Summary
Her, blev en transposon-medieret tilfældige indsættelse af en ikke-kodende DNA element magt brugt til at løse sin optimale kromosomale holdning.
Abstract
Den optimale kromosomale stilling(er) i en given DNA element var/blev bestemt af transposon-medieret tilfældige indsættelse efterfulgt af fitness udvalg. I bakterier, kan konsekvenserne af den genetiske forbindelse på funktionen af et genetisk element være vanskeligt at vurdere. Flere mekanismer, herunder topologisk effekter, transcriptional interferens fra nærliggende gener, og/eller Replikerings-associerede gen dosering, kan påvirke funktionen af en given genetiske element. Her, beskriver vi en metode, der tillader tilfældig integration af et DNA element i kromosom af Escherichia coli og vælge de mest gunstige placeringer ved hjælp af en simpel vækst konkurrence eksperimentere. Metoden udnytter en velbeskrevne transposon-baseret system for tilfældige indsættelse, kombineret med et udvalg af de stærkeste clone(s) af vækst fordel, en procedure, der kan nemt justeres til eksperimentelle behov. Arten af den stærkestes ret clone(s) kan bestemmes ved hele-genome sequencing på en kompleks multi klonede befolkning eller ved let gen gå til hurtig identifikation af udvalgte kloner. Her, blev regionen med ikke-kodende DNA DARS2, som styrer indledningen af kromosom replikation i E. coli, brugt som et eksempel. Funktionen af DARS2 er kendt for at være påvirket af replikering-associerede gen dosering; den tættere DARS2 får til oprindelsen af DNA-replikation, jo mere aktiv det bliver. DARS2 var tilfældigt indsat i kromosom af en DARS2-slettet stamme. De resulterende kloner indeholder enkelte indsætninger blev samlet og konkurrerede mod hinanden for hundredvis af generationer. Endelig, de stærkestes ret kloner var karakteriseret og fundet for at indeholde DARS2 indsat i umiddelbar nærhed af den oprindelige DARS2 placering.
Introduction
Funktionen af et genetisk element kan blive påvirket af dens placering i genomet. I bakterier resulterer hovedsagelig fra indblanding af transkription af nærliggende gener, lokale DNA topologi, og/eller Replikerings-associerede gen dosering. Især processerne af DNA-replikation og segregation styres i det mindste i en del, af ikke-kodende kromosomale områder1, og den korrekte funktion af disse regioner afhænger genomisk placering/kontekst. I E.coli, eksempler er webstedet dif , kræves til søster kromosom opløsning2; KOPS sekvenser, kræves til kromosom segregation3; og datA, DARS1og DARS2 regioner, nødvendige for korrekt kromosom replikation kontrol (nedenfor; 4). vi præsentere en metode giver mulighed for tilfældige udflytning, udvælgelse og bestemmelse af optimal genetiske forbindelse med nogen given genetiske element, her eksemplificeret ved studiet af DARS2 ikke-kodende region.
I E. coli, DnaA er initiativtager protein ansvarlige for DNA streng åbning på enkelt replikation oprindelseoriCsamt ansættelse af helicase DnaB5,6,7. DnaA hører til AAA+ (dvs. ATPases forbundet med forskellige aktiviteter) proteiner og kan binde ATP og ADP med lignende høj samfølelse5. Niveauet af DnaAATP toppe på indledningen8, hvor DnaAATP danner en multimer på oriC , der udløser DNA duplex åbning9. Efter indledningen, oriC er lavet midlertidigt utilgængelig for fornyet indledning som følge af binding af en mekanisme, der involverer bindingen af SeqA proteinet hemimethylated oriC10,11. Under kulstofbindingen, den DnaAATP reduceres af mindst to mekanismer: regulerende inaktivering af DnaA (RIDA)12,13 og datA-afhængige DnaAATP hydrolyse (DDAH)14 ,15. Både RIDA og DDAH fremme omdannelsen af DnaAATP til DnaAADP. Før en ny runde af indledningen, DnaAADP er aktiveret igen til DnaAATP på specifikke genaktivering af DnaA sekvenser (DARS): DARS1 og DARS216,17. Den kromosomale datA, DARS1og DARS2 regioner er ikke-kodende og handle på en anstandsdame-lignende måde til at modulere DnaAATP/DnaAADP energifremtid. Disse regioner, beliggende uden for oprindelsen af replikering, aktiverer forsamlingen af en kompleks DnaA for enten inaktivering (datA; 14) eller aktivisering (DARS1 og DARS2; 17) af DnaA. Sletning af DARS2 i en celle ændres ikke masse fordobling tid men resultater i asynkron replikering indledning15,16,18. Dog DARS2-mangelfuld celler har en fitness omkostninger i forhold til en ellers isogene vildtype under begge kontinuerlig vækst konkurrence i rig medium eller under etableringen af kolonisering i mus tarmen18. Dette indikerer, at selv mindre ændringer i asynkroniske/oprindelse koncentration har en negativ effekt på bakteriel fitness. I E. colier der en selektiv pres for at opretholde kromosom symmetri (dvs. to næsten lige lange replikering arme)19. De datA, DARS1og DARS2 regioner har den samme relative afstand til oriC i alle E. coli stammer sekventeret18, trods store variationer i kromosom størrelse.
Her bruger vi DARS2 regionen af E. coli som et eksempel til identifikation af den kromosomale stilling(er) optimalt for dens funktion. DARS2 blev indsat i NKBOR transposon, og den deraf følgende NKBOR::DARS2 transposon efterfølgende indsat tilfældigt i genomet af MG1655 ΔDARS2. Vi derfor genereret en samling af celler, hver besidder DARS2 placeret på en anden placering på kromosom. En in vitro- konkurrence eksperiment, hvor alle celler i samlingen blev samlet og konkurrerede mod hinanden under kontinuerlig vækst i LB for en anslået 700 generationer, blev udført. Resultatet af konkurrencen eksperiment blev overvåget/bestemmes ved hjælp af det sydlige skamplet, let gen gåture og hele-genome sequencing (WGS; Figur 1). End-point kloner løst fods let gen var karakteriseret ved flowcytometri at evaluere cellecyklus parametre. I en flow cytometric analyse, kan Cellestørrelse, DNA indhold og indledning synchrony måles for et stort antal celler. Under flowcytometri, en strøm af enkelt celler passerer en lysstråle af passende bølgelængde at ophidse den farvede DNA, som er så samtidig registreret af Fotomultiplikatorer, der indsamler de udsendte fluorescens, en foranstaltning af DNA indhold, forudsat at celler er farvet for DNA. Den frem-spredt lys er et mål for celle masse20.
Til i vitro konkurrence eksperiment præsenterer vi her bruges til at behandle spørgsmål vedrørende betydningen af den kromosomale holdning og genomisk forbindelse med det genetiske element. Metoden er fordomsfri og nem at bruge.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. samling af biblioteket Transposon
NOTE: den kromosomale DARS2 locus er klonet i den mini Tn 10-baseret transposon, NKBOR (efter pNKBOR) 21, hvilket resulterer i NKBOR:: DARS2 (pJFM1). pNKBOR kan fås online 22. pNKBOR er en R6K-baseret selvmord vektor, der kræver, at initiatoren protein π for replikering 23. Plasmidet pJFM1 er derfor i stand til at replikere i en E. coli-stamme (f.eks. Dh5α λ pir) indeholdende en kromosomale kopi af pir-genet. Men når pJFM1 er omdannet til Pir-mangelfuld vildtype MG1655, pJFM1 kan ikke replikere, fører til udvælgelse af kanamycin-resistente kloner genereret af de tilfældige indsætninger af NKBOR:: DARS2 ind i den bakterielle kromosom. For enkelhed, er disse omtales som DARS2 indsættelser. Se figur 1 for en skematisk præsentation af metoden.
- Forbered electrocompetent MG1655 Δ DARS2 fra aktivt voksende celler i Lysogeny bouillon (LB) vokset til 37 ° C 24.
- Electroporate pJFM1 i electrocompetent MG1655 Δ DARS2, ifølge Gonzales et al. 24
- tilføje 1 µg for pJFM1 (i 1 µL vand) til 40 µL af electrocompetent E. coli MG1655 Δ DARS2 og overføre denne blanding til en pre kølede, sterile 0,2 cm hul kuvette. Indsæt kuvette i elektroporation kammer. Electroporate på 18 kV, 500 Ω og 25 µF; Konstanten tid bør være ~5.0 ms, og ingen Buedannelse bør forekomme.
- Hurtigt gendanne den bakterielle suspension af resuspending det i 1 mL pre varmede LB bouillon og overførsel til en 15 mL reagensglas.
- Lad cellerne gendanne ved at inkubere under kulsyre vækstbetingelser ved 37 ° C i 30 min, uden antibiotika valg. Plade bakterier på LB agar plader suppleret med 50µg/mL kanamycin og inkuberes ved 37 ° C natten.
- Tælle kolonier fra elektroporation: en koloni betragtes som svarende til en kromosomale transposon indsættelse.
Bemærk: Kolonier kan tælles, med det blotte øje eller med en koloni counter. Antallet af kolonier er omvendt proportional med den gennemsnitlige afstand mellem transposoner beliggende på kromosom af hver klon. - Tilføje 1 mL af LB bouillon til hver plade og vaske alle kolonier; 1 mL af LB bouillon bør være tilstrækkeligt til at vaske af ~ 100.000 kolonier. Genbruge den samme 1 mL af LB bouillon til at øge den bakterielle koncentration. Samle alle kolonier i den samme 50 mL tube.
- Vortex røret og fryser start materiale (t = 0). For at fryse det, 1 mL cellesuspension blandes med 1 mL 50% glycerol på is. Overføre rør for at tørre isbad i 10 min. Når kulturer er fastfrosset, overføre dem til en-80 ° C fryser.
Bemærk: En celle koncentration af et minimum af 50.000 CFU/mL forventes på dette trin.
2. Konkurrence eksperiment i LB
- tø transposon bibliotek fra-80 ° C på is. Mix af pipettering.
- Overføres 100 µL af transposon bibliotek til 10 mL af LB i en 15 mL reagensglas.
- Vokser celler, tilsat kulsyre ved kontinuerlig omrystning (250 rpm), i 8 timer ved 37 ° C til stationær fase (dvs. OD 600 = ~ 4.0). Justere disse parametre til forskellige vækstbetingelser, som ønskede.
- Forplanter den bakterielle befolkning af løbende overførsler i frisk forvarmet medium hver ~ 10 generationer. Gøre dette ved at overføre 10 µL af den tidligere stationære fase kultur 10 ml frisk LB og vokser til et andet 8 h til den stationære fase (dvs. OD 600 = ~ 4.0).
Bemærk: Eftersom de start- og optiske densitet er det samme, en 1.000-fold fortynding svarer til ~ 10 generationer af vækst (2 10 = 1.024). Den bakterielle befolkning kan enten overføres direkte til frisk forvarmet medie eller gemmes på 0-4 ° C (på is) og opformeret den følgende dag. LB blev brugt her at sikre så mange cellulære doublings i så kort tid som muligt (en fordobling tid tæt på 22 min). - Efter hver 100 generationer af konkurrence, gemme fem 1 mL prøver på-80 ° C (som beskrevet i trin 3.3).
- Hvis fitness forskelle mellem celler, der indeholder individuelle transposon indsætninger forventes at være lille, holde varigheden af konkurrencen længe; her, 700 generationer (t = 700) anvendtes.
3. Sydlige duppes analyse til at overvåge konkurrencen eksperiment Over tid
- forberede sonden for den sydlige skamplet (1-kb afsnit af NKBOR) ved at udføre polymerase kædereaktion (PCR) forstærkning ved hjælp af specifikke primere: NKBOR_Probe_FW : gatgttggacgagtcggaat og NKBOR_Probe_RV: cgttacatccctggcttgtt.
- Incubate på 98 ° C til 30 s til indledende denaturering. Udfør derefter, 35 cykler på 98 ° C for 10 s, 60 ° C i 30 s og 72 ° C i 45 s. For den sidste udvidelse, bruge mindst 72 ° C i 10 min.
Bemærk: Skabelon til PCR reaktion var en renset pNKBOR plasmid 21. - Mærke den resulterende PCR fragment med [α - 32P] dATP ved hjælp af tilfældige primer system, ifølge Smith 25.
- Incubate på 98 ° C til 30 s til indledende denaturering. Udfør derefter, 35 cykler på 98 ° C for 10 s, 60 ° C i 30 s og 72 ° C i 45 s. For den sidste udvidelse, bruge mindst 72 ° C i 10 min.
- Forberede den samlede cellulære DNA ifølge Løbner-Olesen og von Freiesleben 26 for t = 0 og udvalgte tidspunkter indtil t = 700 anslået generationer af konkurrence.
- Fordøje det samlede cellulære DNA med Pvu I, der skærer NKBOR indeholdende område af interesse når kun i en region, som ikke er omfattet af sonden; 1 enhed af Pvu jeg kan bruges til helt digest 1 µg af substrat DNA.
Bemærk: Sonden vil genkende fragmenter der indeholder en del af transposon, sammen med kromosomale DNA af forskellige længder, afhængigt af indsættelsesstedet. - Udføre en sydlige skamplet ved hjælp af en 0,7%-agarosegel ifølge Løbner-Olesen og von Freiesleben 26.
4. Identifikation af den stærkestes ret kloner
- Brug let gen walking, som beskrevet af Harrison et al. 27, at identificere DARS2 indsættelse websteder fra enkelt kloner (isoleret på LB plader) efter 700 anslåede generationer af konkurrencen; Flere bands på den sydlige skamplet, de flere isolater er nødvendige for at dække alle transposon indsætninger.
- Anvendes på isolatet af genomisk DNA til PCR skabelon. Sprede bakterier på en LB-agar plade der indeholder 50 µg/mL kanamycin og inkuberes ved 37 ° C natten over. Vokse enkelt kolonier overnatning i LB bouillon ved 37 ° C og efterfølgende overføre 20 µL til 200 µL autoklaveres destilleret vand (eller bruge DNA oprensning, som i trin 3.2).
- Vortex at blande. Varme blanding ved 100 ° C i 10 min og centrifugeres ved max hastighed i 5 min. Gem cellen lysate ved-20 ° C til fremtidig brug.
- Design tre indlejrede primere at anneal inden for transposon valg (Se figur 2 en grafisk repræsentation af PCR-strategien).
Bemærk: Designe indlejret primere bør sikre at indlejret Primer 3 ligger tættest på den kendte 5 ' slutningen af transposon DNA, efterfulgt af indlejrede primere 2 og 1. Afstanden mellem indlejret Primer 3 og 5 ' slutningen af den kendte transposon DNA bør være tilstrækkeligt for en sekvens gennemlæsning fra den kendte DNA i ukendt DNA (at finde specifikke kromosomale transposon indsættelsesstedet). For NKBOR de følgende indlejrede primere blev anvendt: pNKBOR_Nested3_RV: gcagggctttattgattcca, pNKBOR_Nested2_RV: tcagcaacaccttcttcacg, og pNKBOR_Nested1_RV: actttctggctggatgatgg. Tilfældige primere indeholdende genkendelsessekvenser af kendte restriktionsenzymer bruges også. For at sikre et resultat, bør man bruge mindst to forskellige tilfældige primere. Begrænsning websteder for restriktionsenzymer (e.g.,Sau 3AI og Hin dIII) bør være placeret på 3 ' ende og indledes med ti tilfældige baser, så 5 ' - NNNNNNNNNNGATC - 3 ' og 5 ' - NNNNNNNNNNAAGCTT - 3 ' er primere indeholdende en Sau 3AI site (GATC'EN) og en Hin dIII websted (AAGCTT), henholdsvis, hvor N = A, T, G eller C. - Brug 200 ng af genomisk DNA i en 20 µL PCR reaktionen. Der inkuberes ved 98 ° C til 30 s til den oprindelige denaturering. Udføre 25 cykler på 98 ° C til 30 s, 50 ° C i 15 s, og mindst 72 ° C i 4 min. For den sidste udvidelse, bruge 72 ° C i 10 min. Brug primer par bestående af indlejrede Primer 1 og en af de tilfældige primere.
- Bruge primer par bestående af indlejrede Primer 2 og den samme tilfældige primer fra den anden forstærkning, ved hjælp af 1 µL af sin tidligere reaktion som en skabelon.
- Gentag trin 4.1.4 med primer par bestående af indlejrede Primer 3 og den samme tilfældige primer.
- Køre produkterne fra den endelige PCR reaktion på en 1,5% agarosegel og farvning med ethidiumbromid. Skære et band i størrelsesordenen 100-800 bp og isolere DNA ved hjælp af enhver kommerciel DNA gel udvinding kit ifølge producenten ' s retning. Resuspend DNA i 15 µL vand.
Bemærk: forsigtighed. Ethidiumbromid er giftigt og skal håndteres med omhu. - Sekvens bandet isoleret i det foregående trin (trin 4.1.6), med indlejret Primer 3 som sekventering primer, ved hjælp af Sanger sekvensering på en kommerciel udbyder.
- Anvendes på isolatet af genomisk DNA til PCR skabelon. Sprede bakterier på en LB-agar plade der indeholder 50 µg/mL kanamycin og inkuberes ved 37 ° C natten over. Vokse enkelt kolonier overnatning i LB bouillon ved 37 ° C og efterfølgende overføre 20 µL til 200 µL autoklaveres destilleret vand (eller bruge DNA oprensning, som i trin 3.2).
- Udføre WGS.
- Udføre WGS på det samlede DNA ekstraheret fra udvalgte prøver, der opsamlet under konkurrence eksperimentet, som beskrevet af Frimodt-Møller mfl 4.
- Udføre sekvenseringen analyse.
- Juster parret-ende læser til 150 Ns sammenhængende med NKBOR, AF310136.1 1,904 … 2,204 med et interval mellem frø understrenge (S, 1, 1,15) og et maksimalt antal tvetydige figurer (L, 0, 0,9) Bowtie2 28.
- Vælg de justeret læser og derefter igen tilslutter til begge MG1655 ref | NC_000913.3 og NKBOR gb | AF310136 ved hjælp af blastN 29
- tildele gennemførelse indsættelse holdninger på kryds MG1655-NKBOR.
5. Flow flowcytometri
- indsamle prøver til flowcytometri.
- Balance hver kultur ved at fastholde det i den eksponentielle vækstfase for mindst 10 generationer. Tjek OD 600 og sikre, at det aldrig overstiger 0,3.
- Indsamler to slags flow prøver.
- For RIF-runout, overføres 1 mL af kultur til en 15 mL tube indeholder 30 µL af RIF-CEF (300 µg/mL rifampicin og 36 µg/mL cephalexin opløst i 12,5 mM NaOH). Lade det blive ved 37 ° C i mindst 4 h af rysten.
Bemærk: Rifampicin indirekte blokerer indledningen af kromosom replikation knappanel for igangværende runder af replikering fortsætte at opsigelsen. Cephalexin forhindrer celledeling, hvilket resulterer i replikering runout (RIF-runout) og ophobning af celler med fuldt replikerede kromosomer. Antallet af fuldt replikerede kromosomer er lig med antallet af oprindelse på tidspunktet for behandling med rifampicin og cephalexin 20. - For EXP-prøve, overførsel 1 mL eksponentielt voksende kultur til en 1,5 mL tube på ice.
- For RIF-runout, overføres 1 mL af kultur til en 15 mL tube indeholder 30 µL af RIF-CEF (300 µg/mL rifampicin og 36 µg/mL cephalexin opløst i 12,5 mM NaOH). Lade det blive ved 37 ° C i mindst 4 h af rysten.
- Fix cellerne som følger. Høste cellerne ved centrifugering ved 15.000 x g i 5 min. ved 4 ° C. resuspenderes i 100 µL af iskold 10 mM Tris pH 7,5 og tilsættes 1 mL iskold 77% ethanol. Opbevare prøver ved 4 ° C indtil brug.
- Pletten cellerne som følger. Høste 100-300 µL af faste celler ved centrifugering ved 15.000 x g i 15 min. Fjern supernatanten og resuspenderes i 130 µL af " DNA farvning løsning " (90 µg/mL mithramycin, 20 µg/mL ethidiumbromid, 10 mM MgCl 2 og 10 mM Tris pH 7,5). Sætte prøverne på is og i mørke; prøverne er klar til flow flowcytometri analyse efter 10 min.
Bemærk: Andre DNA pletter end ethidiumbromid og mithramycin kan også være brugt 30 , 31. - Bestemme oprindelse pr. celle, relative cellemasse og den relative DNA indhold af analysen af handelsstrømmen flowcytometri.
- Udføre flowcytometri, som tidligere beskrevet 32. Køre RIF-runout og EXP-prøver ved hjælp af flow forskellige producent ' s instruktioner . For mithramycin- og ethidium bromid-farvede celler, bruge excitation bølgelængder 395 og 440 nm og indsamle fluorescens ovenfor 565 nm.
- Til at bestemme de relative celle masse og relative DNA-indhold køre EXP-prøver at opnå single-parameter frem-lys scatter versus celle nummer histogrammer og fluorescens intensitet versus celle nummer histogrammer for minimum 30.000 begivenheder svarende til mobilsignal.
- Brug frem-spredt lys single-parameter distribution til at måle den gennemsnitlige relative celle Mass
Bemærk: Frem-spredt lys er et mål for den gennemsnitlige celle masse 20. - Brug fluorescens intensitet single-parameter distributioner til at måle den gennemsnitlige DNA indhold 20.
- DNA koncentration som forholdet af gennemsnitlige DNA indhold til den gennemsnitlige celle masse 20.
- Bestemme antallet af oprindelse pr. celle.
- Kør RIF-runout prøver at opnå single-parameter fluorescens intensitet versus celle nummer histogrammer for minimum 30.000 begivenheder svarende til mobilsignal.
- Brug fluorescens intensitet single-parameter distributioner til at bestemme antallet af kromosomer i hver celle 20.
- Udføre flowcytometri, som tidligere beskrevet 32. Køre RIF-runout og EXP-prøver ved hjælp af flow forskellige producent ' s instruktioner . For mithramycin- og ethidium bromid-farvede celler, bruge excitation bølgelængder 395 og 440 nm og indsamle fluorescens ovenfor 565 nm.
- Beregning af asynkroniske indeks (Ai).
- Beregn Ai, som beskrevet af Løbner-Olesen et al. 32, ved hjælp af fluorescens intensitet enkelt parameter distributioner af RIF-runout prøver og formel Ai = (f3 + f5 + f6 + f7) / (f2 + f4 + f8), hvor fx er brøkdel cellerne med x antal fuldt replikerede kromosomer. Overveje indvielser asynkron Hvornår A > 0,1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En sydlige skamplet blev gjort for at kontrollere, at DARS2 var fordelt tilfældigt i kromosom i biblioteket transposon (t = 0), og at de stærkeste kloner ville der stadig over tid. Den sydlige skamplet blev udført på DNA ekstraheret fra den oprindelige transposon pool (ved t = 0) og hver anslået 100 ud af 700 generationer af konkurrence (figur 3). Her, den samlede cellulære DNA fra hvert tidspunkt var fordøjet med Pvubegrænsning enzym, kendt for at skære transposon NKBOR::DARS2 endnu kun i en region, der ikke er omfattet af sonden. Den sydlige skamplet var probed med et radioaktivt mærket DNA fragment supplement til en del af NKBOR. Som det ses af figur 3, den indledende DARS2 swimmingpool (t = 0) manglede forskellige bands, som viser, at DARS2 var indsat tilfældigt hele kromosom. Over tid, et mønster opstod, hvor den første store pulje af DARS2 kloner udviklet i kun én eller et par vedvarende DARS2 kloner (figur 3; t = 0 til t = 700).
I det viste eksempel blev DARS2 indsættelse websteder fra konkurrence eksperiment identificeret ved hjælp af WGS og let gen walking. Her, WGS blev brugt til at identificere indsættelse websteder fra start pool (t = 0) og efter 300, 400 og 700 generationer af konkurrence. Bemærk, at dækning i den nuværende dybe sekventering var utilstrækkelige for en komplet kortlægning af indsættelse websteder på t = 0; men det giver et repræsentativt delmængde af det samlede antal indrykninger. WGS bekræftet sydlige skamplet resultatet (dvs. udvælgelsen af de stærkeste DARS2 kloner), slutter med ca. 98% af alle DARS2 indsætninger tæt på vildtype DARS2 kromosomale placering (DARS2 Klon IR og klon rppH), mens de resterende 2% var andetsteds på kromosom (figur 4). Dette tyder stærkt på at den vildtype holdning er optimalt for DARS2 funktion. På t = 400, en indsættelse blev fundet på den modsatte replikering arm med en næsten identisk afstand til oriC som vildtype DARS2 position (figur 4), men denne indsættelse blev ikke gendannet efter 700 generationer. Således kan ikke replikation-associerede gen dosering være den enkelte faktor for optimal position.
Nem gen gå blev brugt til at identificere DARS2 indsætninger websteder i enkelt kloner isoleret efter 700 anslåede generationer af konkurrence. Her, blev de to DARS2 indsættelse steder nævnt ovenfor (DARS2 klon IR og klon rppH) identificeret. Nem gen gå blev kun udført på 20 kloner, og dette forklarer, hvorfor alle DARS2 indsætninger lokaliteter kortlagt i WGS ikke blev identificeret. DARS2-mangelfuld celler blev tidligere vist at indlede replikation i asynkroniske og at have et fald i oprindelse koncentration i forhold til vildtype celler4,16,17, 18. vi derfor brugt flowcytometri at løse synchrony i indledning af DNA replikation og cellulær oprindelse indhold for de to udvalgte stammer (DARS2 klon IR og klon rppH) som i begge tilfælde blev gendannet til vildtype niveauer (figur 5). Et repræsentativt eksempel på en stamme besidde en enkelt kopi af DARS2 beliggende i endestation er vist (figur 5E). Her, gendanner tilstedeværelsen af et DARS2 element i endestation ikke synchrony eller cellulær oprindelse indhold til vildtype niveauer, mens de valgte DARS2 kloner IR og rppH ikke.
Figur 1 : Metode oversigt. Skematisk præsentation af metoden. Regionen kromosomale DARS2 er klonet i mini Tn10 på pNKBOR, at skabe pJFM1. pJFM1 omdannes til E. coli MG1655 ΔDARS2, som udløser en tilfældig indsættelse af DARS2 knyttet til Tn10 på kromosom af E. coli MG1655 ΔDARS2. Cirka 70.000 kloner, hver indeholder en forskellig kromosomale DARS2 indsættelse, blev samlet og konkurrerede direkte mod hinanden i LB bouillon ved 37 ° C. Den direkte konkurrence eksperiment i LB bouillon blev udført for en anslået 700 generationer, hvor en stikprøve blev isoleret for hver 100 generationer af direkte konkurrence. Den samlede DNA blev udvundet fra hver isoleret prøve og anvendes til det sydlige blotting og identifikation af DARS2 indsættelser af WGS. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Grafisk præsentation af let gen gå. Denne figur viser en genomisk DNA skabelon for en ukendt DNA sekvens støder op til et kendt sekvens med priming websteder for tilfældige primer og indlejrede primere 1, 2 og 3. Resultaterne af de tre successive klarlægger udføres ved hjælp af de tre designet indlejrede primere er illustreret nedenfor. Det endelige produkt (fra runde 3) er sekventeret, ved hjælp af indlejret Primer 3. Dette tal blev tilpasset fra Harrison et al. 27. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Det sydlige skamplet aftestede for NKBOR. Sydlige skamplet analyse af DARS2 indsættelse i en DARS2-mangelfuld stamme. Genomisk DNA ekstraheret fra hver ~ 100 generationer af direkte konkurrence, startende fra t = 0 og slutter på 700 generationer, var fordøjet med Pvuog gel-fraktioneret. Skamplet blev udvidet med en NKBOR sonde (Se protokollen). t angiver antallet af generationer af konkurrence. Dette tal blev tilpasset fra Frimodt-Møller et al. 4. HMW og LMW er høj-Molekylær vægt og lav-Molekylær vægt DNA, henholdsvis. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Grafisk repræsentation af resolvEd transposon indsætninger websteder i ΔDARS2. Holdninger oriC, datA, DARS1, DARS2, og terC angives. DARS2 indsættelse websteder i ΔDARS2 til t = 0 (sorte bjælker), t = 400 (lys blå bjælker), t = 500 (røde søjler), og t = 700 (grønne barer), løst af fuld-genome sequencing. Dette tal blev lavet ved hjælp af DNAPlotter33 og var tilpasset fra Frimodt-Møller et al. 4. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Repræsentant flow flowcytometri histogrammer transposon steder fundet af let gen gå på t = 700. Celler blev dyrket i AB minimal medium suppleret med 0,2% glukose, 10 µg/mL thiamin, og 0,5% casamino syrer ved 37 ° C. Vildtype og ΔDARS2 er vist i A og B, henholdsvis. Derivater af vildtype stamme MG1655 blottet for DARS2 på det oprindelige sted og i stedet bærer en kopi af DARS2 på løst transposon site rrpH, IR og terminus (terC) er vist i C, D og E, henholdsvis. Dette tal blev tilpasset fra Frimodt-Møller et al. 4 at vise en DARS2 beliggenhed, resulterer i en celle cyklus anomali (terC) eller der genskaber vildtype fænotype(rrpH, IR). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den metode, der anvendes her udnytter state-of-the-art teknikker til at besvare vanskelige spørgsmål vedrørende den optimale genomiske holdning af et genetisk element. Den tilfældige indsættelse af det genetiske element (medieret af transposon) giver mulighed for hurtig og nem indsamling af tusindvis af kloner, som derefter kan bringes til at konkurrere mod hinanden for at vælge den optimale stilling af de undersøgte genetiske element (dvs. de stærkeste klon).
Her, DARS2 blev indsat i mini-Tn10-baseret transposon, NKBOR. Valget af transposon er vigtigt for downstream analyse af indsætninger websteder. Flere forskellige transposoner har været brugt i transposon-instrueret indsættelsesstedet sekventering (TraDIS) eksperimenter, som mini-Tn5Km234 og de mere populære valg, Himar jeg Mariner transposon35, 36 (for en nylig gennemgang af dette, se van Opijnen og Camilli36). Vi aimed nemlig 70.000 oprindelige tilfældige indsætninger af DARS2, hvilket giver ca en DARS2 indsættelse evert 65 bp i MG1655 genom. Dette kan nemt justeres ved at reducere eller øge den indledende pulje af kolonier indsamlet.
Her valgte vi løbende overførsler i LB batch kulturer, men konkurrencen eksperiment kan også udføres i et andet medium eller under forskellige forhold, herunder ved hjælp af en chemostat37. Derudover kan proceduren ændres for at imødekomme eventuelle betingelser valg, herunder forskellige understreger, såsom oxidative, osmotisk eller antibiotika stress. For at kontrollere tilstedeværelsen af vedvarende kloner over tid, man kan gøre mindst tre ting: WGS; transposon sekventering (Tn-Seq); eller som her, en sydlige skamplet. Endelig, let gen gåture kan gøres på et par kloner, med den yderligere fordel at transposon indsættelse steder er identificeret i enkelt kloner, således at effekten af den specifikke indsættelsesstedet kan analyseres fænotype.
Valg af fænotypiske assay at evaluere resultatet af en konkurrence eksperiment afhænger det undersøgte område. Vi brugte flowcytometri, som er en kraftfuld metode til at måle cellecyklus parametre af bakterier. Her, afslørede flowcytometri, at den valgte kromosomale stilling(er) i DARS2, (dvs. DARS2 indsætninger tæt på vildtype DARS2 position) resulterede i en korrekt regulering af replikering indledning ( dvs., synchrony og DNA koncentration). De optimale kromosomale stilling(er) for DARS2 blev valgt delvis skyldes ordentlig replikation-associerede gen dosering og delvis på grund af de gunstige lokale genomisk miljø, der er vigtigt for DARS2 funktion4.
Her, en ikke-kodende DNA element blev undersøgt, men dette kan udvides til nogen kodende region af valg. En nylig undersøgelse viste, at niveauet af genekspression varierede ~ 300-fold, afhængigt af dets holdning på kromosom, uden klare korrelation til replikering-associerede gen dosering38. Metoden beskrevet her kunne give vigtig indsigt i forholdet mellem genomisk placeringen af et bestemt gen, dens transcriptional aktivitet og den tilknyttede fitness fordel. Dette kunne i teorien hjælpe med valg af genomisk positioner, fører til stærkere ekspression af et bestemt gen, der igen kunne være af interesse for engineering nye, forbedrede stammer for rekombinante protein produktion.
Da E. coli indeholder begrænset intergenic regioner39, vil, transposon indsættelser i de fleste tilfælde forstyrre molekylærgenetisk. Dette kan lejlighedsvis oprette falske positiver, hvor de stærkestes ret clone(s) ikke er valgt på grund af den optimale kromosomale holdning af det genetiske element pågældende, men snarere fordi et gen er forstyrret - som på andre måder, giver en fitness fordel under de konkurrence eksperiment4.
Denne metode tager fordel af et let-at-bruge transposon system, hvor enhver region i valg kan være integreret på tilfældige steder. Designet konkurrence eksperiment kan ændres til at omfatte et vilkårligt antal udvalg styrker end ren vækst, som ses her. Opsætningen kan også ændres for at være udelukkende baseret på Tn-FF., som giver en større sekventering opløsning af indsætninger websteder end WGS, anvendes her. Denne fordomsfri tilgang bør anvendes til at belyse spændende nye funktioner i således langt uncharacterized organismer, som kan vise, at fælles tendenser eksisterer i den kromosomale organisation af Eubacteria.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende finansiel interesse.
Acknowledgments
Forfatterne var finansieret af tilskud fra Novo Nordisk Fonden, Lundbeckfonden og den danske National Research Foundation (DNRF120) via Center for bakteriel stressrespons og persistens (BASP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclaved Mili-Q water | None | ||
| Electroporation Cuvettes, 0.1 cm | Thermo Fisher Scientific | P41050 | |
| Bio-Rad MicroPulser Electroporation System | Bio-Rad | 165-2100 | |
| LB Broth | Thermo Fisher Scientific | 12780029 | |
| LB Agar, powder (Lennox L agar) | Thermo Fisher Scientific | 22700025 | |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | 17904 | |
| Fisherbrand Plastic Petri Dishes | Fisher Scientific | S33580A | |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Nunc CryoTubes | Sigma-Aldrich | V7634 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/µL) | Thermo Fisher Scientific | F530S | |
| dATP, [α-32P]- 3000Ci/mmol 10mCi/ml, 250 µCi | PerkinElmer | BLU012H250UC | |
| DECAprime II DNA Labeling Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1455 | |
| Spectrophotometer SF/MBV/03.32 | Pharmacia | ||
| Hermle Centrifuge SF/MBV/03.46 | Hermle | ||
| Ole Dich Centrifuge SF/MBV/03.29 | Ole Dich | ||
| Eppendorftubes 1.5 mL | Sigma-Aldrich | T9661 | |
| Eppendorftubes 2.0 mL | Sigma-Aldrich | T2795 | |
| Sodium Chloride | Merck | 6404 | |
| 96% Ethanol | Sigma-Aldrich | 16368 | |
| Trizma HCl | Sigma-Aldrich | T-3253 | |
| Phenol Ultra Pure | BRL | 5509UA | |
| Chloroform | Merck | 2445 | |
| Ribonuclease A type II A | Sigma-Aldrich | R5000 | |
| Sodiumdodecylsulphate (SDS) | Merck | 13760 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L 6876 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 405-7 | |
| 0.5M Na-EDTA pH 8.0 | BRL | 5575 UA | |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 10106801001 | |
| PvuI (10 U/µL) | Thermo Fisher Scientific | ER0621 | |
| UltraPure Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16500500 | |
| DNA Gel Loading Dye (6X) | Thermo Fisher Scientific | R0611 | |
| Tris-Borate-EDTA buffer | Sigma-Aldrich | T4415 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E7637 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 433160 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 71687 | |
| Whatman 3MM papers | Sigma-Aldrich | WHA3030931 | |
| SSC Buffer 20× Concentrate | Sigma-Aldrich | S6639 | |
| Amersham Hybond-N+ | GE Healthcare | RPN119B | |
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F8016 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | PVP40 | |
| Bovine Serum Albumin - Fraction V | Sigma-Aldrich | 85040C | |
| Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes | Sigma-Aldrich | D1626 | |
| Carestream Kodak BioMax light film | Sigma-Aldrich | Z373494 | |
| GenElute Gel Extraction Kit | Sigma-Aldrich | NA1111 | |
| GenElute PCR Clean-Up Kit | Sigma-Aldrich | NA1020 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | ||
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | ||
| Rifampicin | Serva | 34514.01 | |
| Cephalexin | Sigma-Aldrich | C4895 | |
| Mithramycin | Serva | 29803.02 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 246964 | |
| Apogee A10 instrument | Apogee |
References
- Frimodt-Moller, J., Charbon, G., Lobner-Olesen, A. Control of bacterial chromosome replication by non-coding regions outside the origin. Curr Genet. , (2016).
- Sherratt, D. J., et al. Recombination and chromosome segregation. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 359 (1441), 61-69 (2004).
- Bigot, S., et al. DNA motifs that control E. coli chromosome segregation by orienting the FtsK translocase. EMBO J. 24 (21), 3770-3780 (2005).
- Frimodt-Moller, J., Charbon, G., Krogfelt, K. A., Lobner-Olesen, A. DNA Replication Control Is Linked to Genomic Positioning of Control Regions in Escherichia coli. PLoS Genet. 12 (9), 1006286 (2016).
- Kornberg, A., Baker, T. A. DNA Replication, Second Edition. , University Science Books. (1992).
- Kaguni, J. M. Replication initiation at the Escherichia coli chromosomal origin. Curr Opin Chem Biol. 15 (5), 606-613 (2011).
- Leonard, A. C., Grimwade, J. E. Regulation of DnaA assembly and activity: taking directions from the genome. Annu Rev Microbiol. 65, 19-35 (2011).
- Kurokawa, K., Nishida, S., Emoto, A., Sekimizu, K., Katayama, T. Replication cycle-coordinated change of the adenine nucleotide-bound forms of DnaA protein in Escherichia coli. EMBO J. 18 (23), 6642-6652 (1999).
- Sekimizu, K., Bramhill, D., Kornberg, A. ATP activates dnaA protein in initiating replication of plasmids bearing the origin of the E. coli chromosome. Cell. 50 (2), 259-265 (1987).
- Brendler, T., Austin, S. Binding of SeqA protein to DNA requires interaction between two or more complexes bound to separate hemimethylated GATC sequences. EMBO J. 18 (8), 2304-2310 (1999).
- Lu, M., Campbell, J. L., Boye, E., Kleckner, N. SeqA: a negative modulator of replication initiation in E. coli. Cell. 77 (3), 413-426 (1994).
- Katayama, T., Kubota, T., Kurokawa, K., Crooke, E., Sekimizu, K. The initiator function of DnaA protein is negatively regulated by the sliding clamp of the E. coli chromosomal replicase. Cell. 94 (1), 61-71 (1998).
- Kato, J., Katayama, T. Hda, a novel DnaA-related protein, regulates the replication cycle in Escherichia coli. EMBO J. 20 (15), 4253-4262 (2001).
- Kasho, K., Katayama, T. DnaA binding locus datA promotes DnaA-ATP hydrolysis to enable cell cycle-coordinated replication initiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (3), 936-941 (2013).
- Kitagawa, R., Ozaki, T., Moriya, S., Ogawa, T. Negative control of replication initiation by a novel chromosomal locus exhibiting exceptional affinity for Escherichia coli DnaA protein. Genes Dev. 12 (19), 3032-3043 (1998).
- Fujimitsu, K., Senriuchi, T., Katayama, T. Specific genomic sequences of E. coli promote replicational initiation by directly reactivating ADP-DnaA. Genes Dev. 23 (10), 1221-1233 (2009).
- Kasho, K., Fujimitsu, K., Matoba, T., Oshima, T., Katayama, T. Timely binding of IHF and Fis to DARS2 regulates ATP-DnaA production and replication initiation. Nucleic Acids Res. 42 (21), 13134-13149 (2014).
- Frimodt-Moller, J., Charbon, G., Krogfelt, K. A., Lobner-Olesen, A. Control regions for chromosome replication are conserved with respect to sequence and location among Escherichia coli strains. Front Microbiol. 6, 1011 (2015).
- Bergthorsson, U., Ochman, H. Distribution of chromosome length variation in natural isolates of Escherichia coli. Mol Biol Evol. 15 (1), 6-16 (1998).
- Boye, E., Steen, H. B., Skarstad, K. Flow cytometry of bacteria: a promising tool in experimental and clinical microbiology. J Gen Microbiol. 129 (4), 973-980 (1983).
- Rossignol, M., Basset, A., Espeli, O., Boccard, F. NKBOR, a mini-Tn10-based transposon for random insertion in the chromosome of Gram-negative bacteria and the rapid recovery of sequences flanking the insertion sites in Escherichia coli. Res Microbiol. 152 (5), 481-485 (2001).
- SHIGEN. , Available from: http://shigen.nig.ac.jp (2017).
- Shafferman, A., Helinski, D. R. Structural properties of the beta origin of replication of plasmid R6K. J Biol Chem. 258 (7), 4083-4090 (1983).
- Gonzales, M. F., Brooks, T., Pukatzki, S. U., Provenzano, D. Rapid protocol for preparation of electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae. J Vis Exp. (80), (2013).
- Smith, D. R.
- Lobner-Olesen, A., von Freiesleben, U. Chromosomal replication incompatibility in Dam methyltransferase deficient Escherichia coli cells. EMBO J. 15 (21), 5999-6008 (1996).
- Harrison, R. W., Miller, J. C., D'Souza, M. J., Kampo, G.
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 215 (3), 403-410 (1990).
- Stepankiw, N., Kaidow, A., Boye, E., Bates, D. The right half of the Escherichia coli replication origin is not essential for viability, but facilitates multi-forked replication. Mol Microbiol. 74 (2), 467-479 (2009).
- Lobner-Olesen, A. Distribution of minichromosomes in individual Escherichia coli cells: implications for replication control. EMBO J. 18 (6), 1712-1721 (1999).
- Lobner-Olesen, A., Skarstad, K., Hansen, F. G., von Meyenburg, K., Boye, E. The DnaA protein determines the initiation mass of Escherichia coli K-12. Cell. 57 (5), 881-889 (1989).
- Carver, T., Thomson, N., Bleasby, A., Berriman, M., Parkhill, J. DNAPlotter: circular and linear interactive genome visualization. Bioinformatics. 25 (1), 119-120 (2009).
- Eckert, S. E., et al. Retrospective application of transposon-directed insertion site sequencing to a library of signature-tagged mini-Tn5Km2 mutants of Escherichia coli O157:H7 screened in cattle. J Bacteriol. 193 (7), 1771-1776 (2011).
- van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms. Nat Methods. 6 (10), 767-772 (2009).
- van Opijnen, T., Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nat Rev Microbiol. 11 (7), 435-442 (2013).
- Jeong, H., Lee, S. J., Kim, P. Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat. J Vis Exp. (115), (2016).
- Bryant, J. A., Sellars, L. E., Busby, S. J., Lee, D. J. Chromosome position effects on gene expression in Escherichia coli K-12. Nucleic Acids Res. 42 (18), 11383-11392 (2014).
- Blattner, F. R., et al. The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).
