Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

In Vitro Mareld Assay att karakterisera dygnsrytmen i mjölkkörtlar epitelceller

doi: 10.3791/55832 Published: September 28, 2017

Summary

En in vitro- Mareld analys att bestämma cellulära dygnsrytmen i mjölkkörtlar epitelceller presenteras. Denna metod använder tredjeparts däggdjursceller reporter plasmider uttrycker destabiliserat luciferas under kontroll av PERIOD 2 gen arrangören. Det kan anpassas till andra celltyper att utvärdera organ-specifika effekter på dygnsrytmen.

Abstract

Dygnsrytmen är en grundläggande fysiologiska process i alla organismer som reglerar biologiska processer alltifrån genuttryck sova beteende. Hos ryggradsdjur styrs dygnsrytmen av en molekylär oscillator som fungerar i både suprachiasmatiska kärnan (SCN; centrala pacemaker) och enskilda celler bestående av mest perifera vävnader. Viktigare, är störningar av dygnsrytmen av exponering för ljus-at-night, miljöfaktorer eller gifter associerade med ökad risk för kroniska sjukdomar och åldrande. Förmåga att identifiera ämnen som kan störa central eller perifer biologiska klockor och agenter som kan förhindra eller mildra effekterna av dygnsrytm störningar, har betydande konsekvenser för förebyggande av kroniska sjukdomar. Även om gnagare modeller kan användas för att identifiera exponeringar och agenter som inducerar eller förhindra/minska dygnsrytm störningar, kräver dessa experiment stort antal djur. In vivo studier också kräver betydande resurser och infrastruktur, och kräver forskare att arbeta hela natten. Således finns det ett brådskande behov av en celltyp lämpliga in vitro- system till skärmen för miljömässiga dygnsrytm ämnen och smakförstärkare i celltyper från olika organ och stater sjukdom. Vi konstruerade en vektor som driver transkription av den destabiliserat luciferas i eukaryota celler under kontroll av mänskliga PERIOD 2 gen arrangören. Denna dygnsrytm reporter konstruktion var stabilt transfekterade till mänsklig coitus epitelceller och dygnsrytm lyhörd reporter cellerna valdes att utveckla in vitro- Mareld analysen. Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för att skapa och validera analysen. Vi ger ytterligare Detaljer för bevis på koncept-experiment som visar våra i vitro assay förmåga att sammanfatta i vivo effekterna av olika kemikalier på den cellulära biologiska klockan. Resultaten indikerar att analysen kan anpassas till en mängd celltyper till skärmen för både miljömässiga ämnen och chemopreventive förstärkare av dygnsrytm klockor.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Den dygnsrytm klockan styr ett brett spektrum av biologiska processer från dagaktiva uttryck av gener att sova beteende i en förutsägbar rytm med en periodicitet av cirka 24 h. Epidemiological studier föreslår att kroniska störningar i dygnsrytm rytmen ökar risken för bröst- och prostatacancer hos skiftarbetare, inklusive sjuksköterskor och flight besättningar1,2,3. Dessa fynd är styrks av gnagare studier, som visar att exponering för konstant ljus, ljus-at-night eller ljus cykler som efterliknar jetlag ökning tumör incidens och accelererar tumör tillväxt4,5. Baserat på data från både människa och gnagare studier, klassificeras International Agency for Research on Cancer skiftarbete som sannolikt cancerframkallande (typ 2A) i 20106.

Tidigare har vi visat att en cancerframkallande engångsdos av de mammary tumör specifika cancerframkallande, N- nitroso-N- methylurea (NMU), störd dygnsrytm uttrycket av stora dygnsrytm gener (CGs) (t.ex., det Period 2 , Per2) och flera dygnsrytm-kontrollerade gener (CCGs), inklusive viktiga DNA-skador som är lyhörd och reparera (DDRR) gener i målet mjölkkörtlar (men inte i levern). Dessutom återställa dygnsrytm uttrycket av både Per2 och DDRR gener mot normalt genom en chemopreventive regim med kosten L-metyl-selenocystein (MSC) incidensen av tumör med 63%. Dessa fynd var först som visar en mekanistisk koppling mellan dygnsrytmen, kemisk carcinogenes och chemoprevention7,8. Exponeringar för andra miljögifter som visat att störa dygnsrytm gen uttryck i vivo är också associerade med ökad risk för miljörelaterade sjukdomar9,10. Förstå de mekanismer som länkar dygnsrytm störningar av miljögifter och patogenes kan leda till slentrianmässigt-baserade strategier för förebyggande av sjukdomar. Dock studier som syftar till att definiera interaktioner mellan exponeringarna och dygnsrytmen utförs vanligtvis invivo. En typisk i vivo experiment undersöker påverkan på dygnsrytmen kräver stora mängder djur, som vävnader från minst tre styra och tre utsatta djur måste samlas in varje 3-4 h under 24 eller 48 h. Utveckling av validerade in vitro- system som recapitulates i vivo observationer och mekanismer skulle därför inte bara minska antalen djur som krävs, men också dramatiskt minska experimentella kostnader och krav som forskare arbetar kontinuerligt under 24-48 h. Dessutom skulle ett validerat in vitro- system kunna användas för high throughput screening av föreningar eller genetisk förändring som påverkar dygnsrytmen eller dess svar på miljöfaktorer eller gifter. Därför behövs strategiska kombinationen av in vitro- och in-vivo modeller och experiment för att få olika insikter med olika fokus.

Hos däggdjur finns dygnsrytm oscillatorer inte bara i specialiserade nervceller av SCN, men också i mest perifera celltyper. Dessa molekylära klockor är liknande de i etablerade fibroblast cellinjer och primära fibroblaster från embryon eller vuxna djur. dock finns det ett behov för vävnad typspecifika cellular-modeller11. Följaktligen, traditionella studier av rörelseaktivitet i vivo, SCN explants ex vivooch cellbaserade in vitro- analyser i förevigade fibroblast celler används allmänt att studera cell-autonoma dygnsrytm defekter. Dock finns det inga belägg för att ett in vitro- fibroblast cellbaserade test kan sammanfatta dygnsrytm mekanismer och svaren finns i cellerna i andra perifera organ i vivo. Olika celltyper kan ha distinkta mönster av genuttryck, xenobiotiska metabolism och DDRR, och kopplingarna mellan toxicitet och dygnsrytm genuttryck kan vara celltyp specifika eller modulerad av olika fysiologiska parametrar. Dessutom har dygnsrytm oscillatorer i fibroblast-datorer inte helt utvärderats för Svaren till miljögifter, stressfaktorer och förebyggande medel som länk exponeringar mot mekanismer av sjukdomsutvecklingen och förebyggande. Således finns det ett behov för lättköpt, validerade cell-typ specifika, in vitro- Mareld analyser att studera orgel specifika miljömässiga dygnsrytm ämnen. Även om en mängd olika cellulära klocka modeller (t.ex., i levern, keratinocyter, fettceller, samt ett osteosarkom cellinje) har utvecklats i senare år12,13,14, 15, analysen beskrivs här är den första cellulära klocka modellen i bröst epitelceller, och den första demonstrationen att sammanfatta i vivo Svaren till miljöfaktorer, gifter, droger och chemopreventive agenter.

Renilla luciferas (rLuc) och firefly luciferas är 30-61 kDa monomer proteiner som inte kräver posttranslationell bearbetning för enzymatisk aktivitet och kan fungera som en genetiska reporter omedelbart vid översättning. När substratet associates med enzymet luciferas, genererar biokemisk reaktion katalyseras en blixt av ljus. Således, luciferas konstruktioner används allmänt som en gen uttryck reporter systemet in vitro- och in vivo. Dock i dygnsrytmen studier, nyttan av luciferas reportern begränsas av den relativt långa halveringstiden av proteinet luciferas (T1/2 = 3.68 h) i förhållande till perioden (speciellt till den korta perioden) för förändringar i dygnsrytm gen uttryck; dock använt ett flertal studier under åren framgångsrikt har luciferas genen i pGL3 vektorn, vilket indikerar att den snabbt nedbrytbara luciferas inte får nödvändig för rapportering dygnsrytm, särskilt för rytmer med en längre period, såsom 24 h. Därför utvecklats en reporter plasmid med destabiliserat luciferas vektor, pGL [Luc2P/Neo], som innehåller hPEST (en destabilisering proteinsekvens), vilket tillåter oss att använda den som en dygnsrytm reporter vektor för vår nuvarande in vitro- Mareld assay. Det protein som kodas av Luc2P har en mycket kortare halveringstid (T1/2 = 0,84 h) och därför reagerar snabbare och med en större magnitud på förändringar i transkriptionell aktivitet än vildtyp, jagindikerande att det kan vara används för att övervaka det rytmiska uttrycket för luciferas reglerad av promotorn PER2 korrekt i realtid16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. byggandet av PER2 arrangören Driven destabiliserat luciferas Reporter vektor

  1. köpa en anpassad pLS [hPER2P / rLuc / Puro] vektor som innehåller cDNA kodning rLuc och mänskliga PER2 arrangören fragment (hPER2P, 941 bp) på webbplatsen mellan Sac jag och Hind III i flera kloning regionen 17.
  2. Skär mänskliga PER2 arrangören fragmentet (hPER2P, 941 bp) ut från vektorn.
    1. Lägga till 2,5 µL restriktionsenzym buffert, 10 µL (180 ng) pLS [hPER2P / rLuc / Puro] vektor och 1 µL varje begränsning enzymer, Sac I (10 enhet/µL) och Hind III (10 enhet/µL), in en DNA/RNA/nukleotid-free mikrocentrifug rör. Tillsätt ultrarent vatten (10,5 µL) upp till 25 µL och blanda försiktigt genom pipettering.
    2. Inkubera vid 37 ° C i 90 min i ett värmeblock.
    3. Kör hela volymen (25 µL) av restriktionsenzym reaktionen på 0,7% agarosgel innehållande 0,0001% etidiumbromid (EtBr) separera hPER2P från vektorn.
      Obs: EtBr, 3,8-diamino-1-ethyl-6-phenylphenantridinium metylbromid (CAS registreringsnummer: 1239-45-8), är en luktfri vätska. Det är en intercalating agent som vanligen används som en fluorescerande tagga (nucleic acid fläck) i agaros gel-elektrofores och synlig som en orange färg under UV-ljus. Möjlig risk för irreversibla mutagena effekter har inträffat hos försöksdjur, även om ingen av tillsynsmyndigheterna kategoriseras den som en cancerframkallande 18. Därför, vi samlas används agaros gel och elektrofores buffert innehållande EtBr som kemisk risk avfall, och begärde Rutgers miljöhälsa & säkerhet (REHS) att plocka upp och kasta säkert.
    4. Skär en bit av agarosgel innehållande ett EtBr fluorescens band på 941 bp, och rena hPER2P fragment från gelen med en DNA gel extraction kit, följt av kvantifiering på en spektrofotometer genom att mäta absorption densitet (OD) 260 nm våglängd.
  3. Linjär 1,0 µL (1 µg) destabiliserat firefly luciferas uttryck vektorns pGL [Luc2P / Neo] med samma metod som beskrivs i steg 1.2.1-1.2.2. Extrahera vektorn med ett DNA sanering kit följt av kvantifiering som beskrivs ovan med en spektrofotometer.
  4. Ligera av hPER2P in i det linearized vektor pGL [Luc2P / Neo].
    Obs: Per tillverkaren ' s instruktion, idealisk molar förhållandet infoga och vektor är 2:1. För 50 ng vektor, beräknas den perfekta mängden Infoga som 23,6 ng med en formel, [(50 ng vector x 1.0 kb insert)/4.242 kb vektor] x (2/1) = 23,6 ng insert]. Baserat på koncentrationerna av hPER2P (7,26 ng/µL) och pGL [Luc2P / Neo] (50 ng/µL), volymerna av 50 ng pGL [Luc2P / Neo] och 23,6 ng hPER2P beräknas som 1 µL och 3.26 µL, respektive.
    1. Add 2 µL T4 DNA-ligase reaktion buffert (10 X) (50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl 2, 1 mM ATP och 10 mM DTT), 3.26 µL (23,6 ng) hPER2P, 1 µL (50 ng) pGL [Luc2P / Neo], och 13.74 µL vatten upp till 20 µL , blanda försiktigt.
    2. Lägga 1 µL T4 DNA-ligase (400 enhet/µL), blanda försiktigt och inkubera vid 16 ° C över natten i en termocykler och sedan chill ligated vector på is per tillverkaren ' s instruktion.
  5. Omvandla den sammanskrivna vektor pGL [hPer2P / Luc2P / Neo] att kemiskt behöriga E. coli 19.
    1. Ange vattenbad vid 42 ° C, värma upp Super Optimal buljong med catabolite förtryck (S.O.C.) medium (2% trypton, 0,5% jästextrakt, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl 2, 10 mM MgSO 4 och 20 mM glukos) vid rumstemperatur , värma upp Luria-Bertani (LB) agarplatta (innehållande 100 µg/mL ampicillin, 80 µg/mL X-gal och 0,5 µM IPTG) i 37 ° C inkubator och Tina på is en injektionsflaska med behöriga E. coli-celler för varje omformning.
    2. Lägga till 6 µL (21 ng) sammanskrivna vektor- eller 1 µL (30 ng) Töm vektor (negativ kontroll) till en tub kemiskt behöriga E. coli (50 µL) och Vänd sedan försiktigt i slangen för att blanda. Inkubera på is för 30 min.
    3. Värme chock i 42 ° C vattenbad för 30 s utan skakningar och sedan återgå till ice.
  6. Välj en E. coli koloni förvandlas med en ligated vector med blå/vit screening.
    1. Lägg 250 µL S.O.C. medium i den transformerade E. coli tube och inkubera det för 1 h vid 37 ° C under skakning på 200 rpm.
    2. Jämnt om 10-50 µL av omvandlade E. coli på ytan av LB agarplattan. Satte plattan uppochner i 37 ° C inkubator övernattning.
      Obs: En effektiv kloning reaktion bör producera flera hundra kolonier. Plätering två olika volymer rekommenderas att se till att minst en tallrik kommer att ha stor, tydlig vit eller blå färg och välplacerade kolonier. När kolonierna är för liten och färgen är inte urskiljbar, det är praktiskt att använda ett mikroskop (10 X eller 50 X).
    3. Plocka 3-6 vita kolonier från plattorna med steriliserad tand pinnar, och släppa varje koloni i en kultur rör som innehåller 4 mL LB odlingsmedium med 50 µg/mL ampicillin.
    4. Inkubera rören vid 37 ° C under skakning på 200 rpm över natten. Extrahera DNA med 2 mL 4 ml odlade E. coli med en plasmid DNA extraktion mini prep kit per tillverkaren ' s instruktion.
  7. Kontrollera och analysera skäret (hPER2P, 941 bp)
    1. smälta plasmiden DNA med restriktionsenzym och köra elektrofores som beskrivs i steg 1.2.1-1.2.3 att bekräfta om det finns en insert.
      Obs: Positiv kontroll (hPER2P renas vid steg 1.2.4) och negativ kontroll (E. coli förvandlas med en tom vektor) ingick.
    2. Sekvens valda plasmid DNA använder M13 framåt och M13 omvänd primers bekräfta orientering och sekvens av infoga i plasmiden 19.
      Obs: Endast en koloni som hade ett skär med rätt storlek på hPER2P i elektrofores och rätt orientering och sekvens i sekvensering resultatet valdes.
    3. Analysera den mänskliga PER2 arrangör fragmenten (hPER2P, 941 bp) sekvens för dygnsrytm reglerande element, inklusive E-box motiv (Bmal1 bindningsställe, katt/CGTG), CCAATC, GC box och transkription starta webbplats (CAGCGG) 20.
  8. Amplify den valda E. coli genom att lägga till den överblivna 2 mL odlade E. coli till 200 mL LB odlingsmedium som innehåller 50 µg/mL ampicillin och sedan ruvar det över natten vid 37 ° C under skakning på 200 rpm.
  9. Extrahera DNA med en endotoxinfria plasmid maxi prep kit per tillverkaren ' s instruktion, och sedan kvantifiera det genom att mäta OD våglängden 260 nm med en spektrofotometer. Delprov och store plasmid DNA, pGL [hPer2P/Luc2P/Neo], vid-80 ° C frys för framtida användning.

2. Övergående Transfection

  1. inköp och kultur MCF10A celler
    1. Köp en förevigade, icke-omvandlad normal mänsklig coitus epitelial cell linje (MCF10A) från en kommersiell cell bank, där cellerna är cytogenetiskt testad och verifierad med kort tandem upprepa analys innan frysning. Tina och underhålla varje injektionsflaska med frusna celler i kultur för upp till 8 veckor.
      Obs: Till skillnad från andra celler, dessa celler har kontakt hämning när de kommer till ~ 70% sammanflödet. Det kräver att subkultur bedrivs vid ~ 70%.
    2. Odla cellerna med bröst epitelceller odlingsmedium (MEGM), som innehåller mjölkkörtlar epitelial basala medium (MEBM), tillväxt kosttillskott och kolera toxin i en cell kultur inkubator vid 37 ° C och 95% luftfuktighet 5% CO 2.
      Obs: Köp färdiga att använda tillväxtfaktorer som tillhandahålls i SingleQuot (SQ) och få kolera toxin separat. Slutliga koncentrationer av tillväxt kosttillskott är 0,4% bovint hypofysen extrakt, 0,1% insulin, 0,1% hydrokortison, 0,1% human epidermal tillväxtfaktor, 100 ng/mL kolera toxin, och 0,05% gentamycin sulfat och 0,05% amfotericin B.
    3. Separera celler i 10-cm kultur maträtt genom inkubation med 10 mL trypsin/EDTA för ~ 20 min och sedan neutralisera trypsin genom att tillsätta 10 mL trypsin neutraliserande lösning. Samla alla celler med HEPES buffrad koksaltlösning (HBSS).
    4. Räkna cellerna med en hemocytometer under en inverterade Mikroskop och beräkna koncentrationen av den enda cellsuspensionen, och sedan frö ett visst antal celler som behövs. Snurra runt plattorna ordentligt för att få en jämn fördelning av celler i varje platta. Inkubera cellerna i cell kultur inkubator vid 37 ° C och 95% luftfuktighet 5% CO 2.
      Obs: Köpa en subkultur reagens förpackning innehållande trypsin/EDTA, trypsin neutraliserande lösning och HBSS använda.
  2. Övergående transfection av celler med dygnsrytm vektorn konstruerade.
    1. Frö 2 x 10 5 MCF10A celler jämnt i 35 mm kultur skålen med MEGM och växa till 20-30% sammanflödet (nästa dag).
    2. Värma upp den reducerade serum media (t.ex., Opti-MEM) i 37 ° C vatten bad och transfection reagens i rumstemperatur i 30 min. Späd plasmiden DNA konstruerade (pGL [hPer2P / Luc2P / Neo]) till 30 ng/µL med endo-toxin gratis Tris-EDTA (TE) buffert och hålla rumstemperatur.
    3. Förbered plasmid transfection blandningen i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör genom att lägga till 63,6 µL varm minskade serum media först och sedan lägga till 33,4 µL (0.1 µg) plasmid DNA, och blanda försiktigt genom pipettering, och sedan slutligen lägga 3 µL av transfection reagens direkt in till centrum av röret utan att vidröra väggen. Efter blandning försiktigt genom pipettering, förvara i rumstemperatur i 30 min.
    4. Släpper hela plasmid blandningen (100 µL) direkt på center ytan av mediet i plattan och blanda försiktigt genom att skaka skålen. Odla cellerna i en CO 2 inkubator för ytterligare 48-72 h.
      Obs: Det förutspås att högsta transfection effektivitet skulle vara i 40-70% sammanflödet av dessa celler på grund av deras kontakt hämning på ~ 70%. Därför fungerar transfection bästa start på ~ 20% och stopp vid ~ 70% sammanflödet.

3. Inrättandet av In Vitro Mareld analysen i normalnivå transfekterade MCF10A celler

  1. svälta de odlade cellerna på ~ 70% confluence (efter transfection för 48-72 h) i MEBM utan tillväxtfaktorer för 24 h.
  2. Behandla cellerna med synkronisering agent (t.ex., 50% häst serum (HS)) i MEBM för 1,5 h i en CO 2 inkubator.
    Obs: För att välja en perfekt synkronisering agent, 10 µM forskolin, 1 nM melatonin, 0.1 µM dexametason, 50% HS och 100% SQ jämfördes när det gäller dygnsrytm amplituden och perioden i dygnsrytm vektor transfekterade cellerna. Tom vektor transfekterade celler behandlas med 100% SQ som en negativ kontroll.
  3. Pre-prepare 20 mL lagringsmediet (för 10 av de 30-mm kultur rätterna) genom att tillsätta 5 mL av MEGM, 15 mL MEBM, 150 µL natriumbikarbonat, 200 µL HEPES och 40 µL luciferin stamlösning (50 mM) i ett 50 mL sterilt centrifugrör.
    Obs: De slutliga koncentrationerna av varje komponenter: 20% SQ och 20 ng/mL kolera toxin, 0,06% natriumbikarbonat, 1% penicillin/streptomycin och 10 mM HEPES. Värma upp färdiga inspelningen medium och steriliseras 1 x PBS under 30 minuter i 37 ° C vattenbad. Lägga till 100 µM luciferin omedelbart före användningen.
  4. Tvätta cellerna med varm 1 x Dulbecco ' s Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) för 3 gånger efter inkubering med synkronisering agent, och tillsätt därefter 2 mL inspelningen medium.
  5. Tätning skålen med en steriliserad locket klass med silikonfett förhindra avdunstning och sedan märka det på sida.
  6. Placerar slutna skålen i sätet släpper luminometern och aktivera alternativet för att spara filen i mappen (för detaljer, se avsnitt 6).

4. Urval av stabilt transfekterade celler

  1. optimera en idealisk G418 koncentration (800 µg/mL) med en kill kurva analys enligt tillverkaren ' s instruktion för val av stabilt transfekterade cellerna.
  2. Efter övergående transfection för 48 h eller 72 h, subkultur och utsäde cellerna med MEGM i större rätter på 5 000 celler/maträtt (100 mm). Efter 24 h kultur i cell kultur inkubator (37 ° C, 95% luftfuktighet och 5% CO 2), behandla cellerna med 800 µg/mL G418 genom att ersätta det gamla mediet med nya medium som innehåller 800 µg/mL G418 varje 3-4 dagar för 2 veckor.
  3. Subkultur efterlevande stabilt transfekterade kolonier för 1-3 passager med MEGM innehållande 500µg/mL G418 att upprätthålla ett stabilt uttryck för hPer2P/Luc2P och frysa i flytande kväve för framtida användning.
  4. Behandlar 500µg/mL G418 efter allmänna subkultur åter välja stabilt transfekterade befolkningen av celler, om Mareld intensiteten i resultatet av in vitro- Mareld assay blir progressivt lägre efter användning i många passager.

5. Behandling med kemikalier

  1. på 48 timmar eller 72 h efter transfection, svälta cellerna från tillväxtfaktorer i MEBM för 24 h.
  2. Efter synkronisering med 50% HS för 2 h, behandla celler med 0,25 eller 0,5 mM nitrosomethylurea (NMU), 20 nM EX527 eller 1 µM cambinol för 1 h i MEBM som innehåller 20% SQ.
  3. Efter tvätt med 1 x D-PBS, lägga till inspelningen medium innehållande 12,5 µM MSC ensam eller i kombination med 20 nM EX527 eller 1 µM cambinol, till cellerna. Övervakning Mareld med luminometern.
  4. Behandla den stabilt transfekterade MCF10A / PER2-dLuc celler med NMU på 0,5, 1 eller 2 mM, EX527 vid 40 nM, eller Cambinol på 2,0 µM, för 1 h efter synkronisering med 50% HS, och sedan Inkubera cellerna i inspelningen medium innehållande 12,5 µM av MSC eller olika doser (5, 10 eller 20 µM) av n-acetylcystein (NAC). Placera plåtarna i luminometern, posten och spara Mareld av luminometer för 4-8 dagar som beskrivs i avsnitt 3.6.
    Obs: NMU är en metylerade nitrosourea förening med mutagena, cancerframkallande och teratogena egenskaper. NMU är en direktverkande alkylerare och har en kort halveringstid (T 1/2 = ~ 30 min). Det är stabilt på surt villkorar (pH 4-5), men instabil vid alkaliskt tillstånd (pH 9-10) och vid temperaturer över 20 ° C. Därför kan blekmedel på 10% användas som en effektiv avaktivera agent för rengöring bänk ytor och lab wares potentiellt förorenade av NMU lösningpå. Överblivna stamlösning är plockade upp och säkert bortskaffas genom REHS. Baserat på verkningsmekanismen av kemikalier, kan synkroniserade celler behandlas för kortare tider före odling i lagringsmediet. Cellerna kan också behandlas i lagringsmediet för en längre tid (flera dagar).

6. Datainsamling, analys och Presentation

Obs: cellviabiliteten måste fastställas med standardmetoder (t.ex. MTT assay) efter behandling av celler vid samma koncentrationerna för samma tider anges. Alla behandling koncentrationer används i in vitro- Mareld analysen var lägre än 30% dödliga koncentrationen (LC30). Alla experiment genomfördes i tre exemplar och representativa resultat presenterades.

  1. Efter tätning skålen (steg 3.5), Fyll på rätterna på stolarna i luminometern, som förvaras inuti en inkubator vid 37 ° C utan H 2 O och CO 2, och ansluten till en dator.
  2. Klicka " Spara " och ange namn för mappen och filen där inspelade luminiscens signalen från motsvarande skålen kommer att sparas.
    Obs: Systemet upptäcker luminiscens signal i realtid från cellerna i skålen på enskilda positioner. Signalerna överförs till datorn via 4-fotonräknande Fotomultiplikatorrör, och sparas och visas i datorn av data collection programvaran.
  3. Analysera signaler efter inspelningen för 4-7 dagar, vilket skulle kunna följas av medelstora förändring och kontinuerlig inspelning för en andra veckan om nödvändigt.
    Obs: För att erhålla dygnsrytm parametrar, inklusive fas, periodens längd, rytm amplitud och dämpning takt, vi använt luminometer analys programvara för att analysera Mareld data.
  4. Detrend rådata med ett genomsnittsvärde, och analysera den bästa-passar till en sinus våg att få tid, fas, amplitud och dämpning kurs 21 , 22.
  5. På grund av den höga övergående Marelden vid behandling och medelstora förändring, utesluta den första cykeln av data från analys.
  6. För datapresentation, rita rådata (Mareld, greve/s) mot tiden (h eller dag). Vid behov, baseline-subtraheras data kan ritas att jämföra amplitud och fas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Dygnsrytm Mareld reporter vektor: mänskliga PER2 arrangören-driven uttryck av destabiliserat luciferas variant

DNA-sekvensen som består av ett 941 bp fragment härrör från mänskliga PER2 arrangören används för att konstruera den dygnsrytm reporter vektorn, pGL [hPer2P/Luc2P/Neo, var först analyseras för förekomst av reglerande element känt att reglera dygnsrytm genuttryck. Bioinformatik analys visade att inom detta arrangören fragment, det finns tre olika Bmal1 bindningsställen (E-box) (katt/CGTG), två dygnsrytm transkription förbättra platser (CCAATG), två GC lådor och en transkription startwebbplats (figur 1). Därav förutsåg denna reporter vektor för att återspegla dygnsrytm genuttryck.

Optimering av synkronisering agent

Flera ombud har använts för att synkronisera eller påverka autonoma dygnsrytmen av fibroblast celler för in vitro- Mareld studier. För att välja en effektiv och kostnadseffektiv cell-typ specifika synkronisering agent i mjölkkörtlar epitelceller, Vi jämförde 10 µM forskolin, 1 nM melatonin, 0.1 µM dexametason, 50% HS och 100% SQ i mjölkkörtlar epitelceller (MCF10A) övergående transfekterade med dygnsrytm reporter vektorn. Celler synkroniseras med 50% HS visade bästa dygnsrytmen, med 3 toppar på dygnsrytm inducerad luminiscens, jämfört med bara en eller två toppar i celler synkroniseras med andra medel. Dessutom, Mareld profiler av celler som synkroniseras med 50% HS produceras godtagbar period, amplitud och bäst anpassade värde under dataanalys (figur 2). Baserat på dessa fynd, valt vi denna kostnadseffektiva metoden som cellen synkronisering agenten för alla efterföljande experiment.

Störningar och restaurering av cellulära dygnsrytmen av kemisk exponering

I in vitro- modellen, obehandlad, övergående transfekterade celler (kontrollgrupp) visade minst två kompletta cykler av luminiscens signalering efter synkroniseringen (figur 3A). Celler som utsätts för det direktverkande mutagent, NMU, visade en dosberoende störning av dygnsrytm genuttryck vilket återspeglas av förlusten av luminiscens toppar. Medan behandling med 0,25 mM NMU inte störa cellulära dygnsrytmen, en dos på 0,5 mM NMU försenad initialt och senare avskaffades dygnsrytmen, indikerat av försvinnandet av den andra toppen av luminiscens på ~ 72 h efter behandling. Hämning av SIRT1 aktivitet med 20 nM Ex257 eller 1 µM cambinol störs likaså dygnsrytmen av dämpande efterföljande dygnsrytm cykeln (figur 3A-1). Ännu viktigare, tillägg av MSC (12,5 µM) till odlingsmediet återställd mot normala första och andra cykler av dygnsrytm genuttryck i NMU-behandlade celler. MSC inte bara återställas rytmen störs av NMU, men också hindrat de störande effekterna av SIRT1 hämmare, Ex257 och cambinol (figur 3A-2).

I stabilt transfekterade celler störd både NMU och SIRT1 hämmare dygnsrytm, om än i högre koncentrationer än vad som observerades i övergående transfectants (figur 3B-1). MSC (12,5 µM) återställs dygnsrytmen i de celler som förbehandlats med 1 mM NMU (figur 3B-2). Viktigare, MSC återuppbyggde dygnsrytmen i celler behandlas med SIRT1-hämmare, inklusive EX257 (40 nM) (figur 3B-3) och cambinol (2 µM) (figur 3B(4)), respektive.

I jämförelse mellan figur 3A och figur 3B, Mareld intensiteten var mycket högre men rytmen inröstades för en kortare tid i normalnivå transfekterade celler vs stabilt transfekterade celler (~ 10 gånger högre, kortare 2 gånger) i Allmänt, även efter behandling av celler med NMU eller MSC. Cellulära dygnsrytmen var dessutom 2-faldigt mer känsliga för exponering för kemikalier i normalnivå transfekterade celler jämfört med stabilt transfekterade cellerna.

Kvantitativ dosberoende förändring av cellulära dygnsrytmen av kemikalier

Likaså störd cellulära dygnsrytmen stabilt transfekterade celler behandlas med 1 mM NMU återställdes genom behandling av NAC på ett dosberoende sätt (0-20 µM) (figur 4A) som observerats i förändringar av dygnsrytm period (figur 4B ) och fas (figur 4 c).

Figure 1
Figur 1: Sekvens av mänskliga PER2 arrangören fragment och dygnsrytm reporter vektorn. (A) mänskliga PER2 arrangören fragment (941 bp) sekvenserades, och sekvensen analyserades för element i funktionella dygnsrytm arrangören. E-box, CACGTT / CATGTG; dygnsrytm transkription förbättra webbplatsen, CCAATG; GC box, CGCCCC / GGGGCGGG; transkription startar plats (TSS): CAGCGG. (B) Schematisk bild av destabiliserat luciferas reporter vektor, pGL [hPer2P/Luc2P/Neo]. Transkriptionen av destabiliserat luciferas (dLuc) är under direkt kontroll av promotorn hPER2 . En samtidig uttryckt neomycin motstånd gen (Neo) underlättar val av infekterade celler av G418. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: synkronisering av in vitro- cellulära dygnsrytmen av olika synkronisering agenter. Efter 24 h svält behandlades MCF10A celler normalnivå transfekterade av dygnsrytm reporter vektor med varje synkronisering agent för 2 h, följt av inspelning luminiscens signal. Blå, 10 µM forskolin; röd, 1 nM melatonin; Green, 0.1 µM dexametason; lila; 50% häst serum (HS). kricka, 100% SingleQuot (SQ); gul, tom vektor (negativ kontroll). X-axeln, tid (dag); Y-Mareld (greve/min). Klicka här för att se en större version av denna siffra.


Figur 3: MSC återställd cellulära dygnsrytmen störs av NMU och SIRT1 hämmare i mjölkkörtlar epitelceller in vitro-. Mareld analyser utfördes på MCF10A /PER2-dLuc reporter cellerna efter synkronisering med 50% HS. X-axeln, tid (h) (post-NMU behandlingstid); Y-Mareld (greve/min). (A) resultat från övergående transfekterade celler. (1) celler behandlades med 0, 0,25 eller 0,5 mM NMU, 20 nM EX527 eller 1 µM cambinol för 1 h efter synkronisering. Gul: kontroll; röd: 0,25 mM NMU; grön: 0,5 mM NMU; blå: 20 nM EX527; Gulgrön: 1µM cambinol. (2) celler behandlades med 12,5 µM MSC ensam eller i kombination med 20 nM EX527 eller 1 µM cambinol i inspelningen medium efter exponering för 0,5 mM NMU. Gul: Kontroll; röd: 0,25 mM NMU; grön: 0,5 mM NMU; blå: 0,5 mM NMU + 12,5 µM MSC; Gulgrön: 0,5 mM NMU + 12,5 µM MSC + 20 nM EX527; Lila: 0,5 mM NMU + 12,5 µM MSC + 1 µM cambinol. (B) resultat från stabilt transfekterade celler. 3rd- 5th toppar som visade rena och klara skillnader mellan grupper presenteras som ett representativt resultat. (1) celler behandlades med 0, 0.5, 1.0 eller 2.0 mM NMU, 40 nM EX527 eller 2 µM cambinol för 1 h efter synkroniseringen. Gul: Kontroll; röd: 0,5 mM NMU; grön: 1,0 mM NMU; blå: 2,0 mM NMU; Gulgrön: 40 nM EX527; Lila: 2 µM cambinol. (2) celler behandlades med 12,5 µM MSC i inspelningen medium efter exponering för 1,0 mM NMU. Gul: Kontroll; röd: 1,0 mM NMU; grön: 1,0 mM NMU + 12,5 µM MSC. (3) celler behandlades med 12,5 µM MSC följande exponering till 40 nM EX257. Gul: Kontroll; röd: 40 nM EX257; grön: 40 nM EX257 + 12,5 µM MSC. (4) celler behandlades med 12,5 µM MSC följande exponering för 2 µM cambinol. Gul: Kontroll; röd: 2 µM cambinol; grön: 2 µM cambinol + 25 µM MSC. Detta resultat redovisades tidigare och är licensierat under CC BY 2.022. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: NAC dosberoende ligandinducerad återställd cellulära dygnsrytmen störs av NMU. Celler behandlades med 1,0 mM NMU eller fordonskontroll för 1 h efter synkroniseringen. (A) representativa resultat av Mareld (greve/min) mot tiden (h). Gul: Kontroll; röd: 1,0 mM NMU; grön: 1,0 mM NMU, 5 µM NAC; blå: 1,0 mM NMU, 10 µM NAC; Gulgrön: 1,0 mM NMU, 20 µM NAC. (B) Period (timmar). (C) fas (timmar). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

I däggdjursceller regleras periodicitet av dygnsrytm klockan av sammankopplade transkriptionell/translationell återkopplingar. Heterodimerer av Bmal1 och klocka eller Npas2 reglera dygnsrytm transkription genom bindning till E-box element i initiativtagarna till core CGs, inklusive Per2 och gråtaoch talrika CCGs4. När de samlas i cellen, heterodimerer av Per: Cry ändras post-translationally och transporteras till kärnan att förtränga klocka: Bmal1 transkriptionell aktivitet. Detta negativ återkoppling gör core CGs reglera sin egen transkription och ställa in rytmiska uttrycket av CGs och CCGs23. Även om de flesta däggdjursceller har en inneboende dygnsrytm klocka, klockor i enskilda celler kan synkroniseras av båda inneboende villkor (t.ex., redox potential) och externa stimuli från omgivningen24. Dygnsrytm gen uttryck i vivo kan synkroniseras av melatonin, ett hormon som produceras av tallkottkörteln i svar på signaler från centrala pacemakern (SCN). SCN integrerar signalerna från ljus inkräkta på specialiserade melanospin-uttryckande ljuskänsliga näthinnan ganglionceller i näthinnan. Melatonin frigörs från tallkottkörteln träder cirkulationen och reglerar dygnsrytmen av SCN och mest perifera celler in vitro- och in-vivo25,26. Dygnsrytmen kan också regleras genom stress hormoner (t.ex., kortisol och katekolaminer)27,28 och tillväxtfaktorer29,30. Avreglering av tillväxtfaktorer är kända för att vara associerade med dygnsrytm störningar av cell tillväxt och differentiering31.

Dygnsrytm reporter vektorn vi konstruerat utnyttjar denna negativa biokemisk feedbackmekanism. Den core dygnsrytm negativ återkoppling består av transkriptionell aktivatorer, BMAL1 och klocka, som binder till dygnsrytm E/E´-box bindande motiven i PER2 promotorn och kvinnoförtryckarna PERs och CRYs, som negativt reglerar BMAL1 uttryck. I det nuvarande reporter underlättar rytmiska aktivering av PER2 arrangören av BMAL1 och klocka dygnsrytm uttryck för destabiliserat luciferas, vilket möjliggör en mer exakt dygnsrytm periodicitet av luminiscens signaler. Byggandet av en reporter plasmid innehåller webbplatsen BMAL1 bindande, dygnsrytmen förbättra webbplatsen, GC box och transkription start platsen för hPER2 arrangören. Vektorn möjliggör realtid avläsning för cellulära autonoma dygnsrytmen i transfekterade celler och kan användas för att identifiera villkor eller särskilda ombud att ändrar denna endogena dygnsrytm mönster av genuttryck. Men när celler odlade i vitro eller ex vivo, deras dygnsrytm oscillatorer snabbt blivit desynchronized. Det är därför nödvändigt att synkronisera deras rytmer innan någon dygnsrytm analyser kan vara utförda i vitro. I mjölkkörtlar epitelceller, fann vi att 50% HS, melatonin och 100% SQ kunde varje inducera effektiv synkronisering av dygnsrytmen in vitro. Dexametason och forskolin produceras endast delvis synkronisering. Dosberoende tester skulle vara nödvändigt för utveckling och val av nya synkronisera agenter i framtida studier. Gett låg kostnad, effektivitet och dess omfattande användning som synkronisering agenten, 50% HS befanns vara en effektiv synkronisering agent som producerat stabila och reproducerbara cellulära dygnsrytmen i mjölkkörtlar epitelceller och neurala celler, som tidigare rapporterats i många andra celltyper och olika experimentella inställningar24.

För att validera en in vitro- modell av dygnsrytm förordning, frågade vi nästa om dygnsrytmen svar på miljöfaktorer i vitro skulle sammanfatta effekterna vi observerade i vivo. Tidigare har vi visat att en cancerframkallande engångsdos av NMU störd dygnsrytm uttrycket av stora CGs (t.ex., Per2) och flera CCGs i målet bröstkörteln. Dessutom återställa en chemopreventive regim med MSC dygnsrytm uttrycket av både Per2 och CCGs gener mot normalt. Vi har vidare visat att exponering av celler för gifter och stressfaktorer kan förändra dygnsrytm genuttryck genom sina effekter på NAD+-beroende SIRT1 aktivitet7,8,22. De resultat som erhålls med in vitro- dygnsrytm reporter-analys visade att exponering för NMU orsakat störningar av cellulära dygnsrytm genuttryck och att mer intressant, MSC inte är bara kunna återställa cellulära dygnsrytmen störs av NMU, men också återställa dygnsrytmen störs av de SIRT1-hämmare. Dessa resultat visade att in vitro analysen inte bara reproducerar NMU effekter på dygnsrytm genuttryck, men också återger effekterna av MSC på störd dygnsrytm rytm i vivo via SIRT1-beroende mekanismer. In vitro- dygnsrytm reporter systemet har därmed potential att upptäcka en mängd gifter och stressfaktorer som förändrar NAD+/NADH nivåer i cellen, inklusive direkta hämmare och modulatorer av cellulära redox cykling samt genotoxisk agenter som kan bryter NAD+ via Poly ADP-ribos beroende DNA reparation32. Dessa resultat tyder på att in vitro reporter systemet ger en nyttig redskap till skärmen för cellen villkor och kemiska agenser som kan störa eller återställa dygnsrytm gen förordning i vivo.

Även om in vitro- analysen kan inrättas med celler övergående eller stabilt transfekterade med den reporter bygga, noterades vissa skillnader i svaret på behandling av kemikalier mellan övergående och stabilt transfekterade celler. Stabilt transfekterade cellerna var mer resistenta mot behandling av kemikalier, särskilt NMU och SIRT1 hämmare, än övergående transfekterade celler. Dessa skillnader kunde återspegla subtila skillnader i reglering av promotorn vektor i stabil transfectants på grund av påverkan från de sekvenser som omger specifika integration platser. Urval av stabila transfectants av antibiotikabehandling kan därför också välja kloner som är mer motståndskraftiga mot dygnsrytm störningar. Således måste enskilda i vitro cellmodeller med övergående eller stabil transfectants valideras för deras förmåga att sammanfatta i vivo svaren. Olika transfection metoder framkalla också varierande nivåer av genotoxiska stress och toxicitet på celler och resultatet i deras olika känslighet för toxiska effekter av kemikalier. Därför krävs cytotoxicitet test och pilot experiment för val av produktionsförhållanden transfection och behandling. Trots skillnaden i deras känslighet var de övergripande resultaten med vår mjölkkörtlar epitelial dygnsrytm reporter cellerna för störningar och restaurering av cellulära dygnsrytmen av kemikalier konsekventa och jämförbara mellan övergående transfekterade och stabilt transfekterade celler och resultaten redovisas effekterna som vi sågs in vivo.

För att avgöra om dygnsrytm reporter vektorn kan användas i andra celltyper, var mänskliga glioblastoma/astrocytom celler (U-87 MG) stabilt transfekterade med denna dygnsrytm vektor. De preliminära resultaten med cellulära Mareld in vitro- analys visade att dessa neurala-derived tumörceller efter synkroniseringen har en regelbunden och stark cellulär dygnsrytmen jämförbara som observerats i mänskliga bröst epitelceller. Celler behandlas med IC261, en välkänd hämmare av kasein kinase 1 δ (CK1δ) och CK1 ε, visade dygnsrytm återkoppla men lägre amplitud som rapporterade by andra (inga data anges)33. Dessa resultat indikerar att dygnsrytm luciferas reporter vektor- och in vitro- cellulära Mareld analysen är tillämpliga i andra organ speciella celler, inklusive neurala celler.

Cellulära reporter systemet utvecklas här kunde därför användas i stort sett som ett in vitro- test för bestämning av dygnsrytm genuttryck i olika celltyper i allmänhet. Det experimentella förfarandet är enkel, snabb och säker. Dock denna cellulära reporter systemet lätt kan inte anpassas i celler som är svåra att transfect, icke-dela celler (t.ex., neuronala celler), eftersom de har notoriskt låg transfection effektivitetsvinster. Virus-baserat transfection metoder (t.ex., lentivirus transfection) kan erbjuda en högre effektivitet-lösning för dessa celler34. Tid och svårigheter som hör samman med lentiviral tillverkning gör dock denna metod svårt och tidskrävande. Dessutom krävs en lämplig säkerhetsnivå lab för produktion och användning av viruset. Hög upplösning enskild cell luminiscens detektorer kan dessutom användas för bestämning av långlivade, självständigt faser rytmer av dygnsrytm genuttryck i icke-dela celler35.

Studier av däggdjur dygnsrytmen i vivo är inte bara arbetskrävande, och kostsamt, men de kräver också användning av stora mängder djur. Tillgängligheten av in vitro- system kan avsevärt minska antalet djur som krävs för att testa associationer mellan störningar av dygnsrytm genuttryck och utveckling av kroniska sjukdomar, inklusive carcinogenes och metaboliska syndrom. Kvantitativa uppgifter om dygnsrytm parametrar, inklusive perioden, amplitud och fas, kan informera dos- eller tidsberoende effekter av kemikalier på cellulära dygnsrytmen. Till exempel observerat vi att antioxidanten NAC kan dosberoende ligandinducerad återställa period och fasen av cellulära dygnsrytmen störs av NMU. In vitro- modellen kan också användas till skärmen och klassificera miljömässiga dygnsrytm ämnen och att undersöka effekterna av störd dygnsrytm på nedskrivning av cellulär funktion, som ger mekanistiska insikter för utveckling av åtgärdsstrategier för kohorter ökad risk för bröstcancer, metabolt syndrom och neurofysiologiska störningar, på grund av avvikande arbetsscheman.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete fick stöd av den 2012 samhället av toxikologi (SOT)-Colgate Palmolive Grant för Alterative forskning (M. Fang) och internationellt samarbete forskningen finansiera från djur- och växt karantän byrå, Sydkorea (M. Fang), och NIEHS bevilja P30ES005022 (H. Zarbl). Vi vill tacka Dr Zheng Chen (McGovern Medical School vid universitetet i Texas Health Science Center på Houston) för hans bra diskussion, Mr Shao-An Juan för hans experimentella hjälp och Ms. Kimi Nakata för hennes korrekturläsning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pLS[hPER2P/rLuc/Puro] vector SwitchGear Genomics S700000 customized vector
pGL4.18[Luc2P/Neo] vector Promega 9PIE673 destabilized luciferase expression vector
T4 DNA ligase Invitrogen 15224041 For subcloning
TOPO TA cloning kit Invitrogen K4500-02 with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli
Sac I New England BioLabs R0156S Restriction enzyme
Hind III-HF New England BioLabs R3104S Restriction enzyme
CutSmart buffer New England BioLabs B7204S Restriction enzyme buffer
DNA gel extraction kit Qiagen 28704 Purify DNA fragments from agarose gel
PCR Purification Kit Qiagen 28104 DNA clean up
LB Miller's modification TEKNOVA L8600 For transformed E. Coli culture
LB Agar Plate TEKNOVA L1902 For white/blue selection
QIAprep spin miniprep Kit Qiagen 27104 For extraction of plasmide DNA
EndoFree plasmid maxi prep Kit Qiagen 12362 For extraction of plasmide DNA
FuGene HD Promega E2311 Transfection reagent
Opti-MEM reduced serum medium Invitrogen 31985-062 For transfection
MCF10A cell line American Type Culture Collection CRL-10317 Mammary Epithelial Cells
MEGM BulletKit Lonza CC-3150 Mammary Epithelial Growth Medium
MEBM Lonza CC-3151 Mammary Epithelial Basal Medium
MEGM SingleQuot Kit Lonza CC-4136 Suppliments & Growth Factors
ReagentPack Lonza CC-5034 Reagent for subculture
D-PBS (10X) Sigma D1408 Wash cells in culture dishes
UltraPure Distilled Water Invitrogen 10977 Dilute 10X D-PBS
Tissue culture dish (35 mm) BD/Falcon 353001 cell culture dish suitable to LumiCycle
Silicon grease Fisher NC9044707 For sealing dish with recording medium
Round cover glass Harvard Bioscience 64-1500 (CS-40R) For sealing dish with recording medium
Cholera toxin Sigma C8052 Supplement for growth medium
G418 sulfate (Geniticin) Invitrogen 10131035 Antibiotic for selection of stabliy transfected cells
Ampicillin Sigma A9393 For colony selection
Forskolin Sigma F6886 Synchronization agent
Melatonin Sigma M5250 Synchronization agent
Dexamethasone Sigma D4902 Synchronization agent
Horse serum Sigma H1138 Synchronization agent
d-Luciferin, sodium salt Invitrogen L2912 Luciferase substrate
IC261 Sigma 10658 Positive control for circadian disruptor
Methylnitrosourea (NMU) Sigma N1517 Mammary specific carcinogen
Methylselenocysteine (MSC) Sigma M6680 Organic selenium (chemopreventive agent)
EX527 Sigma E7034 SIRT1 specific inhibitor
Cambinol Sigma C0494 SIRT1 & SIRT2 inhibitor
NanoDrop Spectrophotometer Thermo Scientific NanoDrop 8000 Quantify nucleotide
GeneAmp PCR System 9700 Applied Biosystems N805-0200 For molecular biology experiment
CO2 Incubator NAPCO Series 8000 DH For cell culture at 5% CO2 at 37 °C
Desktop centrifuge with refrezerator Eppendorf 5430R For molecular biology experiment
Centrifuge with swing bucket Eppendorf 5810 R For cell culture
Inverted microscope Nikon 80124 Phase contrast optional
Tissue culture hood Labconco Class II A2 BSL-2 certified
LumiCycle 32 Actimetrics Not Available Luminoscence detector

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Akerstedt, T., et al. Night work and breast cancer in women: a Swedish cohort study. BMJ Open. 5, (4), e008127 (2015).
  2. Parent, M. E., El-Zein, M., Rousseau, M. C., Pintos, J., Siemiatycki, J. Night work and the risk of cancer among men. Am J Epidemiol. 176, (9), 751-759 (2012).
  3. Knutsson, A., et al. Breast cancer among shift workers: results of the WOLF longitudinal cohort study. Scand J Work Environ Health. 39, (2), 170-177 (2013).
  4. Fu, L., Lee, C. C. The circadian clock: pacemaker and tumour suppressor. Nat Rev Cancer. 3, (5), 350-361 (2003).
  5. Fu, L., Kettner, N. M. The circadian clock in cancer development and therapy. Prog Mol Biol Transl Sci. 119, 221-282 (2013).
  6. IARC. Painting, Firefighting, and Shiftwork. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. 98, 563-764 (2010).
  7. Zhang, X., Zarbl, H. Chemopreventive doses of methylselenocysteine alter circadian rhythm in rat mammary tissue. Cancer Prev Res (Phila Pa). 1, (2), 119-127 (2008).
  8. Fang, M. Z., Zhang, X., Zarbl, H. Methylselenocysteine resets the rhythmic expression of circadian and growth-regulatory genes disrupted by nitrosomethylurea in vivo. Cancer Prev Res (Phila). 3, (5), 640-652 (2010).
  9. Burbulla, L. F., Kruger, R. Converging environmental and genetic pathways in the pathogenesis of Parkinson's disease. J Neurol Sci. 306, (1-2), 1-8 (2011).
  10. Aitlhadj, L., Avila, D. S., Benedetto, A., Aschner, M., Sturzenbaum, S. R. Environmental exposure, obesity, and Parkinson's disease: lessons from fat and old worms. Environ Health Perspect. 119, (1), 20-28 (2011).
  11. Nagoshi, E., Brown, S. A., Dibner, C., Kornmann, B., Schibler, U. Circadian gene expression in cultured cells. Methods Enzymol. 393, 543-557 (2005).
  12. Ramanathan, C., et al. Cell type-specific functions of period genes revealed by novel adipocyte and hepatocyte circadian clock models. PLoS Genet. 10, (4), e1004244 (2014).
  13. Sporl, F., et al. A circadian clock in HaCaT keratinocytes. J Invest Dermatol. 131, (2), 338-348 (2011).
  14. Zhang, E. E., et al. A genome-wide RNAi screen for modifiers of the circadian clock in human cells. Cell. 139, (1), 199-210 (2009).
  15. Yoo, S. H., et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, (15), 5339-5346 (2004).
  16. Leclerc, G. M., Boockfor, F. R., Faught, W. J., Frawley, L. S. Development of a destabilized firefly luciferase enzyme for measurement of gene expression. Biotechniques. 29, (3), (2000).
  17. Genomics, S. Technical Note: SwitchGear methods for gene model construction and transcription start site prediction. (2009).
  18. Scientific, F. Safety Data Sheet: Ethidium bromide, 1% Solution/Molecular Biology. (2010).
  19. Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. Current Protocols in Molecular Biology. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience. New York. (1994).
  20. Yoo, S. H., et al. A noncanonical E-box enhancer drives mouse Period2 circadian oscillations in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, (7), 2608-2613 (2005).
  21. Chen, Z., et al. Identification of diverse modulators of central and peripheral circadian clocks by high-throughput chemical screening. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (1), 101-106 (2012).
  22. Fang, M., Guo, W. R., Park, Y., Kang, H. G., Zarbl, H. Enhancement of NAD+-dependent SIRT1 deacetylase activity by methylselenocysteine resets the circadian clock in carcinogen-treated mammary epithelial cells. Oncotarget. (2015).
  23. Chen-Goodspeed, M., Lee, C. C. Tumor suppression and circadian function. J Biol Rhythms. 22, (4), 291-298 (2007).
  24. Balsalobre, A. Clock genes in mammalian peripheral tissues. Cell Tissue Res. 309, (1), 193-199 (2002).
  25. Jung-Hynes, B., Huang, W., Reiter, R. J., Ahmad, N. Melatonin resynchronizes dysregulated circadian rhythm circuitry in human prostate cancer cells. J Pineal Res. 49, (1), 60-68 (2010).
  26. von Gall, C., et al. Melatonin plays a crucial role in the regulation of rhythmic clock gene expression in the mouse pars tuberalis. Ann N Y Acad Sci. 1040, 508-511 (2005).
  27. Vujovic, N., Davidson, A. J., Menaker, M. Sympathetic input modulates, but does not determine, phase of peripheral circadian oscillators. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 295, (1), R355-R360 (2008).
  28. Schofl, C., Becker, C., Prank, K., von zur Muhlen, A., Brabant, G. Twenty-four-hour rhythms of plasma catecholamines and their relation to cardiovascular parameters in healthy young men. Eur J Endocrinol. 137, (6), 675-683 (1997).
  29. Yu, H., et al. Circadian rhythm of circulating fibroblast growth factor 21 is related to diurnal changes in fatty acids in humans. Clin Chem. 57, (5), 691-700 (2011).
  30. Nakagawa, H., et al. Modulation of circadian rhythm of DNA synthesis in tumor cells by inhibiting platelet-derived growth factor signaling. J Pharmacol Sci. 107, (4), 401-407 (2008).
  31. Yang, X., Guo, M., Wan, Y. J. Deregulation of growth factor, circadian clock, and cell cycle signaling in regenerating hepatocyte RXRalpha-deficient mouse livers. Am J Pathol. 176, (2), 733-743 (2010).
  32. Virag, L. Structure and function of poly(ADP-ribose) polymerase-1: role in oxidative stress-related pathologies. Curr Vasc Pharmacol. 3, (3), 209-214 (2005).
  33. Kon, N., Sugiyama, Y., Yoshitane, H., Kameshita, I., Fukada, Y. Cell-based inhibitor screening identifies multiple protein kinases important for circadian clock oscillations. Commun Integr Biol. 8, (4), e982405 (2015).
  34. Ramanathan, C., Khan, S. K., Kathale, N. D., Xu, H., Liu, A. C. Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters. J Vis Exp. (67), e4234 (2012).
  35. Welsh, D. K., Yoo, S. H., Liu, A. C., Takahashi, J. S., Kay, S. A. Bioluminescence imaging of individual fibroblasts reveals persistent, independently phased circadian rhythms of clock gene expression. Curr Biol. 14, (24), 2289-2295 (2004).
<em>In Vitro</em> Mareld Assay att karakterisera dygnsrytmen i mjölkkörtlar epitelceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fang, M., Kang, H. G., Park, Y., Estrella, B., Zarbl, H. In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (127), e55832, doi:10.3791/55832 (2017).More

Fang, M., Kang, H. G., Park, Y., Estrella, B., Zarbl, H. In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (127), e55832, doi:10.3791/55832 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter