Summary
이 원고는 고해상도 스펙트럼 도메인 광학 일관성 단층 촬영 (SD-10 월)와 마우스 망막의 비보에 이미징에 대 한 프로토콜을 설명합니다. 그것은 몇 가지 검색 및 측정 방법 설명 peripapillary 지역에서 망막 신경 절 세포 (RGC)에 초점을 맞추고.
Abstract
망막에 구조 변경 안과 질병의 일반적인 발현 됩니다. 광학 일관성 단층 촬영 (OCT) 그들의 식별에서 비보에있습니다-빠르게, 반복적으로, 그리고 높은 해상도. 이 프로토콜 광섬유 neuropathies (OPN)를 공부 하는 강력한 도구로 마우스 망막에 10 월 영상을 설명 합니다. OCT 시스템은 일반적인 사후 조직학 분석을 간섭계 기반, 비-침략 적 대안 이다. 그것은 망막 엷게 또는 두껍게 등의 변경 내용을 추적 하는 가능성을 허용 하는 망막 두께의 신속 하 고 정확한 평가 제공 합니다. 선물이 Opa1delTTAG 마우스 라인의 예제와 이미징 프로세스 및 분석. 세 가지 유형의 스캔, 정량화 방법으로 두 제안: 표준 및 수 제 캘리퍼스. 후자는 peripapillary 망막에서 사용 하기 위해 최고의 동안 방사형 검사; 더 정확 하 게 되 고, 하는 것이 얇은 구조를 분석 하는 데 좋습니다. 여기에 설명 된 모든 접근 하지만 망막 신경 절 세포 (RGC) 설계는 다른 세포 인구에 쉽게 적응할 수 있다. 끝으로, 10 월 마우스 모델 형질에 효율적 이며 치료 개입의 신뢰할 수 있는 평가 위해 사용 될 가능성이 있다.
Introduction
10 월 망막 구조1, 시 신경 머리 (ONH) 등의 검사를 용이 하 게 하는 진단 도구입니다. 년 동안 인간2,3, 설치류4,5에서 뿐만 아니라 질병 진행의 신뢰할 수 있는 표시기 되고있다. 간섭계를 사용 하 여 2 µ m 축 해상도 망막 층의 단면 이미지를 만듭니다. 안쪽 층은 망막 신경 섬유 (RNFL), 포함 된 레이어 RGC 축 삭, 신경 절 세포 레이어 (GCL), 주로 RGC 시체를 포함 하 여 뒤. 다음은 내부 plexiform 계층 (IPL), RGC dendrites 바이 폴라, 수평, 그리고 amacrine 세포 축 삭을 만나는 곳입니다. 가로 셀, 함께이 형성 안 핵 층 (INL), 그리고 그들의 돌출 외부 plexiform 레이어 (OPL) 축 삭 포토 리셉터와 연결. 이 포토 리셉터 세포 기관과 외부 핵 층 (ONL), 뒤 및 외부 제한 막 (옴), 내부 세그먼트/외부 세그먼트 라고도 포토 리셉터 계층에서 분리 (IS / OS) 계층. 마지막으로, 마우스 망막에 마지막 관찰 레이어는 망막 안료 상피 (RPE) 및 맥락 막 (C). 혼자 RNFL은 일반적으로 너무 얇은 쥐;에서 측정 따라서, 낫4,5는 대신 RNFL/GCL을 분석입니다. 또 다른 가능성은 IPL 뿐만 아니라 후자 포함 된 GC 복잡 한 레이어, 두꺼운 고 따라서 더욱 쉽게 10 월 측정 스캔4. 따라서, 10 월에 OPNs와 같은 망막의 병 적인 상태에 대 한 통찰력을 제공할 수 있습니다.
또는, 마우스 망막의 두께 종종 사후 조직학으로 분석 했다. 그러나,이 기술은 얼굴 제한 관련 된 조직 수집, 고정, 절단, 얼룩, 장착, 등 그러므로, 미묘한 두께 변화 등 몇 가지 결함이 감지할 수 없습니다. 마지막으로, 같은 마우스 테스트할 수 없습니다에서 여러 시간 때문에 점, 당 동물의 수 공부 크게 증가와 달리 10 월. 모두 모두, 반복에 대 한 비 침해, 고해상도, 가능성, 시간 시간, 및 10 월 기술 사용의 용이성에 모니터링 할 선택의 방법 망막 질병 연구에.
마우스 모델은 유전자 결함을 식별 하 고 retinopathies6기본 분자 메커니즘을 명료 하 게 하는 데 사용 됩니다. OPN는 약 1.2 백만 RGC axons 이루어져 있다 (에), 망막 시 신경에 상당한 손상의 형태입니다. OPN ON에 집중 될 수 있다 또는 선도 시야 손실 후, 실명 아닌7또는 다른 장애, 선천적인된 보조 수 있습니다. OPN의 특성을 특성 RGC 손실 되며 손상에는 관찰 될 수 있다 인간 10 월에 RNFL와 GCL 숱이2,3. 한편, OPN의 이상, 아직도 제대로 이해 하 고 따라서 마우스 망막 테스트 필요가 남아 있다.
이 원고는 이미징 및 Opa1delTTAG 마우스 선8,9, 지배적인 광섬유 위축 (DOA)10모델의 예를 사용 하 여 망막 층 두께의 정량화를 설명 합니다. RGC 이상 평가, 방사형, 직사각형, 그리고 환상 검사 정량 했다. 이것은 10 월 소프트웨어에서 제공 하는 표준 캘리퍼스 또는 오픈 소스 이미지 처리 프로그램 개발 만든 매크로 이루어졌다. 만든 캘리퍼스는 사용 하기 쉬운, 재현, 그리고 더 정확 하 게 표준 캘리퍼스 조작 하기 어렵고 종종 RNFL/GCL, 보다 두꺼운 있습니다. 매크로 5 포인트에서와 peripapillary 지역에서 ONH의 양쪽에 고정된 위치에서 자동으로 검색 된 계층에 대 한 측정을 수행합니다. 제시 프로토콜의 목표 10 월 스캔 수집 RGCs에 초점을 맞춘 망막 위치 지정을 설명 하는입니다.
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Protocol
실험 프로토콜 인 국립 드 라 건강에 의해 승인 되었다 동부 표준시 드 라 검색 médicale (Inserm; 몽펠리에, 프랑스), 유럽 지침과 일치 이며 ARVO 문을 안과 연구에 있는 동물의 사용에 대 한 준수. 랑 그 독 루시 옹 예 윤리 동물 실험 (CEEALR; nuCEEA-LR-12123)의 계약에 따라 실시 됐다.
1. 장비 설치 및 사전 영상 준비
참고: 여기, 10 월 스펙트럼 도메인 (SD) 안과 이미징 시스템 ( 그림 1A)를 사용 하 여 마우스 망막에서 수행 되었다. SD-10 월 장치 설치류 맞춤 단계 (RAS) ( 그림 1B)는 기지와 동물 이미지 마운트 (AIM)의 구성 됩니다. 기본은 컴퓨터, OCT 엔진, SD 10 월 조사 및 마우스 전용 렌즈 포함 됩니다. 프로브는 Z-번역기를 포함 하는 목표에 거치 된다. RAS는 마우스와 X-및 Y-번역, 테이블 덕분에 올려지고, 회전 수 있는 카세트 위치와 이동식 물린 바 코 밴드와 함께 사용 됩니다. 비록 후자 또한 할 수 있습니다 오픈 소스 이미지 프로세싱 프로그램 제조업체에서 제공 하는 소프트웨어 수집 및 OCT 파일의 분석에 대 한 수 있습니다.
- 단단히 목표에 프로브를 배치.
- 프로브를 연결 하는 마우스 전용 렌즈.
- 특정 렌즈 (여기, 086에서 964에 위치)에 대 한 참조 팔 설정을 조정.
- 만들기 있는지 마우스 전용 렌즈 충분히 먼에서 카세트, 카세트에 코 밴드와 함께 물린 바 첨부.
참고: 렌즈와 카세트 사이의 거리는 목표의 뒤에 위치한 Z 번역기 나사와 조정할 수 있다. 코 밴드 상용 탄성 밴드 이며 장력은 마우스의 크기에 따라 조정 되어야 합니다. - 전원 공급 장치 (손수레의 하단 오른쪽 모서리) 및 다음 컴퓨터를 켭니다.
- 이미징 프로그램을 실행 하는 화면에서 해당 바로 가기를 두 번 클릭.
참고:이 렌즈; 종류에 따라 다릅니다. 여기, 마우스 망막. - 새로운 임상 연구 만들고 원하는 프로토콜을 추가 합니다. 그렇지 않으면, 기존 임상 연구 및 프로토콜을 사용 하 여.
- 선택 하 여 새로운 연구를 추가 " 연구 NameŔ " IDŔ " 치료 팔 사양 " (여기, " 분류 "); 미리 정의 된 " 검색 프로토콜 ", 그들이 존재 하는 경우.
- 선택 된 " 심사 관 "에 " 임상 연구 " 섹션.
참고:에 대 한 새로운 " 심사 관 ", 이동 " 설치 심사 관 & 의사 " 그것을 정의 하려면 - 추가 환자/시험에서 새로운 환자 섹션 추가 환자에 클릭 하 여, 입력은 " ID ", " 이름 ", " 성 ", " 섹스 ", 및 " 생년월일 " (선택 사항).
참고: 이렇게 각 마우스 테스트 직전 경우 더 편리 합니다. ID는 10 자 보다는 더 이상 다는 것을 확인 하십시오. 마우스를 두 눈에 대 한 굴절 과실은 0 축 길이 이며 23.0. - 클릭 " 추가 시험 " 원하는 선택 하 고 " 프로토콜 " 추가 하 여 " 검사 미리 " 먼저 측정 됩니다 눈 시작 (여기, 오른쪽 눈), 목록에서 또는 검사를 사용자 지정 하 여.
- 검사를 사용자 지정 하는 기존 스캔의 템플릿으로 사용 및 편집, 하거나 통해 처음부터 그것을 만들는 " 추가 사용자 정의 스캔 " 옵션. 모든 검사를 목록에 추가한 후 사용 하 여 새 프로토콜 정의 " 입력 " 새로운 프로토콜 이름 " 옵션 (OS: 쏟아지는 불길 한, 왼쪽 눈; OD: 쏟아지는 덱스터, 오른쪽 눈).
참고: 여기, 프로토콜 포함 3 검사: (i) 방사형 스캔, 1.4 m m 직경, 0 mm 수평 및 수직 오프셋, A-스캔/B-스캔, 100 B-스캔/볼륨, 1 프레임/B-스캔, 80 개의 비활성 A-검사/B-스캔, 그리고 1 볼륨; 1000 라인 (ii) 직사각형 스캔, 1.4 m m 길이 폭, 0 ° 각도, 0 mm 가로 및 세로 오프셋, A-스캔/B-스캔, 스캔-100 B, 1 프레임/B-스캔, 80 개의 비활성 A-검사/B-스캔, 그리고 1 볼륨; 1000 라인 그리고 (iii)는 환상 스캔, 0.4 m m 최소 및 0.6 m m 최대 직경, 0 mm 수평 및 수직 오프셋, A-스캔/B-스캔, 3 B-스캔/볼륨, 48 프레임/B-스캔, 80 개의 비활성 A-검사/B-스캔, 그리고 1 볼륨의 1000 라인.
2. 마우스 준비
- 눈 팽창 및 동원 정지
- 데이터 수집 전에 적어도 15 분 마우스 눈으로 10 %phenylephrine 안 약 한 방울 씩, 초과, 제거 하 고 0.5 %tropicamide 안 약 한 방울 씩.
참고: 첫 번째 팽창 세션에서 시험 될 것 이다 모든 쥐에 대 한 한 번에 할 수 있습니다. 실내 온도에 액체는 있는지 확인 하십시오. - 즉시 유도 전신 (2.2 단계), 0.4 %oxybuprocaine 염 산 염 점 안 액, 3에 대 한 장소에서 그들을 유지 관리 anesthetize 눈을 고정 하는 s. 나중에, 방울을 닦아 내 고 눈은 잘 열려진 확인 phenylephrine, 0.5 %tropicamide 10%의 문제를 반복.
참고: 실내 온도에 액체는 고 마우스는 oxybuprocaine 삼 키 지 하지 않습니다 있는지 확인 하십시오.
- 데이터 수집 전에 적어도 15 분 마우스 눈으로 10 %phenylephrine 안 약 한 방울 씩, 초과, 제거 하 고 0.5 %tropicamide 안 약 한 방울 씩.
- 전신
- 염 분에 케 타 민 (20 mg/mL) 및 xylazine (1.17 mg/mL)의 마 취 솔루션을 준비. 2 주 최대 4 ° C에서 저장소.
- 테스트를 하기 전에 약 5 분 intraperitoneally 주사 마 취 솔루션 신체 질량, 나이 및 마우스의 크기에 따라 1 g 당 5-10 µ L.
참고: 영 또는 얇은 마우스 필요 덜 취, 적은 시간이 걸릴 anesthetize, 하지만 또한 빨리 각 성. 여기, 8 µ L/g (160 mg/kg의 케 타 민, xylazine의 9.33 mg/kg). - 필요에 따라 점 안 약 이나 각 막 건조를 피하기 위해 안과 젤으로 눈에 기름칠.
3. 마우스 위치
- 점성 글리콜 기반 눈으로 눈 각 막 수 화를 제공 하기 위해 상품 Lubricate.
참고: 보이는 경우에 눈 건조 시험 중,는 다시 적용 한다 눈 방울. - 외과 거 즈 그것을 따뜻하게의 시트에서 마우스를 포장.
- 0.3 %hypromellose 각 눈에는 눈 젤의 얇은 층을 적용 스폰지 또는 목화 심지를 사용 하 여, 빛의 굴절을 최소화 하기 위해 불투명도와 안전한 각 막 수 화 피. 이렇게 하는 동안 속눈썹과 수염 옆으로 이동.
- 머리 직선과 포인팅 앞으로 카세트에 마우스 위치.
- 부드럽게 물린 바 클램프를 열고 입에 막대 배치; 코 밴드를 사용 하 여 보안 위치.
참고: 물린 바 카세트 중간 인지 확인. - 장소 오른쪽 (왼쪽된) 눈 테스트 하는 경우 (왼쪽된) 오른쪽 아래는 면 롤.
- 마우스 전용 렌즈에 클립 목표로 팁을 유지 하면서가지고 그것은 눈으로 Z-번역기 나사를 시계 반대 방향으로 회전 하 여.
- 회전 하 고 카세트를 회전 시키는 고 여 물린 바와 X-번역기 나사 미리 설정 마우스의 위치, 목표 오른쪽 눈 모양을 직접 렌즈에 그리고 이렇게 하는 눈과 렌즈의 광 축 정렬.
참고: 마우스 너무 높이 또는 너무 낮게 경우 Y 번역기 나사 사용 해야 먼저. - 선택에서 첫 번째 검사는 " 시험 ", 클릭 " 목표로 시작 ", 고 망막 화상 진 찰에 대 한 추가 수동 조정.
- 왼쪽된 패널 ( 그림 2, 가로 B-스캔 정렬)에 맞추고, 가로 r에 수직으로 망막을 이동 Z-번역기 나사를 사용 하 여항공 패널 ( 그림 2, 수직 B-스캔 정렬).
- 는 ONH 위나 아래로 이동 하 여 오른쪽 패널 중간 ONH 려 카세트 회전. 오른쪽 패널에 망막을 물린 바 나사를 사용 합니다. 회전 위치 왼쪽된 패널 중간 ONH 카세트.
- X 번역기 나사를 사용 하 여 왼쪽된 패널에 망막 수준. 더는 ONH 중앙 망막의 위치를 조정 각 변조기의 주요 기능을 명심.
참고: 필요한 경우 오른쪽 패널에는 ONH를 아래로 이동 하려면 Y-번역기 나사를 사용 합니다. 위치는 언제 든 지 검사 사이의 세련 된 수 있습니다.
4. SD-10 월 ONH 및 망막의 이미징
- 일단 조정 된 콘텐츠를 클릭 " 스냅숏 시작 " SD 10 월 스캔 시작.
- 3D 이미징, 필요 없는 경우 OCU 옵션의 선택을 취소.
- 스캔 및 보고서 저장.
- 다음 스캔 진행.
- 이미지 두 번째 눈, 렌즈를 제거 후 카세트 따라 바뀌고 반복 단계 3.6-4.3.
5. 수집 완료
- 마지막 인수 후 소프트웨어를 닫고 컴퓨터와 OCT 시스템 (전원 공급 장치 단추) 전환.
- 청소 살 균 제 카세트.
6. 분석
- 망막 레이어 두께 측정에 대 한 제조 업체에서 제공 하는 자동된 분할 소프트웨어를 사용 하 여.
- 클릭는 " 환자 ", 원하는 선택 " 시험 "에서 목록, 그리고 클릭은 " 검토 시험 " 옵션.
- 원하는 스캔에서 폴더 아이콘을 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 여 10 월 소프트웨어에 원하는 10 월 데이터를 로드.
- 오른쪽 클릭 B-스캔, 최대 10 캘리퍼스;를 측정 함으로써는 캘리퍼스를 구성 하 고, 그들의 이름, 각도, 색상을 입력.
- 적절 하 게 배치 B-스캔;에 마우스 오른쪽 버튼으로 원하는 캘리퍼스를 선택 측정에 대 한 망막에.
참고: 검사는 ONH 중심으로 서로 등거리 그것의 각 측에 5 캘리퍼스를 설정 합니다. Peripapillary 분석은 캘리퍼스는 ONH에서 너무 멀리 배치 되지 않습니다 있는지 확인 합니다. 방사형 스캔, 스캔 당 10 월 소프트웨어에 의해 선택 되었다 10 사진을 분석. 그들의 숫자에서 찾을 수 있습니다는 " 보고서 " 폴더. - B-스캔을 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 클릭 하 여 스프레드시트 소프트웨어 프로그램에서 분석 결과 저장 " 결과 저장 ".
참고: 결과 검색 데이터와 같은 폴더에 찾을 수 있습니다.
- 또는 만든 캘리퍼스 매크로 사용 하 여 " MRI 망막 도구 ", 오픈 소스 이미지 처리 프로그램 개발 (재료의 표 참조).
- 있는지 확인 하는 " MRI 망막 도구 "와 " 다각형 섹션 도구 수정 " 매크로 활성화. 이미지를 로드 합니다. 측정을 시작 하는 m 버튼을 클릭.
참고: 매크로 자동으로 생성 한 0.2 m m 긴 카세트는 ONH의 양쪽 모두를 측정. 각 카세트 캘리퍼스로 5 측정 포인트 기능을 포함합니다. 그들의 측면 위치 변경 가능 하 고 광선 검사에서 peripapilla에 대 한 사용자 지정. RNFL/GCL 두께 측정 하는 카세트의 수평 위치를 미리 정의 된 하지만 대신 GC 복잡 한 레이어를 측정 하기 위해 쉽게 수정 가능. 면 스캔 품질이 가난, 수평 위치 조정 될 필요가 또는 그림 분석에서 제외할 필요가. - 수평 조정에 대 한 e 버튼을 클릭. 새롭게 문을 연에서 " ROI 관리자 " 창 첫 번째 카세트를 선택 하십시오.
- 블루 다각형을 클릭 버튼을 그림에서 측정 된 레이어의 테두리를 클릭 하 여 첫 번째 카세트의 위치를 조정.
- 두 번째 반복에서 첫 번째 선택 하 여 카세트는 " ROI 매니저 " 창 고 적절 한 이미지에 클릭. 다시 측정 하기 위해 r 버튼 클릭 합니다. 보기에서 결과 " 측정 " 창.
참고: 결과 수 있습니다 복사 스프레드시트 소프트웨어 프로그램을 언제 든 지. 그들은 바로 카세트 (r), 왼쪽된 카세트 (l), 및 합계에 대 한 다음 값 포함: Intden-카세트; 내 통합된 밀도 위치: 측정, m m 2; Mm; 카세트 내 캘리퍼스의 Len: 길이 평균: 카세트; 내 신호의 강도 의미 그리고 성병: 신호의 평균 농도의 표준 오차. - 다음 이미지로 진행.
- 추가 스프레드시트 소프트웨어 프로그램에서 데이터를 분석.
참고: 층의 평균 두께 찾으려면 걸릴 10 Len 값.
- 있는지 확인 하는 " MRI 망막 도구 "와 " 다각형 섹션 도구 수정 " 매크로 활성화. 이미지를 로드 합니다. 측정을 시작 하는 m 버튼을 클릭.
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Representative Results
SD-10 월 기술 망막 상상 및 두께 조직학, 비교 하지만 빠른 분석과 더 자세한 (그림 3) 수 있습니다. 제시 wildtype C57Bl/6 마우스, 비록 SD 10 월 스캔의 품질 (그림 3A, 오른쪽)은 (그림 3A, 왼쪽) 망막 횡단면의 이미지의 좋은, 그것은 더 많은 레이어 (예: 옴)을 시각화. 또한, 그것은 일 또는 조직학 분석을 위한 주 대 마우스 준비를 포함 하 여 약 40 분 걸립니다. 마지막으로, 처리 및 등 haematoxylin, 오신, 사프란, 조직을 손상 하 고 잘못 된 데이터의 수집을 유발 수 있습니다, 얼룩이 지기 요구 하지 않는다. 10 월에서 쉽게 측정 망막 레이어 포함 RNFL/GCL, IPL, INL, OPL, ONL, IS / OS, RPE, 및 C (그림 3B), 따라서 전체 망막의 복잡 한 연구에 대 한 허용. 따라서, 망막 변화 질병 개발을 반영합니다. OPNs, 경우이 RGCs에, 그리고 따라서 RNFL/GCL과 IPL에 적용 됩니다.
DOA 가장 일반적인 OPNs 중 하나 이며 RGC 퇴보와 RNFL11의 손실에 의해 특징입니다. OPA1 유전자12에 돌연변이, 때문에 그것은 시각 장애 및 실명을 리드. 인간의 재발 c.2708delTTAG 돌연변이 운반, Opa1delTTAG 마우스 모델을 사용 하 여 Opa1 haplo-부족 섹스 의존 방식으로8,9에서 비전을 방해 발견 했다. 이것은 GC 복잡 한 레이어 (그림 4A)와 (그림 4B, 4c) RNFL peripapillary의 진보적인 두껍게 Opa1+ 여성에서 보여준 망막 두께의 10 월 측정 기준 결정 했다. 이 실험에서 계산 직사각형 검사에 대 한 표준 캘리퍼스와 환상 스캔 프로그램 처리 오픈 소스 이미지를 완료 했다. 방사형 검사, 자주는 낮은 품질과 생산 분석, 직접 만든 매크로 대 한 망막 당 10 이미지의 최소 개발 되었다 있다. 표준 및 수 제 캘리퍼스 (그림 4D)의 비교 RNFL/GCL 및 GC 복잡 한 레이어 후자와 측정의 상당히 낮은 두께 보였다. 이 때문에 표준 캘리퍼스는 훨씬 두꺼운 레이어의 테두리에 더 어렵습니다. 따라서, 방사형 검사에 특히 얇은 레이어를 위한 표준 캘리퍼스를 사용 하지 않는 것이 최상 이다.
요약 하면, SD-10 월 마우스 시각적 형질 여러 시간 지점에서 반복 될 수 있습니다. 그러나, OCT 검색 유형 및 측정 방법 조사 질병 및 따라서 망막 층에에 적응 되어야 합니다. 그럼에도 불구 하 고, 10 월 망막 구조의 결함을 식별 하기 위해 충분 한 정보를 제공 합니다. 그러나,이 되어야 더 분석을 제공 하는 기본 메커니즘에 대 한 완전 한 이해를 다른 방법으로.
그림 1: SD-10 월 안과 이미징 시스템. 기지와 SD 10 월 장치의 목표-RAS 부분 (A) 개요. 목표-RAS 구성 요소 (B) 개요. A: 컴퓨터, b: 전원 공급 장치, c: 10 월 엔진 참조 팔, d: SD-10 월 조사, e: 마우스 전용 렌즈, f: Z-번역기, g: 목표-RAS 테이블, h: Y-번역기, i: 카세트 (회전), j: 물린 바, K-코 밴드, l: 카세트 회전, m: X-번역기, 및 n: 목표로 팁. 이 figute는 분홍색으로 표시 된 망막 위치 비 변조기로 그림 2, 색. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 망막 위치. 가로 (왼쪽)과 B-스캔 정렬의 수직 (오른쪽) 보기 화살표 색된 변조기에 의해 유도 된 움직임에 해당 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 망막 층. (A) Wildtype 마우스 망막 조직학 haematoxylin, 오신, 그리고 사프란 얼룩 (왼쪽)과 후 SD-10 월 (오른쪽); 눈금 막대: 50 µ m. (B) 망막 두께 측정 3 개월 wildtype 마우스; n = 14, ± SEM, 의미 눈금 막대: 50 µ m. GC: 신경 절 세포, RNFL/GCL: 망막 신경 섬유 층/신경 절의 세포 레이어, IPL: 내부 plexiform 레이어, INL: 안 핵 층, OPL: 외부 plexiform 레이어, ONL: 외부 핵 층, IS / 운영 체제: 포토 리셉터 내부 세그먼트/외부 세그먼트, RPE: c: 맥락 막 및 망막 안료 상피. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 모범적인 SD 10 월 측정. 직사각형 측정 표준 캘리퍼스; ONH에서 중심에서 (A) GC 복잡 한 레이어 두께 Opa1delTTAG 마우스 선, n = 4, ± sem의 의미 * * p < 0.01 스튜던트 t-검정 평가. 분야 당 RNFL 영역 계산으로 결정 환상에서 SD-10 월 (C) Peripapillary RNFL 두께 (B) Peripapillary RNFL Opa1delTTAG 여성 쥐, n = 5-11, ± SEM을 의미 * p < 0.05 스튜던트 t-검정 평가. (D) RNFL/GCL 및 GC 복잡 한 레이어 두께에서 방사형, 각각; 3, 10 스캔에 대 한 표준 또는 만든 캘리퍼스로 측정 wildtype 쥐, n = 8, ± sem의 의미 * * p < 0.01, * * * p < 0.001 스튜던트 t-검정 평가. RNFL/GCL-망막 신경 섬유 층/신경 절의 세포 레이어, GC: 신경 절 세포. 그림 A-C Sarzi 외. 에서 적응 9. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
OCT 시스템은 비-침략 적 vivo에서 이미징 방법, 고해상도 망막 교차 section 같은 검사를 제공 합니다. 따라서, 그것의 주요 이점은 정기적으로 마우스 모델에 인 간에 게 적용 하는 프로토콜을 바꾸어 좋은 기회와 상세한 분석을 위한 잠재력 이다.
Opa1delTTAG 돌연변이 생쥐의 예에서는 SD-10 월 DOA 이상9의 추가 탐사에 대 한 허용 되는 RNFL 및 GC 복잡 한 레이어 두께의 증가 보여준 결과. 그것은 하지 했 조직학 분석만 가능. 비교에서는, 조직학 환상 또는 방사형 10 월 검사와 달리 전체 망막을 시각화 하는 가능성을 제공 하지 않습니다. 또한, 그것은 더 많은 시간과 비용이 많이 드는 여러 시간 점 연구에 동물의 증가 수를 고려입니다. 사실, SD-10 월 DOA, 뮐러 셀9에서 망막 세포 신형 씌 웠 어 요 하는 방법은 포장. 이 단일 셀 해상도 특정 셀 식별 시스템으로 가능 하다는 사실에도 불구 하 고 이루어졌다. 그와 반대로, 두께 중심 및 일반 상태 집중 분석 peripapillary 영역의 크게 세포 열화를 검출 하는 충분 한. 조직학으로 추가 수사 다음 찾을 것 이다 무엇의 명확한 아이디어로 수행할 수 있습니다. 따라서, 같은 메서드를 방지 하거나 브레이크 망막 변성 치료 개입의 평가에 적용할 수 있습니다.
추가로 10 월의 유틸리티를 개선 하기 위해, 만든 캘리퍼스 개발 하 고 표준 것 들 보다 훨씬 높은 정밀도 했다. 비록 표준 RNFL/GCL 보다 두꺼운, 일부 팀 사용 어쨌든, 하지만 더 큰 층13. 여기, 우리 망막, peripapillary 지역에서 모두 당 10 방사형에서 RGCs에 비교 분석 집중. 혼자 RNFL 방사형 검사 어느 쪽이 든에 측정 되지 않았습니다. 이 계층은 너무 얇고 막연 한; 따라서, RNFL/GCL과 GC 복잡 한 레이어 대신 측정 했다. 같은 시간에 우리는 마우스 형질에 도움이 입증 환상 검사를 사용 하 여 RNFL를 측정에 성공 했다. 그러나, 신뢰성 논란이 있을 수 있습니다. 이러한 모든 방법에 중요 한 단계 센터는 ONH에서 검사 하 고 그림자와 불투명도 없이 망막을 시각화 했다. 전 조정할 수 있습니다 쉽게 망막의 위치에서 프로토콜의 단계에 따라. 후자는 각 막과는 결정의 투과율에 따라 다릅니다. 예를 들어 경우 안과 젤을 균등 하 게 확산은, 검사는 모호한 및/또는 망막 구부러진 나타납니다. 이 문제를 해결 하려면 그것은 제대로 다시 젤을 적용 하기에 충분 한 것입니다. 경우는 결정은 불투명, 어두운 또는 불완전 한 검사가입니다. 여기 솔루션 검색을 반복 하는 것 또 다른 하루, 경우에 결정의 투명도 반환 합니다. 또 다른 가능한 이유는 나쁜 품질 검사에 대 한 장애물, 수염 등 속눈썹의 존재입니다. 이 설정 옆으로 약간 적용 하 여 쉽게 제거 될 수 있다 눈 젤 장소에서 개최. 장비 유형, 검색 유형, 각도, 및 다른 매개 변수를 다른 분석 접근 뿐만 아니라 존재 하 고 분석 된 이미지의 다양 한 숫자를가지고. 이 결과 품질이 여전히 만족 하지 경우 고려 되어야 한다. 예를 들어, 리 우 외. 약간 두꺼운 레이어를 보고 방사형 검사를 여러 각도13, 단 하나에서 우리의 방사형 검사에 비해 했다. 그럼에도 불구 하 고, OCT 수집 및이 원고에 제안 된 분석 접근 분석 RGCs peripapillary 마우스 망막에 대 한 적합 합니다.
끝으로, 10 월 큰 잠재력을 가진 기술 이다. 하면 망막 구조에 미묘한 변화 감지-는 OPNs에 대 한 안부에 (서) 특히 RGCs를 포함 하 여-그리고 비전 과학에 불가결을 증명 한다. 따라서, 제시 프로토콜은 소설 치료의 평가 관해서는 OPN 마우스 모델 형질, 뿐만 아니라에 대 한 실용적입니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품 Inserm, 몽펠리에 대학교, 망막 프랑스, 연합 국가 des Aveugles에 의해 지원 되었다 외 Déficients Visuels (UNADEV), 협회 증후군 데 볼 프 람, Fondation 부 라 검색 Médicale, Fondation 드 프랑스, 그리고 우수의 실험실 EpiGenMed 프로그램입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| Opa1delTTAG mouse | Institute for Neurosciences in Montpellier, INSERM UMR 1051, France | - | Opa1 knock-in mice carrying OPA1 c.2708_2711delTTAG mutation on C57Bl6/J background |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System | Bioptigen, Leica Microsystems, Germany | - | Spectral-Domain Optic Coherence Tomography system |
| EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System Software | Bioptigen, Leica Microsystems, Germany | - | Software for OCT acquisition and analysis |
| ImageJ 1.48v | Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA | - | Software for analysis, requires downloading and installing two hommade macros: http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Retina_Tool |
| Self-regulating heating plate | Bioseb, France | BIO-062 | Protection against hypothermia |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Supplies | |||
| Nose Band | - | - | Elastic band |
| Gauze pads 3" x 3" | Curad, USA | CUR20434ERB | Protection against hypothermia |
| Dual Ended Cotton tip applicator | Essence of Beauty, CVS Health Corporation, USA | - | Gel application |
| Cotton Twists | CentraVet, France | T.7979C.CS | Mouse positioning |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and Drugs | |||
| Néosynéphrine Faure 10% | Laboratoires Europhtha, Monaco | - | Eye dilatation |
| Mydriaticum 0.5% | Laboratoires Théa, France | 3397908 | Eye dilatation |
| Cebesine 0.4% | Laboratoire Chauvin, Bausch&Lomb, France | 3192342 | Local anesthesia |
| Imalgene 1000 | Merial, France/CentraVet, France | IMA004 | General anesthesia |
| Rompun | Bayer Healthcare, Germany/CentraVet, France | ROM001 | General anesthesia, analgesia, muscle relaxation |
| NaCl 0.9% | Laboratoire Osalia, France | 103697114 | Physiological serum |
| Systene Ultra | Alcon, Novartis, USA | - | Hydration of eyes |
| GenTeal' | Alcon, Novartis, USA | - | Ophtalmic gel to minimize light refraction and opacities |
| Aniospray Surf 29 | Laboratoires Anios, France | 59844 | Desinfectant |
References
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