In Vitro Mareld Assay att karakterisera dygnsrytmen i mjölkkörtlar epitelceller
Summary
En in vitro- Mareld analys att bestämma cellulära dygnsrytmen i mjölkkörtlar epitelceller presenteras. Denna metod använder tredjeparts däggdjursceller reporter plasmider uttrycker destabiliserat luciferas under kontroll av PERIOD 2 gen arrangören. Det kan anpassas till andra celltyper att utvärdera organ-specifika effekter på dygnsrytmen.
Abstract
Dygnsrytmen är en grundläggande fysiologiska process i alla organismer som reglerar biologiska processer alltifrån genuttryck sova beteende. Hos ryggradsdjur styrs dygnsrytmen av en molekylär oscillator som fungerar i både suprachiasmatiska kärnan (SCN; centrala pacemaker) och enskilda celler bestående av mest perifera vävnader. Viktigare, är störningar av dygnsrytmen av exponering för ljus-at-night, miljöfaktorer eller gifter associerade med ökad risk för kroniska sjukdomar och åldrande. Förmåga att identifiera ämnen som kan störa central eller perifer biologiska klockor och agenter som kan förhindra eller mildra effekterna av dygnsrytm störningar, har betydande konsekvenser för förebyggande av kroniska sjukdomar. Även om gnagare modeller kan användas för att identifiera exponeringar och agenter som inducerar eller förhindra/minska dygnsrytm störningar, kräver dessa experiment stort antal djur. In vivo studier också kräver betydande resurser och infrastruktur, och kräver forskare att arbeta hela natten. Således finns det ett brådskande behov av en celltyp lämpliga in vitro- system till skärmen för miljömässiga dygnsrytm ämnen och smakförstärkare i celltyper från olika organ och stater sjukdom. Vi konstruerade en vektor som driver transkription av den destabiliserat luciferas i eukaryota celler under kontroll av mänskliga PERIOD 2 gen arrangören. Denna dygnsrytm reporter konstruktion var stabilt transfekterade till mänsklig coitus epitelceller och dygnsrytm lyhörd reporter cellerna valdes att utveckla in vitro- Mareld analysen. Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för att skapa och validera analysen. Vi ger ytterligare Detaljer för bevis på koncept-experiment som visar våra i vitro assay förmåga att sammanfatta i vivo effekterna av olika kemikalier på den cellulära biologiska klockan. Resultaten indikerar att analysen kan anpassas till en mängd celltyper till skärmen för både miljömässiga ämnen och chemopreventive förstärkare av dygnsrytm klockor.
Introduction
Den dygnsrytm klockan styr ett brett spektrum av biologiska processer från dagaktiva uttryck av gener att sova beteende i en förutsägbar rytm med en periodicitet av cirka 24 h. Epidemiological studier föreslår att kroniska störningar i dygnsrytm rytmen ökar risken för bröst- och prostatacancer hos skiftarbetare, inklusive sjuksköterskor och flight besättningar1,2,3. Dessa fynd är styrks av gnagare studier, som visar att exponering för konstant ljus, ljus-at-night eller ljus cykler som efterliknar jetlag ökning tumör incidens och accelererar tumör tillväxt4,5. Baserat på data från både människa och gnagare studier, klassificeras International Agency for Research on Cancer skiftarbete som sannolikt cancerframkallande (typ 2A) i 20106.
Tidigare har vi visat att en cancerframkallande engångsdos av de mammary tumör specifika cancerframkallande, N– nitroso-N– methylurea (NMU), störd dygnsrytm uttrycket av stora dygnsrytm gener (CGs) (t.ex., det Period 2 , Per2) och flera dygnsrytm-kontrollerade gener (CCGs), inklusive viktiga DNA-skador som är lyhörd och reparera (DDRR) gener i målet mjölkkörtlar (men inte i levern). Dessutom återställa dygnsrytm uttrycket av både Per2 och DDRR gener mot normalt genom en chemopreventive regim med kosten L-metyl-selenocystein (MSC) incidensen av tumör med 63%. Dessa fynd var först som visar en mekanistisk koppling mellan dygnsrytmen, kemisk carcinogenes och chemoprevention7,8. Exponeringar för andra miljögifter som visat att störa dygnsrytm gen uttryck i vivo är också associerade med ökad risk för miljörelaterade sjukdomar9,10. Förstå de mekanismer som länkar dygnsrytm störningar av miljögifter och patogenes kan leda till slentrianmässigt-baserade strategier för förebyggande av sjukdomar. Dock studier som syftar till att definiera interaktioner mellan exponeringarna och dygnsrytmen utförs vanligtvis invivo. En typisk i vivo experiment undersöker påverkan på dygnsrytmen kräver stora mängder djur, som vävnader från minst tre styra och tre utsatta djur måste samlas in varje 3-4 h under 24 eller 48 h. Utveckling av validerade in vitro- system som recapitulates i vivo observationer och mekanismer skulle därför inte bara minska antalen djur som krävs, men också dramatiskt minska experimentella kostnader och krav som forskare arbetar kontinuerligt under 24-48 h. Dessutom skulle ett validerat in vitro- system kunna användas för high throughput screening av föreningar eller genetisk förändring som påverkar dygnsrytmen eller dess svar på miljöfaktorer eller gifter. Därför behövs strategiska kombinationen av in vitro- och in-vivo modeller och experiment för att få olika insikter med olika fokus.
Hos däggdjur finns dygnsrytm oscillatorer inte bara i specialiserade nervceller av SCN, men också i mest perifera celltyper. Dessa molekylära klockor är liknande de i etablerade fibroblast cellinjer och primära fibroblaster från embryon eller vuxna djur. dock finns det ett behov för vävnad typspecifika cellular-modeller11. Följaktligen, traditionella studier av rörelseaktivitet i vivo, SCN explants ex vivooch cellbaserade in vitro- analyser i förevigade fibroblast celler används allmänt att studera cell-autonoma dygnsrytm defekter. Dock finns det inga belägg för att ett in vitro- fibroblast cellbaserade test kan sammanfatta dygnsrytm mekanismer och svaren finns i cellerna i andra perifera organ i vivo. Olika celltyper kan ha distinkta mönster av genuttryck, xenobiotiska metabolism och DDRR, och kopplingarna mellan toxicitet och dygnsrytm genuttryck kan vara celltyp specifika eller modulerad av olika fysiologiska parametrar. Dessutom har dygnsrytm oscillatorer i fibroblast-datorer inte helt utvärderats för Svaren till miljögifter, stressfaktorer och förebyggande medel som länk exponeringar mot mekanismer av sjukdomsutvecklingen och förebyggande. Således finns det ett behov för lättköpt, validerade cell-typ specifika, in vitro- Mareld analyser att studera orgel specifika miljömässiga dygnsrytm ämnen. Även om en mängd olika cellulära klocka modeller (t.ex., i levern, keratinocyter, fettceller, samt ett osteosarkom cellinje) har utvecklats i senare år12,13,14, 15, analysen beskrivs här är den första cellulära klocka modellen i bröst epitelceller, och den första demonstrationen att sammanfatta i vivo Svaren till miljöfaktorer, gifter, droger och chemopreventive agenter.
Renilla luciferas (rLuc) och firefly luciferas är 30-61 kDa monomer proteiner som inte kräver posttranslationell bearbetning för enzymatisk aktivitet och kan fungera som en genetiska reporter omedelbart vid översättning. När substratet associates med enzymet luciferas, genererar biokemisk reaktion katalyseras en blixt av ljus. Således, luciferas konstruktioner används allmänt som en gen uttryck reporter systemet in vitro- och in vivo. Dock i dygnsrytmen studier, nyttan av luciferas reportern begränsas av den relativt långa halveringstiden av proteinet luciferas (T1/2 = 3.68 h) i förhållande till perioden (speciellt till den korta perioden) för förändringar i dygnsrytm gen uttryck; dock använt ett flertal studier under åren framgångsrikt har luciferas genen i pGL3 vektorn, vilket indikerar att den snabbt nedbrytbara luciferas inte får nödvändig för rapportering dygnsrytm, särskilt för rytmer med en längre period, såsom 24 h. Därför utvecklats en reporter plasmid med destabiliserat luciferas vektor, pGL [Luc2P/Neo], som innehåller hPEST (en destabilisering proteinsekvens), vilket tillåter oss att använda den som en dygnsrytm reporter vektor för vår nuvarande in vitro- Mareld assay. Det protein som kodas av Luc2P har en mycket kortare halveringstid (T1/2 = 0,84 h) och därför reagerar snabbare och med en större magnitud på förändringar i transkriptionell aktivitet än vildtyp, jagindikerande att det kan vara används för att övervaka det rytmiska uttrycket för luciferas reglerad av promotorn PER2 korrekt i realtid16.
Protocol
Representative Results
Discussion
I däggdjursceller regleras periodicitet av dygnsrytm klockan av sammankopplade transkriptionell/translationell återkopplingar. Heterodimerer av Bmal1 och klocka eller Npas2 reglera dygnsrytm transkription genom bindning till E-box element i initiativtagarna till core CGs, inklusive Per2 och gråtaoch talrika CCGs4. När de samlas i cellen, heterodimerer av Per: Cry ändras post-translationally och transporteras till kärnan att förtränga klocka: Bmal1 transkriptionell aktivit…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete fick stöd av den 2012 samhället av toxikologi (SOT)-Colgate Palmolive Grant för Alterative forskning (M. Fang) och internationellt samarbete forskningen finansiera från djur- och växt karantän byrå, Sydkorea (M. Fang), och NIEHS bevilja P30ES005022 (H. Zarbl). Vi vill tacka Dr Zheng Chen (McGovern Medical School vid universitetet i Texas Health Science Center på Houston) för hans bra diskussion, Mr Shao-An Juan för hans experimentella hjälp och Ms. Kimi Nakata för hennes korrekturläsning.
Materials
| pLS[hPER2P/rLuc/Puro] vector | SwitchGear Genomics | S700000 | customized vector |
| pGL4.18[Luc2P/Neo] vector | Promega | 9PIE673 | destabilized luciferase expression vector |
| T4 DNA ligase | Invitrogen | 15224041 | For subcloning |
| TOPO TA cloning kit | Invitrogen | K4500-02 | with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli |
| Sac I | New England BioLabs | R0156S | Restriction enzyme |
| Hind III-HF | New England BioLabs | R3104S | Restriction enzyme |
| CutSmart buffer | New England BioLabs | B7204S | Restriction enzyme buffer |
| DNA gel extraction kit | Qiagen | 28704 | Purify DNA fragments from agarose gel |
| PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | DNA clean up |
| LB Miller's modification | TEKNOVA | L8600 | For transformed E. Coli culture |
| LB Agar Plate | TEKNOVA | L1902 | For white/blue selection |
| QIAprep spin miniprep Kit | Qiagen | 27104 | For extraction of plasmide DNA |
| EndoFree plasmid maxi prep Kit | Qiagen | 12362 | For extraction of plasmide DNA |
| FuGene HD | Promega | E2311 | Transfection reagent |
| Opti-MEM reduced serum medium | Invitrogen | 31985-062 | For transfection |
| MCF10A cell line | American Type Culture Collection | CRL-10317 | Mammary Epithelial Cells |
| MEGM BulletKit | Lonza | CC-3150 | Mammary Epithelial Growth Medium |
| MEBM | Lonza | CC-3151 | Mammary Epithelial Basal Medium |
| MEGM SingleQuot Kit | Lonza | CC-4136 | Suppliments & Growth Factors |
| ReagentPack | Lonza | CC-5034 | Reagent for subculture |
| D-PBS (10X) | Sigma | D1408 | Wash cells in culture dishes |
| UltraPure Distilled Water | Invitrogen | 10977 | Dilute 10X D-PBS |
| Tissue culture dish (35 mm) | BD/Falcon | 353001 | cell culture dish suitable to LumiCycle |
| Silicon grease | Fisher | NC9044707 | For sealing dish with recording medium |
| Round cover glass | Harvard Bioscience | 64-1500 (CS-40R) | For sealing dish with recording medium |
| Cholera toxin | Sigma | C8052 | Supplement for growth medium |
| G418 sulfate (Geniticin) | Invitrogen | 10131035 | Antibiotic for selection of stabliy transfected cells |
| Ampicillin | Sigma | A9393 | For colony selection |
| Forskolin | Sigma | F6886 | Synchronization agent |
| Melatonin | Sigma | M5250 | Synchronization agent |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Synchronization agent |
| Horse serum | Sigma | H1138 | Synchronization agent |
| d-Luciferin, sodium salt | Invitrogen | L2912 | Luciferase substrate |
| IC261 | Sigma | 10658 | Positive control for circadian disruptor |
| Methylnitrosourea (NMU) | Sigma | N1517 | Mammary specific carcinogen |
| Methylselenocysteine (MSC) | Sigma | M6680 | Organic selenium (chemopreventive agent) |
| EX527 | Sigma | E7034 | SIRT1 specific inhibitor |
| Cambinol | Sigma | C0494 | SIRT1 & SIRT2 inhibitor |
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 8000 | Quantify nucleotide |
| GeneAmp PCR System 9700 | Applied Biosystems | N805-0200 | For molecular biology experiment |
| CO2 Incubator | NAPCO | Series 8000 DH | For cell culture at 5% CO2 at 37 °C |
| Desktop centrifuge with refrezerator | Eppendorf | 5430R | For molecular biology experiment |
| Centrifuge with swing bucket | Eppendorf | 5810 R | For cell culture |
| Inverted microscope | Nikon | 80124 | Phase contrast optional |
| Tissue culture hood | Labconco | Class II A2 | BSL-2 certified |
| LumiCycle 32 | Actimetrics | Not Available | Luminoscence detector |
References
- Akerstedt, T., et al. Night work and breast cancer in women: a Swedish cohort study. BMJ Open. 5 (4), e008127 (2015).
- Parent, M. E., El-Zein, M., Rousseau, M. C., Pintos, J., Siemiatycki, J. Night work and the risk of cancer among men. Am J Epidemiol. 176 (9), 751-759 (2012).
- Knutsson, A., et al. Breast cancer among shift workers: results of the WOLF longitudinal cohort study. Scand J Work Environ Health. 39 (2), 170-177 (2013).
- Fu, L., Lee, C. C. The circadian clock: pacemaker and tumour suppressor. Nat Rev Cancer. 3 (5), 350-361 (2003).
- Fu, L., Kettner, N. M. The circadian clock in cancer development and therapy. Prog Mol Biol Transl Sci. 119, 221-282 (2013).
- IARC. Painting, Firefighting, and Shiftwork. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. 98, 563-764 (2010).
- Zhang, X., Zarbl, H. Chemopreventive doses of methylselenocysteine alter circadian rhythm in rat mammary tissue. Cancer Prev Res (Phila Pa). 1 (2), 119-127 (2008).
- Fang, M. Z., Zhang, X., Zarbl, H. Methylselenocysteine resets the rhythmic expression of circadian and growth-regulatory genes disrupted by nitrosomethylurea in vivo. Cancer Prev Res (Phila). 3 (5), 640-652 (2010).
- Burbulla, L. F., Kruger, R. Converging environmental and genetic pathways in the pathogenesis of Parkinson’s disease. J Neurol Sci. 306 (1-2), 1-8 (2011).
- Aitlhadj, L., Avila, D. S., Benedetto, A., Aschner, M., Sturzenbaum, S. R. Environmental exposure, obesity, and Parkinson’s disease: lessons from fat and old worms. Environ Health Perspect. 119 (1), 20-28 (2011).
- Nagoshi, E., Brown, S. A., Dibner, C., Kornmann, B., Schibler, U. Circadian gene expression in cultured cells. Methods Enzymol. 393, 543-557 (2005).
- Ramanathan, C., et al. Cell type-specific functions of period genes revealed by novel adipocyte and hepatocyte circadian clock models. PLoS Genet. 10 (4), e1004244 (2014).
- Sporl, F., et al. A circadian clock in HaCaT keratinocytes. J Invest Dermatol. 131 (2), 338-348 (2011).
- Zhang, E. E., et al. A genome-wide RNAi screen for modifiers of the circadian clock in human cells. Cell. 139 (1), 199-210 (2009).
- Yoo, S. H., et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (15), 5339-5346 (2004).
- Leclerc, G. M., Boockfor, F. R., Faught, W. J., Frawley, L. S. Development of a destabilized firefly luciferase enzyme for measurement of gene expression. Biotechniques. 29 (3), (2000).
- Genomics, S. . Technical Note: SwitchGear methods for gene model construction and transcription start site prediction. , (2009).
- Scientific, F. . Safety Data Sheet: Ethidium bromide, 1% Solution/Molecular Biology. , (2010).
- Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. . Current Protocols in Molecular Biology. , (1994).
- Yoo, S. H., et al. A noncanonical E-box enhancer drives mouse Period2 circadian oscillations in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (7), 2608-2613 (2005).
- Chen, Z., et al. Identification of diverse modulators of central and peripheral circadian clocks by high-throughput chemical screening. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (1), 101-106 (2012).
- Fang, M., Guo, W. R., Park, Y., Kang, H. G., Zarbl, H. Enhancement of NAD+-dependent SIRT1 deacetylase activity by methylselenocysteine resets the circadian clock in carcinogen-treated mammary epithelial cells. Oncotarget. , (2015).
- Chen-Goodspeed, M., Lee, C. C. Tumor suppression and circadian function. J Biol Rhythms. 22 (4), 291-298 (2007).
- Balsalobre, A. Clock genes in mammalian peripheral tissues. Cell Tissue Res. 309 (1), 193-199 (2002).
- Jung-Hynes, B., Huang, W., Reiter, R. J., Ahmad, N. Melatonin resynchronizes dysregulated circadian rhythm circuitry in human prostate cancer cells. J Pineal Res. 49 (1), 60-68 (2010).
- von Gall, C., et al. Melatonin plays a crucial role in the regulation of rhythmic clock gene expression in the mouse pars tuberalis. Ann N Y Acad Sci. 1040, 508-511 (2005).
- Vujovic, N., Davidson, A. J., Menaker, M. Sympathetic input modulates, but does not determine, phase of peripheral circadian oscillators. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 295 (1), R355-R360 (2008).
- Schofl, C., Becker, C., Prank, K., von zur Muhlen, A., Brabant, G. Twenty-four-hour rhythms of plasma catecholamines and their relation to cardiovascular parameters in healthy young men. Eur J Endocrinol. 137 (6), 675-683 (1997).
- Yu, H., et al. Circadian rhythm of circulating fibroblast growth factor 21 is related to diurnal changes in fatty acids in humans. Clin Chem. 57 (5), 691-700 (2011).
- Nakagawa, H., et al. Modulation of circadian rhythm of DNA synthesis in tumor cells by inhibiting platelet-derived growth factor signaling. J Pharmacol Sci. 107 (4), 401-407 (2008).
- Yang, X., Guo, M., Wan, Y. J. Deregulation of growth factor, circadian clock, and cell cycle signaling in regenerating hepatocyte RXRalpha-deficient mouse livers. Am J Pathol. 176 (2), 733-743 (2010).
- Virag, L. Structure and function of poly(ADP-ribose) polymerase-1: role in oxidative stress-related pathologies. Curr Vasc Pharmacol. 3 (3), 209-214 (2005).
- Kon, N., Sugiyama, Y., Yoshitane, H., Kameshita, I., Fukada, Y. Cell-based inhibitor screening identifies multiple protein kinases important for circadian clock oscillations. Commun Integr Biol. 8 (4), e982405 (2015).
- Ramanathan, C., Khan, S. K., Kathale, N. D., Xu, H., Liu, A. C. Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters. J Vis Exp. (67), e4234 (2012).
- Welsh, D. K., Yoo, S. H., Liu, A. C., Takahashi, J. S., Kay, S. A. Bioluminescence imaging of individual fibroblasts reveals persistent, independently phased circadian rhythms of clock gene expression. Curr Biol. 14 (24), 2289-2295 (2004).
