Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Bepaling van de optimale chromosomale locatie (s) voor een DNA Element in Escherichia coli met behulp van een nieuwe benadering van Transposon-gemedieerde

Published: September 11, 2017 doi: 10.3791/55946
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Biology, Section for Functional Genomics and Center for Bacterial Stress Response and Persistence (BASP), University of Copenhagen, 2Department of Microbiology and Infection Control, Statens Serum Institut

Summary

Hier, werd de kracht van een transposon-gemedieerde willekeurige invoeging van een niet-coderende DNA element gebruikt om op te lossen zijn optimale chromosomale positie.

Abstract

De optimale chromosomale stand(en) van een bepaald DNA element was/waren vastbesloten door transposon-gemedieerde willekeurige opneming gevolgd door fitness selectie. Bij bacteriën kunnen de gevolgen van de genetische context op de functie van een genetische element moeilijk te beoordelen zijn. Verschillende mechanismen, met inbegrip van topologische effecten, transcriptionele storing door naburige genen, en/of Replicatie-geassocieerde gene dosering, kunnen invloed hebben op de functie van een bepaalde genetische element. Hier beschrijven we een methode waarmee de willekeurige integratie van een DNA-element in het chromosoom van Escherichia coli en selecteer de meest gunstige locaties met behulp van een eenvoudige groei competitie experimenteren. De methode maakt gebruik van een goed beschreven transposon gebaseerde systeem van willekeurige toevoeging, in combinatie met een selectie van de sterkste clone(s) door groei voordeel, een procedure die is gemakkelijk instelbaar tot experimentele behoeften. De aard van de sterkste clone(s) kan worden bepaald door geheel-genoom sequentiebepaling van een complexe multi klonale populatie of door eenvoudig gen lopen voor de snelle identificatie van geselecteerde klonen. Hier, werd de niet-coderende DNA regio DARS2, die controles van de inleiding van chromosoom replicatie in E. coli, gebruikt als een voorbeeld. De functie van DARS2 is bekend worden beïnvloed door replicatie-geassocieerde gene dosering; de dichter DARS2 krijgt naar de oorsprong van DNA replicatie, Hoe actiever wordt. DARS2 was willekeurig ingevoegd op het chromosoom van een DARS2-stam verwijderd. De resulterende klonen met individuele invoegingen werden gebundeld en streden tegen elkaar voor honderden generaties. Ten slotte waren de sterkste klonen gekenmerkt en blijken te bevatten DARS2 ingevoegd in de nabijheid van de locatie van de oorspronkelijke DARS2 .

Introduction

De functie van een genetische element kan worden beïnvloed door de locatie in het genoom. In bacteriën resulteert dit voornamelijk van inmenging door de transcriptie van naburige genen, de lokale DNA topologie, en/of de replicatie-geassocieerde gene dosering. In het bijzonder de processen van DNA-replicatie en segregatie worden gecontroleerd, ten minste gedeeltelijk, door niet-coderende chromosomale regio1, en de werking van deze regio's hangt af van genomic locatie/context. In E.coli, voorbeelden zijn de dif -site, vereist voor zuster chromosoom resolutie2; KOPS sequenties, vereist voor3van de segregatie van chromosomen; en gegevens, DARS1en DARS2 regio's, nodig zijn voor de controle van de juiste chromosomale replicatie (hieronder; 4). presenteren we een methode waardoor de willekeurige bedrijfsverplaatsingen, selectie en bepaling van de optimale genetische context van een bepaalde genetische element, hier wordt geïllustreerd door de studie van de DARS2 niet-coderende regio.

In E. coli, DnaA is de initiatiefnemer eiwit verantwoordelijk voor opening om de interne replicatie oorsprongoriCbundel van DNA, en voor de aanwerving van de helicase DnaB5,6,7. DnaA behoort tot de AAA+ (dat wil zeggen, ATPasen die is gekoppeld aan diverse activiteiten) eiwitten en zowel ATP en ADP kunt binden met een vergelijkbaar hoge affiniteiten5. Het niveau van DnaAATP pieken op inleiding8, waar DnaAATP vormt een multimer op oriC dat DNA dubbelzijdig opening9triggers. Na de inleiding, oriC tijdelijk niet beschikbaar voor opnieuw starten als gevolg van de sekwestratie is gemaakt door een mechanisme waarbij de binding van het eiwit SeqA te hemimethylated oriC10,11. Tijdens sekwester, het niveau van DnaAATP wordt verminderd met ten minste twee mechanismen: de regelgevende inactivering van DnaA (RIDA)12,13 en gegevens-afhankelijke DnaAATP hydrolyse (DDAH)14 ,15. Zowel RIDA en DDAH bevordering van de omschakeling van DnaAATP te DnaAADP. Voorafgaand aan een nieuwe ronde van inleiding, DnaAADP is opnieuw geactiveerd te DnaAATP op specifieke opeenvolgingen van het DnaA-reactiveren (DARS): DARS1 en DARS216,17. De chromosomale gegevens, DARS1,en DARS2 regio's zijn niet-coderende en handelen op een chaperone-achtige wijze te moduleren DnaAATP/DnaAADP interconversion. Deze gebieden, gelegen buiten de oorsprong van replicatie inschakelen de vergadering van een complexe DnaA voor hetzij de inactivering (gegevens; 14) of activering (DARS1 en DARS2; 17) van DnaA. Verwijderen van DARS2 in een cel verandert niet massa verdubbeling tijd maar resultaten van asynchrone replicatie initiatie15,16,18. Echter DARS2-deficiënte cellen hebben een fitness kosten ten opzichte van een anders isogene wildtype tijdens de wedstrijd van beide continue groei in rijke medium of tijdens de totstandbrenging van kolonisatie van de darm van muis18. Dit geeft aan dat zelfs kleine veranderingen in de concentratie van de asynchrony/oorsprong een negatief effect hebben op bacteriële fitness. In E. coliis er een selectieve druk om het handhaven van chromosoom symmetrie (dat wil zeggen, twee bijna gelijke lengte replicatie arms)19. De gegevens, DARS1en DARS2 regio's hebben de dezelfde relatieve afstand tot oriC in alle E. coli stammen sequenced18, ondanks de grote verschillen in de grootte van het chromosoom.

Hier, gebruiken we de DARS2 regio van E. coli als voorbeeld voor de identificatie van de chromosomale stand(en) optimaal functioneren. DARS2 werd ingevoegd in de NKBOR transposon, en de resulterende NKBOR::DARS2 transposon vervolgens willekeurig ingevoegd in het genoom van MG1655 ΔDARS2. Wij aldus opgewekte een verzameling cellen, elk bezit DARS2 geplaatst op een andere locatie op het chromosoom. Een in vitro competitie experiment, waar alle cellen in de collectie waren gebundeld en streden tegen elkaar tijdens de continue groei in LB voor een geschatte 700 generaties, werd uitgevoerd. De uitkomst van het experiment van de competitie werd gecontroleerd/bepaald met behulp van zuidelijke vlek gemakkelijk gene wandelen en geheel-genoom sequencing (WGS; Figuur 1). Eindpunt klonen opgelost door eenvoudig gene lopen werden gekenmerkt door stroom cytometry te evalueren van de celcyclus parameters. In een flow cytometrische analyse, kunnen celgrootte, DNA-inhoud en inleiding synchrony worden gemeten voor een groot aantal cellen. Tijdens stroom cytometry, loopt een stroom van afzonderlijke cellen een lichtstraal van de juiste golflengte te prikkelen de gebeitst DNA, die wordt vervolgens tegelijkertijd geregistreerd door photomultipliers die het verzamelen van de uitgestoten fluorescentie, een maatregel van DNA de inhoud, mits de cellen zijn gekleurd voor DNA. De forward-strooilicht is een maatregel van cel massa20.

De in vitro competitie experiment we hier presenteren wordt gebruikt om kwesties met betrekking tot het belang van de chromosomale positie en genomische context van de genetische element. De methode is onbevooroordeeld en makkelijk te gebruiken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. collectie van de bibliotheek van Transposon

Opmerking: de chromosomale locus van DARS2 werd gekloond in de mini Tn 10-op basis van transposon, NKBOR (op pNKBOR) 21, wat resulteert in NKBOR:: DARS2 (pJFM1). pNKBOR kan worden verkregen online 22. pNKBOR is een R6K gebaseerde zelfmoord vector die de initiatiefnemer eiwit π voor replicatie 23 vereist. Plasmide pJFM1 daarom kan repliceren in een stam met E. coli (bijvoorbeeld Dh5α λ pir) met een chromosomale kopie van de pir-gen. Echter, wanneer de pJFM1 wordt omgezet in de Pir-deficiënte wildtype MG1655, pJFM1 niet repliceren, leidt tot de keuze van kanamycine-resistente klonen gegenereerd door de willekeurige inlassingen uit NKBOR:: DARS2 in het bacteriële chromosoom. Voor eenvoud, worden deze aangeduid als DARS2 invoegingen. Zie afbeelding 1 voor een schematische voorstelling van de methodologie.

  1. Voorbereiden electrocompetent MG1655 Δ DARS2 van de actief groeiende cellen in lysogenie Bouillon (LB) gekweekt bij 37 ° C 24.
  2. Electroporate pJFM1 in electrocompetent MG1655 Δ DARS2, volgens Gonzales et al. 24
    1. pJFM1 (in 1 µL van water) tot 40 µg add 1 µL van E. coli MG1655 electrocompetent Δ DARS2 en dit mengsel overbrengen in een cuvet vooraf gekoeld, steriele 0,2 cm tussenruimte. De cuvette invoegen de electroporation kamer. Electroporate op 18 kV, 500 Ω en 25 µF; De tijdconstante moet ~5.0 ms, en geen vonken plaatsvinden.
    2. De bacteriële suspensie snel te herstellen door het resuspending in 1 mL voorverwarmde de pond-Bouillon en overdracht aan een test tube van 15 mL.
    3. Laat de cellen herstellen door omstandigheden waaraan koolzuurgas is toegevoegd groei bij 37 ° C gedurende 30 minuten, zonder antibiotica selectie aan het broeden. Plaat van de bacteriën op LB agar platen aangevuld met 50µg/mL kanamycine en Incubeer bij 37 ° C's nachts.
  3. De kolonies van de electroporation tellen: één kolonie wordt beschouwd als gelijk aan één chromosomale transposon invoeging.
    Opmerking: Kolonies kunnen worden geteld door oog of met een Kolonieteller. Het aantal kolonies is omgekeerd evenredig aan de gemiddelde afstand tussen de transposons gelegen in het chromosoom van elke kloon.
  4. Add 1 mL van de pond-Bouillon aan elke plaat en wassen van alle kolonies; 1 mL van de pond-Bouillon moet voldoende zijn om te afwassen ~ 100.000 kolonies. Hergebruik de dezelfde 1 mL van de pond-Bouillon toe de bacteriële concentratie. Bundelen alle kolonies in de dezelfde tube van 50 mL.
  5. Vortex de buis en het bevriezen van de start-materiaal (t = 0). Om te bevriezen, meng 1 mL celsuspensie met 1 mL 50% glycerol op ijs. Overdracht van de buizen om droog ijs gedurende 10 minuten. Zodra de culturen zijn bevroren, overbrengen naar een vriezer-80 ° C.
    Opmerking: De concentratie van een cel van een minimum van 50.000 CFU/mL wordt verwacht bij deze stap.

2. Competitie Experiment in LB

  1. dooi de transposon bibliotheek van-80 ° C op ijs. Meng door pipetteren.
  2. Transfer 100 µL van de bibliotheek van transposon tot 10 mL voor LB in een reageerbuis 15 mL.
  3. Groeien de cellen, belucht door continue schudden (250 rpm), gedurende 8 uur bij 37 ° C tot stationaire fase (dat wil zeggen, OD 600 = ~ 4.0). Deze parameters aan verschillende groei omstandigheden, desgewenst aanpassen.
  4. De bacteriële bevolking door continue overdrachten in verse voorverwarmde medium elke ~ 10 generaties worden doorgegeven. Dit doen door overdracht van 10 µL van de vorige stationaire fase cultuur tot 10 mL van de verse LB en in toenemende mate van een andere 8 h aan de stationaire fase (dat wil zeggen, OD 600 = ~ 4.0).
    Opmerking: Als de optische dichtheid van begin- en einddatum gelijk zijn, een 1,000-fold verdunning komt overeen met ~ 10 generaties groei (2 10 = 1024). De bacteriële bevolking kan worden rechtstreeks in verse voorverwarmde medium doorgegeven of opgeslagen op 0-4 ° C (op ijs) en de volgende dag doorgegeven. LB werd hier gebruikt om zo veel cellulaire verdubbelingen in zo kort mogelijk (een verdubbeling keer dicht bij 22 min).
  5. Na elke 100 generaties van concurrentie, slaan vijf 1-mL monsters bij-80 ° C (zoals beschreven in stap 3.3).
  6. Als de fitness verschillen tussen cellen met individuele transposon invoegingen zijn naar verwachting zal kleine, houden de duur van wedstrijd lang; hier, 700 generaties (t = 700) dienden.

3. Zuidelijke vlek analyse om te controleren de concurrentie Experiment Over tijd

  1. bereiden de sonde voor de zuidelijke vlek (1-kb sectie van de NKBOR) door het uitvoeren van de polymerase-kettingreactie (PCR) versterking met behulp van specifieke primers: NKBOR_Probe_FW : gatgttggacgagtcggaat en NKBOR_Probe_RV: cgttacatccctggcttgtt.
    1. Incubate bij 98 ° C gedurende 30 s voor eerste denaturatie. Voer vervolgens 35 cycli bij 98 ° C voor 10 s, 60 ° C gedurende 30 s, en 72 ° C gedurende 45 s. Gebruiken voor de laatste uitbreiding, 72 ° C gedurende 10 minuten
      Opmerking: De sjabloon voor de PCR reactie was een gezuiverde pNKBOR plasmide 21.
    2. Het resulterende PCR fragment van een label met [α - 32P] dATP via het systeem willekeurig primer volgens Smith 25.
  2. De totale cellulaire DNA volgens Løbner-Olesen en von Freiesleben 26 voorbereiden op t = 0 en geselecteerde tijdstippen tot t = 700 generaties van concurrentie geschat.
  3. Verteren het totale cellulaire DNA met Pvu ik, die snijdt de NKBOR met de regio van belang eens alleen in een regio niet door de sonde gedekt; 1 eenheid van Pvu ik kan worden gebruikt om volledig digest 1 µg substraat DNA.
    Opmerking: De sonde zal herkennen fragmenten waarop een deel van de transposon, samen met de chromosomale DNA van verschillende lengtes, afhankelijk van de plaats van de invoegpositie.
  4. Uitvoeren van een zuidelijke vlek met behulp van een 0,7% agarose gel volgens Løbner-Olesen en von Freiesleben 26.

4. Identificatie van de sterkste klonen

  1. Gebruik gemakkelijk gene wandelen, zoals beschreven door Harrison et al. 27, DARS2 inbrengen sites van enkele klonen (geïsoleerd op LB platen) identificeren na 700 geschatte generaties van concurrentie; de meer bands op de Southern blot, de meer isolaten zijn nodig ter dekking van alle transposon invoegingen.
    1. Isolaat genomic DNA voor PCR sjabloon. Verspreiden bacteriën op een LB agarplaat met 50 µg Mo/mL kanamycine en Incubeer bij 37 ° C's nachts. Groeien enkele kolonies 's nachts in de pond-Bouillon bij 37 ° C en daarna Pipetteer 20 µL in 200 µL van gesteriliseerde met autoclaaf gedestilleerd water (of gebruik van DNA zuivering, zoals in stap 3.2).
      1. Vortex te mengen. Verwarm de mix bij 100 ° C voor 10 min en centrifugeer bij max snelheid gedurende 5 min. de cel lysate bij-20 ° C voor toekomstig gebruik opslaan.
    2. Ontwerp van de drie genestelde inleidingen te ontharden binnen het transposon van keuze (Zie Figuur 2 voor een grafische weergave van de PCR-strategie).
      Opmerking: Ontwerpen van inleidingen genest moet ervoor zorgen dat genest Primer 3 dichtst bij de bekende 5 ligt ' einde van het transposon DNA, gevolgd door geneste inleidingen 2 en 1. De afstand tussen geneste Primer 3 en de 5 ' einde van het bekende transposon DNA moet voldoende zijn voor een read-through van de reeks van het bekende DNA tot het onbekende DNA (de specifieke chromosomale transposon inbrengen om site te vinden). Voor NKBOR de volgende genestelde inleidingen werden gebruikt: pNKBOR_Nested3_RV: gcagggctttattgattcca, pNKBOR_Nested2_RV: tcagcaacaccttcttcacg, en pNKBOR_Nested1_RV: actttctggctggatgatgg. Willekeurige inleidingen met de sites van de erkenning van bekende restrictie-enzymen worden ook gebruikt. Om ervoor te zorgen een resultaat, moet men gebruik maken van ten minste twee verschillende willekeurige inleidingen. De beperkingsplaatsen voor de restrictie-enzymen (e.g.,Sau 3AI en Hin terugmatch) moeten worden gevestigd op de 3 ' beëindigen en voorafgegaan door tien willekeurige basen dus dat 5 ' - NNNNNNNNNNGATC - 3 ' en 5 ' - NNNNNNNNNNAAGCTT - 3 ' zijn de inleidingen met een Sau 3AI site (GATC) en een Hin terugmatch site (AAGCTT), respectievelijk, waar N = A, T, G en C.
    3. Gebruik 200 ng van genomic DNA in een 20 µL PCR reactie. Incubeer bij 98 ° C gedurende 30 s voor de eerste denaturatie. Uitvoeren van 25 cycli bij 98 ° C voor 30 s, 50 ° C gedurende 15 s, en 72 ° C gedurende 4 minuten. Voor de laatste uitbreiding, 72 ° C te gebruiken voor 10 min. gebruik primerparen bestaande uit genest Primer 1 en een van de willekeurige inleidingen.
    4. Primerparen bestaande uit genest Primer 2 en de dezelfde willekeurige primer van de tweede versterking, waarbij 1 µL van haar eerdere reactie als sjabloon gebruiken.
    5. Herhaal stap 4.1.4 met bestaande uit genest Primer 3 en de dezelfde willekeurige primer primerparen.
    6. Voer de producten uit de laatste PCR-reactie op een 1,5% agarose gel en de vlek met ethidiumbromide. Knip uit een band in het bereik 100-800 bp en isoleren van het DNA met behulp van een commerciële DNA-gel uitpakken kit volgens de fabrikant ' s richting. Resuspendeer de DNA in 15 µL water.
      Opmerking: Let op. Ethidiumbromide is giftig en moeten met zorg worden behandeld.
    7. Sequentie van de band in de vorige stap (stap 4.1.6), met geneste Primer 3 geïsoleerd als de sequencing primer, met behulp van Sanger sequencing bij een commerciële leverancier.
  2. Uitvoeren WGS.
    1. Uitvoeren op de totale DNA geëxtraheerd uit WGS geselecteerd monsters verzameld tijdens het experiment van de concurrentie, zoals beschreven door Frimodt-Møller et al. 4.
  3. Sequencing analyses uit te voeren.
    1. Uitlijnen gekoppeld-einde leest tot 150 Ns grenzen aan NKBOR, AF310136.1 1,904 … 2,204 Bowtie2 28 met een interval tussen zaad subtekenreeksen (S, 1, 1.15) en een maximum aantal onduidelijke tekens (L, 0, 0.9).
    2. Selecteer de uitgelijnde leest en vervolgens opnieuw uitlijnen op beide MG1655 ref | NC_000913.3 en NKBOR gb | AF310136 met behulp van blastN 29
    3. toewijzen omzetting invoeging posities bij kruisingen MG1655-NKBOR.

5. Stroom Cytometry

  1. verzamelen van monsters voor stroom cytometry.
    1. Evenwicht, elke cultuur door het behoud van het in de fase van de exponentiële groei van ten minste 10 generaties. De OD-600 controleren en ervoor te zorgen dat het nooit hoger is dan 0,3.
    2. Twee soorten stroom monsters verzamelen.
      1. Voor RIF-uitloop, breng 1 mL van de cultuur een tube van 15 mL met 30 µL van de RIF-CEF (300 µg/mL rifampicine en 36 µg/mL cephalexin opgelost in 12,5 mM NaOH). Laat het bij 37 ° C gedurende ten minste 4 uur schudden.
        Opmerking: Rifampicine niet indirect blokkeert de inleiding van chromosoom replicatie terwijl u voor lopende rondes van de replicatie tot beëindiging zou blijven. Cephalexin voorkomt celdeling, waardoor slijtage van de replicatie (RIF-uitloop) en de accumulatie van cellen met volledig gerepliceerde chromosomen. Het aantal volledig gerepliceerde chromosomen is gelijk aan het aantal oorsprong ten tijde van de behandeling met rifampicine en cephalexin 20.
      2. Voor de EXP-steekproef, overdracht 1 mL van de exponentieel groeiende cultuur tot een 1.5-mL koker op ice.
  2. De cellen als volgt oplossen. Oogsten van de cellen door centrifugeren bij 15.000 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. resuspendeer de pellet in 100 µL van de ijskoude 10 mM Tris pH 7.5 en voeg 1 mL ijskoud 77% ethanol. Bewaren van de monsters bij 4 ° C tot gebruik.
  3. Vlek de cellen als volgt. Oogsten van 100-300 µL van vaste cellen door centrifugeren bij 15.000 x g gedurende 15 min. verwijderen het supernatant en resuspendeer de pellet in 130 µL van " DNA kleuring oplossing " (90 µg/mL mithramycin, 20 µg Mo/mL ethidiumbromide, 10 mM MgCl 2 en 10 mM Tris pH 7.5). Zet de monsters op ijs en in het donker; de monsters zijn klaar voor stroom cytometry analyse na 10 min.
    Opmerking: Andere DNA vlekken dan ethidiumbromide en mithramycin kunnen ook gebruikte 30 , 31.
  4. Bepalen van de oorsprong per cel, de relatieve cel-massa en de relatieve inhoud van DNA door stroom cytometry analyse.
    1. Uitvoeren stroom cytometry, zoals eerder beschreven 32. RIF-uitloop en EXP-monsters met behulp van de stroom cytometer fabrikant uitvoeren ' s instructies . Gebruik van excitatie golflengten 395 en 440 nm voor mithramycin- en ethidium bromide gebeitste cellen, en verzamelen de fluorescentie boven 565 nm.
      1. Te bepalen van de relatieve inhoud van cel massa en relatieve DNA, lopen de EXP-monsters om één-parameter vooruit-licht scatter versus cel nummer histogrammen en intensiteit van de fluorescentie versus cel nummer histogrammen voor een minimum van 30.000 gebeurtenissen te verkrijgen overeenkomt met de cel signaal.
      2. Gebruik voorwaartse-verstrooid single-parameter lichtverdeling te meten van de gemiddelde relatieve cel mass.
        Opmerking: Voorwaartse-verstrooid licht is een maat voor de gemiddelde cel massa 20.
      3. Gebruik fluorescentie intensiteit single-parameter distributies voor het meten van de gemiddelde DNA inhoud 20.
      4. Verkrijgen van de DNA-concentratie als de verhouding van het gemiddelde gehalte aan DNA aan de gemiddelde cel massa 20.
    2. Bepalen het aantal oorsprong per cel.
      1. Run RIF-uitloop monsters te verkrijgen van de intensiteit van de fluorescentie van de één-parameter versus cel nummer histogrammen voor een minimum van 30.000 gebeurtenissen die overeenkomt met de cel signaal.
      2. Gebruik fluorescentie intensiteit single-parameter uitkeringen aan het bepalen van het aantal chromosomen in elke cel 20.
  5. Berekenen de asynchrony index (Ai).
    1. Berekenen de Ai, zoals beschreven door Løbner-Olesen et al. 32, met behulp van de fluorescentie intensiteit enkele parameter distributies van de RIF-uitloop monsters en de formule Ai = (f3 + f5 f6 + f7) / (f2 + f4- + f8), waar fx is de cellen van de breuk met x aantal volledig gerepliceerde chromosomen. Inwijdingen wanneer asynchrone overwegen A > 0.1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Een zuidelijke vlek werd gedaan om te verifiëren dat de DARS2 willekeurig was verspreid over het chromosoom in de bibliotheek van transposon (t = 0) en die het geschiktst klonen na verloop van tijd zou aanhouden. De zuidelijke vlek werd uitgevoerd op DNA geëxtraheerd uit het eerste transposon zwembad (op t = 0) en elke geschatte 100 uit 700 generaties van de concurrentie (Figuur 3). Hier, de totale cellulaire DNA van elk moment-punt werd verteerd met de Pvuik restrictie-enzym, bekend te snijden transposon NKBOR::DARS2 eens alleen in een regio die niet worden gedekt door de sonde. De zuidelijke vlek was gesondeerd met een radioactief gelabelde fragment van DNA aanvulling op deel van NKBOR. Zoals blijkt uit Figuur 3, het eerste DARS2 -zwembad (t = 0) miste verschillende bands, waaruit blijkt dat de DARS2 willekeurig in het chromosoom is ingevoegd. Na verloop van tijd een patroon ontstaan waar de eerste grote pool van DARS2 klonen uitgegroeid tot slechts een of een paar hardnekkige DARS2 klonen (Figuur 3; t = 0 voor t = 700).

In het voorbeeld, werden DARS2 inbrengen sites van de concurrentie-experiment geïdentificeerd met behulp van WGS en gemakkelijk gene lopen. Hier, WGS werd gebruikt om te identificeren invoeging sites uit het start-zwembad (t = 0) en na 300, 400 en 700 generaties van de concurrentie. Merk op dat de dekking in de huidige diepe sequencing onvoldoende voor een volledige toewijzing van invoeging sites op t was = 0; het geeft echter een representatieve subset van het totale aantal invoegingen. WGS bevestigd het zuidelijke vlek resultaat (dat wil zeggen, de selectie van de sterkste DARS2 klonen), eindigend met ongeveer 98% van alle DARS2 invoegingen Kortbij de wildtype DARS2 chromosomale locatie (DARS2 Kloon IR en kloon rppH), terwijl de resterende 2% elders op het chromosoom (Figuur 4 waren). Dit suggereert sterk dat de positie van wildtype optimaal voor de DARS2 functie is. Op t = 400, sluissymbool bleek op de tegenovergestelde arm van de replicatie met een bijna identieke afstand tot oriC als de wildtype DARS2 positie (Figuur 4), maar deze toevoeging werd niet teruggevonden na 700 generaties. Dus, replicatie-geassocieerde gene dosering kan niet de enige bepalende factor voor optimale positie.

Gemakkelijk gene wandelen was gebruikt ter identificatie van de DARS2 invoegingen sites in één klonen geïsoleerd na 700 geschatte generaties van de concurrentie. Hier, werden de twee DARS2 inbrengen sites bovengenoemde (DARS2 kloon IR en kloon rppH) geïdentificeerd. Gemakkelijk gene wandelen alleen op 20 klonen werd gedaan, en dit verklaart waarom alle DARS2 invoegingen sites toegewezen in WGS niet werden geïdentificeerd. DARS2-deficiënte cellen werden eerder getoond tot replicatie in asynchrony en hebben een afname van de concentratie van de oorsprong ten opzichte van wildtype cellen4,16,17, 18. wij daarom stroom cytometry gebruikt om op te lossen de synchrony in de inleiding van DNA-replicatie en cellulaire oorsprong-inhoud voor de twee geselecteerde stammen (DARS2 kloon IR en kloon rppH) heeft in beide gevallen werden teruggezet naar wildtype niveaus (Figuur 5). Een representatief voorbeeld van een stam die het bezitten van een enkele kopie van DARS2 gelegen in het eindpunt wordt weergegeven (Figuur 5E). Hier, wordt de aanwezigheid van een DARS2 -element in het eindpunt niet hersteld synchrony of de inhoud van de cellulaire oorsprong tot wildtype niveaus, terwijl de geselecteerde DARS2 IR klonen en rppH doen.

Figure 1
Figuur 1 : Overzicht van de methodologie. Schematische voorstelling van de methodologie. De chromosomale DARS2 regio wordt gekloond in de mini Tn10 op pNKBOR, maken van pJFM1. pJFM1 wordt omgezet in E. coli MG1655 ΔDARS2, die een willekeurige invoeging van DARS2 triggers gekoppeld aan Tn10 op het chromosoom van E. coli MG1655 ΔDARS2. Ongeveer 70.000 klonen, elk met een verschillende chromosomale DARS2 inbrengen, werden gebundeld en streden rechtstreeks tegen elkaar in de pond-Bouillon bij 37 ° C. Het experiment van de directe concurrentie in de pond-Bouillon werd uitgevoerd voor een geschatte 700 generaties, waar een steekproef werd geïsoleerd voor elke 100 generaties van rechtstreekse concurrentie. Het totale DNA was uit elke geïsoleerde monster geëxtraheerd en gebruikt voor Southern blotting en de identificatie van de DARS2 invoegingen door WGS. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 : Grafische presentatie gemakkelijk gene lopen. Deze afbeelding toont een genomic DNA-sjabloon van een onbekende DNA-sequentie grenzend aan een bekende opeenvolging met priming sites voor de willekeurige primer en geneste inleidingen 1, 2 en 3. De resultaten van de drie opeenvolgende amplifications uitgevoerd met behulp van de drie ontworpen genestelde inleidingen zijn hieronder geïllustreerd. Het eindproduct (vanaf ronde 3) is sequenced met behulp van geneste Primer 3. Dit cijfer werd aangepast van Harrison et al. 27. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 : Southern blot gesondeerd voor NKBOR. Zuidelijke vlekkenanalyse van DARS2 inlassingen in een DARS2-deficiënte stam. Genomic DNA geëxtraheerd uit elke ~ 100 generaties van directe concurrentie, die bij t beginnen = 0 en eindigt bij 700 generaties, waren verteerd met Pvuik en gel-gefractioneerde. De vlek werd gekruist met een NKBOR probe (Zie het Protocol). t geeft het aantal generaties van de concurrentie. Dit cijfer werd aangepast van Frimodt-Møller et al. 4. HMW en LMW zijn hoog-moleculair gewicht en laag-moleculair gewicht DNA, respectievelijk. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4 : Grafische weergave van ddnsm.all_errresolv="omzettenEd transposon invoegingen sites in ΔDARS2. De posities van oriC, gegevens, DARS1, DARS2, en terC worden aangeduid. DARS2 inbrengen sites in ΔDARS2 op t = 0 (zwarte balken), t = 400 (licht blauwe staven), t = 500 (rode balken), en t = 700 (groene balken), opgelost door full-genoom sequentiebepaling. Dit cijfer is gemaakt met behulp van DNAPlotter33 en werd aangepast van Frimodt-Møller et al. 4. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5 : Vertegenwoordiger stroom cytometry histogrammen van transposon sites gevonden door eenvoudig gene wandelen op t = 700. Cellen werden gekweekt in minimaal medium AB aangevuld met 0,2% glucose, 10 µg/mL thiamine, en 0,5% casamino zuren bij 37 ° C. Wildtype en ΔDARS2 staan in A en B, respectievelijk. Derivaten van de stam van wildtype MG1655 verstoken van DARS2 bij de oorspronkelijke locus en in plaats daarvan dragen een kopie van DARS2 op de opgelost transposon site rrpH, IR en het eindpunt (terC) worden weergegeven in de C, D en E, respectievelijk. Dit cijfer werd aangepast van Frimodt-Møller et al. 4 om te laten zien van een DARS2 locatie die leidt tot de anomalie van een celcyclus (terC) of dat het fenotype van wildtype herstelt(rrpH, IR). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De hier gebruikte methode maakt gebruik van state-of-the-art technieken een moeilijke vraag met betrekking tot de optimale genomic positie van een genetische element te beantwoorden. De willekeurige invoeging van het genetische element (gemedieerd door de transposon) maakt het snel en gemakkelijk collectie van duizenden klonen, die vervolgens kunnen worden aangebracht om te concurreren tegen elkaar te selecteren voor de optimale positie van het onderzochte genetische element (d.w.z. de sterkste kloon).

Hier, DARS2 werd ingevoegd in de mini-Tn10-op basis van transposon, NKBOR. De keuze van transposon is belangrijk voor de downstream-analyse van ingevoegde sites. Verscheidene verschillende transposons zijn gebruikt in transposon geleide invoeging-site rangschikken (TraDIS) experimenten, zoals mini-Tn5Km234 en de meer populaire keuze, de Himar ik Mariner transposon35, 36 (Zie voor een recente review van deze, van Opijnen en Camilli36). We gericht voor 70.000 eerste willekeurige inlassingen uit DARS2, waardoor ongeveer een DARS2 inbrengen 65 Evert bp in het genoom van de MG1655. Dit kan eenvoudig worden aangepast door het verminderen of het verhogen van de eerste pool van kolonies verzameld.

Hier hebben we gekozen voor continue overdrachten in LB batch culturen, maar de concurrentie experiment kan ook worden uitgevoerd in een ander medium of onder verschillende omstandigheden, waaronder het gebruik van een chemostat-37. Bovendien kan de procedure worden gewijzigd voor de eventuele voorwaarden van keuze, met inbegrip van verschillende benadrukt, zoals oxidatieve, osmotische of antibiotica stress. Om te controleren of de aanwezigheid van aanhoudende klonen na verloop van tijd, kan een ten minste drie dingen doen: WGS; transposon sequencing (Tn-Seq); of, zoals hier, een zuidelijke vlek. Tot slot kan gemakkelijk gene wandelen worden gedaan op een paar klonen, met het extra voordeel dat transposon invoeging sites geïdentificeerd worden op één klonen, zodanig dat het effect van de specifieke invoeging site fenotypische kan worden geanalyseerd.

De keuze van fenotypische assay te evalueren van de uitkomst van een experiment van de concurrentie, is afhankelijk van de onderzochte regio. We gebruiken stroom cytometry, dat is een krachtige methode voor het meten van de celcyclus parameters van bacteriën. Hier, stroom cytometry geopenbaard dat de geselecteerde chromosomale stand(en) van DARS2, (dat wil zeggen, de DARS2 invoegingen dicht bij het standpunt van wildtype DARS2 ) resulteerde in de juiste regulering van replicatie initiatie) dat wil zeggen, synchrony en DNA-concentratie). De optimale chromosomale stand(en) voor DARS2 werden gedeeltelijk geselecteerd vanwege de goede replicatie-geassocieerde gene dosering en deels vanwege het gunstige lokale genomic milieu dat belangrijk is voor de DARS2 functie4.

Hier, een niet-coderende DNA element werd onderzocht, maar dit zou kunnen worden uitgebreid tot elke codering regio van keuze. Een recente studie vond dat het niveau van de genexpressie gevarieerd ~ 300-fold, afhankelijk van de positie op het chromosoom, zonder duidelijke correlatie met replicatie-geassocieerde gene dosering38. De hier beschreven aanpak zou belangrijk inzicht verschaffen in de relatie tussen de genomic locatie van een bepaald gen, haar transcriptionele activiteit en het bijbehorende fitness voordeel. Dit kan in theorie helpen met de selectie van genomic posities, wat leidt tot de sterkere uitdrukking van een bepaald gen, die op zijn beurt van belang voor engineering nieuwe, verbeterde variëteiten productie van recombinante eiwitten zijn kan.

Omdat E. coli beperkte regio intergenic's39 bevat, zal de transposon invoegingen in de meeste gevallen verstoren over gene(s). Dit kan soms leiden tot valse positieven, waar de sterkste clone(s) zijn niet geselecteerd als gevolg van de optimale chromosomale positie van de genetische element in kwestie, maar eerder omdat een gen wordt verstoord - die, in andere opzichten biedt een fitness voordeel tijdens de competitie experiment4.

Deze methode maakt gebruik van een easy-to-use transposon systeem, waar elke regio van keuze kan worden geïntegreerd op willekeurige locaties. Het ontworpen competitie experiment kan worden aangepast voor het bevatten van een willekeurig aantal selectie krachten dan pure groei, zoals hier te zien. De instelling kan ook worden gewijzigd om te worden puur op basis van Tn-Seq, die resulteert in een grotere resolutie van de volgorde van ingevoegde sites dan WGS, hier gebruikt. Deze onbevooroordeelde benadering moet worden gebruikt voor het verhelderen van de opwindende nieuwe functies in hij-tot nu toe genfunctieonderzoek organismen, die aantonen kunnen dat de gemeenschappelijke trends in de chromosomale organisatie van Eubacteria aanwezig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belang.

Acknowledgments

De auteurs werden gefinancierd door subsidies van de Novo Nordisk Foundation, de Stichting Lundbeck en de Deense nationale Research Foundation (DNRF120) door het centrum voor bacteriële stressrespons en persistentie (BASP).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Autoclaved Mili-Q water None
Electroporation Cuvettes, 0.1 cm Thermo Fisher Scientific P41050
Bio-Rad MicroPulser Electroporation System Bio-Rad 165-2100
LB Broth Thermo Fisher Scientific 12780029 
LB Agar, powder (Lennox L agar) Thermo Fisher Scientific 22700025
Glycerol Thermo Fisher Scientific 17904
Fisherbrand Plastic Petri Dishes Fisher Scientific S33580A
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-432-22
Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-959-53A
Nunc CryoTubes Sigma-Aldrich V7634 
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/µL) Thermo Fisher Scientific F530S
dATP, [α-32P]- 3000Ci/mmol 10mCi/ml, 250 µCi PerkinElmer BLU012H250UC
DECAprime II DNA Labeling Kit Thermo Fisher Scientific AM1455
Spectrophotometer  SF/MBV/03.32 Pharmacia
Hermle Centrifuge    SF/MBV/03.46 Hermle
Ole Dich Centrifuge  SF/MBV/03.29 Ole Dich
Eppendorftubes 1.5 mL Sigma-Aldrich T9661
Eppendorftubes 2.0 mL Sigma-Aldrich T2795
Sodium Chloride Merck 6404
96% Ethanol Sigma-Aldrich 16368
Trizma HCl Sigma-Aldrich T-3253
Phenol Ultra Pure BRL 5509UA
Chloroform Merck 2445
Ribonuclease A type II A Sigma-Aldrich R5000
Sodiumdodecylsulphate (SDS) Merck 13760
Lysozyme Sigma-Aldrich L 6876
Isopropanol Sigma-Aldrich 405-7
0.5M Na-EDTA pH 8.0 BRL 5575 UA
Kanamycin sulfate Sigma-Aldrich 10106801001
PvuI (10 U/µL) Thermo Fisher Scientific ER0621
UltraPure Agarose Thermo Fisher Scientific 16500500
DNA Gel Loading Dye (6X) Thermo Fisher Scientific R0611
Tris-Borate-EDTA buffer Sigma-Aldrich T4415
Ethidium bromide Sigma-Aldrich E7637
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 433160
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich 71687
Whatman 3MM papers Sigma-Aldrich WHA3030931
SSC Buffer 20× Concentrate Sigma-Aldrich S6639
Amersham Hybond-N+ GE Healthcare RPN119B
Ficoll 400 Sigma-Aldrich F8016
Polyvinylpyrrolidone Sigma-Aldrich PVP40
Bovine Serum Albumin - Fraction V Sigma-Aldrich 85040C
Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes Sigma-Aldrich D1626
Carestream Kodak  BioMax  light film Sigma-Aldrich Z373494
GenElute  Gel Extraction Kit Sigma-Aldrich NA1111 
GenElute  PCR Clean-Up Kit Sigma-Aldrich NA1020
T100  Thermal Cycler Bio-Rad
SmartSpec Plus Spectrophotometer Bio-Rad
Rifampicin Serva 34514.01
Cephalexin Sigma-Aldrich C4895
Mithramycin Serva 29803.02
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich 246964
Apogee A10 instrument Apogee

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frimodt-Moller, J., Charbon, G., Lobner-Olesen, A. Control of bacterial chromosome replication by non-coding regions outside the origin. Curr Genet. , (2016).
  2. Sherratt, D. J., et al. Recombination and chromosome segregation. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 359 (1441), 61-69 (2004).
  3. Bigot, S., et al. DNA motifs that control E. coli chromosome segregation by orienting the FtsK translocase. EMBO J. 24 (21), 3770-3780 (2005).
  4. Frimodt-Moller, J., Charbon, G., Krogfelt, K. A., Lobner-Olesen, A. DNA Replication Control Is Linked to Genomic Positioning of Control Regions in Escherichia coli. PLoS Genet. 12 (9), 1006286 (2016).
  5. Kornberg, A., Baker, T. A. DNA Replication, Second Edition. , University Science Books. (1992).
  6. Kaguni, J. M. Replication initiation at the Escherichia coli chromosomal origin. Curr Opin Chem Biol. 15 (5), 606-613 (2011).
  7. Leonard, A. C., Grimwade, J. E. Regulation of DnaA assembly and activity: taking directions from the genome. Annu Rev Microbiol. 65, 19-35 (2011).
  8. Kurokawa, K., Nishida, S., Emoto, A., Sekimizu, K., Katayama, T. Replication cycle-coordinated change of the adenine nucleotide-bound forms of DnaA protein in Escherichia coli. EMBO J. 18 (23), 6642-6652 (1999).
  9. Sekimizu, K., Bramhill, D., Kornberg, A. ATP activates dnaA protein in initiating replication of plasmids bearing the origin of the E. coli chromosome. Cell. 50 (2), 259-265 (1987).
  10. Brendler, T., Austin, S. Binding of SeqA protein to DNA requires interaction between two or more complexes bound to separate hemimethylated GATC sequences. EMBO J. 18 (8), 2304-2310 (1999).
  11. Lu, M., Campbell, J. L., Boye, E., Kleckner, N. SeqA: a negative modulator of replication initiation in E. coli. Cell. 77 (3), 413-426 (1994).
  12. Katayama, T., Kubota, T., Kurokawa, K., Crooke, E., Sekimizu, K. The initiator function of DnaA protein is negatively regulated by the sliding clamp of the E. coli chromosomal replicase. Cell. 94 (1), 61-71 (1998).
  13. Kato, J., Katayama, T. Hda, a novel DnaA-related protein, regulates the replication cycle in Escherichia coli. EMBO J. 20 (15), 4253-4262 (2001).
  14. Kasho, K., Katayama, T. DnaA binding locus datA promotes DnaA-ATP hydrolysis to enable cell cycle-coordinated replication initiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (3), 936-941 (2013).
  15. Kitagawa, R., Ozaki, T., Moriya, S., Ogawa, T. Negative control of replication initiation by a novel chromosomal locus exhibiting exceptional affinity for Escherichia coli DnaA protein. Genes Dev. 12 (19), 3032-3043 (1998).
  16. Fujimitsu, K., Senriuchi, T., Katayama, T. Specific genomic sequences of E. coli promote replicational initiation by directly reactivating ADP-DnaA. Genes Dev. 23 (10), 1221-1233 (2009).
  17. Kasho, K., Fujimitsu, K., Matoba, T., Oshima, T., Katayama, T. Timely binding of IHF and Fis to DARS2 regulates ATP-DnaA production and replication initiation. Nucleic Acids Res. 42 (21), 13134-13149 (2014).
  18. Frimodt-Moller, J., Charbon, G., Krogfelt, K. A., Lobner-Olesen, A. Control regions for chromosome replication are conserved with respect to sequence and location among Escherichia coli strains. Front Microbiol. 6, 1011 (2015).
  19. Bergthorsson, U., Ochman, H. Distribution of chromosome length variation in natural isolates of Escherichia coli. Mol Biol Evol. 15 (1), 6-16 (1998).
  20. Boye, E., Steen, H. B., Skarstad, K. Flow cytometry of bacteria: a promising tool in experimental and clinical microbiology. J Gen Microbiol. 129 (4), 973-980 (1983).
  21. Rossignol, M., Basset, A., Espeli, O., Boccard, F. NKBOR, a mini-Tn10-based transposon for random insertion in the chromosome of Gram-negative bacteria and the rapid recovery of sequences flanking the insertion sites in Escherichia coli. Res Microbiol. 152 (5), 481-485 (2001).
  22. SHIGEN. , Available from: http://shigen.nig.ac.jp (2017).
  23. Shafferman, A., Helinski, D. R. Structural properties of the beta origin of replication of plasmid R6K. J Biol Chem. 258 (7), 4083-4090 (1983).
  24. Gonzales, M. F., Brooks, T., Pukatzki, S. U., Provenzano, D. Rapid protocol for preparation of electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae. J Vis Exp. (80), (2013).
  25. Smith, D. R. Random primed labeling of DNA. Methods Mol Biol. 18, 445-447 (1993).
  26. Lobner-Olesen, A., von Freiesleben, U. Chromosomal replication incompatibility in Dam methyltransferase deficient Escherichia coli cells. EMBO J. 15 (21), 5999-6008 (1996).
  27. Harrison, R. W., Miller, J. C., D'Souza, M. J., Kampo, G. Easy gene walking. Biotechniques. 22 (4), 650-653 (1997).
  28. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  29. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 215 (3), 403-410 (1990).
  30. Stepankiw, N., Kaidow, A., Boye, E., Bates, D. The right half of the Escherichia coli replication origin is not essential for viability, but facilitates multi-forked replication. Mol Microbiol. 74 (2), 467-479 (2009).
  31. Lobner-Olesen, A. Distribution of minichromosomes in individual Escherichia coli cells: implications for replication control. EMBO J. 18 (6), 1712-1721 (1999).
  32. Lobner-Olesen, A., Skarstad, K., Hansen, F. G., von Meyenburg, K., Boye, E. The DnaA protein determines the initiation mass of Escherichia coli K-12. Cell. 57 (5), 881-889 (1989).
  33. Carver, T., Thomson, N., Bleasby, A., Berriman, M., Parkhill, J. DNAPlotter: circular and linear interactive genome visualization. Bioinformatics. 25 (1), 119-120 (2009).
  34. Eckert, S. E., et al. Retrospective application of transposon-directed insertion site sequencing to a library of signature-tagged mini-Tn5Km2 mutants of Escherichia coli O157:H7 screened in cattle. J Bacteriol. 193 (7), 1771-1776 (2011).
  35. van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms. Nat Methods. 6 (10), 767-772 (2009).
  36. van Opijnen, T., Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nat Rev Microbiol. 11 (7), 435-442 (2013).
  37. Jeong, H., Lee, S. J., Kim, P. Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat. J Vis Exp. (115), (2016).
  38. Bryant, J. A., Sellars, L. E., Busby, S. J., Lee, D. J. Chromosome position effects on gene expression in Escherichia coli K-12. Nucleic Acids Res. 42 (18), 11383-11392 (2014).
  39. Blattner, F. R., et al. The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).

Tags

Genetica kwestie 127 Random transposon invoeging zwembad cultuur competitie optimale genomic context geheel-genoom sequencing gemakkelijk gene wandelen celcyclus analyse door stroom cytometry
Bepaling van de optimale chromosomale locatie (s) voor een DNA Element in <em>Escherichia coli</em> met behulp van een nieuwe benadering van Transposon-gemedieerde
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Frimodt-Møller, J., Charbon,… More

Frimodt-Møller, J., Charbon, G., Krogfelt, K. A., Løbner-Olesen, A. Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach. J. Vis. Exp. (127), e55946, doi:10.3791/55946 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter