Summary
Aquí, el poder de una inserción al azar de un elemento de DNA no codificante mediada por transposones se utilizó para resolver su posición cromosómica óptima.
Abstract
La posición o posiciones cromosómica óptima de un determinado elemento de ADN fue/fueron determinada por la inserción al azar mediada por transposones, seguido por la selección de fitness. En bacterias, el impacto del contexto genético de la función de un elemento genético puede ser difícil de evaluar. Varios mecanismos, incluyendo efectos topológicos, interferencia transcripcional de genes vecinos, o dosis de gen asociado de replicación, pueden afectar la función de un elemento genético. Aquí, describimos un método que permite la integración al azar de un elemento de DNA en el cromosoma de Escherichia coli y seleccionar las ubicaciones más favorables mediante una competencia de crecimiento simple experimentan. El método aprovecha de un bien-descrito transposones-sistema de inserción al azar, juntada con una selección de los más aptos clone(s) ventaja del crecimiento, un procedimiento que es fácilmente ajustable a las necesidades experimentales. Puede determinarse la naturaleza de la clone(s) más aptos por todo el genoma que ordenaba en una población clonal múltiples compleja o por gene fácil para la identificación rápida de clones seleccionados. Aquí, la región no codificante de ADN DARS2, que controla la iniciación de la replicación del cromosoma de e. coli, fue utilizada como ejemplo. La función de DARS2 es conocida por ser afectados por dosis de gen asociado de replicación; el más DARS2 obtiene el origen de replicación del ADN, más activo se convierte. DARS2 fue insertado al azar en el cromosoma de un DARS2-elimina la tensión. Los clones resultantes que contienen inserciones individuales se agruparon y compitieron entre sí a cientos de generaciones. Finalmente, los clones más aptos se caracteriza y contiene DARS2 en proximidad cercana a la ubicación original de DARS2 .
Introduction
La función de cualquier elemento genético puede verse afectada por su localización en el genoma. En las bacterias, esto resulta fundamentalmente de interferencia por la transcripción de genes vecinos, local topología de ADN o dosis de gen asociado de replicación. En particular, los procesos de replicación del DNA y la segregación son controlados, al menos en parte, por las regiones cromosómicas no codificante1y el funcionamiento de estas regiones depende de situación/contexto genómico. En e. coli, los ejemplos son el sitio de dif , necesario para la hermana de resolución del cromosoma2; Secuencias KOPS, necesarias para de la segregación del cromosoma3; datos, DARS1y DARS2 regiones, requeridas para el control de la replicación cromosómica adecuada (abajo; 4). se presenta un método que permite la reubicación al azar, la selección y la determinación del contexto genético óptimo de cualquier elemento genético, ejemplificados aquí por el estudio de la región no codificante de DARS2 .
En e. coli, DnaA es la proteína del iniciador responsable de filamento de la DNA en la replicación solo origenoriCy para la contratación de la helicasa DnaB5,6,7. DnaA pertenece a la AAA+ (es decir, asociados a diversas actividades de ATPasas) proteínas y puede enlazar ATP y ADP con similar alta afinidad5. El nivel de DnaAATP picos en iniciación8, donde DnaAATP forma un multimer en oriC que activa el ADN dúplex apertura9. Después de la iniciación, oriC se hace disponible para la iniciación debido a secuestro por un mecanismo que implica el atascamiento de la proteína SeqA hemimethylated oriC10,11. Durante el secuestro, se reduce el nivel de DnaAATP por al menos dos mecanismos: la regulación inactivación de DnaA (RIDA)12,13 y datos-DnaA dependienteATP hidrólisis (DDAH)14 ,15. RIDA y DDAH promoción la conversión de DnaAATP aADPde DnaA. Antes de una nueva ronda de iniciación, DnaAADP se reactiva a DnaAATP en secuencias específicas de reactivación de DnaA (DARS): DARS1 y DARS216,17. La cromosómica datos, DARS1y DARS2 regiones son no codificante y actuar de una manera como acompañante para modular DnaAATPADP interconversión de /DnaA. Estas regiones, las afueras del origen de replicación, que al montaje de un complejo de DnaA para cualquiera la inactivación (datos; 14) o activación (DARS1 y DARS2; 17) de DnaA. Eliminación de DARS2 en una celda no altera masa doblar tiempo pero resulta en replicación asincrónica iniciación15,16,18. Sin embargo, DARS2-células deficientes tienen un gimnasio costo comparado con un tipo de salvaje lo contrario isogénicas durante ambos competencia de continuo crecimiento en medio rico o en el establecimiento de la colonización en el intestino de ratón18. Esto indica que incluso pequeños cambios en la concentración de asincronía/origen tienen un efecto negativo en fitness bacteriano. En e. coli, hay una presión selectiva para mantener la simetría (es decir, dos brazos de la replicación de casi igual longitud) de cromosoma19. Los datos, DARS1y DARS2 regiones tienen la misma distancia relativa a oriC en todo e. coli cepas secuenciadas18, a pesar de grandes variaciones en el tamaño del cromosoma.
Aquí, utilizamos la región DARS2 de e. coli como ejemplo para la identificación de los puestos cromosómicas óptimos para su función. DARS2 fue insertado en el transposon NKBOR y la resultante NKBOR:: transposonDARS2 posteriormente se inserta al azar en el genoma de MG1655 ΔDARS2. Así generó una colección de células, cada posesión DARS2 colocado en un lugar diferente en el cromosoma. Se realizó un en vitro competencia experimento, donde todas las células de la colección fueron agrupadas y compitieron entre sí durante el crecimiento continuo en libras para un estimado generaciones 700. El resultado del experimento de competencia monitoreados/determinó mediante Southern blot, gene fácil caminar y secuenciación del genoma completo (gt; Figura 1). Clones de punto final resueltas por gene fácil caminar se caracterizaron por citometría de flujo para evaluar los parámetros de ciclo celular. En un análisis cytometric del flujo, tamaño de celda, el contenido de ADN y sincronía de iniciación se pueden medir para un gran número de células. En citometría de flujo, un flujo de células pasa un haz de luz de la longitud de onda adecuada para excitar el ADN teñido, que entonces está simultáneamente registrado por photomultipliers que recogen la fluorescencia emitida, una medida de contenido de ADN, siempre la las células se tiñen para ADN. La luz dispersada hacia adelante es una medida de masa celular20.
El experimento de competencia en vitro que presentamos aquí se utiliza para abordar las cuestiones relativas a la importancia de la posición cromosómica y el contexto genómico del elemento genético. El método es fácil de usar e imparcial.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. colección de la biblioteca del Transposon
Nota: el locus cromosómico de DARS2 fue clonado en la mini Tn 10-basado transposon, NKBOR (en pNKBOR) 21, resultando en NKBOR:: DARS2 (pJFM1). pNKBOR pueden obtenerse en línea 22. pNKBOR es un vector basado en R6K suicida que requiere el π de la proteína del iniciador para replicación 23. Plásmido pJFM1 por lo tanto es capaz de replicar en una cepa de e. coli (por ejemplo, Dh5α λ pir) que contiene una copia cromosómica del gene del pir. Sin embargo, cuando pJFM1 se transforma en el Pir-deficiente wildtype MG1655, pJFM1 no pueden replicar, llevando a la selección de clones resistentes a kanamicina generados por las inserciones aleatorias de NKBOR:: DARS2 en el cromosoma bacteriano. Para simplificar, estas se denominan inserciones DARS2. Vea la figura 1 para una presentación esquemática de la metodología de.
- Preparar espectro MG1655 Δ DARS2 de crecimiento de las células en caldo de lisogenia (LB) a 37 ° C 24.
- Electroporate pJFM1 en Δ de espectro MG1655 DARS2, según González et al. 24
- agregue 1 μg de pJFM1 (en 1 μl de agua) a 40 μl de espectro MG1655 de e. coli Δ DARS2 y transferir esta mezcla a una cubeta de brecha de 0.2 cm estéril, previamente enfriada. Insertar la cubeta en la cámara de electroporación. Electroporate a 18 kV, Ω 500 y 25 μF; la constante de tiempo debe ser ~5.0 ms, y no hay formación de arcos ocurre.
- Recuperar rápidamente la suspensión bacteriana por resuspender en 1 mL de caldo LB precalentado y transfiéralo a un tubo de ensayo de 15 mL.
- Deje las células recuperar por incubar bajo condiciones de crecimiento aireada a 37 ° C por 30 min, sin la selección antibiótica. Plato de las bacterias en placas de agar LB con kanamicina 50 μg/mL e incubar a 37 ° C durante la noche.
- Contar las colonias de la electroporación: una colonia se considera igual a una inserción del transposón cromosómica.
Nota: Las colonias pueden ser contadas por el ojo o con un contador de colonias. El número de colonias es inversamente proporcional a la distancia media que separa los transposones localizados en el cromosoma de cada clon. - Agregue 1 mL de caldo LB a cada placa y lava todas las colonias, 1 mL de LB caldo debe ser suficiente para lavar ~ 100.000 colonias. Vuelva a usar el mismo 1 mL de caldo LB para aumentar la concentración bacteriana. Piscina de todas las colonias en el mismo tubo de 50 mL.
- Vortex el tubo y el material de inicio (t = 0). Para congelarlo, mezclar 1 mL de la suspensión celular con 1 mL de glicerol al 50% en el hielo. Transferir los tubos para secar hielo durante 10 minutos. Una vez que las culturas son congeladas, transferirlos a un congelador de-80 ° C.
Nota: Una concentración de células de un mínimo de 50.000 ufc/mL se espera en este paso.
2. Concurso de experimento en libras
- deshielo la biblioteca transposon de-80 ° C en hielo. Mezclar por pipeteo.
- Transferir 100 μl de la biblioteca del transposon a 10 mL de LB en un tubo de ensayo de 15 mL.
- Crecen las células, aireadas por agitación continua (250 rpm), de 8 h a 37 ° C a la fase estacionaria (es decir, OD 600 = ~ 4.0). Ajustar estos parámetros a diferentes condiciones de crecimiento, según se desee.
- Propagar la población bacteriana por continuos traslados en medio fresco precalentado cada ~ 10 generaciones. Para ello, transferir 10 μl de la cultura de la anterior fase estacionaria a 10 mL de LB fresco y a la fase estacionaria de crecimiento para otro 8 h (es decir, OD 600 = ~ 4.0).
Nota: Como la densidad óptica inicial y final son iguales, una dilución de 1,000-fold corresponde a ~ 10 generaciones de crecimiento (2 10 = 1.024). La población bacteriana puede ser propagada directamente en medio fresco precalentado o guardada 0-4 ° C (en hielo) y al día siguiente. LB se utilizó aquí para tantos doblajes celulares en más breve tiempo posible (un tiempo de duplicación cerca de 22 min). - Después de cada 100 generaciones de la competencia, ahorrar cinco muestras de 1 mL a-80 ° C (como se describe en el paso 3.3).
- Si las diferencias de aptitud entre las células que contienen inserciones de transposones individual se esperan que sean pequeños, tener la duración de la competencia largo; aquí, generaciones 700 (t = 700) fueron utilizados.
3. Southern Blot análisis para controlar el experimento en tiempo de competencia
- prepara la sonda para el Southern blot (sección de 1 kb de la NKBOR) realizando la amplificación de la reacción en cadena (PCR) polimerasa usando las cartillas específicas: NKBOR_Probe_FW : gatgttggacgagtcggaat y NKBOR_Probe_RV: cgttacatccctggcttgtt.
- Incubar a 98 ° C por 30 s para desnaturalización inicial. Luego, realizar 35 ciclos a 98 ° C por 10 s, 60 ° C durante 30 s y 72 ° C por 45 s. Para la extensión final, uso 72 ° C durante 10 minutos
Nota: La plantilla para la reacción de PCR fue una de plásmido purificado pNKBOR 21. - El fragmento resultante de la polimerización en cadena de la etiqueta con [α - 32P] dATP utilizando el sistema de cebador al azar, según Smith 25.
- Incubar a 98 ° C por 30 s para desnaturalización inicial. Luego, realizar 35 ciclos a 98 ° C por 10 s, 60 ° C durante 30 s y 72 ° C por 45 s. Para la extensión final, uso 72 ° C durante 10 minutos
- Preparar la DNA celular total según Løbner-Olesen y von Freiesleben 26 para t = 0 y seleccionado momentos hasta t = 700 Estimado las generaciones de la competencia.
- Digerir el DNA celular total con Pvu, que corta el NKBOR que contiene la región de interés una vez solamente en una región no cubierto por la sonda, 1 unidad de Pvu puedo ser solía totalmente digest 1 μg de substrato ADN.
Nota: La sonda reconoce fragmentos que contenían parte de transposones, junto con el ADN cromosómico de diferentes longitudes, dependiendo del sitio de inserción. - Realizar un Southern blot usando un gel de agarosa al 0,7% según Løbner-Olesen y von Freiesleben 26.
4. Identificación de los Clones más aptos
- gene fácil de uso a pie, según lo descrito por Harrison et al. 27, para identificar los sitios de inserción DARS2 de clones solo (aislados en placas de LB) después de generaciones unas 700 de la competencia; las bandas más en el Southern blot, los más aislados son necesarios para cubrir todas las inserciones de transposones.
- Aislar ADN genómico para plantilla de PCR. Propagación de bacterias en un agar LB con kanamicina 50 μg/mL de la placa e incuban a 37 ° C durante la noche. Crecen solo colonias durante la noche en caldo LB a 37 ° C y posteriormente transferir 20 μl a 200 μL de agua destilada esterilizada (o usar de la purificación de DNA, como en el paso 3.2).
- Vortex para mezclar. Calentar la mezcla a 100 ° C para 10 min y centrifugar a velocidad máxima durante 5 minutos excepto la celda lisada a-20 ° C para su uso futuro.
- Diseño tres cebadores anidados a templar en el transposon de elección (ver figura 2 para una representación gráfica de la estrategia PCR).
Nota: Diseñar cebadores anidados debe asegurar que anidado cartilla 3 está más cercana a las conocidas 5 ' final de transposones ADN, seguido por Nested Primers 2 y 1. El espaciado entre anidados cartilla 3 y los 5 ' final de la t conocidaransposon ADN debería ser suficiente para una lectura a través secuencia de la DNA conocida del ADN desconocido (para encontrar el sitio de inserción del transposón cromosómicos específicos). Para NKBOR se utilizaron los siguientes iniciadores anidados: pNKBOR_Nested3_RV: gcagggctttattgattcca, pNKBOR_Nested2_RV: tcagcaacaccttcttcacg y pNKBOR_Nested1_RV: actttctggctggatgatgg. También se utilizan primers al azar que contienen los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción conocidos. Para asegurar un resultado, uno debe utilizar al menos dos diferentes primers al azar. Los sitios de restricción para las enzimas de restricción (e.g.,Sau 3AI y Hin dIII) deben estar ubicados en los 3 ' final y precedido por diez bases al azar así que 5 ' - NNNNNNNNNNGATC - 3 ' y 5 ' - NNNNNNNNNNAAGCTT - 3 ' son los iniciadores que contiene un Sau 3AI sitio (GATC) y un Hin dIII (PALINDROMIC), respectivamente, donde N = A, T, G o C. - Uso 200 ng de ADN genómico en una 20 μl PCR la reacción. Incubar a 98 ° C por 30 s para la desnaturalización de la inicial. Realizar ciclos de 25 a 98 ° C por 30 s, 50 ° C por 15 s y 72 ° C durante 4 minutos. Para la extensión final, use 72 ° C para 10 min uso pares de cartilla de anidar la cartilla 1 y uno de los iniciadores al azar.
- Utilizar pares de cartilla que consta de 2 anidadas de la Primer y la misma cartilla al azar de la amplificación de la segunda, con 1 μl de la reacción anterior como plantilla.
- Repetir paso 4.1.4 con pares de primer consisten en 3 anidadas de la Primer y la cartilla al azar mismo.
- Ejecutar los productos de la reacción final de la PCR en un gel de agarosa al 1.5% y tinción con bromuro de etidio. Cortar una banda en el rango de 100-800 bp y aislar el ADN usando cualquier comercial gel de DNA extracción kit según el fabricante ' dirección s. Resuspender el DNA en 15 μl de agua.
Nota: PRECAUCIÓN. Bromuro de etidio es tóxico y debe manipularse con cuidado. - La secuencia de la banda aislada en el paso anterior (paso 4.1.6), con 3 anidadas de la Primer como la cartilla de la secuencia, usando Sanger secuenciación en un proveedor comercial.
- Aislar ADN genómico para plantilla de PCR. Propagación de bacterias en un agar LB con kanamicina 50 μg/mL de la placa e incuban a 37 ° C durante la noche. Crecen solo colonias durante la noche en caldo LB a 37 ° C y posteriormente transferir 20 μl a 200 μL de agua destilada esterilizada (o usar de la purificación de DNA, como en el paso 3.2).
- Realizar WGS.
- WGS realizar sobre el total de ADN extraído de seleccionado muestras recolectadas durante el experimento de la competencia, según lo descrito por Frimodt-Møller et al 4.
- Realizar el análisis de secuenciación.
- Lee fin de alinear junto a 150 Ns contiguos a NKBOR, AF310136.1 1.904 … 2.204 Bowtie2 28 con un intervalo entre subcadenas de semilla (S, 1, 1,15) y un número máximo de caracteres ambiguos (L, 0, 0.9).
- Seleccionar la Lee alineada y luego volver a alinear a ambos ref MG1655 | NC_000913.3 y NKBOR gb | AF310136 usando blastN 29
- asignar transposición posiciones de inserción en las ensambladuras MG1655-NKBOR.
5. Citometría de flujo
- recoger muestras para citometría de flujo.
- Balance cada cultura por mantener en la fase de crecimiento exponencial durante al menos 10 generaciones. Compruebe el OD 600 y asegúrese de que no exceda 0.3.
- Recoge dos tipos de muestras de flujo.
- De RIF-descentramiento, transfiera 1 mL de cultivo a un tubo de 15 mL que contenga 30 μl de RIF-CEF (300 μg/mL rifampicina y cefalexina de 36 μg/mL disueltos en 12,5 mM NaOH). Dejar a 37 ° C durante un mínimo de 4 h de agitación.
Nota: La rifampicina bloquea indirectamente la iniciación de la replicación de cromosomas permitiendo continuas rondas de replicación continúen hasta su finalización. Cephalexin previene la división celular, que resulta en replicación descentramiento (RIF-descentramiento) y la acumulación de células con cromosomas replicados completamente. El número de cromosomas completamente replicados es igual al número de origen en el momento del tratamiento con rifampicina y cefalexina 20. - Para la muestra de EXP, transferencia 1 mL de la exponencialmente creciente cultura a un tubo de 1,5 mL en hielo.
- De RIF-descentramiento, transfiera 1 mL de cultivo a un tubo de 15 mL que contenga 30 μl de RIF-CEF (300 μg/mL rifampicina y cefalexina de 36 μg/mL disueltos en 12,5 mM NaOH). Dejar a 37 ° C durante un mínimo de 4 h de agitación.
- Fijar las celdas como sigue. La cosecha de las células por centrifugación a 15.000 x g durante 5 min a 4 ° C. Resuspender el precipitado en 100 μl de Tris, pH helada 10 mM 7.5 y añadir 1 mL de etanol al 77% helada. Almacenar las muestras a 4 ° C hasta su uso.
- Mancha las células como sigue. Cosecha 100-300 μL de células fijas por centrifugación a 15.000 x g durante 15 minutos retirar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 130 μl de " solución de tinción de DNA " (90 μg/mL mitramicina, 20 bromuro de etidio μg/mL, 10 mM MgCl 2 y 10 mM Tris pH 7.5). Poner las muestras en hielo y en la oscuridad; las muestras están listas para el análisis de citometría de flujo después de 10 minutos
Nota: Otros ADN manchas de bromuro de etidio y mitramicina puede también ser utilizado 30 , 31. - Determinar el origen celular, la masa relativa de la celda y el contenido relativo de ADN por citometría de flujo análisis.
- Realizar citometría de flujo, como se describió anteriormente 32. Ejecutar RIF-descentramiento y EXP-muestras utilizando el citometría de flujo fabricante ' instrucciones . Para células con tinción Bromuro etidio y mitramicina, longitudes de onda 395 y 440 nm de excitación y recoger la fluorescencia sobre 565 nm.
- Para determinar el relativa relativo y masa ADN contenido de celda, ejecutar el EXP-las muestras para obtener la dispersión de luz hacia adelante solo-parámetro versus histogramas número celular y la intensidad de fluorescencia versus histogramas número celular para un mínimo de 30.000 eventos correspondiente a la señal de celular.
- La distribución de luz dispersada hacia delante uso de solo-parámetro para medir la relativa promedio celular Massachusetts
Nota: La luz dispersada hacia adelante es una medida de la masa celular promedio 20. - Distribuciones de solo-parámetro de intensidad uso fluorescencia para medir el ADN promedio contenido 20.
- Obtener la concentración de ADN como la relación de medio contenido de ADN a la célula promedio masa 20.
- Determinar el número de orígenes por la célula.
- Muestras de RIF-descentramiento de la gestión para obtener la intensidad de la fluorescencia del solo-parámetro versus celular número histogramas para un mínimo de 30.000 eventos correspondientes a la señal de celular.
- Distribuciones de solo-parámetro de intensidad uso fluorescencia para determinar el número de cromosomas en cada célula 20.
- Realizar citometría de flujo, como se describió anteriormente 32. Ejecutar RIF-descentramiento y EXP-muestras utilizando el citometría de flujo fabricante ' instrucciones . Para células con tinción Bromuro etidio y mitramicina, longitudes de onda 395 y 440 nm de excitación y recoger la fluorescencia sobre 565 nm.
- Calcular el índice de asincronía (Ai).
- Calcular la inteligencia artificial, según lo descrito por Løbner-Olesen et al. 32, usando las distribuciones de parámetro de intensidad de fluorescencia de las muestras de descentramiento de la RIF y la fórmula Ai = (f3 + f5 + f6 + f7) / (f2 + f4 + f8), donde fx es las células de la fracción con x número de los cromosomas replicados completamente. Consideran iniciaciones asincrónica cuando A > 0.1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Una mancha blanca /negra meridional fue hecha para verificar que DARS2 se distribuyó al azar a lo largo del cromosoma en la biblioteca de transposon (t = 0) y que los clones más aptos persistiría en el tiempo. El Southern blot fue realizada en la DNA extraída de la piscina de transposon inicial (en t = 0) y cada 100 estimado de 700 generaciones de competencia (figura 3). Aquí, la DNA celular total de cada punto del tiempo fue digerido con Pvuy enzima de la restricción, que cortan el transposon NKBOR::DARS2 una vez solamente en una región no cubierta por la sonda. El Southern blot fue sondeado con un fragmento de ADN marcado radiactivamente complementario a parte de NKBOR. Como se ve en la figura 3, el grupo de DARS2 inicial (t = 0) carecen vendas distintas, que demuestra que DARS2 fue insertado al azar en todo el cromosoma. Con el tiempo, un patrón surgido donde la piscina inicial de clones de DARS2 desarrollado en sólo uno o unos pocos clones de DARS2 persistentes (figura 3; t = 0 a t = 700).
En el ejemplo mostrado, se identificaron sitios de inserción de DARS2 del experimento de competencia utilizando WGS y gene fácil caminar. Aquí, WGS fue utilizado para identificar los sitios de inserción de la piscina de inicio (t = 0) y después de 300, 400 y 700 generaciones de competencia. Tenga en cuenta que la cobertura en la secuenciación profunda actual era insuficiente para un mapeo completo de los sitios de inserción en t = 0; sin embargo, es un subconjunto representativo de la cantidad total de inserciones. WGS confirmó el resultado del Southern blot (es decir, la selección de los clones de DARS2 más aptos), terminando con el aproximadamente 98% de todos DARS2 inserciones cerca de wildtype DARS2 ubicación cromosómica (DARS2 IR de clon y clon rppH), mientras que el restante 2% en otros lugares en el cromosoma (figura 4). Esto sugiere que la posición de tipo salvaje es óptima para la función DARS2 . En t = 400, encontraron a una inserción en el brazo opuesto de replicación con una distancia casi idéntica a oriC como el wildtype DARS2 posición (figura 4), pero esta inserción no se recuperó después de generaciones de 700. Por lo tanto, dosis de genes asociados de replicación no pueden ser el único determinante para la posición óptima.
Genética fácil caminar se utilizó para identificar sitios de inserciones DARS2 en solo clones aislados tras generaciones aproximadamente 700 de la competencia. Aquí, se identificaron los sitios de inserción de dos DARS2 mencionados arriba (IRDARS2 clon y clon rppH). Genética fácil caminar sólo se hizo el 20 clones, y esto explica por qué todas las inserciones de DARS2 sitios asignados en grupos no fueron identificaron. DARS2-células deficientes mostraron anteriormente para iniciar la replicación en asincronía y a tener una disminución en la concentración de origen en relación con el tipo salvaje las células4,16,17, 18. por lo tanto utiliza citometría de flujo para resolver la sincronía en el inicio de contenido de ADN celular y replicación de origen para las dos cepas seleccionadas (IR deDARS2 clon y clon rppH) que, en ambos casos, fueron restaurados a tipo salvaje niveles (figura 5). Un ejemplo representativo de una cepa que posee una sola copia del DARS2 situado en la terminal se muestra (figura 5E). Aquí, la presencia de un elemento DARS2 en la terminal de no restaurar la sincronía o el contenido de origen celular a wildtype niveles, mientras que el seleccionado DARS2 clones de IR y hacer rppH .
Figura 1 : Resumen metodología. Presentación esquemática de la metodología. La región cromosómica DARS2 se clona en el mini Tn10 sobre pNKBOR, creando pJFM1. pJFM1 se transforma en e. coli MG1655 ΔDARS2, que desencadena una inserción al azar de DARS2 vinculado a Tn10 en el cromosoma de e. coli MG1655 ΔDARS2. Aproximadamente 70.000 clones, cada uno con una inserción de DARS2 cromosómica diferentes, se agruparon y compitieron directamente entre sí en caldo LB a 37 ° C. El experimento de competencia directa en caldo LB fue realizado para un estimado generaciones 700, donde se aisló una muestra por cada 100 generaciones de competencia directa. El ADN total extraído de cada muestra aislado y utilizado para borrar meridional y la identificación de inserciones de DARS2 por grupos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Presentación gráfica de gene fácil caminar. Esta figura ilustra una plantilla de ADN genómica de una secuencia de ADN desconocida junto a una secuencia conocida con sitios de cebado para la cartilla al azar y anidados cartillas 1, 2 y 3. Los resultados de las tres ampliaciones sucesivas a cabo utilizando los cebadores anidados diseñados tres se ilustran a continuación. El producto final (de la ronda 3) se ordena utilizando anidados cartilla 3. Esta figura fue adaptada de Harrison et al. 27. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Mancha blanca /negra meridional sondeado para NKBOR. Análisis de la mancha blanca /negra meridional de las inserciones de DARS2 en un DARS2-cepa deficiente. La DNA genomic extraída de cada ~ 100 generaciones de competencia directa, a partir de t = 0 y terminando en las generaciones 700, fueron digeridos con PvuI y fraccionado de gel. La mancha fue cruzado por hibridación con un NKBOR sondar (véase el Protocolo). t indica el número de generaciones de la competencia. Esta figura fue adaptada de Frimodt-Møller et al. 4. APM y BPM son de peso molecular alto y bajo peso molecular ADN, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Representación gráfica de resolvsitios de inserciones de transposones Ed en ΔDARS2. Las posiciones de oriC, se indican los datos, DARS1, DARS2 y terC . Sitios de inserción de DARS2 en ΔDARS2 en t = 0 (barras negras), t = 400 (luz barras azules), t = 500 (barras rojas) y t = 700 (barras verdes), resuelto por la secuenciación del genoma completo. Esta figura fue hecha usando DNAPlotter33 y fue adaptada de Frimodt-Møller et al. 4. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 : Histogramas de citometría de flujo representativo de sitios transposon genes fácil caminando en t = 700. Las células fueron cultivadas en AB mínimo suplementado con 0.2% glucosa, tiamina μg/mL y 10 0,5% casamino ácidos a 37 ° C. Tipo salvaje y ΔDARS2 se muestran en A y B, respectivamente. Derivados de la cepa de tipo salvaje MG1655 desprovisto de DARS2 en el lugar original y en su lugar llevar una copia de DARS2 en el sitio de transposon resuelto rrpH, IR y la terminal (terC) se muestran en C, D y E, respectivamente. Esta figura fue adaptada de Frimodt-Møller et al. 4 para mostrar una posición de DARS2 que resulta en una anomalía del ciclo celular (terC) o que restaura el fenotipo de tipo salvaje(rrpH, IR). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La metodología utilizada aquí toma ventaja de las técnicas de vanguardia para responder a una pregunta difícil con respecto a la posición óptima de genomic de un elemento genético. La inserción al azar del elemento genético (mediada por el transposon) permite la fácil y rápida recopilación de miles de clones, que luego se pueden hacer para competir entre sí para seleccionar la posición óptima del elemento genético investigado (es decir, el clon más apto).
Aquí, DARS2 fue insertado en el mini-Tn10-basado transposon, NKBOR. La elección del transposón es importante para el posterior análisis de sitios de inserciones. Varios transposones diferentes se han utilizado en experimentos de secuenciación (TraDIS) dirigido por el transposon-sitio de la inserción, como mini-Tn5Km234 y la opción más popular, el Himar que Mariner transposon35, 36 (para una revisión reciente de esto, véase van Opijnen y Camilli36). El objetivo fue de 70.000 inserciones al azar iniciales de DARS2, que da aproximadamente una inserción DARS2 evert 65 bp en el genoma MG1655. Esto se puede ajustar fácilmente, disminuyendo o aumentando el grupo inicial de colonias recogidos.
Aquí, optamos por continuos traslados en cultivos batch LB, pero también se puede realizar el experimento de competencia en un medio diferente o bajo diversas condiciones, incluyendo el uso de un chemostat37. Además, el procedimiento puede modificarse para adaptarse a las condiciones de elección, incluyendo tensiones diversas, tales como estrés oxidativo, osmótica o antibióticos. Para verificar la presencia de clones que persiste en el tiempo, uno puede hacer por lo menos tres cosas: gt; secuencia de transposones (Tn-Seq); o, como aquí, un Southern Blot. Finalmente, es posible gene fácil caminar en algunos clones, con la ventaja adicional de que sitios de inserción del transposón se identifican en clones individuales, que puede analizarse fenotípicamente el efecto de la zona de inserción específicos.
La elección de ensayo fenotípico para evaluar el resultado de un experimento de competencia depende de la región investigada. Hemos utilizado la citometría de flujo, que es un poderoso método para medir los parámetros de ciclo celular de las bacterias. Aquí, citometría de flujo reveló que la posición o posiciones cromosómica seleccionada de DARS2, (es decir, las inserciones de DARS2 cerca de la posición de DARS2 de tipo salvaje) resultó en la correcta regulación de replicación () iniciación es decir, la sincronía y la concentración de ADN). La posición o posiciones cromosómica óptima para DARS2 fueron seleccionada en parte por la dosificación del gene de asociados de replicación apropiado y en parte debido al favorable entorno genómico que es importante para DARS2 función4.
Aquí, un elemento de DNA no codificante fue investigado, pero esto podría ampliarse a cualquier región de la codificación de la opción. Un estudio reciente encontró que el nivel de la expresión génica variado ~ 300-fold, dependiendo de su posición en el cromosoma, sin clara correlación a asociados de replicación génica dosis38. El enfoque descrito aquí podría dar penetración importante en la relación entre la localización genómica de un gen en particular, su actividad transcripcional y la ventaja de fitness asociados. Esto podría en teoría ayudar a con la selección genómica posiciones, llevando a la más fuerte expresión de un gen dado, que a su vez puede ser de interés para ingeniería cepas nuevas y mejoradas para la producción de proteínas recombinantes.
Porque e. coli contiene regiones intergénicas limitada39, inserciones de transposones, en la mayoría de los casos, interrumpen los genes. En ocasiones esto puede crear falsos positivos donde el clone(s) más aptos no es elegidos debido a la óptima posición cromosómica del elemento genético en cuestión, sino porque un gen es interrumpido - que, de otra manera, ofrece una ventaja de aptitud durante el competencia del experimento4.
Esta metodología se aprovecha de un sistema de transposon de fácil uso, donde puede ser cualquier región de elección integrados al azar localizaciones. El experimento de competencia diseñado puede ser modificado para incluir cualquier número de fuerzas de selección que no sea de puro crecimiento, como se ve aquí. La configuración puede modificarse también para basarse puramente en Tn-Seq, que produce una mayor resolución de la secuencia de los sitios de inserciones que WGS, utilizado aquí. Este enfoque imparcial debe ser utilizado para aclarar emocionantes nuevas características en los organismos no caracterizados así lejos, que podrían mostrar que existen tendencias comunes en la organización cromosómica de eubacterias.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen ningún interés financiero que compiten.
Acknowledgments
Los autores fueron financiados por subvenciones de la Fundación de Novo Nordisk, la Fundación Lundbeck y la Fundación Nacional de investigación danés (DNRF120) a través del centro de respuesta bacteriana al estrés y persistencia (BASP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclaved Mili-Q water | None | ||
| Electroporation Cuvettes, 0.1 cm | Thermo Fisher Scientific | P41050 | |
| Bio-Rad MicroPulser Electroporation System | Bio-Rad | 165-2100 | |
| LB Broth | Thermo Fisher Scientific | 12780029 | |
| LB Agar, powder (Lennox L agar) | Thermo Fisher Scientific | 22700025 | |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | 17904 | |
| Fisherbrand Plastic Petri Dishes | Fisher Scientific | S33580A | |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Nunc CryoTubes | Sigma-Aldrich | V7634 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/µL) | Thermo Fisher Scientific | F530S | |
| dATP, [α-32P]- 3000Ci/mmol 10mCi/ml, 250 µCi | PerkinElmer | BLU012H250UC | |
| DECAprime II DNA Labeling Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1455 | |
| Spectrophotometer SF/MBV/03.32 | Pharmacia | ||
| Hermle Centrifuge SF/MBV/03.46 | Hermle | ||
| Ole Dich Centrifuge SF/MBV/03.29 | Ole Dich | ||
| Eppendorftubes 1.5 mL | Sigma-Aldrich | T9661 | |
| Eppendorftubes 2.0 mL | Sigma-Aldrich | T2795 | |
| Sodium Chloride | Merck | 6404 | |
| 96% Ethanol | Sigma-Aldrich | 16368 | |
| Trizma HCl | Sigma-Aldrich | T-3253 | |
| Phenol Ultra Pure | BRL | 5509UA | |
| Chloroform | Merck | 2445 | |
| Ribonuclease A type II A | Sigma-Aldrich | R5000 | |
| Sodiumdodecylsulphate (SDS) | Merck | 13760 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L 6876 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 405-7 | |
| 0.5M Na-EDTA pH 8.0 | BRL | 5575 UA | |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 10106801001 | |
| PvuI (10 U/µL) | Thermo Fisher Scientific | ER0621 | |
| UltraPure Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16500500 | |
| DNA Gel Loading Dye (6X) | Thermo Fisher Scientific | R0611 | |
| Tris-Borate-EDTA buffer | Sigma-Aldrich | T4415 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E7637 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 433160 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 71687 | |
| Whatman 3MM papers | Sigma-Aldrich | WHA3030931 | |
| SSC Buffer 20× Concentrate | Sigma-Aldrich | S6639 | |
| Amersham Hybond-N+ | GE Healthcare | RPN119B | |
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F8016 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | PVP40 | |
| Bovine Serum Albumin - Fraction V | Sigma-Aldrich | 85040C | |
| Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes | Sigma-Aldrich | D1626 | |
| Carestream Kodak BioMax light film | Sigma-Aldrich | Z373494 | |
| GenElute Gel Extraction Kit | Sigma-Aldrich | NA1111 | |
| GenElute PCR Clean-Up Kit | Sigma-Aldrich | NA1020 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | ||
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | ||
| Rifampicin | Serva | 34514.01 | |
| Cephalexin | Sigma-Aldrich | C4895 | |
| Mithramycin | Serva | 29803.02 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 246964 | |
| Apogee A10 instrument | Apogee |
References
- Frimodt-Moller, J., Charbon, G., Lobner-Olesen, A. Control of bacterial chromosome replication by non-coding regions outside the origin. Curr Genet. , (2016).
- Sherratt, D. J., et al. Recombination and chromosome segregation. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 359 (1441), 61-69 (2004).
- Bigot, S., et al. DNA motifs that control E. coli chromosome segregation by orienting the FtsK translocase. EMBO J. 24 (21), 3770-3780 (2005).
- Frimodt-Moller, J., Charbon, G., Krogfelt, K. A., Lobner-Olesen, A. DNA Replication Control Is Linked to Genomic Positioning of Control Regions in Escherichia coli. PLoS Genet. 12 (9), 1006286 (2016).
- Kornberg, A., Baker, T. A. DNA Replication, Second Edition. , University Science Books. (1992).
- Kaguni, J. M. Replication initiation at the Escherichia coli chromosomal origin. Curr Opin Chem Biol. 15 (5), 606-613 (2011).
- Leonard, A. C., Grimwade, J. E. Regulation of DnaA assembly and activity: taking directions from the genome. Annu Rev Microbiol. 65, 19-35 (2011).
- Kurokawa, K., Nishida, S., Emoto, A., Sekimizu, K., Katayama, T. Replication cycle-coordinated change of the adenine nucleotide-bound forms of DnaA protein in Escherichia coli. EMBO J. 18 (23), 6642-6652 (1999).
- Sekimizu, K., Bramhill, D., Kornberg, A. ATP activates dnaA protein in initiating replication of plasmids bearing the origin of the E. coli chromosome. Cell. 50 (2), 259-265 (1987).
- Brendler, T., Austin, S. Binding of SeqA protein to DNA requires interaction between two or more complexes bound to separate hemimethylated GATC sequences. EMBO J. 18 (8), 2304-2310 (1999).
- Lu, M., Campbell, J. L., Boye, E., Kleckner, N. SeqA: a negative modulator of replication initiation in E. coli. Cell. 77 (3), 413-426 (1994).
- Katayama, T., Kubota, T., Kurokawa, K., Crooke, E., Sekimizu, K. The initiator function of DnaA protein is negatively regulated by the sliding clamp of the E. coli chromosomal replicase. Cell. 94 (1), 61-71 (1998).
- Kato, J., Katayama, T. Hda, a novel DnaA-related protein, regulates the replication cycle in Escherichia coli. EMBO J. 20 (15), 4253-4262 (2001).
- Kasho, K., Katayama, T. DnaA binding locus datA promotes DnaA-ATP hydrolysis to enable cell cycle-coordinated replication initiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (3), 936-941 (2013).
- Kitagawa, R., Ozaki, T., Moriya, S., Ogawa, T. Negative control of replication initiation by a novel chromosomal locus exhibiting exceptional affinity for Escherichia coli DnaA protein. Genes Dev. 12 (19), 3032-3043 (1998).
- Fujimitsu, K., Senriuchi, T., Katayama, T. Specific genomic sequences of E. coli promote replicational initiation by directly reactivating ADP-DnaA. Genes Dev. 23 (10), 1221-1233 (2009).
- Kasho, K., Fujimitsu, K., Matoba, T., Oshima, T., Katayama, T. Timely binding of IHF and Fis to DARS2 regulates ATP-DnaA production and replication initiation. Nucleic Acids Res. 42 (21), 13134-13149 (2014).
- Frimodt-Moller, J., Charbon, G., Krogfelt, K. A., Lobner-Olesen, A. Control regions for chromosome replication are conserved with respect to sequence and location among Escherichia coli strains. Front Microbiol. 6, 1011 (2015).
- Bergthorsson, U., Ochman, H. Distribution of chromosome length variation in natural isolates of Escherichia coli. Mol Biol Evol. 15 (1), 6-16 (1998).
- Boye, E., Steen, H. B., Skarstad, K. Flow cytometry of bacteria: a promising tool in experimental and clinical microbiology. J Gen Microbiol. 129 (4), 973-980 (1983).
- Rossignol, M., Basset, A., Espeli, O., Boccard, F. NKBOR, a mini-Tn10-based transposon for random insertion in the chromosome of Gram-negative bacteria and the rapid recovery of sequences flanking the insertion sites in Escherichia coli. Res Microbiol. 152 (5), 481-485 (2001).
- SHIGEN. , Available from: http://shigen.nig.ac.jp (2017).
- Shafferman, A., Helinski, D. R. Structural properties of the beta origin of replication of plasmid R6K. J Biol Chem. 258 (7), 4083-4090 (1983).
- Gonzales, M. F., Brooks, T., Pukatzki, S. U., Provenzano, D. Rapid protocol for preparation of electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae. J Vis Exp. (80), (2013).
- Smith, D. R.
- Lobner-Olesen, A., von Freiesleben, U. Chromosomal replication incompatibility in Dam methyltransferase deficient Escherichia coli cells. EMBO J. 15 (21), 5999-6008 (1996).
- Harrison, R. W., Miller, J. C., D'Souza, M. J., Kampo, G.
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 215 (3), 403-410 (1990).
- Stepankiw, N., Kaidow, A., Boye, E., Bates, D. The right half of the Escherichia coli replication origin is not essential for viability, but facilitates multi-forked replication. Mol Microbiol. 74 (2), 467-479 (2009).
- Lobner-Olesen, A. Distribution of minichromosomes in individual Escherichia coli cells: implications for replication control. EMBO J. 18 (6), 1712-1721 (1999).
- Lobner-Olesen, A., Skarstad, K., Hansen, F. G., von Meyenburg, K., Boye, E. The DnaA protein determines the initiation mass of Escherichia coli K-12. Cell. 57 (5), 881-889 (1989).
- Carver, T., Thomson, N., Bleasby, A., Berriman, M., Parkhill, J. DNAPlotter: circular and linear interactive genome visualization. Bioinformatics. 25 (1), 119-120 (2009).
- Eckert, S. E., et al. Retrospective application of transposon-directed insertion site sequencing to a library of signature-tagged mini-Tn5Km2 mutants of Escherichia coli O157:H7 screened in cattle. J Bacteriol. 193 (7), 1771-1776 (2011).
- van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms. Nat Methods. 6 (10), 767-772 (2009).
- van Opijnen, T., Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nat Rev Microbiol. 11 (7), 435-442 (2013).
- Jeong, H., Lee, S. J., Kim, P. Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat. J Vis Exp. (115), (2016).
- Bryant, J. A., Sellars, L. E., Busby, S. J., Lee, D. J. Chromosome position effects on gene expression in Escherichia coli K-12. Nucleic Acids Res. 42 (18), 11383-11392 (2014).
- Blattner, F. R., et al. The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).
