Summary
여기, 비 코딩 DNA 요소의 transposon 중재 무작위 삽입의 힘의 최적의 염색체 위치를 해결 하기 위해 사용 되었다.
Abstract
특정된 DNA 요소의 최적의 염색체 position(s)는 / transposon 중재 무작위 삽입 휘트니스 선택에 의해 다음에 의해 결정 되었다. 박테리아, 유전적 요소의 기능에 유전 맥락의 영향을 평가 하기 위해 어려울 수 있습니다. 토폴로지 효과, 이웃 유전자 또는 유전자 복제 관련 된 복용량, transcriptional 방해를 포함 하 여 몇 가지 메커니즘 주어진 유전적 요소의 기능 영향을 줄 수 있습니다. 여기, 대장균 및 간단한 성장 경쟁을 사용 하 여 가장 유리한 위치 실험 선택의 염색체에 DNA 요소의 임의의 통합을 허용 하는 방법을 설명 합니다. 메서드를 사용 하면 임의의 삽입, 성장 혜택, 실험적인 요구에 쉽게 조절 절차 적자 clone(s)의 선택과 결합의 잘 설명된 transposon-기반 시스템의 활용. 복잡 한 다중 클론 인구에 전체 게놈 시퀀싱 또는 선택 된 클론의 급속 한 식별에 대 한 쉬운 유전자 적자 clone(s)의 성격을 결정할 수 있습니다. 여기, 비 코딩 DNA 영역 DARS2, 대장균의 염색체 복제의 개시를 제어 하는 예제로 사용 되었다. DARS2 의 기능 유전자 복제 관련 된 복용량;에 의해 영향을 받을 것으로 알려져 가까이 DARS2 는 더 활성화 된다 DNA 복제의 기원에 가져옵니다. DARS2 DARS2의 염색체에 무작위로 삽입 된-변형 삭제. 개별 삽입을 포함 하는 결과 클론 풀링된 그리고 세대의 수백을 위해 서로 경쟁 했다. 마지막으로, 적자 클론 특징 되었고 DARS2 원래 DARS2 위치에 가까운 근접에서 삽입 포함 발견.
Introduction
어떤 유전적 요소의 기능 게놈에 있는 그것의 위치에 따라 달라질 수 있습니다. 박테리아에이 주로 결과 방해에서 인접 유전자, 로컬 DNA 토폴로지 및 복제 관련 유전자 노출량의 전사에 의해. 특히, DNA 복제 및 분리의 프로세스 제어, 적어도 부분에서 비 코딩 염색체 지역별1, 그리고이 지역의 적절 한 기능에 따라 달라 집니다 genomic 위치/컨텍스트. 대장균, 예제에서는 여동생에 필요한 dif 사이트 염색체 해상도2; KOPS 시퀀스, 염색체 분리3;에 필요한 및 데이터, DARS1및 DARS2 지역, (아래; 적절 한 염색체 복제 제어에 필요한 4). 우리 여기 DARS2 비 코딩 영역의 연구에 의해 exemplified 임의의 이전, 선택, 그리고 어떤 주어진된 유전 요소의 최적의 유전자 맥락의 결정에 대 한 허용 하는 방법 제시.
대장균, DnaA에 시작자 단백질은 DNA 물가는 단일 복제 원점오릭스, 여 helicase DnaB5,,67의 채용에 대 한 책임. DnaA AAA+ (즉, 다양 한 활동과 관련 된 ATPases)에 속하는 단백질 유사한 높은 ATP 그리고 ADP를 바인딩할 수 및 화력5. DnaAATP 수준 개시8, DnaAATP 에 multimer를 형성에서 봉우리 오릭스 는 DNA 이중 오프닝9트리거합니다. 개시, 후 오릭스 hemimethylated SeqA 단백질의 바인딩을 포함 하는 메커니즘에 의해 격리로 인해 다시 개시에 대 한 일시적으로 사용할 수 없게 만든 오릭스10,11. 격리, 동안 DnaAATP 의 수준을 적어도 두 가지 메커니즘에 의해 감소 된다: DnaA (RIDA)12,13 및 데이터의 규제 비활성화-종속 DnaAATP 가수분해 (DDAH)14 ,15. RIDA와 DDAH 홍보 DnaAADPDnaAATP 의 변환. 개시의 새로운 라운드 전에 DnaAADP 는 특정 DnaA 재가동 시퀀스 (DARS)에 DnaAATP 를 재가동: DARS1 및 DARS216,17. 염색체 데이터, DARS1및 DARS2는 비 코딩 지역과 DnaAATP를 변조 하는 보호자와 같은 방식으로 행동 /DnaAADP interconversion. 복제의 근원 밖에이 지역 활성화 DnaA 복잡 한 어셈블리 중 하나에 대 한 비활성화 (데이터, 14) 또는 활성화 (DARS1 및 DARS2; 17) DnaA의. DARS2 셀에서 삭제 대량 배로 시간 되지만 비동기 복제 개시15,,1618변경 되지 않습니다. 그러나, DARS2-결핍 세포는 피트 니스는 풍부한 매체에서 모두 지속적인 성장 경쟁 하는 동안 또는 마우스 내장18에 있는 식민지의 설립 동안에 그렇지 않으면 isogenic wildtype에 비해 비용. 이 비동기/근원 농도에 사소한 변화 세균성 체력에 부정적인 효과 나타냅니다. 대장균, 선택적 압력 유지 염색체 대칭 (즉, 두 거의 같은 길이의 복제 팔)19있다. 데이터, DARS1및 DARS2 지역에 동일한 상대 거리는 오릭스 모든 대장균 변종 시퀀싱18, 염색체 크기에 큰 변화에도 불구 하 고.
여기, 우리가 그것의 기능에 대 한 최적의 염색체 position(s)의 식별에 대 한 예를 들어 대장균 의 DARS2 지역을 사용합니다. DARS2 NKBOR transposon 및 결과 NKBOR에 삽입 되었다: MG1655의 게놈에 무작위로 삽입 이후DARS2 transposon ΔDARS2. 우리는 따라서 셀의 컬렉션을 생성, 각 보유 DARS2 염색체에 다른 위치에 배치 합니다. 생체 외에서 경쟁 실험, 어디는 컬렉션에 있는 모든 셀 풀링된 되었고 약된 700 세대에 대 한 파운드에서 지속적인 성장을 하는 동안 서로 대하여 경쟁, 수행 되었다. 경쟁 실험의 결과 모니터링/결정 했다 남쪽 오 점, 쉬운 유전자 산책, 그리고 전체 게놈 시퀀싱 (WGS;를 사용 하 여 그림 1)입니다. 끝점 클론 쉬운 유전자 걸어서 해결 cytometry 세포 주기 매개 변수를 평가 하 여 특징 이었다. 흐름 cytometric 분석에 많은 수의 셀에 대 한 셀 크기, DNA 콘텐츠 및 개시 synchrony를 측정할 수 있습니다. Cytometry, 하는 동안 단일 셀의 흐름은 다음 동시에 등록 내보낸된 형광 DNA 콘텐츠, 측정을 수집 하는 photomultipliers에 의해 제공, 스테인드 DNA를 자극 하는 적절 한 파장의 광선 전달 합니다 세포는 DNA에 물 들 다. 앞으로 흩어져 빛 셀 대량20의 측정 이다.
생체 외에서 경쟁 실험 선물이 여기 염색체 위치 및 유전 요소의 게놈 맥락의 중요성에 관한 문제를 해결 하는 데 사용 됩니다. 방법은 공평 하 고 사용 하기 쉬운입니다.
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Protocol
1. Transposon 도서관의 컬렉션
참고: 염색체 DARS2 로커 스 미니 테네시 10으로 복제 했다-transposon, NKBOR (pNKBOR)에 21, 결과 기반으로 NKBOR:: DARS2 (pJFM1). pNKBOR 온라인 22 얻어질 수 있다. pNKBOR 복제 23 시작자 단백질 π를 필요로 하는 R6K 기반 자살 벡터 이다. 플라스 미드 pJFM1는 따라서 pir 유전자의 염색체 복사본을 포함 하는 E. 콜라이 긴장 (예를 들어, Dh5α λ pir)에 복제할 수 있습니다. 그러나, pJFM1은 Pir 불충분 한 wildtype MG1655로 변형 때 pJFM1 복제할 수 없습니다, NKBOR의 임의 삽입에 의해 생성 된 대 저항 클론의 선택에 지도:: 세균성 염색체로 DARS2. 편의상,이 DARS2 삽입 라고 하. 그림 1 방법론의 도식 프레 젠 테이 션을 참조 하십시오.
- 준비 electrocompetent MG1655 Δ 적극적으로 성장에서 DARS2 Lysogeny 국물 (파운드)에서 37 ° C 24 성장 세포.
- Electroporate pJFM1 electrocompetent MG1655 Δ로 DARS2, 곤잘레스 외. 따라 24 electrocompetent 대장균 MG1655 Δ의
- 40 (물 1 µ L)에서 pJFM1의 추가 1 µ g µ L DARS2 미리 냉장, 무 균 0.2 cm 간격 베트에이 혼합물을 전송. Electroporation 챔버에는 베트를 삽입 합니다. 18 Electroporate kV, 500 Ω 및 25 µ F; 시간 상수 ~5.0 ms, 그리고 아무 아크가 발생 한다.
- 신속 하 게 미리 데워 파운드 국물과 15 mL 테스트 튜브에 1 mL에 resuspending에 의해 세균성 정지 복구.
- 셀 항생제 선택 없이 30 분 동안 37 ° C에서 화난된 성장 조건 하에서 배양 하 여 복구 하자. 50µg/mL 대 보충 파운드 한 천 배지 위에 박테리아 접시 하 고 37 ° C에서 밤새 품 어.
- 는 electroporation에서 식민지를 계산: 한 식민지는 것으로 간주 한 염색체 transposon 삽입.
참고: 식민지는 식민지 카운터 또는 눈으로 계산 될 수 있습니다. 식민지의 수는 각 클론의 염색체에 위치한 transposons 분리 평균 거리에 반비례 한다. - 추가 1 mL 각 파운드 국물의 접시와 모든 식민지를 씻어; 파운드 국물의 1 mL ~ 100000 식민지 씻어 충분 해야 한다. 다시 파운드 국물 세균 농도 증가 동일한 1 mL를 사용 하 여. 같은 50 mL 튜브에 모든 식민지 수영장.
- 소용돌이 튜브 및 동결 시작 물자 (t = 0). 그것을 고정, 얼음에 50% 글리세롤의 1 mL와 함께 셀 서 스 펜 션의 1 mL를 혼합 한다. 10 분 동안 얼음 건조 튜브를 전송 합니다. 일단 문화, 냉동-80 ° C 냉동 고에 그들을 전송.
참고:이 단계에서 50000 CFU/mL의 최소의 셀 농도으로 예상 된다.
2. 파운드에 경쟁 실험
- 녹여 얼음에-80 ° C에서 transposon 라이브러리. Pipetting으로 믹스.
- Transposon 라이브러리 15 mL 테스트 튜브에 파운드의 10 mL를의 전송 100 µ L.
- 고정 단계를 37 ° C에서 8 h에 대 한 연속 진동 (250rpm) 의해 화난 세포 성장 (즉, OD 600 ~ 4.0 =). 원하는 대로 다른 성장 조건에 이러한 매개 변수를 조정.
- 신선한 prewarmed 매체에 연속 전송에 의해 세균성 인구 모든 ~ 10 세대를 전파합니다. 이렇게 신선한 파운드의 10 mL를 이전 고정 단계 문화 10 µ L를 전송 하 고 다른 8 h에 대 한 성장 하는 고정 단계로 (즉, OD 600 ~ 4.0 =).
참고: 시작 및 끝 광학 밀도 동일 인으로 빌드하기 희석에 해당 ~ 10 세대의 성장 (2 10 = 1024). 세균성 인구 중 신선한 prewarmed 매체에 직접 전파 하거나 저장할 수 0-4 ° C (얼음)에 다음 날을 전파 하 고. 파운드는 여기 많은 휴대폰 doublings에 짧은 가능한 (22 분 가까이 두 배로 시간) 시간을 보장 하기 위해 사용 되었다. - 경쟁의 각 100 세대, 이후 저장-80 ° C에서 5 1 mL 샘플 (단계 3.3에서에서 설명).
- 개별 transposon 삽입을 포함 하는 셀 간의 체력 차이 작은 것으로 예상 된다, 만약 계속 경쟁의 기간 긴, 여기, 700 세대 (t = 700) 사용 되었다.
3. 감시 하는 경쟁 실험 동안 남쪽 오 점 분석
- 특정 뇌관을 사용 하 여 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 증폭을 수행 하 여 오 (1-kb 섹션에서 NKBOR의) 남부에 대 한 조사를 준비: NKBOR_Probe_FW : gatgttggacgagtcggaat 및 NKBOR_Probe_RV: cgttacatccctggcttgtt.
- 품 30 98 ° C에
- 초기 변성에 대 한 s. 그런 다음 10 98 ° C에서 35 주기를 수행 s, 60 ° C 30에 대 한 s, 그리고 45 72 ° C s. 마지막 확장에 대 일 분을 위한 72 ° C 사용
참고: PCR 반응에 대 한 서식 파일은 순화 pNKBOR 플라스 미드 21. - 스미스 25에 따라 결과 PCR 파편 [α-32 P] dATP 임의의 뇌관 시스템을 사용 하 여 레이블.
참고: 프로브 삽입 사이트에 따라 다양 한 길이의 염색체 DNA 함께 transposon의 일부가 들어 있는 조각 인식 합니다.
4. 적자 클론의 식별
- 사용 쉬운 유전자 걷기, 해리슨 그 외 여러분에 의해 설명 된 대로 27, 700 예상된 세대 경쟁; 후 단일 클론 (파운드 플레이트에 고립 된)에서 DARS2 삽입 사이트를 식별 하 더 밴드 남쪽 오 점에 더 격리 하는 데 필요한 모든 transposon 삽입 커버.
- 격리 PCR 템플릿 genomic DNA 50 µ g/mL 대를 포함 하는 파운드 한 천 격판덮개에 박테리아를 확산 하 고 37 ° C에서 밤새 품 어. 37 ° C에서 파운드 국물에서 숙박 한 식민지를 성장 한 이후에 압력가 증류수 200 µ L로 20 µ L을 전송 (또는 DNA 정화 단계 3.2에서 사용).
- 혼합 소용돌이
- 입니다. 위한 10 분 및 5 분에 대 한 최대 속도 원심 분리기 저장 세포 lysate 미래 사용을 위한-20 ° C에서 100 ° C에서 혼합 열.
- 선택의 transposon 내 anneal를 3 중첩 된 뇌관 디자인 (PCR 전략의 그래픽 표현에 대 한 그림 2 참조).
참고: 중첩 된 뇌관 3 알려진된 5에 가장 가까운 거짓말 확인 해야 중첩 된 뇌관 디자인 ' transposon DNA, 중첩 프라이 머 2와 1의 끝. 중첩 된 뇌관 3와 5 사이 간격 ' 알려진된 t의 끝ransposon DNA (사이트를 찾을 수 있는 특정 염색체 transposon 삽입) 알 수 없는 DNA에 알려진된 DNA에서 시퀀스 read-through에 대 한 충분 해야 한다. NKBOR에 대 한 다음 중첩 된 뇌관을 사용 되었다: pNKBOR_Nested3_RV: gcagggctttattgattcca, pNKBOR_Nested2_RV: tcagcaacaccttcttcacg, 및 pNKBOR_Nested1_RV: actttctggctggatgatgg. 알려진된 제한 효소의 인식 사이트를 포함 하는 임의의 뇌관도 사용 됩니다. 결과 보장 하기 위해, 하나는 적어도 두 개의 다른 무작위 뇌관을 사용 해야 합니다. 제한 효소 (e.g.,Sau 3AI 및 힌 dIII)에 대 한 제한 사이트 있어야 3 ' 끝과 앞 10 임의의 기지 그래서 그 5 '-NNNNNNNNNNGATC-3 ' 5 '-NNNNNNNNNNAAGCTT-3 '는 뇌관 포함 된 Sau 3AI 사이트 (GATC) 힌 dIII 사이트 (AAGCTT), 각각, 어디 N = A, T, G, 또는 C. - 20에서 게놈 DNA의 사용 200 ng µ L PCR 반응. 30에 대 한 98 ° C에 품 어 초기 변성에 대 한 s. 30에 대 한 98 ° C에서 25 주기를 수행 15 50 ° C s s, 그리고 4 분 동안 72 ° C. 마지막 확장에 대 한 사용 하 여 72 ° C 10 분 사용 뇌관 쌍 구성 된 중첩 된 뇌관 1 무작위 뇌관 중 하나.
- 뇌관 쌍 뇌관 2 중첩 및 두 번째 증폭에서 동일한 무작위 뇌관의 구성 된 그것의 이전 반응의 1 µ L를 사용 하 여 서식 파일로 사용.
- 반복 단계 4.1.4 뇌관 3 중첩 된 동일한 임의의 뇌관의 구성 된 뇌관 쌍.
- 는 1.5 %agarose 젤에 ethidium 평범한 사람으로 얼룩 최종 PCR 반응에서 제품을 실행합니다. 100-800 bp 범위에서 밴드를 잘라 하 고 어떤 상업적인 DNA 젤 추출 키트 제조 업체에 따르면를 사용 하 여 DNA를 분리 ' s 방향. 물 15 µ L에서 DNA resuspend.
참고: 주의. Ethidium 평범한 사람 독성 그리고 관리와 처리 해야 합니다. - 생어를 사용 하 여 시퀀싱 뇌관으로 뇌관 3 중첩 (4.1.6 단계) 이전 단계에서 격리 하는 밴드 순서는 상업적인 공급자에서 시퀀싱.
- Frimodt 몰 러 외 4에 설명 된 대로 수행 WGS DNA에서 추출한 총에 경쟁 실험 기간 동안 수집 된 샘플을 선택.
- 맞춤 짝 간 150을 읽고 NKBOR, AF310136.1 1,904 인접 Ns … 2,204 씨앗 부분 문자열 (S, 1, 1.15)와의 모호한 문자 (L, 0, 0.9) 최대 수 사이 간격 Bowtie2 28을 사용 하 여.
- 정렬 된 읽기를 선택 하 고 다음 다시 두 MG1655 ref를 정렬 | NC_000913.3 및 NKBOR 기가바이트 | AF310136 blastN 29를 사용 하 여
- 할당 전위 접합 MG1655 NKBOR에서 삽입 위치.
5. Flow Cytometry
- cytometry에 대 한 샘플을 수집.
적어도 10 세대를 위한 지 수 성장 단계에 그것을 유지 하 여
- 균형 각 문화. OD 600을 확인 하 고 그것은 결코 0.3 초과 확인.
- 두 가지 유형의 흐름 샘플을 수집합니다.
- RIF runout에 대 한 RIF-CEF (300 µ g/mL 리 팜 피신과 36 µ g/mL 세 팔 렉 신 12.5 m m NaOH에에서 녹아 있는)의 30 µ L을 포함 하는 15 mL 튜브에 문화의 1 mL을 전송. 동요의 4 h의 최소 37 ° C에서 그것을 두고.
참고: 리 팜 피신 직접 차단 하지 복제에의 지속적인 라운드 종료를 계속 하면서 염색체 복제의 개시 합니다. 세 팔 렉 신 세포 분열, 복제 runout (RIF runout)에 완전히 복제 된 염색체를 가진 세포의 축적을 방지 합니다. 리 팜 피신 및 세 팔 렉 신 20 치료 시 완전히 복제 된 염색체의 수는 근원의 수. - 특급-샘플, 전송의 기 하 급수적으로 성장 하는 얼음에 1.5 mL 튜브에 문화 1 mL
- RIF runout에 대 한 RIF-CEF (300 µ g/mL 리 팜 피신과 36 µ g/mL 세 팔 렉 신 12.5 m m NaOH에에서 녹아 있는)의 30 µ L을 포함 하는 15 mL 튜브에 문화의 1 mL을 전송. 동요의 4 h의 최소 37 ° C에서 그것을 두고.
- 셀을 다음과 같이 수정. 4에서 5 분 동안 15000 x g에서 원심 분리 하 여 세포를 수확 ° C. 얼음 10 mM Tris pH 7.5의 100 µ L에 펠 릿을 Resuspend 하 고 차가운 77% 에탄올의 1 mL을 추가. 사용 될 때까지 4 ° C에서 샘플 저장.
- 셀 다음과 같이 얼룩. 상쾌한 15 분 제거에 대 한 15000 x g에서 원심 분리 하 여 고정된 셀의 100-300 µ L를 수확 하 고 펠 릿의 130 µ L에서 resuspend " DNA 얼룩이 솔루션 " (90 µ g/mL mithramycin, 20 µ g/mL ethidium 평범한 사람, 10 m m MgCl 2 그리고 10 mM Tris pH 7.5). 얼음에 샘플을 넣어 하 어두운; 샘플에 대 한 준비가 흐름 cytometry 분석 10 분 후
참고: 다른 DNA ethidium 평범한 사람 보다 얼룩과 mithramycin 사용된 30 , 31 수. - 흐름 cytometry 분석 셀, 상대 셀 질량 및 상대 DNA 콘텐츠 원본 결정.
- 수행 cytometry, 32에서 설명한 대로
- . RIF runout 및 EXP-샘플 교류 cytometer 제조 업체를 사용 하 여 실행 ' s 지침 . Mithramycin-및 ethidium 평범한 사람 얼룩이 진 셀 여기 파장 395 및 440 nm을 사용 하 고 565 위 형광 수집 nm.
- 셀 번호 히스토그램 대 단일 매개 변수 앞으로 빛 분산형 및 30000 이벤트의 최소 셀 번호 히스토그램 대 형광 강도 특급 샘플 실행 상대 셀 질량과 상대 DNA 콘텐츠를 결정 하려면
- 해당 셀 신호 하.
- 사용 앞으로 흩어져 빛 단일 매개 변수 분포를 평균 상대 측정 셀 미사
참고: 앞으로 흩어져 빛은 평균 셀 대량 20. - 평균 DNA를 측정 하기 위해 사용 형광 강도 단일 매개 변수 배포판 콘텐츠 20.
- 평균 DNA 콘텐츠 평균 셀 대량 20의 비율으로 DNA 농도 얻을.
- 셀 번호 히스토그램 대 단일 매개 변수 앞으로 빛 분산형 및 30000 이벤트의 최소 셀 번호 히스토그램 대 형광 강도 특급 샘플 실행 상대 셀 질량과 상대 DNA 콘텐츠를 결정 하려면
- 셀 당 근원의 수를 결정.
- 대 단일 매개 변수 형광 강도를 실행 RIF runout 샘플 셀 셀 신호에 해당 하는 30000 이벤트의 최소 숫자 히스토그램.
- 각 염색체의 수를 확인 하려면 사용 하 여 형광 강도 단일 매개 변수 배포판 셀 20.
- 32, RIF runout 샘플 및 수식 Ai의 형광 강도 단일 매개 변수 배포판을 사용 하 여 = (f3 + f5 + f6 + f7) / (f2 f4 + f8), fx가 x 완전히 복제 된 염색체의 수와 분수 셀. 식 이라고 때 비동기 고려 A > 0.1.
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Representative Results
남쪽 오 점 DARS2 transposon 라이브러리에 염색체에 걸쳐 무작위로 배포 했다 확인 이루어졌다 (t = 0) 적자 클론 시간이 지남에 유지할 것 이다 그. 남쪽 오 점 초기 transposon 풀에서 추출한 DNA에서 수행 되었다 (t = 0)과 경쟁 (그림 3)의 700 세대에서 모든 예상된 100. 여기, 각 시간 점에서 총 세포 DNA가 나 제한 효소, 잘라 transposon NKBOR 알려진 Pvu와 소화::DARS2 한 번 조사에 의해 적용 되지 않는 지역에만. 남쪽 오 점 NKBOR의 부분 보완 방사성 레이블이 DNA 파편으로 조사 되었다. 그림 3, 초기 DARS2 수영장에서에서 본 (t = 0) DARS2 염색체에 걸쳐 무작위로 삽입 된 보여주는 부족된 고유 밴드. 시간이 지남에, 패턴 등장 DARS2 클론의 초기 대형 수영장 하나 또는 몇 가지 지속 DARS2 클론으로 개발 (그림 3, t = t 0 = 700).
예, 경쟁 실험에서 DARS2 삽입 사이트 WGS 및 쉬운 유전자 산책을 사용 하 여 확인 되었다. 여기, WGS 시작 풀에서 삽입 사이트를 식별 하기 위해 사용 되었다 (t = 0) 300, 400, 및 700 세대 경쟁의 후. 존재 깊은 시퀀싱에 범위는 t 삽입 사이트의 완전 한 매핑을 위한 충분 한 않았습니다 = 0; 그러나, 그것은 삽입의 총 수의 대표적인 하위 집합을 제공합니다. WGS 확인 남쪽 오 점 결과 (즉, 적자 DARS2 클론의 선택), 모든 DARS2 의 약 98%로 끝나는 삽입 wildtype DARS2 염색체 위치 (DARS2 클론 IR 및 복제 rppH), 동안 잔여 2% 다른 염색체 (그림 4). 이 강하게 wildtype 위치는 DARS2 함수에 대 한 최적의 제안 합니다. T = 400, 삽입 반대 복제 팔에 거의 동일한 거리에서 발견 되었다 오릭스 wildtype DARS2 로 위치 (그림 4), 하지만이 삽입 되지 복구 700 세대 후. 따라서, 복제 관련 유전자 노출량 최적의 위치에 대 한 단일 결정 수 없습니다.
걷기 쉬운 유전자 경쟁의 700 예상된 세대 이후 고립 된 단일 클론에 DARS2 삽입 사이트를 식별 하기 위해 사용 되었다. 여기, (DARS2 복제 IR 및 복제 rppH) 위에서 언급 한 두 개의 DARS2 삽입 사이트 확인 되었다. 걷기 쉬운 유전자 20 클론에만 이루어졌다 고이 왜 모든 DARS2 삽입 사이트 WGS에 매핑 되지 않았습니다 확인 설명 한다. DARS2-결핍 세포에 비동기 복제를 시작 하려면 이전 표시 했다 및 wildtype 상대적인 근원 농도 감소를 셀4,,1617, 18. 우리는 따라서 두 선택 된 변종 (DARS2 복제 IR 및 복제 rppH)는, 두 경우 모두 wildtype 복원 했다에 대 한 DNA 복제와 세포 기원 콘텐츠 개시에 synchrony를 해결 하려면 cytometry 사용 레벨 (그림 5)입니다. 종착역에 위치한 DARS2 의 단일 복사본을 소지 하는 긴장의 대표적인 예는 (그림 5E) 표시 됩니다. 여기, 종착역에 DARS2 요소의 존재 복원 하지 않습니다 synchrony 또는 세포질 근원 콘텐츠 wildtype 수준, IR를 복제 하는 선택 된 DARS2 와 rppH 을 하는 동안.
그림 1 : 방법론 개요. 방법론의 개요 프리젠테이션입니다. 염색체 DARS2 지역 미니 테네시10 pNKBOR에 pJFM1 만들기에 복제 됩니다. pJFM1은 대장균 MG1655로 변형 Δ MG1655 대장균 의 염색체에 테네시10에DARS2, DARS2 의 임의 삽입 트리거 연결 ΔDARS2. 각 포함 된 다른 염색체 DARS2 삽입, 약 70000 클론 풀링된 고 37 ° c.에 파운드 국물에서 서로 직접 경쟁 LB 국물에 직접 경쟁 실험 수행 되었다에 대 한 추정된 700 세대, 샘플은 직접적인 경쟁의 각 100 세대에 대 한 격리. 총 DNA 각 고립 된 샘플에서 추출 하 고 WGS 남부 럽 및 DARS2 삽입의 식별을 위해 사용 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 쉽게 유전자 산책의 그래픽 프레 젠 테이 션. 이 그림에서는 알 수 없는 DNA 시퀀스 못쓰게 사이트 무작위 뇌관 및 중첩 뇌관 1, 2, 및 3에 대 한 알려진된 시퀀스에 인접 한의 게놈 DNA 템플렛. 3 연속 확대 3 설계 중첩 된 뇌관을 사용 하 여 수행의 결과 아래 그림. (3 라운드)에서 최종 제품 뇌관 3 중첩을 사용 하 여 시퀀싱은. 이 수치는 해리슨 외. 에서 적응 27. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 남쪽 오 점 NKBOR에 대 한 조사. DARS2에 DARS2 삽입의 남쪽 오 점 분석-결핍 스트레인. 게놈 DNA 추출 t에서 시작 하는 직접적인 경쟁의 모든 ~ 100 세대에서 = 0 그리고 700 세대를 끝으로, 내가 Pvu와 소화 및 젤 분류 한. 오 점 이었다는 NKBOR와 함께 때 교배 프로브 ( 프로토콜참조). t 세대 경쟁의 수를 나타냅니다. 이 수치는 Frimodt 몰 러 외. 에서 적응 4. HMW 및 LMW는 높은 분자 무게와 저 분자 무게 DNA, 각각. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : Resolv의 그래픽 표현Δ에서 드 transposon 삽입 사이트DARS2. 위치 오릭스, DARS1, DARS2, 데이터 및 terC 표시 됩니다. Δ에 DARS2 삽입 사이트DARS2 t = 0 (검은 막대), t = 400 (연한 파란색 막대), t = 500 (빨간색 막대), 및 t = 700 (녹색 막대), 전체 게놈 시퀀싱에 의해 해결. 이 그림 DNAPlotter33 를 사용 하 여와 Frimodt 몰 러 외. 에서 적응 했다 4. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : 쉽게 유전자 걸어서 발견 transposon 사이트의 대표적인 흐름 cytometry 히스토그램 t = 700. 셀 AB 최소한의 매체와 0.2% 포도 당, 10 µ g/mL 티 아민 0.5 %casamino 산 37 ° c.에 보충에서 재배 DARS2 에 표시 됩니다 Wildtype 및 Δ A와 B, 각각. DARS2 원래 로커 스 고 대신 해결된 transposon 사이트 rrpH, IR에서 DARS2 그리고 종점 (terC)의 복사본에 없는 wildtype 스트레인 MG1655의 파생 상품 C, D 및 E에 표시 됩니다. 각각. 이 수치는 Frimodt 몰 러 외. 에서 적응 4 그 결과 세포 주기 이상 (terC) 또는 wildtype 표현 형을 복원 하는 DARS2 위치 표시를(rrpH, IR). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
여기에서 사용 하는 방법론-의 상태--예술 기법 유전적 요소의 최적의 게놈 위치에 대 한 어려운 질문에 대답을 활용 합니다. 유전자 요소 (중재는 transposon)의 임의 삽입 수 클론 다음 조사 유전 요소의 최적의 위치를 위해 선택 하는 서로 대하여 경쟁 하기 위해 만들 수 있는 수천의 신속 하 고 쉽게 컬렉션 (즉 적자 클론).
여기, DARS2 미니-테네시10에 삽입 된-transposon, NKBOR를 기반으로. Transposon의 선택 삽입 사이트의 다운스트림 분석을 위해 중요 하다. 여러 다른 transposons 미니-테네시5Km234 등 더 인기 있는 선택, Himar는 transposon 감독 삽입 사이트 시퀀싱 (TraDIS) 실험에서 사용 된 난 마리너 transposon35, 36 (이의 최근 리뷰에 대 한 참조 밴 Opijnen와 Camilli36). 우리 DARS2, 약 DARS2 삽입을 주는의 70000 초기 랜덤 삽입 evert 65 대 한 목적 MG1655 게놈에 혈압. 이 수집 하는 식민지의 초기 수영장을 증가 또는 감소 하 여 쉽게 조정할 수 있습니다.
여기, 우리가 파운드 배치 문화에 있는 연속 전송에 대 한 선택 하지만 경쟁 실험 chemostat37을 사용 하는 등 다른 조건 또는 다른 매체에서 수행할 수도 있습니다. 또한, 프로시저 선택, 산화, 삼투성, 또는 항생제 스트레스 등 각종 스트레스 등의 모든 조건에 맞게 수정할 수 있습니다. 시간이 지남에 지속 클론의 존재를 확인 하려면 적어도 세 가지를 할 수 있는 하나: WGS; transposon 시퀀싱 (테네시-Seq); 또는 여기에, 남쪽 오 점. 마지막으로, 걷기 쉬운 유전자 특정 삽입 사이트의 효과 phenotypically 분석할 수는 transposon 삽입 사이트 단일 클론에서 식별 됩니다 추가 장점 몇 가지 클론에 할 수 있습니다.
경쟁 실험의 결과 평가 하는 phenotypic 분석 결과의 선택 조사 지역에 따라 다릅니다. 우리는 박테리아의 세포 주기 매개 변수를 측정 하는 강력한 방법입니다, cytometry 사용. 여기, cytometry DARS2, (즉, DARS2 삽입 wildtype DARS2 위치에 가까운)의 선택 된 염색체 position(s) 복제 개시 (올바른 규칙 결과 공개 즉, synchrony 그리고 DNA 농도). DARS2 에 대 한 최적의 염색체 position(s) 적절 한 복제 관련 유전자 노출량 때문과 일부 유리한 지역 게놈 환경 DARS2 함수4에 대 한 중요 한 부분에 선정 됐다.
여기, 비 코딩 DNA 요소 조사 되었다, 하지만이 선택의 어떤 코딩 영역에 확장 될 수 있었다. 최근 연구는 유전자 발현의 수준 변화 발견 ~ 300-fold, 염색체에 그것의 위치에 따라 하지 않고 복제 관련 유전자 노출량38를 취소. 여기에 설명 된 방법은 특정 유전자, transcriptional 활동, 그리고 관련된 피트 니스 이용의 genomic 위치 사이의 관계에 중요 한 통찰력을 줄 수 있었다. 이 수 이론에 도움을 차례로 재조합 단백질 생산에 대 한 엔지니어링 새, 향상 된 계통에 대 한 관심의 수 주어진된 유전자의 강한 표현으로 이어지는 genomic 위치의 선택.
때문에 대장균 포함 제한 intergenic 지역39, transposon 삽입, 대부분의 경우에서 중단 gene(s). 이 만들 수 있습니다 때때로 가양성 적자 clone(s) 유전자 요소의 최적의 염색체 위치 때문에 선택 하지 않은, 하지만 유전자-방해 때문에, 다른 방법으로 제공 하는 동안 피트 니스 이용은 경쟁 실험4.
이 방법론 활용의 선택의 어떤 영역 수 있는 사용 하기 쉬운 transposon 제도의 통합 무작위로 위치. 여기 본 설계 경쟁 실험 순수 성장 이외의 선택 힘의 어떤 숫자를 포함 하도록 수정할 수 있습니다. 설치 또한 테네시-Seq, 여기에서 사용 하는 WGS 보다 삽입 사이트의 높은 시퀀싱 해상도 이며 순수 기반으로 수정할 수 있습니다. 편견된 이렇게 명료 하 게 일반적인 트렌드 Eubacteria의 염색체 조직에 존재 하는 것을 표시할 수 있습니다 따라서 멀리 새롭거나 생물에 흥미로운 새 기능을 사용 해야 합니다.
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Disclosures
저자는 전혀 경쟁 금융 관심이 없다.
Acknowledgments
저자는 세균성 긴장 응답 및 지 속성 (BASP) Novo Nordisk 기초, Lundbeck 재단 그리고 센터를 통해 덴마크 국립 연구 재단 (DNRF120)에서 교부 금에 의해 투자 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclaved Mili-Q water | None | ||
| Electroporation Cuvettes, 0.1 cm | Thermo Fisher Scientific | P41050 | |
| Bio-Rad MicroPulser Electroporation System | Bio-Rad | 165-2100 | |
| LB Broth | Thermo Fisher Scientific | 12780029 | |
| LB Agar, powder (Lennox L agar) | Thermo Fisher Scientific | 22700025 | |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | 17904 | |
| Fisherbrand Plastic Petri Dishes | Fisher Scientific | S33580A | |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Nunc CryoTubes | Sigma-Aldrich | V7634 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/µL) | Thermo Fisher Scientific | F530S | |
| dATP, [α-32P]- 3000Ci/mmol 10mCi/ml, 250 µCi | PerkinElmer | BLU012H250UC | |
| DECAprime II DNA Labeling Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1455 | |
| Spectrophotometer SF/MBV/03.32 | Pharmacia | ||
| Hermle Centrifuge SF/MBV/03.46 | Hermle | ||
| Ole Dich Centrifuge SF/MBV/03.29 | Ole Dich | ||
| Eppendorftubes 1.5 mL | Sigma-Aldrich | T9661 | |
| Eppendorftubes 2.0 mL | Sigma-Aldrich | T2795 | |
| Sodium Chloride | Merck | 6404 | |
| 96% Ethanol | Sigma-Aldrich | 16368 | |
| Trizma HCl | Sigma-Aldrich | T-3253 | |
| Phenol Ultra Pure | BRL | 5509UA | |
| Chloroform | Merck | 2445 | |
| Ribonuclease A type II A | Sigma-Aldrich | R5000 | |
| Sodiumdodecylsulphate (SDS) | Merck | 13760 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L 6876 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 405-7 | |
| 0.5M Na-EDTA pH 8.0 | BRL | 5575 UA | |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 10106801001 | |
| PvuI (10 U/µL) | Thermo Fisher Scientific | ER0621 | |
| UltraPure Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16500500 | |
| DNA Gel Loading Dye (6X) | Thermo Fisher Scientific | R0611 | |
| Tris-Borate-EDTA buffer | Sigma-Aldrich | T4415 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E7637 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 433160 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 71687 | |
| Whatman 3MM papers | Sigma-Aldrich | WHA3030931 | |
| SSC Buffer 20× Concentrate | Sigma-Aldrich | S6639 | |
| Amersham Hybond-N+ | GE Healthcare | RPN119B | |
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F8016 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | PVP40 | |
| Bovine Serum Albumin - Fraction V | Sigma-Aldrich | 85040C | |
| Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes | Sigma-Aldrich | D1626 | |
| Carestream Kodak BioMax light film | Sigma-Aldrich | Z373494 | |
| GenElute Gel Extraction Kit | Sigma-Aldrich | NA1111 | |
| GenElute PCR Clean-Up Kit | Sigma-Aldrich | NA1020 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | ||
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | ||
| Rifampicin | Serva | 34514.01 | |
| Cephalexin | Sigma-Aldrich | C4895 | |
| Mithramycin | Serva | 29803.02 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 246964 | |
| Apogee A10 instrument | Apogee |
References
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