) облегчает выбор инфицированных клеток, G418. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: Синхронизация в vitro сотовой циркадного ритма синхронизации агентами. После 24 ч голодания MCF10A клетки временно transfected вектором суточного репортер относились с каждым агентом синхронизации для 2 h, а затем записывать сигнал люминесценции. Синий, 10 мкм форсколин; красный, 1 Нм мелатонина; Грин, дексаметазона 0,1 мкм; фиолетовый; 50% лошадь сыворотки (СС); Тил, 100% SingleQuot (SQ); желтый, пустой вектор (отрицательный контроль). Оси x, время (день); Ось y, биолюминесценцию (количество/мин). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.


Рисунок 3: MSC восстановлен сотовой циркадные ритмы, сорваны НМУ и SIRT1 ингибиторов в эпителиальных клеток молочной железы в пробирке. Биолюминесценции анализы проводились на MCF10A /PER2-dLuc репортер клетки после синхронизации с 50% HS. Оси x, время (h) (пост НМУ время лечения); Ось y, биолюминесценцию (количество/мин). (A) результаты от временно transfected клеток. (1) клетки обрабатывали 0, 0,25 или 0,5 мм НМУ, 20 Нм EX527 или 1 мкм cambinol за 1 ч, после синхронизации. Желтый: контроль; Красный: 0,25 мм НМУ; Зеленый: 0,5 мм НМУ; синий: 20 Нм EX527; желтый зеленый: 1µм cambinol. (2) клетки относились с 12,5 мкм MSC самостоятельно или в сочетании с 20 Нм EX527 или 1 мкм cambinol в записи средних следующие экспозиции до 0,5 мм Мичиганского университета. Желтый: Контроль; Красный: 0,25 мм НМУ; Зеленый: 0,5 мм НМУ; синий: 0,5 мм НМУ + 12,5 мкм MSC; желтый зеленый: 0,5 мм НМУ + 12,5 мкм MSC + 20 Нм EX527; фиолетовый: 0,5 мм НМУ + 12,5 мкм MSC + 1 мкм cambinol. (B) результаты стабильно transfected клеток. 3rd- 5й вершины, которые показали чистые и ясные различия между группами представлены как представитель результат. (1) клетки обрабатывали 0, 0,5, 1,0 или 2,0 мм НМУ, 40 Нм EX527 или 2 мкм cambinol за 1 ч после синхронизации. Желтый: Контроль; Красный: 0,5 мм НМУ; Зеленый: 1,0 мм НМУ; синий: 2.0 мм НМУ; желтый зеленый: 40 Нм EX527; фиолетовый: 2 мкм cambinol. (2) клетки относились с 12,5 мкм MSC в записи средних следующие экспозиции до 1,0 мм Мичиганского университета. Желтый: Контроль; Красный: 1,0 мм НМУ; Зеленый: 1,0 мм НМУ + 12,5 мкм MSC. (3) клетки обрабатывали 12,5 мкм MSC следующее воздействие на 40 Нм EX257. Желтый: Контроль; Красный: 40 Нм EX257; Зеленый: 40 Нм EX257 + 12,5 мкм MSC. (4) клетки обрабатывали 12,5 мкм MSC следующее воздействие 2 мкм cambinol. Желтый: Контроль; Красный: 2 мкм cambinol; Зеленый: 2 cambinol мкм + 25 мкм MSC. Этот результат сообщалось ранее и лицензируется на условиях CC на 2.022. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: NAC доза зависим восстановлен сотовой циркадного ритма прерваны НМУ. Клетки были относиться с 1,0 мм НМУ или транспортного средства управления за 1 ч после синхронизации. (A) представитель результат биолюминесценции (количество/мин) против времени (h). Желтый: Контроль; Красный: 1,0 мм НМУ; Зеленый: 1,0 мм НМУ, 5 мкм НАК; синий: 1,0 мм НМУ, 10 мкм НАК; желтый зеленый: 1,0 мм НМУ, 20 мкм нац. (B) период (часов). (C) фаза (в часах). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

В клетках млекопитающих периодичности суточного часов регулируется взаимосвязанных транскрипционный анализ/трансляционная обратной связи. Гетеродимерами Bmal1 и часы или Npas2 регулирования суточного транскрипции путем привязки к элементам E-бокс в промоутеров ядра СГС, включая Per2 и плакатьи многочисленные CCGs4. Как они накапливаются в ячейке, гетеродимерами из за: Крик post-translationally изменения и перевезены в ядре для подавления будильник: Bmal1 транскрипционный анализ активности. Этот отрицательной обратной связи позволяет ядру CGs регулировать свои собственные транскрипции и настроить ритмические выражения CGs и CCGs23. Хотя для большинства клеток млекопитающих имеют встроенные суточного часы, часы в отдельных клетках могут быть синхронизированы с обоих внутренних условий (например, окислительно-восстановительного потенциала) и24внешних экологических раздражителей. Суточный ген выражение в естественных условиях могут быть синхронизированы с мелатонин, гормон, вырабатываемый шишковидной железой в ответ на сигналы, полученные от центральной кардиостимулятор (SCN). СКС интегрирует сигналы от света, попадающего на специализированных melanospin выражая фоточувствительные сетчатки ганглия клеток в сетчатке. Освобожден из эпифиза мелатонина входит распространение и регулирует суточный ритм ППП и большинство периферических клеток in vitro и in vivo25,26. Циркадный ритм может также регулироваться стресс гормонов (например, кортизола и катехоламинов)27,28 и факторы роста29,30. Известно, что дерегулирование факторов роста ассоциироваться с суточного нарушение роста и дифференцировки клеток31.

Вектор суточного репортер, который мы построили использует этот механизм негативных биохимических обратной связи. Основные суточного отрицательной обратной связи состоит из transcriptional активаторы, BMAL1 и часы, которые связывают суточного мотивы PER2 промоутер и подавляющего чел и кристаллов, которые отрицательно регулирования BMAL1 выражение привязки E/E´-бокс. В нынешней системе репортер ритмической активации PER2 промоутер BMAL1 и будильник облегчает суточного выражение дестабилизировали Люцифераза, позволяя точнее суточного периодичности свечения сигналов. Строительство репортер плазмида включает в себя сайт BMAL1 привязки, расширения сайта Циркадный ритм, GC коробка и транскрипции стартовый сайт hPER2 промоутер. Вектор позволяет в реальном времени индикация для сотовых вегетативная Циркадный ритм в transfected клеток и может использоваться для определения условий или конкретные агенты, которые изменяют паттерн эндогенного суточного экспрессии генов. Однако когда клетки культивировали в пробирке или ex vivo, стать посланный их суточного осцилляторов быстро. Поэтому необходимо повторно синхронизировать их ритмы, прежде чем любой суточный анализов может быть выполненной в пробирке. В эпителиальных клеток молочной железы, мы обнаружили, что 50% HS, мелатонин и 100% SQ каждый смогли побудить эффективной синхронизации Циркадный ритм в пробирке. Дексаметазон и форсколин производится только частичную синхронизацию. Доза зависимых тестов будет необходимо для разработки и отбора новых синхронизации агентов в будущих исследованиях. Ввиду низкой стоимости, эффективности и его широкое применение, как агент синхронизации, 50% HS оказалась эффективной синхронизации агент, который производства надежных и воспроизводимых сотовой Циркадный ритм в молочной эпителиальные клетки и нервные клетки, как ранее сообщили во многих других типов клеток и различные экспериментальные параметры24.

Чтобы проверить модель в vitro суточного регулирования, мы далее спросил, если ответ Циркадный ритм экологических стрессоров в vitro бы охарактеризовать последствия мы наблюдали в естественных условиях. Ранее мы показали, что одной дозы канцерогенных НМУ нарушена суточного выражение основных CGs (например, Per2) и несколько CCGs в целевой молочной железы. Кроме того заметкой режим MSC сброса суточного выражение генов Per2 и CCGs к нормальной. Мы также показали, что воздействие клеток ядовитых веществ и стресс может изменять суточный ген выражение через их воздействие на NAD+-зависимых SIRT1 деятельности7,8,22. Результаты, полученные с помощью в vitro пробирного суточного репортер показал, что воздействие НМУ вызвало нарушение выражения сотовой суточного гена, и что более интересно, MSC не только возможность сбросить сотовой Циркадный ритм нарушается НМУ, но также восстановить суточный ритм, сорваны SIRT1 ингибиторов. Эти результаты показали, что в пробирке assay не только воспроизводит эффекты НМУ на экспрессию генов суточный, но также воспроизводит эффекты MSC на нарушение суточного ритма в естественных условиях через SIRT1-зависимых механизмов. Системы суточного репортер в vitro таким образом имеет потенциал, чтобы обнаружить целый ряд ядовитых веществ и стресс, которые изменяют уровни NAD+/NADH в клетке, включая прямые ингибиторы и модуляторы из клеточных редокс, Велоспорт и генотоксические агенты, разрушающим NAD+ через поли АДФ рибоза зависимой ДНК ремонт32. Эти результаты показывают, что в пробирке репортер система обеспечивает полезный инструмент для экрана для условий клеток и химических агентов, которые могут нарушить или восстановить суточный гена регулирование в естественных условиях.

Хотя в vitro пробирного можно настроить с использованием клеток временно или стабильно transfected с репортером конструкции, некоторые различия были отмечены в ответ на обращения химических веществ между временно и стабильно transfected клеток. Стабильно transfected клеток были более устойчивы к лечению химических веществ, особенно НМУ и SIRT1 ингибиторы, чем временно transfected клеток. Эти различия могут отражать тонкие различия в регуляции вектор промоутер в стабильных transfectants из-за влияния от последовательностей, вокруг конкретных интеграции сайтов. Таким образом выбор стабильных transfectants, лечение антибиотиками может также выбрать клоны, которые более устойчивы к суточного нарушения. Таким образом отдельные в пробирке клеток модели с помощью переходных или стабильной transfectants должны быть проверены на их способность резюмировать в vivo ответы. Трансфекция различные методы также вызывают различные уровни стресса генотоксического и токсичности на клетки и результат в их различных восприимчивости к токсичному воздействию химических веществ. Таким образом для отбора transfection и лечения условий необходимы цитотоксичность тест и пилот эксперименты. Несмотря на разницу в их чувствительность общие результаты, полученные с нашими клетками молочной эпителиальных суточного репортер нарушение и восстановление клеточных Циркадный ритм химическими веществами, последовательной и сопоставимой между временно transfected и стабильно transfected клеток и результаты резюмировалась эффекты, мы наблюдали в естественных условиях.

Чтобы определить, если суточный репортер вектор может быть использована в других типах клеток, клеток глиобластомы человека/астроцитома (U-87 мг) были стабильно transfected с суточного вектора. Предварительные результаты, используя assay сотовой биолюминесценции в vitro показали, что после синхронизации, эти нервные производные опухолевые клетки имеют регулярные и сильный сотовой Циркадный ритм, сопоставимые с наблюдаемой в человека молочной эпителиальные клетки. Клетки лечат IC261, известный ингибитора киназы протеина казеина 1 δ (CK1δ) и CK1 ε, показало длительное суточный, но меньше амплитуда как сообщалось by другие (данные не показаны)33. Эти результаты показывают, что суточный Люцифераза репортер вектор и в пробирке сотовой биолюминесценции assay применимы в других орган конкретных ячеек, включая нервные клетки.

Системе сотовой репортер, разработанной здесь может поэтому использоваться широко как assay в пробирке для определения экспрессии суточного генов в различных типов клеток в целом. Экспериментальная процедура является простым, быстрым и безопасным. Однако, эта система сотовой репортер не может быть легко адаптирована в клетках, которые трудно transfect, без деления клеток (например, нейрональные клетки), поскольку они имеют крайне низкий трансфекции эффективность. На основе вирус трансфекции методы (например, несущего трансфекции) может предложить выше эффективность решения для этих клеток34. Однако время и трудности, связанные с производством лентивирусные делает этот метод сложным и трудоемким. Кроме того надлежащего уровня безопасности лаборатории необходим для производства и использования вируса. Кроме того высоким разрешением одноклеточного свечения датчики могут использоваться для определения стойких, самостоятельно постепенно ритмы экспрессии генов суточного-деления клетки35.

Исследования млекопитающих Циркадный ритм в vivo являются не только труда интенсивной и дорогостоящий, но они также требуют использования большого количества животных. Наличие систем в пробирке может значительно уменьшить количество животных, необходимых для тестирования связи между нарушения циркадного гена выражения и развития хронических заболеваний, включая канцерогенеза и метаболизм синдром. Количественные данные о суточного параметров, включая период, амплитуде и фазе, может сообщить дозы - и/или зависящие от времени воздействия химических веществ на клеточном суточный ритм. Например мы наблюдали что антиоксидант, НАК доза зависим можно восстановить, период и фазовый сотовой циркадного ритма прерваны Мичиганского университета. В vitro модель может также использоваться для экрана и классификации экологических суточного разрушители и исследовать влияние нарушается циркадного ритма на обесценение клеточную функцию, обеспечивая механистических идей для развития графики работы стратегий вмешательства для когорты на повышенный риск рака молочной железы, метаболического синдромов и психофизиологических расстройств, из-за ненормального.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана 2012 общество токсикологии (ГНС)-компании Colgate Palmolive Грант для укрепляющий исследований (м. клык) и исследования международного сотрудничества Фонда животных и растений карантина агентства, Республика Корея (м. клык), и Грант NIEHS P30ES005022 (H. Zarbl). Мы хотели бы поблагодарить д-ра Чжэн Чэнь (Макговерн медицинская школа при университете центра науки здоровья Техас в Хьюстон) за его полезные обсуждения, г-н Хуан Shao-An для его экспериментальной помощи и г-жа Кими наката для ее доказательство чтения.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pLS[hPER2P/rLuc/Puro] vector SwitchGear Genomics S700000 customized vector
pGL4.18[Luc2P/Neo] vector Promega 9PIE673 destabilized luciferase expression vector
T4 DNA ligase Invitrogen 15224041 For subcloning
TOPO TA cloning kit Invitrogen K4500-02 with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli
Sac I New England BioLabs R0156S Restriction enzyme
Hind III-HF New England BioLabs R3104S Restriction enzyme
CutSmart buffer New England BioLabs B7204S Restriction enzyme buffer
DNA gel extraction kit Qiagen 28704 Purify DNA fragments from agarose gel
PCR Purification Kit Qiagen 28104 DNA clean up
LB Miller's modification TEKNOVA L8600 For transformed E. Coli culture
LB Agar Plate TEKNOVA L1902 For white/blue selection
QIAprep spin miniprep Kit Qiagen 27104 For extraction of plasmide DNA
EndoFree plasmid maxi prep Kit Qiagen 12362 For extraction of plasmide DNA
FuGene HD Promega E2311 Transfection reagent
Opti-MEM reduced serum medium Invitrogen 31985-062 For transfection
MCF10A cell line American Type Culture Collection CRL-10317 Mammary Epithelial Cells
MEGM BulletKit Lonza CC-3150 Mammary Epithelial Growth Medium
MEBM Lonza CC-3151 Mammary Epithelial Basal Medium
MEGM SingleQuot Kit Lonza CC-4136 Suppliments & Growth Factors
ReagentPack Lonza CC-5034 Reagent for subculture
D-PBS (10X) Sigma D1408 Wash cells in culture dishes
UltraPure Distilled Water Invitrogen 10977 Dilute 10X D-PBS
Tissue culture dish (35 mm) BD/Falcon 353001 cell culture dish suitable to LumiCycle
Silicon grease Fisher NC9044707 For sealing dish with recording medium
Round cover glass Harvard Bioscience 64-1500 (CS-40R) For sealing dish with recording medium
Cholera toxin Sigma C8052 Supplement for growth medium
G418 sulfate (Geniticin) Invitrogen 10131035 Antibiotic for selection of stabliy transfected cells
Ampicillin Sigma A9393 For colony selection
Forskolin Sigma F6886 Synchronization agent
Melatonin Sigma M5250 Synchronization agent
Dexamethasone Sigma D4902 Synchronization agent
Horse serum Sigma H1138 Synchronization agent
d-Luciferin, sodium salt Invitrogen L2912 Luciferase substrate
IC261 Sigma 10658 Positive control for circadian disruptor
Methylnitrosourea (NMU) Sigma N1517 Mammary specific carcinogen
Methylselenocysteine (MSC) Sigma M6680 Organic selenium (chemopreventive agent)
EX527 Sigma E7034 SIRT1 specific inhibitor
Cambinol Sigma C0494 SIRT1 & SIRT2 inhibitor
NanoDrop Spectrophotometer Thermo Scientific NanoDrop 8000 Quantify nucleotide
GeneAmp PCR System 9700 Applied Biosystems N805-0200 For molecular biology experiment
CO2 Incubator NAPCO Series 8000 DH For cell culture at 5% CO2 at 37 °C
Desktop centrifuge with refrezerator Eppendorf 5430R For molecular biology experiment
Centrifuge with swing bucket Eppendorf 5810 R For cell culture
Inverted microscope Nikon 80124 Phase contrast optional
Tissue culture hood Labconco Class II A2 BSL-2 certified
LumiCycle 32 Actimetrics Not Available Luminoscence detector

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Akerstedt, T., et al. Night work and breast cancer in women: a Swedish cohort study. BMJ Open. 5, (4), e008127 (2015).
  2. Parent, M. E., El-Zein, M., Rousseau, M. C., Pintos, J., Siemiatycki, J. Night work and the risk of cancer among men. Am J Epidemiol. 176, (9), 751-759 (2012).
  3. Knutsson, A., et al. Breast cancer among shift workers: results of the WOLF longitudinal cohort study. Scand J Work Environ Health. 39, (2), 170-177 (2013).
  4. Fu, L., Lee, C. C. The circadian clock: pacemaker and tumour suppressor. Nat Rev Cancer. 3, (5), 350-361 (2003).
  5. Fu, L., Kettner, N. M. The circadian clock in cancer development and therapy. Prog Mol Biol Transl Sci. 119, 221-282 (2013).
  6. IARC. Painting, Firefighting, and Shiftwork. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. 98, 563-764 (2010).
  7. Zhang, X., Zarbl, H. Chemopreventive doses of methylselenocysteine alter circadian rhythm in rat mammary tissue. Cancer Prev Res (Phila Pa). 1, (2), 119-127 (2008).
  8. Fang, M. Z., Zhang, X., Zarbl, H. Methylselenocysteine resets the rhythmic expression of circadian and growth-regulatory genes disrupted by nitrosomethylurea in vivo. Cancer Prev Res (Phila). 3, (5), 640-652 (2010).
  9. Burbulla, L. F., Kruger, R. Converging environmental and genetic pathways in the pathogenesis of Parkinson's disease. J Neurol Sci. 306, (1-2), 1-8 (2011).
  10. Aitlhadj, L., Avila, D. S., Benedetto, A., Aschner, M., Sturzenbaum, S. R. Environmental exposure, obesity, and Parkinson's disease: lessons from fat and old worms. Environ Health Perspect. 119, (1), 20-28 (2011).
  11. Nagoshi, E., Brown, S. A., Dibner, C., Kornmann, B., Schibler, U. Circadian gene expression in cultured cells. Methods Enzymol. 393, 543-557 (2005).
  12. Ramanathan, C., et al. Cell type-specific functions of period genes revealed by novel adipocyte and hepatocyte circadian clock models. PLoS Genet. 10, (4), e1004244 (2014).
  13. Sporl, F., et al. A circadian clock in HaCaT keratinocytes. J Invest Dermatol. 131, (2), 338-348 (2011).
  14. Zhang, E. E., et al. A genome-wide RNAi screen for modifiers of the circadian clock in human cells. Cell. 139, (1), 199-210 (2009).
  15. Yoo, S. H., et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, (15), 5339-5346 (2004).
  16. Leclerc, G. M., Boockfor, F. R., Faught, W. J., Frawley, L. S. Development of a destabilized firefly luciferase enzyme for measurement of gene expression. Biotechniques. 29, (3), (2000).
  17. Genomics, S. Technical Note: SwitchGear methods for gene model construction and transcription start site prediction. (2009).
  18. Scientific, F. Safety Data Sheet: Ethidium bromide, 1% Solution/Molecular Biology. (2010).
  19. Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. Current Protocols in Molecular Biology. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience. New York. (1994).
  20. Yoo, S. H., et al. A noncanonical E-box enhancer drives mouse Period2 circadian oscillations in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, (7), 2608-2613 (2005).
  21. Chen, Z., et al. Identification of diverse modulators of central and peripheral circadian clocks by high-throughput chemical screening. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (1), 101-106 (2012).
  22. Fang, M., Guo, W. R., Park, Y., Kang, H. G., Zarbl, H. Enhancement of NAD+-dependent SIRT1 deacetylase activity by methylselenocysteine resets the circadian clock in carcinogen-treated mammary epithelial cells. Oncotarget. (2015).
  23. Chen-Goodspeed, M., Lee, C. C. Tumor suppression and circadian function. J Biol Rhythms. 22, (4), 291-298 (2007).
  24. Balsalobre, A. Clock genes in mammalian peripheral tissues. Cell Tissue Res. 309, (1), 193-199 (2002).
  25. Jung-Hynes, B., Huang, W., Reiter, R. J., Ahmad, N. Melatonin resynchronizes dysregulated circadian rhythm circuitry in human prostate cancer cells. J Pineal Res. 49, (1), 60-68 (2010).
  26. von Gall, C., et al. Melatonin plays a crucial role in the regulation of rhythmic clock gene expression in the mouse pars tuberalis. Ann N Y Acad Sci. 1040, 508-511 (2005).
  27. Vujovic, N., Davidson, A. J., Menaker, M. Sympathetic input modulates, but does not determine, phase of peripheral circadian oscillators. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 295, (1), R355-R360 (2008).
  28. Schofl, C., Becker, C., Prank, K., von zur Muhlen, A., Brabant, G. Twenty-four-hour rhythms of plasma catecholamines and their relation to cardiovascular parameters in healthy young men. Eur J Endocrinol. 137, (6), 675-683 (1997).
  29. Yu, H., et al. Circadian rhythm of circulating fibroblast growth factor 21 is related to diurnal changes in fatty acids in humans. Clin Chem. 57, (5), 691-700 (2011).
  30. Nakagawa, H., et al. Modulation of circadian rhythm of DNA synthesis in tumor cells by inhibiting platelet-derived growth factor signaling. J Pharmacol Sci. 107, (4), 401-407 (2008).
  31. Yang, X., Guo, M., Wan, Y. J. Deregulation of growth factor, circadian clock, and cell cycle signaling in regenerating hepatocyte RXRalpha-deficient mouse livers. Am J Pathol. 176, (2), 733-743 (2010).
  32. Virag, L. Structure and function of poly(ADP-ribose) polymerase-1: role in oxidative stress-related pathologies. Curr Vasc Pharmacol. 3, (3), 209-214 (2005).
  33. Kon, N., Sugiyama, Y., Yoshitane, H., Kameshita, I., Fukada, Y. Cell-based inhibitor screening identifies multiple protein kinases important for circadian clock oscillations. Commun Integr Biol. 8, (4), e982405 (2015).
  34. Ramanathan, C., Khan, S. K., Kathale, N. D., Xu, H., Liu, A. C. Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters. J Vis Exp. (67), e4234 (2012).
  35. Welsh, D. K., Yoo, S. H., Liu, A. C., Takahashi, J. S., Kay, S. A. Bioluminescence imaging of individual fibroblasts reveals persistent, independently phased circadian rhythms of clock gene expression. Curr Biol. 14, (24), 2289-2295 (2004).
<em>В пробирке</em> Assay биолюминесценции характеризовать Циркадный ритм в эпителиальных клеток молочной железы
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fang, M., Kang, H. G., Park, Y., Estrella, B., Zarbl, H. In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (127), e55832, doi:10.3791/55832 (2017).More

Fang, M., Kang, H. G., Park, Y., Estrella, B., Zarbl, H. In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (127), e55832, doi:10.3791/55832 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter