Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

Vitro Sirkadiyen ritim meme epitel hücreleri ayırdetmek için bioluminescence tahlil

doi: 10.3791/55832 Published: September 28, 2017

Summary

Hücresel sirkadiyen ritim meme epitel hücreleri belirlemek için bir vitro bioluminescence tahlil sunulur. Bu yöntem memeli hücre muhabir plazmid istikrarsızlığın luciferase dönem 2 gen düzenleyici denetimi altında ifade kullanır. Sirkadiyen ritim organ özgü etkileri değerlendirmek için diğer hücre tipleri için uyarlanabilir.

Abstract

Sirkadiyen ritim biyolojik süreçlerin davranış uyumaya gen ifadeden değişen düzenleyen bir temel fizyolojik tüm canlılar arasında mevcut bir süreçtir. Omurgalılar, sirkadiyen ritim fonksiyonları hem suprachiasmatic çekirdeği (SCN; Merkezi kalp pili) ve tek tek hücreler en periferik dokularda oluşan bir moleküler osilatör tarafından kontrol edilir. Daha da önemlisi, sirkadiyen ritim ışık gece, çevresel stres ve/veya toxicants maruz bozulma yaşlanma ve kronik hastalıkların riski ile ilişkilidir. Merkezi ve/veya periferik biyolojik saatler bozabilir ajanlar ve önlemek veya sirkadiyen bozulma, etkilerini azaltmak aracıları tanımlama yeteneği kronik hastalıkların önlenmesi için önemli sonuçları vardır. Kemirgen modelleri Etkilenmeler ve teşvik veya sirkadiyen kesintileri önlemek/azaltmak aracıları tanımlamak için kullanılan rağmen bu deneylerin hayvanlar çok sayıda gerekir. İn vivo çalışmalar da önemli miktarda kaynak ve altyapı çalıştırmaları ve araştırmacılar bütün gece çalışmak gerekir. Böylece, işte bir hücre tipi uygun vitro sistemi için acil bir ihtiyaç için çevre sirkadiyen olduk ve hücre tipleri arttırıcılar ekran farklı organ ve hastalık durumlarında. Biz insan dönemi 2 gen düzenleyici denetimi altında ökaryotik hücrelerde bozulma luciferase, transkripsiyon sürücüler bir vektör inşa. Bu sirkadiyen muhabir yapıyı stabil insan meme epitel hücreleri transfected ve sirkadiyen duyarlı muhabiri hücre vitro bioluminescence testi geliştirmek üzere seçildi. Burada, kurmak ve tahlil doğrulamak için detaylı bir iletişim kuralı mevcut. Daha fazla kanıt-in vivo etkileri çeşitli kimyasallar hücresel biyolojik saat özetlemek için bizim vitro tahlil yeteneği gösteren kavram deneyler için ayrıntıları sağlar. Sonuçlar tahlil çeşitli hücre tiplerinin çevresel olduk ve chemopreventive arttırıcılar sirkadiyen saatler için ekran için adapte edilebilir gösterir.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Sirkadiyen saat geniş bir düzenleyen davranış tahmin edilebilir bir ritim içinde yaklaşık 24 h Epidemiological bir periodicity ile uyku genlerin diurnal ifadeden biyolojik süreçlerin çalışmalar güçlü sirkadiyen kronik bu bozulma önermek ritim meme ve shift işçiler, hemşireler ve uçuş ekipleri1,2,3gibi prostat kanseri riskini artırır. Bu bulgular kemirgen çalışmaları, jet-lag artış tümörü insidansı taklit ve tümör büyüme4,5hızlandırır sabit ışık, ışık gece veya hafif döngüleri için bu maruz kalma gösteren tarafından doğrulanmıştır. İnsan ve kemirgen çalışmaları gelen verileri esas, Uluslararası Ajansı kanser araştırma için vardiyalı çalışma muhtemel insan kanseri (tip 2A) 20106olarak sınıflandırılmış.

Daha önce biz bu gösterdi meme tümör belirli kanserojen, N- nitrozo kanserojen bir tek doz-N- methylurea (NMU), bozulmuş sirkadiyen ifade büyük sirkadiyen genlerin (CGs) (örneğin, dönem 2 , Per2) ve dahil olmak üzere birkaç sirkadiyen kontrollü genler (CCGs), anahtar DNA hasarı duyarlı ve onarım (DDRR) genleri hedef meme bezi (Ama karaciğer içinde). Ayrıca, diyet Lchemopreventive bir rejimi tarafından normal doğru Per2 ve DDRR genlerin sirkadiyen ifade sıfırlama-metil-selenocysteine (MSC) %63 tümörü insidansı azaldı. Bu bulgular sirkadiyen ritim, kimyasal karsinojenezis ve chemoprevention7,8arasında mekanik bir bağlantı göstermek için ilk idi. Etkilenmeler sirkadiyen gen ifade içinde vivo bozmaya gösterilen diğer çevresel toxicants için Ayrıca çevresel hastalıklar9,10riski ile ilişkilidir. Çevre toxicants ve Patogenez sirkadiyen bozulma bağlantı mekanizmaları anlama mechanistically tabanlı yaklaşımlar hastalık önleme neden olabilir. Ancak, çalışmalar yönelik pozlama arasındaki etkileşimler tanımlama ve sirkadiyen ritim genellikle yapılan içinde vivo. Sirkadiyen ritim etkisi en az üç dokulardan kontrol ve üç maruz kalan hayvan olması gerekir gibi hayvanlar, çok sayıda gerektirir araştıran bir tipik vivo içinde deneme her 3-4 h 24 veya 48 s süre içinde toplanır. Vivo gözlemler ve mekanizmaları beyannamedir doğrulanmış vitro sisteminin geliştirilmesi bu nedenle sadece hayvanların gerekli sayıda azaltmak ama aynı zamanda önemli ölçüde deneysel maliyeti ve gereksinimi azaltmak bu araştırmacılar sürekli olarak 24-48 h bir süre içinde iş. Ayrıca, bir doğrulanmış vitro sistem yüksek üretilen iş bileşikler ve/veya sirkadiyen ritim veya çevresel stres veya toxicants onun yanıtı etkileyen genetik değişiklik ile taranması için kullanılabilir. Bu nedenle, vitro ve in vivo modeller ve deneyler stratejik kombinasyonu ile farklı odak farklı anlayışlar elde etmek için gereklidir.

Memelilerde, sirkadiyen osilatörler SCN özel nöronlar sadece, aynı zamanda en periferik hücre tipleri içinde mevcut. Bu moleküler saatleri embriyo veya yetişkin hayvanlar kurulan fibroblast hücre satırları ve birincil fibroblastlar benzer; Ancak, doku türüne özgü hücresel modelleri11için bir ihtiyaç vardır. Sonuç olarak, geleneksel Lokomotor aktivite içinde vivo, SCN (sahne) çalışmaların ex vivoexplants ve hücre tabanlı vitro deneyleri ölümsüzleştirdi fibroblast hücrelerinde yaygın olarak hücre özerk sirkadiyen hataları incelemek için kullanılır. Ancak, bir vitro fibroblast hücre tabanlı tahlil sirkadiyen mekanizmaları özetlemek gösteren hiçbir kanıt yoktur ve yanıt-e doğru diğer çevre organlara vivo içindehücrelerinde mevcut. Farklı hücre tipleri farklı desenler gen ekspresyonu, xenobiotic metabolizma ve DDRR sahip olabilir ve toksisite ve sirkadiyen gen ekspresyonu arasında bağlantılar hücre tipi olabilir belirli ve/veya farklı fizyolojik parametreler tarafından modüle edilmiş. Buna ek olarak, fibroblast tabanlı sistemlerde sirkadiyen osilatörler tam yanıt çevre toxicants, stres ve Etkilenmeler hastalığı geliştirme ve Önleme mekanizmaları için bağlantı koruyucu ajanlar için değerlendirdikten değil. Böylece, facile, doğrulanmış hücre türü özel, vitro bioluminescence deneyleri organ belirli çevre sirkadiyen bozucular çalışmaya ihtiyaç vardır. Hücresel saat modelleri (örneğin, karaciğer, keratinositler ve yağ hücrelerinin yanı sıra bir osteosarkom hücre kültürünü) çeşitli olmasına rağmen son yıllarda12,13,14' te, geliştirilmiştir 15, burada açıklanan tahlil ilk hücresel saat meme epitel hücreleri ve in vivo yanıt çevresel stres, toxicants, uyuşturucu ve chemopreventive ajanlar için özetlemek için ilk gösteri modelidir.

Renilla luciferase (rLuc) ve ateş böceği luciferase enzimatik aktivite için işleme ardından gerektirmeyen ve hemen sonra çeviri genetik bir muhabir olarak işlev görebilir 30-61 kDa monomeric proteinlerdir. Bir kez belgili tanımlık substrate luciferase enzim ile ilişkilendirir, katalize biyokimyasal reaksiyon bir ışık üretir. Böylece, luciferase yapıları bir gen ifade muhabir sistem vitro ve içinde vivoolarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Ancak, sirkadiyen ritim çalışmaları, luciferase muhabir yarar luciferase protein nispeten uzun yarı ömrü tarafından sınırlı (T1/2 = 3.68 h) (özellikle için kısa süre) dönem sirkadiyen gen değişiklikleri için göreli ifade; Ancak, yıl içinde çok sayıda çalışmalar başarıyla luciferase gen hızla parçalanabilir luciferase ritimleri ile daha uzun bir süre için özellikle sirkadiyen ritim gibi raporlama için gerekli olmayabilir gösteren pGL3 vektör kullanmışlardır 24 saat. Bu nedenle, bozulma luciferase vektör kullanarak bir muhabir plazmid pGL [Luc2P/Neo], hPEST (protein istikrarsızlık dizisi) içeren, mevcut için tüp bebek sirkadiyen muhabir vektör olarak kullanmak bize izin verdiği için geliştirilmiştir bioluminescence tahlil. Luc2P tarafından kodlanmış protein bir çok daha kısa yarı ömrü vardır (T1/2 = 0,84 h) ve bu nedenle, daha hızlı ve daha büyük bir büyüklük değişikliklere daha vahşi-türü, transkripsiyon faaliyette yanıt verdiği beno-ebilmek var olmak göstergeli doğru bir şekilde gerçek zamanlı16içinde PER2 düzenleyici tarafından düzenlenen luciferase ritmik ifade izlemek için kullanılır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. PER2 organizatörü tahrik dengeleri bozdu Luciferase muhabir vektör inşaatı

  1. satın almak bir özelleştirilmiş pLS [hPER2P / rLuc / Puro] cDNA rLuc ve insan kodlaması içeren vektör PER2 organizatörü parçası (hPER2P, 941 bp) sitesinde Sac arasında ben ve Hind III birden çok klonlama bölge 17.
  2. İnsan PER2 organizatörü parçası kesme (hPER2P, 941 bp) out vektöründen.
    1. Ekleyin 2.5 µL restriksiyon enzimi tampon, 10 µL (180 ng) pLS [hPER2P / rLuc / Puro] vektör ve 1 µL her enzimleri, Sac ben (10 birim/µL) ve Hind III (10 birim/µL), bir DNA/RNA/nükleotit-Alerjik içine microcentrifuge tüp. Ultrasaf su (10.5 µL) en çok 25 µL ve karışımı yavaşça pipetting tarafından ekleyin.
    2. Isıtma blok içinde 90 dk 37 ° C'de Incubate.
    3. Çalıştıracağınız tüm birim (25 µL) restriksiyon enzimi tepkisi %0,0001 etidyum bromür (EtBr) hPER2P öğesinden ayırmak için içeren % 0.7 özel jel.
      Not: EtBr, 3,8-diamino-1-ethyl-6-phenylphenantridinium bromür (CAS kayıt numarası: 1239-45-8), kokusuz bir kırmızı sıvıdır. Yaygın olarak kullanılan özel Jel Elektroforez (nükleik asit leke) bir floresan etiketi gibi ve UV ışığı altında turuncu renk olarak görünür intercalating bir ajandır. Düzenleyici kurumlar hiçbiri kanserojen 18 kategorize rağmen olası riskleri geri dönüşü olmayan mutajenik etkileri deneysel hayvanlarda meydana gelmiştir. Bu nedenle, biz kullanılan özel arabellek EtBr kimyasal tehlike atık olarak içeren jel ve Elektroforez toplanan ve Rutgers çevre sağlığı istenen & almak ve güvenli bir şekilde imha Emanet (REHS).
    4. Bir EtBr floresan band 941 içeren özel jel bir parça kesip kan basıncı ve emme yoğunluğu (OD) ölçülerek bir Spektrofotometre miktar tarafından takip bir DNA jel ekstraksiyon kiti ile jel hPER2P parçalardan 260 nm dalga boyu arındırmak.
  3. Linearize 1.0 µL (1 µg) istikrarsızlığın ateş böceği luciferase ifade vektör, pGL [Luc2P / Neo] adımları 1.2.1-1.2.2 açıklandığı gibi aynı yöntemi ile. Bir Spektrofotometre kullanarak yukarıda açıklandığı gibi miktar tarafından takip bir DNA temizlik kiti ile vektör ayıklamak.
  4. HPER2P doğrusallaştırılmış vektör pGL ligate [Luc2P / Neo].
    Not: Üretici başına ' s talimat, Ekle ve vektör ideal molar oranı 2: 1'dir. 50 ng vektör için INSERT ideal miktarı 23,6 hesaplanır bir formül, [(50 ng vector x 1.0 kb insert)/4.242 kb vektör ile ng] x (2/1) 23,6 ng Ekle =]. HPER2P konsantrasyonları dayalı (7,26 ng/µL) ve pGL [Luc2P / Neo] (50 ng/µL), 50 ng pGL hacimleri [Luc2P / Neo] ve 23,6 ng hPER2P hesaplanırken 1 µL ve 3.26 µL anılan sıraya göre.
    1. Ekleyin 2 µL T4 DNA ligaz tepki tampon (10 X) (50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl 2, 1 mM ATP ve 10 mM DTT) 3.26 µL (23,6 ng) hPER2P, 1 µL (50 ng) pGL [Luc2P / Neo], ve 13.74 µL su 20 µL , karışımı yavaşça.
    2. 1 µL T4 DNA ligaz (400 Ünite/µL) eklemek, karışımı yavaşça ve geceleme bir thermocycler 16 ° C'de kuluçkaya ve sonra üreticinin başına buz üzerinde ve birleştirilmiş vektör chill ' s eğitimi.
  5. Ve birleştirilmiş vektör pGL dönüştürmek [hPer2P / Luc2P / Neo] kimyasal olarak yetkili E. coli için 19.
    1. 42 ° c, catabolite baskı (S.O.C.) orta ile süper en iyi suyu kadar sıcak su banyosu ayarla (%2 Tryptone, %0,5 Maya ekstresi, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl 2, 10 mM MgSO 4 ve 20 mM glikoz) oda sıcaklığında , Luria-Bertani (LB) agar plaka 37 ° C kuluçka (100 µg/mL Ampisilin, 80 µg/mL X-gal ve 0.5 µM IPTG içeren) ısınmak ve çözülme buz bir şişe yetkili E. coli hücreleri her dönüşüm için.
    2. Ekleyin 6 µL (21 ng) tane vektör veya 1 µL (30 ng) boş bir tüp kimyasal olarak yetkili E. coli (50 µL) için vektör (negatif kontrol) ve sonra yavaşça karıştırın tüpünü çevir. 30 dakika süreyle buz üzerinde kuluçkaya
    3. Isı 30 42 ° C su banyosu şokta s sallayarak olmadan ve sonra buz dönmek
  6. Mavi/beyaz tarama kullanarak ve birleştirilmiş bir vektör ile dönüştürülmüş bir E. coli kolonisi seçin.
    1. Ekleyin 250 µL S.O.C. ortamda dönüştürülmüş E. coli tüp ve 1 h 37 ° c ile 200 devir / dakikada sallayarak için kuluçkaya.
    2. 10-50 µL dönüştürülmüş E. coli LB agar plaka yüzeyine eşit olarak yayılmış. Plaka baş aşağı gecede 37 ° C kuluçka makinesine koy.
      Not: Yüz sömürgeler verimli bir klonlama reaksiyon üretmek gerekir. İki farklı birimi kaplama en az bir tabak büyük, açık beyaz veya mavi renk ve iyi aralıklı kolonileri sahip olmasını sağlamak için önerilir. Kolonilere çok küçük ve renk ayırt değil, bir mikroskop (10 X veya 50 X) kullanarak yararlıdır.
    3. 3-6 beyaz kolonileri sterilize diş sopa ile plakalar üzerinden almak ve her koloni LB kültür orta 50 µg/mL Ampisilin ile 4 mL içeren bir kültür tüp içine bırakın.
    4. Gecede 200 devir / dakikada sallayarak ile tüpler 37 ° C'de kuluçkaya. 4 mL 2 mL kullanarak DNA ayıklamak bir plazmid DNA ekstraksiyon mini hazırlık kiti ile üretici başına E. coli kültürlü ' s eğitimi.
  7. Doğrula ve INSERT analiz (hPER2P, 941 bp)
    1. enzimleri ile plazmid DNA sindirmek ve Elektroforez bir ekleme olup olmadığını doğrulamak için adımları 1.2.1-1.2.3 içinde açıklandığı gibi çalıştırmanız.
      Not: Pozitif kontrol (hPER2P vasıl adım 1.2.4 saf) ve negatif kontrol (E. coli ile boş bir vektör dönüşüm) dahil edildi.
    2. Sıra Yönlendirme ve INSERT plazmid 19 sırasını onaylamanız M13 ileriye ve geriye doğru M13 astar kullanarak seçili plazmid DNA.
      Not: vardı bir ekleme hPER2P Elektroforez ve doğru Yönlendirme ve sıralama sonucu sırayla doğru boyutu ile tek bir koloni seçildi.
    3. İnsan PER2 organizatörü parçası analiz (hPER2P, 941 bp) sıra sirkadiyen öğeleri için yasal E-box motifi (Bmal1 binding site, kedi/CGTG) dahil olmak üzere, CCAATC, GC kutusu ve site (CAGCGG) 20 başlatmak transkripsiyon.
  8. Ekleyerek seçilen E. coli artık 2 mL 200 mL LB kültür 50 µg/mL Ampisilin içeren ve daha sonra bu gecede 37 ° C'de 200 devir / dakikada sallayarak ile kuluçka orta içine E. coli kültürlü genişletme.
  9. DNA ayıklamak bir plazmid endotoksin-Alerjik maxi ile kit başına hazırlayın Üretici ' s öğretim ve sonra OD 260 nm dalga boyu ile Spektrofotometre ölçerek ölçmek. Aliquot ve mağaza pGL [hPer2P/Luc2P/Neo],-80 ° C dondurucu ileride kullanmak üzere, plazmid DNA.

2. Geçici Transfection

  1. satın alma ve MCF10A hücre kültür
    1. satın alma bir ölümsüzleştirdi, Sigara dönüşüm normal insan meme epitel hücre satırından (MCF10A) ticari bir hücre Bankası, hücreleri nerede cytogenetically test edilmiş ve kimliği doğrulanmış ile kısa tandem tekrar donma önce analiz. Çözülme ve en fazla 8 hafta kültür donmuş hücrelerde her şişe korumak.
      Not: ~ %70 izdiham için geldiklerinde temas inhibisyonu bu hücreler diğer hücrelere farklı olarak, sahip. Bu alt kültür ~ %70 yürütülen gerektirir.
    2. Meme epitelyal Bazal orta (MEBM), büyüme takviyeleri ve 37 ° C, % 95 nem oranı ve % 5 CO 2 hücre kültür kuluçka kolera toksin içeren hücreleri ile meme epitel hücre büyüme orta (MEGM), kültür.
      Not: kullanıma hazır büyüme faktörleri SingleQuot (SQ) sağlanan satın alma ve kolera toksin ayrı olarak elde edilir. Son büyüme takviyeleri konsantrasyonları vardır % 0,4 sığır hipofiz özü, % 0,1 insülin, % 0,1 hidrokortizon, % 0,1 insan epidermal büyüme faktörü, 100 ng/mL kolera toksini ve % 0.05 viomisin sülfat ve % 0.05 Amfoterisin B.
    3. 10 mL tripsin/EDTA ile kuluçka tarafından 10 cm kültür çanak hücrelerde ayırmak ~ 20 dk ve tripsin çözüm nötralize 10 mL tripsin ekleyerek etkisiz hale getirin. Toplamak HEPES içeren tüm hücreleri tuzlu çözüm (HBSS) arabelleğe.
    4. Ters bir mikroskop altında hemasitometre içeren hücreleri saymak ve tek hücre süspansiyon konsantrasyon hesaplamak ve hücreleri belirli sayıda sonra gerektiği gibi temel olarak belirler. İyice her plaka hücrelerde eşit dağılımı elde plakalara girdap. Hücreleri hücre kültür kuluçka 37 ° C, % 95 nem oranı ve % 5 CO 2 kuluçkaya.
      Not: tripsin/EDTA, tripsin nötralize çözüm ve kullanmak için HBSS içeren bir alt kültür reaktif paketi satın.
  2. Hücre inşa sirkadiyen vektör ile geçici transfection.
    1. Tohum 2 x 10 5 MCF10A hücrelerde eşit 35 mm kültür çanağı ile MEGM ve % 20-30 izdiham (ertesi gün) büyümek.
    2. Sıcak azalır kadar serum medyada (örneğin, Opti-MEM) 37 ° C su banyosu ve transfection reaktif, oda sıcaklığında 30 dakika süreyle seyreltik plazmid DNA inşa (pGL [hPer2P / Luc2P / Neo]) 30 ng/µL endo-toksin ücretsiz için Tris-EDTA (TE) arabellek ve oda sıcaklığında tutmak.
    3. 1.5 mL microcentrifuge tüp plazmid transfection karışımı 63.6 µL sıcak düşük serum medya eklemek, sonra 33.4 µL (0.1 µg) plazmid DNA ekleme hazırlamak ve karışımı yavaşça pipetting ve son olarak transfection 3 µL ekleme Reaktif doğrudan duvara dokunmadan tüp Merkezi. Pipetting tarafından hafifçe karıştırdıktan sonra oda sıcaklığında 30 dakika süreyle devam
    4. Plaka ortamda Merkezi yüzeyine doğrudan tüm plazmid karışımı (100 µL) bırakın ve sonra karışımı yavaşça çanak sallayarak. CO 2 kuluçka için ek 48-72 h. hücreler kültür
      Not: Bu en yüksek transfection verimliliği % 40-70 izdiham nedeniyle onların temas inhibisyonu bu hücrelerin adlı olacağını tahmin edilmektedir ~ % 70. Bu nedenle, en iyi başlayan transfection çalışır ~ % 20 ve durağında ~ % 70 izdiham.

3. Kurulması In Vitro Bioluminescence tahlil hücrelerdeki geçici Transfected MCF10A

  1. MEBM olmadan büyüme faktörleri için 24 h ~ %70 izdiham (sonra transfection 48-72 saat), kültürlü hücreleri açlıktan
  2. Eşitleme Aracısı (örneğin, % 50 at serum (HS)) MEBM içinde CO 2 kuluçka 1,5 saat için hücrelerle tedavi.
    Not: bir ideal eşitleme Aracısı, 10 µM forskolin, 1 nM melatonin, 0,1 µM deksametazon, %50 HS ve % 100 seçim için SQ karşılaştırıldığında sirkadiyen genlik ve süre açısından sirkadiyen vektör transfected hücrelerde. Boş vektör transfected hücreleri ile % 100 kabul edilir bir negatif kontrol olarak SQ.
  3. 5 mL MEGM de, MEBM, 150 µL sodyum bikarbonat, 200 µL HEPES ve 40 µL biyoluminesans 15 mL ekleyerek pre-prepare 20 mL kayıt orta (10, 30 mm kültür yemeklerin için) stok 50 mL steril santrifüj tüpü (50 mM) çözümde.
    Not: Her bileşenleri son konsantrasyonları: %20 SQ ve 20 ng/mL kolera toksini, % 0,06 sodyum bikarbonat, % 1 penisilin/streptomisin ve 10 mM HEPES. Orta kayıt ve 1 x PBS için 30 dk 37 ° C su banyosu içinde sterilize önceden hazırlanmış ısınmak. 100 µM biyoluminesans kullanımdan hemen önce ekle.
  4. Sıcak 1 hücrelerle yıkama Dulbecco x ' s Phosphate-Buffered serum fizyolojik (D-PBS) için 3 kez eşitleme Aracısı ile kuluçka sonra ve 2 mL orta kayıt ekleyin.
  5. Silikon gres buharlaşma önlemek ve o zaman üstünde belgili tanımlık yan etiket kullanarak bir steril kapak sınıfı ile çanak mühür.
  6. Luminometer içinde koltukta mühürlü çanak yerleştirin ve klasörde dosya konumunu kaydetmek için seçeneğini etkinleştirin (ayrıntı için bkz: Bölüm 6).

4. Stabil Transfected hücre seçimini

  1. üreticiye göre öldürmek eğrisi tahlil ile ideal bir G418 konsantrasyonu (800 µg/mL) en iyi duruma ' stabil transfected hücrelerin seçimini s talimatı.
  2. 48 h veya 72 h için geçici transfection sonra alt kültür ve tohum MEGM 5.000 adlı daha büyük yemekler hücrelerle hücreler/yemek (100-mm). 24 saat sonra kültür hücre kültür kuluçka (37 ° C, % 95 nem ve % 5 CO 2) tedavi 800 µg/mL G418 hücrelerle yeni orta 2 hafta boyunca her 3-4 günde 800 µg/mL G418 içeren eski orta değiştirerek.
  3. Stabil kalan alt kültür 500µg/mL G418 hPer2P/Luc2P istikrarlı ifade elde etmek ve ileride kullanmak için sıvı azot dondurmak için içeren MEGM ile 1-3 pasajlar için koloniler transfected.
  4. Tedavisinde 500µg/mL G418 hücreleri, stabil transfected nüfusu yeniden seçmek için genel alt kültür sonra birçok pasajlar kullanımdan sonra vitro bioluminescence tahlil sonucu bioluminescence şiddeti giderek daha düşük hale gelirse.

5. Kimyasallar ile tedavi

  1. 48 s, ya da 72 h sonrası transfection, büyüme faktörleri MEBM için 24 h içinde hücrelerden açlıktan
  2. % 50 ile eşitlemeden sonra HS için 2 h, 0,25 mM veya 0,5 mM nitrosomethylurea (NMU), 20 nM EX527 veya 1 µM cambinol MEBM %20 içeren 1 h için hücrelerle tedavi SQ.
  3. 1 ile yıkama sonra x D-PBS, tek başına veya birlikte 20 nM EX527 veya hücrelere 1 µM cambinol ile orta içeren 12.5 µM MSC kayıt ekleyin. Luminometer ile bioluminescence izleme.
  4. Tedavi stabil transfected MCF10A / PER2-NMU dLuc hücrelerle 0.5, 1 veya 2 mM, 40 nM, EX527 veya Cambinol için 1 h % 50 ile eşitleme sonra 2.0 µM, HS ve MSC orta içeren 12.5 µM kayıt hücreler kuluçkaya ya da farklı doz (5, 10 veya 20 µM) n-acetylcysteine (NAC). Tabakları luminometer, kayıt yerleştirmek ve 3.6 bölümünde anlatıldığı gibi luminometer tarafından bioluminescence 4-8 gün boyunca kaydedin.
    Not: NMU metillenmiş nitrosourea mutajenik, kanserojen ve teratojenik özellikleri ile bileşik olduğunu. NMU doğrudan etkili bölücü ve kısa bir yarı ömrü vardır (T 1/2 = ~ 30 dk). Asidik koşulu (pH 4-5), ama kararsız alkalin koşulu (pH 9-10) ve sıcaklık 20 ° c ötesinde, stabil Bu nedenle, çamaşır suyu %10 verimli bir deactivating ajan olarak temizlik tezgah yüzeyler ve potansiyel olarak NMU Solutia tarafından kontamine laboratuar gereçleri için kullanılabilirüzerinde. Artık hisse senedi çözüm aldı-up ve güvenli bir şekilde bertaraf tarafından REHS. Kimyasal maddelerin eylem modu dayanarak, eşitlenmiş hücreleri daha önce kayıt ortamda kültür kısa süreleri için tedavi edilebilir. Hücreleri de tedavi edilebilir kayıt orta uzun bir süre (birkaç gün).

6. Veri toplama, analiz ve sunum

Not: hücre canlılığı ihtiyacı standart yöntemleri (Örneğin, ÇMT tahlil) kullanarak belirlenecek hücre Aynı konsantrasyonlarda tedavisinde belirtilen aynı kez sonra. Vitro bioluminescence assay olarak kullanılan tüm tedavi konsantrasyonu % 30 öldürücü konsantrasyon (LC30) düşük bulunmuştur. Tüm deneyler nüsha yapılmıştır ve temsilcisi sonuçları sunuldu.

  1. Çanak (Adım 3.5) mühürledikten sonra bulaşıkları ayarla H 2 O ve CO 2 olmadan 37 ° C'de ve bir bilgisayara bağlı bir kuluçka içinde tutulur luminometer koltuklarda üzerine yük.
  2. Tıklama " kurtarmak " ve nerede karşılık gelen çanak kaydedilen ışıldama sinyalini kaydedilecek dosya ve klasör adlarını girin.
    Not: Sistem ışıldama sinyali algılar bireysel pozisyonlarda tabak hücrelerden gerçek zamanlı. Sinyalleri üzerinden photomultiplier tüp 4 foton sayma, bilgisayara transfer ve kaydedilir ve bilgisayar veri toplama yazılımı tarafından görüntülenen.
  3. Kayıt için orta değiştirmek ve sürekli bir ikinci hafta için gerekirse kayıt tarafından takip edilebilir 4-7 gün sonra sinyalleri analiz.
    Not: dahil olmak üzere faz, dönem uzunluğu, ritim genlik ve oranı, sönümleme sirkadiyen parametreleri elde etmek için biz luminometer analiz yazılımı bioluminescence verileri çözümlemek için kullanılan.
  4. Çalışan bir ortalama ile ham veri detrend ve en uygun dönem, evre, genlik ve oranı 21 , 22 damping almak için bir sinüs dalga için analiz.
  5. Tedavi ve orta değiştirmek üzerine yüksek geçici bioluminescence nedeniyle, ilk döngüsü veri çözümleme dışı bırakmak.
  6. Zaman (saat veya gün) karşı ham verileri (bioluminescence, sayısı/s) veri sunumu için çizmek. Gerekli olduğunda, veri temel düşülen genlik ve faz karşılaştırmak için çizilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Sirkadiyen bioluminescence muhabir vektör: insan PER2 organizatörü tahrik ifade istikrarsızlığın luciferase varyant

941 bp parçası oluşan DNA dizisi sirkadiyen muhabir vektör, pGL oluşturmak için kullanılan insan PER2 organizatörü türetilmiş [hPer2P/Luc2P/Neo, ilk düzenleyici elemanlarının düzenleyen bilinen varlığı için analiz sirkadiyen gen ekspresyonu. Biyoinformatik analizi bu organizatörü parçası içinde orada üç farklı Bmal1 bağlayıcı siteleri (E-box) (kedi/CGTG), iki sirkadiyen transkripsiyon artırılması site (CCAATG), iki GC kutusu ve bir transkripsiyon başlangıç sitesi (şekil 1) gösterdi. Bu nedenle bu muhabir vektör sirkadiyen gen ekspresyonu yansıtmak için beklenen oldu.

Eşitleme Aracısı'nın en iyi duruma getirme

Birkaç Aracısı eşitlemek veya özerk sirkadiyen ritim fibroblast hücre vitro bioluminescence çalışmaları için etkilemek için kullanılmaktadır. Biz göre 10 µM forskolin, 1 nM melatonin, 0,1 µM deksametazon, %50 HS ve % 100 verimli ve maliyet-etkin hücre tipi belirli eşitleme Aracısı meme epitel hücreleri seçmek için geçici transfected meme epitel hücreleri (MCF10A) olarak SQ sirkadiyen muhabir vektör ile. Hücreleri senkronize HS en iyi sirkadiyen ritim gösterdi, ışıma 3 doruklarına sirkadiyen ile indüklenen, hücrelerde yalnızca bir veya iki zirveleri ile karşılaştırıldığında % 50 diğer ajanlar ile senkronize. Buna ek olarak, %50 HS üretilen kabul edilebilir süre, genlik ve en uygun değer ile veri analizi (Şekil 2) sırasında senkronize hücre bioluminescence profilleri. Bu bulgulara dayanarak, biz bu maliyet-etkin yöntem tüm sonraki deneyler için hücre eşitleme Aracısı olarak seçildi.

Bozulma ve hücresel sirkadiyen ritim kimyasal pozlama tarafından restorasyonu

Bu vitro modelde, en az iki tam döngüleri ışıldama eşitlemeden sonra (şekil 3A) sinyal tedavi edilmezse, geçici transfected hücreleri (kontrol grubu) gösterdi. Hücreleri doğrudan oyunculuk alkil NMU, maruz sirkadiyen gen ekspresyonu doz bağımlı bozulma ışıldama doruklarına kaybı tarafından yansıtıldığı gibi gösterdi. 0,25 mM NMU ile tedavi hücresel sirkadiyen ritim bozmak değil, 0,5 mM NMU bir doz başlangıçta gecikmeli ve sirkadiyen ritim, ışıma ~ 72 h tedavi sonrası, ikinci zirve kaybolması gösterildiği gibi daha sonra kaldırıldı. 20 nM Ex257 veya 1 µM cambinol ile SIRT1 aktivitesinin inhibisyonu benzer şekilde sirkadiyen ritim sonraki sirkadiyen döngüsü (şekil 3A-1) nemlendirme tarafından bozulur. Önemlisi, MSC eklenmesi (12,5 µM) kültür sirkadiyen gen ekspresyonu hücrelerdeki NMU tedavi normal birinci ve ikinci döngüleri doğru geri orta. MSC NMU tarafından kesintiye ritim geri kalmayıp Ayrıca SIRT1 inhibitörleri, Ex257 ve cambinol (şekil 3A-2) yıkıcı etkileri engelledi.

Stabil transfected hücrelerde, geçici transfectants (şekil 3B-1) gözlenen daha yüksek konsantrasyonlarda olsa, sirkadiyen ritim, NMU ve SIRT1 inhibitörleri bozdu. MSC (12,5 µM) geri 1 mM NMU (şekil 3B-2) ile ön işleme hücrelerdeki sirkadiyen ritim. Daha da önemlisi, MSC de sirkadiyen ritim EX257 de dahil olmak üzere SIRT1 inhibitörleri ile tedavi hücrelerdeki geri (40 nM) (şekil 3B-3) ve cambinol (2 µM) (şekil 3B(4)), anılan sıraya göre.

Şekil 3A ve şekil 3Barasında karşılaştırma, bioluminescence yoğunluğu çok daha yüksek oldu ama ritmi geçici transfected hücreleri daha kısa sürede vs stabil hücreleri transfected için kabul edildi (~ 10 kat daha yüksek, 2 kez daha kısa) içinde General, NMU veya MSC hücrelerle tedavi sonra bile. Buna ek olarak, hücresel sirkadiyen ritim 2 kat daha stabil transfected hücrelere göre geçici transfected hücrelerdeki kimyasallara maruz hassastı.

Hücresel sirkadiyen ritim kimyasallar tarafından nicel doz bağımlı Değiştir

Benzer şekilde, kesintiye hücresel sirkadiyen ritim stabil transfected hücrelerinin tedavi ile 1 mM NMU bir doz bağımlı şekilde (0-20 µM) NAC tedavi ile geri yüklendi (sirkadiyen dönemi (şekil 4B değişimler gibişekil 4A) ) ve fazlı (şekil 4 c).

Figure 1
Resim 1: İnsan PER2 organizatörü parçası ve sirkadiyen muhabir vektör dizisi. (A)insan PER2 organizatörü parçası (941 bp) sıralı, ve sıra işlevsel sirkadiyen organizatörü öğeleri için analiz edildi. E-box, CACGTT / CATGTG; sirkadiyen transkripsiyon sitesi, CCAATG artırılması; GC kutusu, CGCCCC / GGGGCGGG; site (TDH) başlayan transkripsiyon: CAGCGG. (B) istikrarsızlığın luciferase muhabir vektör, pGL şematik diyagramı [hPer2P/Luc2P/Neo]. Hale luciferase (dLuc) transkripsiyon hPER2 organizatörü altında doğrudan bir denetimdir. Bir ortak ifade paromisin direnç gen (Neo) G418 tarafından enfekte hücre seçimini kolaylaştırır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: Synchronization-in vitro hücresel sirkadiyen ritim farklı eşitleme ajanları tarafından. 24 saat açlıktan sonra geçici sirkadiyen muhabir vektör tarafından transfected MCF10A hücreleri her eşitleme aracı için 2 h, ışıma sinyal kaydederek takip ile tedavi edildi. Mavi, 10 µM forskolin; kırmızı, 1 nM melatonin; yeşil, 0,1 µM deksametazon; mor; % 50 at serum (HS); Deniz mavisi, % 100 SingleQuot (SQ); Sarı, boş vektör (negatif kontrol). X ekseni, zaman (gün); Y ekseni, bioluminescence (Say/dak). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: MSC geri hücresel sirkadiyen ritim NMU ve SIRT1 inhibitörleri meme epitel hücreleri tarafından kesintiye tüp bebek. Bioluminescence deneyleri MCF10A üzerinde gerçekleştirilen /PER2-dLuc muhabiri hücre % 50 ile eşitlemeden sonra HS. X ekseni, zaman (h) (post-NMU tesir süresi); Y ekseni, bioluminescence (Say/dak). (A)sonuçları geçici transfected hücrelerden. (1) hücreleri 0, 0.25 veya 0,5 mM NMU, 20 nM EX527 veya 1s eşitleme takip için 1 µM cambinol ile tedavi edildi. Sarı: kontrolü; Kırmızı: 0,25 mM NMU; Yeşil: 0,5 mM NMU; mavi: 20 nM EX527; sarı yeşil: 1µM cambinol. (2) hücreleri ile 12.5 µM MSC yalnız veya 20 nM EX527 veya aşağıdaki maruz orta: 0,5 mM NMU kayıt 1 µM cambinol ile tedavi edildi. Sarı: Kontrolü; Kırmızı: 0,25 mM NMU; Yeşil: 0,5 mM NMU; mavi: 0,5 mM NMU + 12.5 µM MSC; sarı yeşil: 0,5 mM NMU + 12.5 µM MSC + 20 nM EX527; mor: 0,5 mM NMU + 12.5 µM MSC + 1 µM cambinol. (B) sonuçlar stabil transfected hücrelerden. 3rd- gruplar arasında temiz ve berrak farklılıklar gösterdi 5inci doruklarına temsilcisi bir sonucu olarak sunulmaktadır. (1) hücreleri 0, 0,5, 1,0 ile tedavi veya 2.0 mM NMU, 40 nM EX527 veya 2 µM cambinol eşitlemeden sonra 1 h için. Sarı: Kontrolü; Kırmızı: 0,5 mM NMU; Yeşil: 1.0 mM NMU; mavi: 2.0 mM NMU; sarı yeşil: 40 nM EX527; mor: 2 µM cambinol. (2) hücreleri aşağıdaki maruz orta: 1.0 mM NMU kayıt 12.5 µM MSC ile tedavi edildi. Sarı: Kontrolü; Kırmızı: 1.0 mM NMU; Yeşil: 1.0 mM NMU + 12.5 µM MSC. (3) hücreleri ile 12.5 µM MSC aşağıdaki tedavi pozlama 40 nM EX257. Sarı: Kontrolü; Kırmızı: 40 nM EX257; Yeşil: 40 nM EX257 + 12.5 µM MSC. (4) hücreleri ile 12.5 µM MSC aşağıdaki tedavi 2 µM cambinol maruz. Sarı: Kontrolü; Kırmızı: 2 µM cambinol; Yeşil: 2 µM cambinol + 25 µM MSC. Bu sonuç daha önce bildirilmiş ve CC 2.022altında lisanslanmıştır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: NAC doz bağımlı hücresel sirkadiyen ritim NMU tarafından kesintiye restore. Hücreleri senkronizasyondan sonra 1.0 mM NMU veya 1 h için araç kontrolü ile tedavi edildi. (A)bioluminescence (Say/dak) saat (h) karşı temsilcisi sonucu. Sarı: Kontrolü; Kırmızı: 1.0 mM NMU; Yeşil: 1.0 mM NMU, 5 mikron NAC; mavi: 1.0 mM NMU, 10 µM NAC; sarı yeşil: 1.0 mM NMU, 20 µM NAC. (B) süre (saat). (C) (saat) aşama. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Memeli hücrelerinde sirkadiyen saat periyodik olarak birbirine bağlı transkripsiyon/translasyonel geribesleme döngüsü tarafından düzenlenir. Bmal1 heterodimers ve saat veya Npas2 düzenleyen ve çekirdek CGs, Per2 ve Cryve çok sayıda CCGs4de dahil olmak üzere E-box öğelerine bağlama tarafından sirkadiyen transkripsiyon. Onlar heterodimers, hücrede biriktikçe başına: Cry post-translationally değiştirilme tarihi ve saati: Bmal1 transkripsiyon faaliyet bastırmak için çekirdeği nakli. Bu negatif geribesleme çekirdek CGs kendi transkripsiyonu düzenleyen ve CGs ve CCGs23ritmik ifade ayarlamak için izin verir. En memeli hücreleri bir içsel sirkadiyen saat olmasına rağmen tek tek hücreleri içinde saatler koşulların her ikisi de iç tarafından (örneğin, redoks potansiyeli) senkronize edilebilir ve dış çevre uyaranlara24. Sirkadiyen gen ifade vivo melatonin, Yanıt Merkezi kalp pili (SCN) alınan sinyaller olarak epifiz bezi tarafından üretilen bir hormon tarafından senkronize edilebilir. SCN üzerinde özel melanospin ifade çarpan ışık sinyalleri entegre retina ışığa duyarlı retina ganglion hücrelerinin. Melatonin epifiz bezi serbest dolaşıma girer ve SCN sirkadiyen ritmini düzenler ve çoğu periferik vitro ve in vivo25,26hücreleri. Sirkadiyen ritim stres hormonları (örneğin, kortizol ve katekolaminler)27,28 ve büyüme faktörleri29,30tarafından düzenlenmiş olması. Büyüme faktörleri deregülasyon hücre büyüme ve farklılaşma31sirkadiyen bozulma ile ilişkili olduğu bilinmektedir.

Biz inşa sirkadiyen muhabir vektör bu olumsuz biyokimyasal geribildirim mekanizması kullanır. Transkripsiyon aktivatörleri, BMAL1 ve saat, sirkadiyen E/E´-box bağlayıcı motifler PER2 organizatörü ve repressors PERs ve olumsuz BMAL1 ifade düzenleyen CRYs bağlamak, çekirdek sirkadiyen negatif geri besleme döngüsü oluşur. Mevcut muhabir sistemi PER2 düzenleyici tarafından BMAL1 ve saat ritmik aktivasyonu istikrarsızlığın luciferase, ışıma sinyalleri bir daha doğru sirkadiyen periodicity için izin sirkadiyen ifade kolaylaştırır. Bir muhabir plazmid inşaat BMAL1 bağlama sitesi, sirkadiyen ritim arttırıcı sitesi, GC kutusu ve transkripsiyon başlangıç sitesi hPER2 düzenleyicinin içerir. Vektör hücresel otonomik sirkadiyen ritim transfected hücrelerdeki için gerçek zamanlı okuma için izin verir ve koşullar veya gen ekspresyonu bu endojen sirkadiyen deseninde değişiklik belirli ajanlar tanımlamak için kullanılan. Ancak, hücreler kültürlü vitro veya ex vivo, çalışırken kendi sirkadiyen osilatörler hızlı bir şekilde desynchronized olmak. Bu nedenle önce herhangi bir sirkadiyen deneyleri gerçekleştirilen vitroolabilir onların ritimleri yeniden eşzamanlı yapmak gereklidir. Meme epitel hücrelerinde bulduk %50 HS, melatonin ve % 100 SQ her başardık sirkadiyen ritim içinde vitroverimli eşitlenmesi ikna etmek. Deksametazon ve forskolin yalnızca kısmi eşitleme üretti. Doz bağımlı testleri geliştirme ve seçim yeni Eşitleme aracılarının gelecekteki çalışmaları için gerekli olacaktır. Eşitleme Aracısı, %50 HS sağlam ve tekrarlanabilir hücresel sirkadiyen ritim meme epitel hücreleri ve sinirsel üretilen bir etkili eşitleme Aracısı bulundu daha önce hücreleri gibi düşük maliyetli verimlilik ve geniş kullanımı göz önüne alındığında birçok diğer hücre tipleri ve farklı deneysel ayarlar24bildirdi.

Sirkadiyen yönetmelik in vitro modeli doğrulama için biz sonraki sirkadiyen ritim cevaben çevresel stres vitro etkileri özetlemek Eğer biz içinde vivogözlenen sordu. Daha önce biz NMU bir tek kanserojen doz büyük CGs (örneğin, Per2) sirkadiyen ifade kesintiye gösterdi ve hedef meme bezi içinde birkaç CCGs. Ayrıca, MSC chemopreventive bir rejim normal doğru Per2 ve CCGs genlerin sirkadiyen ifade sıfırlayın. Daha fazla toxicants o maruz hücre gösterdi ve stresler sirkadiyen gen ekspresyonu NAD+üzerindeki etkileri ile alter-bağımlı SIRT1 aktivite7,8,22. NMU o maruz gösterdi vitro sirkadiyen muhabir tahlil kullanarak elde edilen sonuçları hücresel sirkadiyen gen ekspresyonu yol açtı ve daha da ilginci, MSC yalnızca hücresel sirkadiyen ritim sıfırlamak mümkün değil tarafından bozdu NMU, ama aynı zamanda SIRT1 inhibitörleri tarafından bozulmuş sirkadiyen ritim sıfırlamak. Bu sonuçlar içinde vitro tahlil sadece sirkadiyen gen ekspresyonu NMU etkileri üretir, ama aynı zamanda SIRT1 bağımlı mekanizmaları yoluyla kesintiye sirkadiyen ritim in vivo MSC etkileri üretir belirtti. Vitro sirkadiyen muhabir sistem böylece çeşitli toxicants ve doğrudan inhibitörleri ve modülatörler dahil olmak üzere hücre seviyelerinde NAD+/NADH alter stresler algılamak potansiyeline sahiptir, hücresel Redoks genotoksik yanı sıra Bisiklete binme NAD+ Poli ADP-riboz bağımlı DNA via tüketmek ajanlar32onarın. Bu sonuçlar içinde vitro muhabir sistemi hücre koşulları ve bozabilir veya sirkadiyen gen yönetmelik in vivogeri kimyasal maddeler için ekran için yararlı bir araç sağlar öneririz.

Vitro tahlil geçici veya stabil sahip muhabir yapı transfected hücreleri kullanarak ayarlanabilir rağmen bazı farklılıklar yanıt geçici ve stabil transfected hücreleri arasındaki kimyasal tedavi olarak kaydedilmiştir. Stabil transfected hücreleri daha kimyasallar, tedaviye dirençli özellikle NMU ve SIRT1 inhibitörleri, geçici transfected hücreleri daha. Bu farklılıklar, düzenleme vektör düzenleyici etkileri nedeniyle istikrarlı transfectants içinde ince farklılıkları belirli Tümleştirme siteleri çevreleyen dizilerinden yansıtmak. Bu nedenle, antibiyotik tedavisi ile istikrarlı transfectants yelpazesi de sirkadiyen kesinti daha dayanıklıdır klonlar seçebilirsiniz. Bu nedenle, geçici veya sabit transfectants kullanarak bireysel vitro hücre modelleri yeteneklerini vivo yanıtları özetlemek için doğrulanması gerekir. Farklı transfection yöntemleri ise stres ve hücreleri ve sonucu toksisite çeşitli düzeylerde kimyasalların toksik etkileri farklı onların duyarlılık içinde da teşvik. Bu nedenle, sitotoksisite testi ve pilot deney transfection ve tedavi koşulları seçimi için gereklidir. Onların duyarlılık farkı rağmen bozulma ve hücresel sirkadiyen ritim restorasyonu için bizim meme epitel sirkadiyen muhabir hücreler kimyasallar tarafından elde edilen genel sonuçlar geçici tutarlı ve arasında karşılaştırılabilir transfected ve stabil transfected hücreleri ve sonuçları biz içinde vivogözlenen etkileri recapitulated.

Sirkadiyen muhabir vektör diğer hücre tiplerinde kullanılabilir eğer belirlemek için insan glioblastoma/tümörü hücreleri (U-87 MG) ile bu sirkadiyen vektör stabil transfected. Bu sinirsel kaynaklı tümör hücreleri bir düzenli ve güçlü hücresel sirkadiyen ritim bu insanda meme gözlenen karşılaştırılabilir belirlenmeden senkronizasyondan sonra vitro hücresel bioluminescence tahlil kullanarak ilk sonuçlar gösterdi epitel hücreleri. Hücreleri tedavi IC261 ile bir iyi bilinen inhibitörü olan kazein kinaz 1 δ (CK1δ) ve CK1 ε, gösterdi sirkadiyen uzun bir süre, ama daha düşük genlik olarak bildirilen by diğerleri (veri gösterilmez)33. Bu sonuçlar sirkadiyen luciferase muhabir vektör ve vitro hücresel bioluminescence tahlil olduğunu uygulanabilir sinir hücreleri de dahil olmak üzere diğer organ belirli hücrelerde gösteriyor.

Burada geliştirilen hücresel muhabir sistemi bu nedenle geniş bir vitro tahlil olarak farklı hücre tipleri sirkadiyen gen ifade tespiti için genel olarak kullanılabilir. Deneysel işlemin basit, hızlı ve güvenli. Ancak, bu hücresel muhabir sistem kolayca adapte olamaz transfect zor olan hücrelerde, Sigara bölen hücreleri (örneğin, nöronal hücre), onlar Rootkitler düşük transfection verimliliği beri. Transfection virüs tabanlı yöntemleri (örneğin, lentivirus transfection) bu hücreler34için daha yüksek bir verimlilik çözüm sunabilir. Ancak, zaman ve lentiviral üretimle ilişkili zorluk yapar bu yöntem zor ve zaman alıcı. Ayrıca, uygun güvenlik düzeyi laboratuvar üretim ve virüs kullanımı için gereklidir. Buna ek olarak, yüksek çözünürlüklü tek hücre ışıldama dedektörleri sirkadiyen gen ekspresyonu hücreleri35sigara bölme içinde kalıcı, bağımsız olarak aşamalı ritimlerin belirlenmesi için kullanılabilir.

Memeli sirkadiyen ritim in vivo çalışmalar sadece emek yoğun ve pahalı, ama onlar da hayvanlar çok sayıda ihtiyaç vardır. Vitro sistemleri kullanılabilirliğini önemli ölçüde sirkadiyen gen ekspresyonu bozulma ve kronik hastalıkların gelişme arasındaki ilişkileri test etmek için gerekli hayvan sayısını azaltmak olabilir ve metabolik karsinojenezis dahil olmak üzere sendromu. Nicel veri dönemi, genlik ve faz, gibi sirkadiyen Parametrelerdeki doz - ve/veya saat-bağımlı etkilerini kimyasallar hücresel sirkadiyen ritim bilgilendirebilir. Örneğin, NAC doz bağımlı dönemi ve hücresel sirkadiyen ritim NMU tarafından kesintiye aşaması geri yükleyebilirsiniz Bu antioksidan görülmektedir. Vitro modeli de ekran ve çevre sirkadiyen bozucular sınıflandırmak için ve mekanik anlayışlar için geliştirme sağlayan hücresel fonksiyon bozukluğu kesintiye sirkadiyen ritim etkisini araştırmak için kullanılabilir müdahale stratejilerinin tabur meme kanseri, metabolik sendromlar ve nörofizyolojik bozukluğu, anormal iş programları yüzünden artan riski için.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Bu eser 2012 toplum, toksikoloji (SOT tarafından) desteklenen-Colgate Palmolive Grant değiştirici araştırma (M. Fang) ve uluslararası işbirliği araştırma fonu hayvan ve bitki karantina ajansı, Kore (M. Fang), ve NIEHS vermek P30ES005022 (H. Zarbl). Biz Dr Zheng Chen (McGovern Tıp Fakültesi Üniversitesi'nde Teksas Sağlık Bilimleri Merkezi Houston) teşekkür etmek için Bay Shao-An Juan yaptığı deneysel yardım için ve Bayan Kimi Nakata onun kanıt okumak için yararlı onun tartışma istiyorum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pLS[hPER2P/rLuc/Puro] vector SwitchGear Genomics S700000 customized vector
pGL4.18[Luc2P/Neo] vector Promega 9PIE673 destabilized luciferase expression vector
T4 DNA ligase Invitrogen 15224041 For subcloning
TOPO TA cloning kit Invitrogen K4500-02 with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli
Sac I New England BioLabs R0156S Restriction enzyme
Hind III-HF New England BioLabs R3104S Restriction enzyme
CutSmart buffer New England BioLabs B7204S Restriction enzyme buffer
DNA gel extraction kit Qiagen 28704 Purify DNA fragments from agarose gel
PCR Purification Kit Qiagen 28104 DNA clean up
LB Miller's modification TEKNOVA L8600 For transformed E. Coli culture
LB Agar Plate TEKNOVA L1902 For white/blue selection
QIAprep spin miniprep Kit Qiagen 27104 For extraction of plasmide DNA
EndoFree plasmid maxi prep Kit Qiagen 12362 For extraction of plasmide DNA
FuGene HD Promega E2311 Transfection reagent
Opti-MEM reduced serum medium Invitrogen 31985-062 For transfection
MCF10A cell line American Type Culture Collection CRL-10317 Mammary Epithelial Cells
MEGM BulletKit Lonza CC-3150 Mammary Epithelial Growth Medium
MEBM Lonza CC-3151 Mammary Epithelial Basal Medium
MEGM SingleQuot Kit Lonza CC-4136 Suppliments & Growth Factors
ReagentPack Lonza CC-5034 Reagent for subculture
D-PBS (10X) Sigma D1408 Wash cells in culture dishes
UltraPure Distilled Water Invitrogen 10977 Dilute 10X D-PBS
Tissue culture dish (35 mm) BD/Falcon 353001 cell culture dish suitable to LumiCycle
Silicon grease Fisher NC9044707 For sealing dish with recording medium
Round cover glass Harvard Bioscience 64-1500 (CS-40R) For sealing dish with recording medium
Cholera toxin Sigma C8052 Supplement for growth medium
G418 sulfate (Geniticin) Invitrogen 10131035 Antibiotic for selection of stabliy transfected cells
Ampicillin Sigma A9393 For colony selection
Forskolin Sigma F6886 Synchronization agent
Melatonin Sigma M5250 Synchronization agent
Dexamethasone Sigma D4902 Synchronization agent
Horse serum Sigma H1138 Synchronization agent
d-Luciferin, sodium salt Invitrogen L2912 Luciferase substrate
IC261 Sigma 10658 Positive control for circadian disruptor
Methylnitrosourea (NMU) Sigma N1517 Mammary specific carcinogen
Methylselenocysteine (MSC) Sigma M6680 Organic selenium (chemopreventive agent)
EX527 Sigma E7034 SIRT1 specific inhibitor
Cambinol Sigma C0494 SIRT1 & SIRT2 inhibitor
NanoDrop Spectrophotometer Thermo Scientific NanoDrop 8000 Quantify nucleotide
GeneAmp PCR System 9700 Applied Biosystems N805-0200 For molecular biology experiment
CO2 Incubator NAPCO Series 8000 DH For cell culture at 5% CO2 at 37 °C
Desktop centrifuge with refrezerator Eppendorf 5430R For molecular biology experiment
Centrifuge with swing bucket Eppendorf 5810 R For cell culture
Inverted microscope Nikon 80124 Phase contrast optional
Tissue culture hood Labconco Class II A2 BSL-2 certified
LumiCycle 32 Actimetrics Not Available Luminoscence detector

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Akerstedt, T., et al. Night work and breast cancer in women: a Swedish cohort study. BMJ Open. 5, (4), e008127 (2015).
  2. Parent, M. E., El-Zein, M., Rousseau, M. C., Pintos, J., Siemiatycki, J. Night work and the risk of cancer among men. Am J Epidemiol. 176, (9), 751-759 (2012).
  3. Knutsson, A., et al. Breast cancer among shift workers: results of the WOLF longitudinal cohort study. Scand J Work Environ Health. 39, (2), 170-177 (2013).
  4. Fu, L., Lee, C. C. The circadian clock: pacemaker and tumour suppressor. Nat Rev Cancer. 3, (5), 350-361 (2003).
  5. Fu, L., Kettner, N. M. The circadian clock in cancer development and therapy. Prog Mol Biol Transl Sci. 119, 221-282 (2013).
  6. IARC. Painting, Firefighting, and Shiftwork. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. 98, 563-764 (2010).
  7. Zhang, X., Zarbl, H. Chemopreventive doses of methylselenocysteine alter circadian rhythm in rat mammary tissue. Cancer Prev Res (Phila Pa). 1, (2), 119-127 (2008).
  8. Fang, M. Z., Zhang, X., Zarbl, H. Methylselenocysteine resets the rhythmic expression of circadian and growth-regulatory genes disrupted by nitrosomethylurea in vivo. Cancer Prev Res (Phila). 3, (5), 640-652 (2010).
  9. Burbulla, L. F., Kruger, R. Converging environmental and genetic pathways in the pathogenesis of Parkinson's disease. J Neurol Sci. 306, (1-2), 1-8 (2011).
  10. Aitlhadj, L., Avila, D. S., Benedetto, A., Aschner, M., Sturzenbaum, S. R. Environmental exposure, obesity, and Parkinson's disease: lessons from fat and old worms. Environ Health Perspect. 119, (1), 20-28 (2011).
  11. Nagoshi, E., Brown, S. A., Dibner, C., Kornmann, B., Schibler, U. Circadian gene expression in cultured cells. Methods Enzymol. 393, 543-557 (2005).
  12. Ramanathan, C., et al. Cell type-specific functions of period genes revealed by novel adipocyte and hepatocyte circadian clock models. PLoS Genet. 10, (4), e1004244 (2014).
  13. Sporl, F., et al. A circadian clock in HaCaT keratinocytes. J Invest Dermatol. 131, (2), 338-348 (2011).
  14. Zhang, E. E., et al. A genome-wide RNAi screen for modifiers of the circadian clock in human cells. Cell. 139, (1), 199-210 (2009).
  15. Yoo, S. H., et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, (15), 5339-5346 (2004).
  16. Leclerc, G. M., Boockfor, F. R., Faught, W. J., Frawley, L. S. Development of a destabilized firefly luciferase enzyme for measurement of gene expression. Biotechniques. 29, (3), (2000).
  17. Genomics, S. Technical Note: SwitchGear methods for gene model construction and transcription start site prediction. (2009).
  18. Scientific, F. Safety Data Sheet: Ethidium bromide, 1% Solution/Molecular Biology. (2010).
  19. Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. Current Protocols in Molecular Biology. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience. New York. (1994).
  20. Yoo, S. H., et al. A noncanonical E-box enhancer drives mouse Period2 circadian oscillations in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, (7), 2608-2613 (2005).
  21. Chen, Z., et al. Identification of diverse modulators of central and peripheral circadian clocks by high-throughput chemical screening. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (1), 101-106 (2012).
  22. Fang, M., Guo, W. R., Park, Y., Kang, H. G., Zarbl, H. Enhancement of NAD+-dependent SIRT1 deacetylase activity by methylselenocysteine resets the circadian clock in carcinogen-treated mammary epithelial cells. Oncotarget. (2015).
  23. Chen-Goodspeed, M., Lee, C. C. Tumor suppression and circadian function. J Biol Rhythms. 22, (4), 291-298 (2007).
  24. Balsalobre, A. Clock genes in mammalian peripheral tissues. Cell Tissue Res. 309, (1), 193-199 (2002).
  25. Jung-Hynes, B., Huang, W., Reiter, R. J., Ahmad, N. Melatonin resynchronizes dysregulated circadian rhythm circuitry in human prostate cancer cells. J Pineal Res. 49, (1), 60-68 (2010).
  26. von Gall, C., et al. Melatonin plays a crucial role in the regulation of rhythmic clock gene expression in the mouse pars tuberalis. Ann N Y Acad Sci. 1040, 508-511 (2005).
  27. Vujovic, N., Davidson, A. J., Menaker, M. Sympathetic input modulates, but does not determine, phase of peripheral circadian oscillators. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 295, (1), R355-R360 (2008).
  28. Schofl, C., Becker, C., Prank, K., von zur Muhlen, A., Brabant, G. Twenty-four-hour rhythms of plasma catecholamines and their relation to cardiovascular parameters in healthy young men. Eur J Endocrinol. 137, (6), 675-683 (1997).
  29. Yu, H., et al. Circadian rhythm of circulating fibroblast growth factor 21 is related to diurnal changes in fatty acids in humans. Clin Chem. 57, (5), 691-700 (2011).
  30. Nakagawa, H., et al. Modulation of circadian rhythm of DNA synthesis in tumor cells by inhibiting platelet-derived growth factor signaling. J Pharmacol Sci. 107, (4), 401-407 (2008).
  31. Yang, X., Guo, M., Wan, Y. J. Deregulation of growth factor, circadian clock, and cell cycle signaling in regenerating hepatocyte RXRalpha-deficient mouse livers. Am J Pathol. 176, (2), 733-743 (2010).
  32. Virag, L. Structure and function of poly(ADP-ribose) polymerase-1: role in oxidative stress-related pathologies. Curr Vasc Pharmacol. 3, (3), 209-214 (2005).
  33. Kon, N., Sugiyama, Y., Yoshitane, H., Kameshita, I., Fukada, Y. Cell-based inhibitor screening identifies multiple protein kinases important for circadian clock oscillations. Commun Integr Biol. 8, (4), e982405 (2015).
  34. Ramanathan, C., Khan, S. K., Kathale, N. D., Xu, H., Liu, A. C. Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters. J Vis Exp. (67), e4234 (2012).
  35. Welsh, D. K., Yoo, S. H., Liu, A. C., Takahashi, J. S., Kay, S. A. Bioluminescence imaging of individual fibroblasts reveals persistent, independently phased circadian rhythms of clock gene expression. Curr Biol. 14, (24), 2289-2295 (2004).
<em>Vitro</em> Sirkadiyen ritim meme epitel hücreleri ayırdetmek için bioluminescence tahlil
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fang, M., Kang, H. G., Park, Y., Estrella, B., Zarbl, H. In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (127), e55832, doi:10.3791/55832 (2017).More

Fang, M., Kang, H. G., Park, Y., Estrella, B., Zarbl, H. In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (127), e55832, doi:10.3791/55832 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter