Summary
ここでは、非コーディング DNA 要素のトランスポゾンを介したランダム挿入の力は、その最適な染色体の位置の解決に使用されました。
Abstract
与えられた DNA 要素の最適な染色体位置/フィットネス選択続いてトランスポゾンを介したランダムな挿入によって定められました。細菌、遺伝的要素の機能に関する遺伝的コンテキストの影響は評価することは困難することができます。近隣の遺伝子や複製関連遺伝子投与量から転写干渉位相効果を含むいくつかのメカニズムは、与えられた遺伝的要素の機能に影響があります。ここでは、大腸菌と単純な成長競争を使用して最も有利な場所実験選択の染色体への DNA 要素のランダムな統合を可能にする手法について述べる。メソッドは、ランダムな挿入、結合で適者生存のクローンの選択成長の利点は、実験のニーズに簡単に調整されているプロシージャのよく説明トランスポゾン ベース システムの利点を受け取ります。適者生存のクローンの性質は、複雑な多クローン集団の全ゲノム シーケンスまたは選択されたクローンの迅速同定のため歩きやすい遺伝子によって決定できます。ここでは、 DARS2、エシェリヒア属大腸菌の染色体複製開始を制御する DNA の非コード領域は例として使用されました。複製関連遺伝子の用量の影響を受けるDARS2の機能は知られています。近いDARS2をさらにアクティブになる、DNA の複製の起源に取得します。DARS2がDARS2の染色体に挿入されたランダムに-ひずみを削除します。個々 の挿入を含む結果のクローンはプールされ、何百世代のため互いに競った。最後に、適者生存のクローンは、特徴し、 DARS2元のDARS2の場所の近くに挿入が含まれて発見されました。
Introduction
遺伝的要素の機能は、ゲノムでの位置によって影響を受けます。細菌、これは主に、隣接遺伝子、ローカル DNA のトポロジー、および/または複製関連遺伝子量のトランスクリプションによって干渉から結果します。特に、DNA 複製と偏析の過程の制御は、少なくとも一部では、非コーディング染色体領域で1とこれらの地域の適切な機能のゲノム位置/コンテキストに依存します。エシェリヒア属大腸菌、例としては、妹に必要なdifサイト染色体の解像度2KOPS シーケンス、染色体分離3に必要なデータ、 DARS1とDARS2の地域、(以下; 適切な染色体複製制御に必要な4). ここでDARS2非コード領域の研究に代表されるランダムな再配置、選択、および与えられた遺伝的要素の最適な遺伝的コンテキストの定量を可能にする手法を提案します。
大腸菌DnaA は、イニシエーター蛋白質 DNA 鎖、単一のレプリケーションの起源、oriC、開くとヘリカーゼ DnaB5,6、7の採用担当。AAA+ (すなわち、多様な活動に伴う Atpase) に属する DnaA タンパク質同様高い ATP、ADP をバインドできます、親和性5。DnaAATPのレベルのピーク開始時8、DnaAATPが上、多量体を形成oriC DNA 両面開口部9を起動します。開始後oriC hemimethylated に複製蛋白質の結合を含むメカニズムによって隔離のため再開始のため一時的に使用できなくされるoriC10,11。隔離中に DnaAATPのレベルは、少なくとも 2 つのメカニズムによって減少: DnaA (ライダー)12,13とデータの規制不活化-依存 DnaAATP加水分解 (DDAH)14 ,15。ライダーと DDAH の両方は、DnaAATPの DnaAADPへの変換を促進します。開始の新ラウンドは、前に DnaAADPは特定 DnaA 再アクティブ化シーケンス (邸宅) に DnaAATPに再活性化される: DARS1およびDARS216,17。染色体データ DARS1、および DARS2地域非コーディング、DnaAATPを調節するシャペロンのような方法で行動/DnaAADP相互変換。複製の起源の外に位置するこれらの地域はいずれかの複雑な DnaA のアセンブリを有効に不活化 (データ;14) または活性化 (DARS1およびDARS2;17) DnaA の。セルのDARS2を削除する質量の 2 倍の時間が、非同期レプリケーション開始15,16,18の結果を変更しません。ただし、 DARS2-フィットネスがある欠損細胞豊富な媒体で両方の継続的な成長の競争の間にまたはマウス腸18の植民地化の確立の間にそうしないと同質遺伝子野生型に比べてコスト。これは非同期/起源濃度の些細な変更が細菌フィットネスにマイナスの影響であることを示します。大腸菌染色体の対称性 (すなわち、 2 長さがほぼ等しいレプリケーション腕)19を維持する選択的な圧力があります。データ、 DARS1、およびDARS2領域に同じ相対的な間隔があるoriCすべて大腸菌株シーケンス18染色体サイズの大きな変化にもかかわらず。
ここでは、その機能に最適な染色体の位置の同定の例としてエシェリヒア属大腸菌のDARS2領域を用いてください。DARS2が NKBOR トランスポゾンと結果 NKBOR に挿入された:: その後ランダムに MG1655 のゲノムに挿入DARS2トランスポゾン ΔDARS2。我々 はこのように細胞のコレクションを生成された、それぞれの所有しているDARS2は染色体上の別の場所に配置します。体外競争実験、コレクション内のすべてのセルがプール、ポンドで推定 700 世代のための持続的な成長の間に互いに競ったかを行った。競争実験の結果監視/決定された南しみ、簡単な遺伝子を歩いて、全ゲノム シーケンス (WGS; を使用して図 1)。簡単な遺伝子を踏んで解決エンドポイント クローンは細胞周期のパラメーターを評価するフローサイトメトリーにより特徴づけられた.フローサイトメトリー解析、セル サイズ、DNA コンテンツ、および開始同期が多数のセルを測定できます。フローサイトメトリー、単一セルの流通過提供が、同時に放出される蛍光、DNA 含量の測定を収集フォトマルによって登録されますし、ステンド グラスの DNA を刺激する適切な波長の光線、細胞は DNA のステンド グラスします。前方散乱光は、細胞質量20の指標です。
ここでは提示の in vitro競争の実験、染色体の位置および遺伝的要素のゲノムのコンテキストの重要性に関連する質問に対処するため使用されます。メソッドは、公平な使いやすいです。
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Protocol
1 トランスポゾン ライブラリのコレクション
注: ミニ Tn 10 に複製された染色体 DARS2 の軌跡-トランスポゾン (pNKBOR) に NKBOR 21 の結果を基。NKBOR:: DARS2 (pJFM1)。pNKBOR オンライン 22 が得られます。pNKBOR は、イニシエーター蛋白質 π をレプリケーション 23 R6K ベース自殺ベクトルです。プラスミド pJFM1 つまり、pir 遺伝子の染色体コピーを含む 大腸菌 の菌株 (例えば Dh5α λ pir) に複製することができます。しかし、pJFM1 は、Pir 欠損または MG1655 に変換されると、pJFM1 をレプリケートできません、NKBOR のランダムな挿入によって生成されたカナマイシン耐性クローンの選択につながる:: 細菌の染色体に DARS2。わかりやすくするためは、これらを DARS2 挿入と呼びます。方法論の図式の 図 1 を参照してください
。- 準備 electrocompetent MG1655 Δ DARS2 積極的に成長してから細胞のホストゲノム スープ (LB) 37 ° C 24 で成長しています 。 Electrocompetent MG1655 Δ に
- Electroporate pJFM1 DARS2、ゴンザレス ら によると 24 electrocompetent 大腸菌 MG1655 Δ
- 40 (水の 1 μ L) で pJFM1 の追加 1 μ μ DARS2 中古冷蔵、滅菌の 0.2 cm ギャップ キュベットにこの混合物を転送。キュベットをエレクトロポレーション室に挿入します。18 Electroporate kV、500 Ω、25 μ F。時定数は ~5.0 ms をする必要があります、アーク放電は発生しません 。
- 流体培養基 LB に予め温めておいた 1 mL、15 mL の試験管に転送で再によって細菌懸濁液をすばやく回復します 。
- 抗生物質選択なしの 30 分の 37 ° C で気泡の成長条件の下での孵化によって回復細胞ができます。50µg/mL カナマイシンを添加した LB 寒天培地プレート上に細菌をプレートし、37 ° C で一晩インキュベートします 。
- 、エレクトロポレーションからコロニーをカウント: 1 つのコロニーは 1 つの染色体のトランスポゾン挿入に等しいと見なされます
。 注: 目、コロニー カウンターは、コロニーが数えることができます。コロニーの数、各クローンの染色体にあるトランスポゾンを分離する平均距離に反比例します 。
流体培養基 LB のそれぞれに追加の 1 mL - プレートし、すべてのコロニーを洗い流して; 流体培養基 LB の 1 mL は 〜 100,000 コロニーを洗浄するための十分な必要があります。流体培養基 LB の細菌濃度を増加する同じ 1 mL を再利用します。同じ 50 mL のチューブですべてのコロニーをプールします 。
- 渦管凍結開始材料と (t = 0)。それを凍結、氷の上の 50% のグリセロールの 1 mL の細胞懸濁液の 1 mL を混ぜます。10 分のドライアイスにチューブを転送します。文化が固定されている一度は-80 ° C のフリーザーにそれらを転送します
。 注: 50,000 CFU/mL 以上の細胞濃度はこの段階で予想します 。
2。LB の競争実験
- 融解氷-80 ° C からトランスポゾン ライブラリ。ピペッティングでミックスします 。
- 10 ml LB の 15 mL の試験管にトランスポゾン ライブラリの転送 100 μ L.
- 固定相への 37 ° C で 8 時間の連続振動 (250 rpm)、曝気、細胞の成長 (すなわち、 外径 600 〜 4.0 を =)。必要に応じて、生育条件にこれらのパラメーターを調整します 。
- は、すべて 〜 10 世代、新鮮な prewarmed 中に連続転送によって細菌の人口を反映します。以前の固定相文化の 10 μ L を新鮮なポンドの 10 mL に転送する、静止した段階別の 8 h の成長によってこれを行う (すなわち、 外径 600 〜 4.0 を =).
注: 開始と終了の光学密度は同じ、1,000 倍希釈対応 〜 10 世代の成長する (2 10 = 1,024)。細菌の人口が新鮮な prewarmed 媒体に直接反映したり、0 - 4 保存 ° C (氷上) し、次の日を反映します。ポンドがここでは、できるだけ (22 分近く倍加時間) 時間の短い多くの細胞の doublings を確保するために使用されたします 。
- 競争の各 100 世代後、付けて-80 ° c の 5 つの 1 mL サンプル (ステップ 3.3 で説明します).
- 個々 のトランスポゾンの挿入を含むセルとフィットネスの差が小さい場合は、期間を保つ、競争の長い; ここでは、700 世代 (t = 700) 使用された 。
3。競争期間実験を監視する南しみ分析
- 特異的プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) の拡大を実行してしみ (1 kb、NKBOR 部)、サザンのプローブ
- 準備: NKBOR_Probe_FW: gatgttggacgagtcggaat と NKBOR_Probe_RV: cgttacatccctggcttgtt。
初期変性
- 加温 30 98 ° C で s。次に、10 の 98 ° C で 35 サイクルを実行 s、60 ° C、30 s、および 45 のための 72 ° C s。最後の拡張使用 72 ° C で 10 分間
注: PCR の反作用のテンプレートだった精製 pNKBOR プラスミド 21 。
- スミス 25 によると任意プライマーを用いた α [32 P] dATP の結果 PCR のフラグメントのラベルします 。
- 加温 30 98 ° C で s。次に、10 の 98 ° C で 35 サイクルを実行 s、60 ° C、30 s、および 45 のための 72 ° C s。最後の拡張使用 72 ° C で 10 分間
- Løbner 欧米とフォン Freiesleben 26 によると総細胞 DNA を備える t t まで 0 と選択した時点を = = 競争の世代を推定 700 。
- ダイジェスト Pvu プローブによって覆われていない領域でのみ一度関心の領域を含む NKBOR をカット、私の全細胞の DNA; Pvu の 1 単位使えます基板 DNA の完全にダイジェスト 1 μ g にします
。 メモ: プローブの挿入部位によって、様々 な長さの染色体 DNA と共に、トランスポゾンの一部を含むフラグメントが認識されます 。
- 南しみ Løbner 欧米とフォン Freiesleben 26 によると 0.7% の agarose のゲルを使用してを実行します 。
4。適者生存のクローンの同定
ウォーキング、前述のハリソン ら によって- 使用簡単な遺伝子 27, 700 推定世代競争の後 (LB の版に分離) 単一のクローンから DARS2 挿入サイトを識別するために他のバンドすべてトランスポゾン挿入をカバーするためにより多くの分離、サザンブロット上。
PCR テンプレート用
- 分離株のゲノム DNA。50 μ G/ml カナマイシンを含む LB 寒天培地プレートに細菌を広げるし、37 ° C で一晩インキュベートします。流体培養基 LB の 37 ° c で一晩シングル コロニーを成長しその後オートクレーブに蒸留水を 200 μ L に 20 μ L を転送 (または、ステップ 3.2 のように、DNA の浄化を使用)。
- ミックスする渦。100 ° C でミックスを熱の 10 min と max 速度で 5 分間遠心するを保存する将来の使用のための-20 ° C でライセートのセル 。
- 好みのトランスポゾンでアニールする 3 つの入れ子になったプライマーを設計 (PCR 戦略のグラフィック表現の 図 2 を参照).
注: はプライマー 3 の入れ子にある知られている 5 に最も近いように入れ子にプライマーの設計 ' トランスポゾン DNA、続いてネスト プライマー 2 と 1 の終わり。入れ子になっているプライマー 3 と 5 の間隔 ' 知られている t の終わりransposon DNA は、(特定の染色体トランスポゾン挿入部位を見つける) に未知の dna 既知の DNA からシーケンス リード スルーのため十分なはずです。NKBOR 次の入り込まれたプライマーは使用された: pNKBOR_Nested3_RV: gcagggctttattgattcca pNKBOR_Nested2_RV: tcagcaacaccttcttcacg、および pNKBOR_Nested1_RV: actttctggctggatgatgg。知られている制限酵素の認識部位を含むランダム プライマーも使用されます。結果を確保するため、1 つは少なくとも 2 つの異なるランダムなプライマーを使用する必要があります。制限酵素 (e.g.,Sau 3AI、Hin dIII) の制限のサイトは 3 時位置にする必要があります ' を終了し、10 のランダムな塩基によって先行 5 ' - NNNNNNNNNNGATC - 3 ' と 5 ' - NNNNNNNNNNAAGCTT - 3 '、プライマーそれぞれ、ソウ 3AI サイト (GATC) と Hin dIII サイト (AAGCTT) を含む、N = A、T、G、または C - 、20 の DNA の使用 200 ng μ L の PCR 反応。30 98 ° C の孵化初期変性の s。30 の 98 ° C で 25 サイクルを実行 s、50 ° C、15 s と 4 分の 72 ° C。最後の拡張使用 72 ° C 10 分使用プライマー プライマー 1 の入れ子になっているとランダムなプライマーのいずれかから成る 。
- テンプレートとして 1 μ L の反応は以前を使用して入れ子になったプライマー 2 と 2 番目の増幅から同じ任意プライマーから成るプライマー対を使用します 。
- プライマー プライマー 3 のネストと同じ任意プライマーから成ると繰り返しステップ 4.1.4 。
- は、1.5% の agarose のゲルとエチジウム ブロマイドで染色に最終的な PCR の反作用から製品を実行します。100-800 bp の範囲でバンドをカットし、抽出キットの製造元によって任意の商業 DNA ゲルを用いた DNA を隔離 ' s 方向。水の 15 μ L の DNA を再懸濁します
。 注: 注意。臭化エチジウムは毒性があり注意して処理する必要があります 。
- サンガーを使用して配列のプライマーとしてネスト プライマー 3 前の手順 (手順 4.1.6) で分離帯をシーケンス商業プロバイダーの配列 。
- 分離株のゲノム DNA。50 μ G/ml カナマイシンを含む LB 寒天培地プレートに細菌を広げるし、37 ° C で一晩インキュベートします。流体培養基 LB の 37 ° c で一晩シングル コロニーを成長しその後オートクレーブに蒸留水を 200 μ L に 20 μ L を転送 (または、ステップ 3.2 のように、DNA の浄化を使用)。
- 実行 WGS。
- から抽出した DNA の合計実行 WG Frimodt Møller ら 4 で説明されているように競争実験中に収集されたサンプルを選択した 。
- シーケンス解析を実行します。
- 整列ペアエンド読み取り 150 Ns NKBOR、AF310136.1 1,904 に隣接した … Bowtie2 28 を用いた種子部分文字列 (S、1、1.15) とあいまいな文字 (L、0, 0.9) の最大数間隔 2,204 。
- 配向の読み取りを選択し、両方 MG1655 ref に再整列 |NC_000913.3 と NKBOR gb |AF310136 blastN 29 を使用して
- 接合 MG1655 NKBOR で、挿入位置の転位を割り当てる 。
5。フローサイトメトリー
- フローサイトメトリー用サンプルを収集します。
少なくとも 10 世代のため指数関数的成長の段階でそれを維持する
- バランス各文化です。外径 600 を確認し、それが 0.3 を超えることはありません 。
- は、フロー サンプルの 2 種類を収集します。
- リフ-振れのリフ CEF (300 μ g/mL リファンピシン、36 μ g/mL セファレキシン 12.5 mM NaOH に溶解) の 30 μ L を含む 15 mL チューブ文化の 1 mL に転送します。揺れの 4 h の最小値の 37 ° C でそれを残しています
。 注: リファンピシン直接ブロックないのレプリケーションの継続的なラウンドを終了し続けるようにしながら染色体複製開始します。セファレキシンは、レプリケーション振れ (リフ振れ) および完全に複製された染色体を持つ細胞の蓄積で起因する細胞分裂を防ぐことができます。リファンピシン、セファレキシン 20 治療の時に完全に複製された染色体の数は起源の数と等しい 。
- EXP サンプル、転送指数関数的に成長する氷を 1.5 mL チューブに文化の 1 mL
- リフ-振れのリフ CEF (300 μ g/mL リファンピシン、36 μ g/mL セファレキシン 12.5 mM NaOH に溶解) の 30 μ L を含む 15 mL チューブ文化の 1 mL に転送します。揺れの 4 h の最小値の 37 ° C でそれを残しています
- 次のようにセルを修正します。4 で 5 分間 15,000 × g で遠心分離によって細胞を収穫 ° C の冷たい 10 mM Tris pH 7.5 100 μ L でペレットを再懸濁し、冷たい 77% エタノール 1 mL を加えます。使用するまで 4 ° c のサンプルを格納します 。
- は、次のとおりセルを汚します。上澄み 15 分削除 15,000 × g で遠心分離によって固定セルの 100-300 μ L を収穫し、130 μ でペレットを再懸濁します " DNA 染色液 " (90 μ g/mL ミスラマイシン、20 μ G/ml エチジウム ブロマイド、10 mM MgCl 2、と 10 mM Tris pH 7.5)。暗闇の中、氷の上にサンプルを置くサンプルは 10 分後フローサイトメトリー解析のため準備ができている
注: 他の DNA のエチジウム ブロマイドよりも汚れし、ミスラマイシンはまた使用される 30 , 31 をすることができます 。
- フローサイトメトリー分析によるセル、相対セル質量と相対的核 DNA 量あたりの起点を特定します。
- 実行フローサイトメトリー、 32 を前述のよう。リフ振れと流れの cytometer メーカーを使用して EXP サンプルを実行 ' の指示 .ミスラマイシン、エチジウム ブロマイド染色細胞励起波長 395 と 440 nm を使用し、収集 565 上記蛍光 nm。
- 携帯番号ヒストグラム対単一パラメーター前方光散乱と 30,000 イベントの最小値のセル番号ヒストグラムと蛍光強度を取得する EXP サンプルを実行相対セル質量と相対の DNA の内容を決定するにはセル信号に対応する 。
- 使用を前方散乱平均相対を測定するための光単一パラメーターの分布細胞マサチューセッツ州
注: 前方散乱光は平均セル質量 20 の尺度 。
- 平均の DNA を測定する使用蛍光強度単一パラメーター分布コンテンツ 20 。
- 平均セル質量 20 平均核 DNA 量の比として DNA の濃度を取得します 。
- 起源細胞 1 個あたりの数を決定します。
- 対単一パラメーター蛍光強度を取得する実行リフ振れサンプル セル セル信号に対応する 30,000 のイベントの最小数のヒストグラム 。
- それぞれの染色体の数を決定する使用蛍光強度単一パラメーター分布細胞 20 。
- 実行フローサイトメトリー、 32 を前述のよう。リフ振れと流れの cytometer メーカーを使用して EXP サンプルを実行 ' の指示 .ミスラマイシン、エチジウム ブロマイド染色細胞励起波長 395 と 440 nm を使用し、収集 565 上記蛍光 nm。
- 非同期性指数 (Ai) を計算します。
- 計算 Løbner 欧米 ら による記述で、Ai 32、リフ振れサンプルと数式の Ai の蛍光強度の単一のパラメーター分布を使用して (f3 キー + f5 キー + f6 f7) =/(f2 f4 + f8), fx が完全に複製された染色体の x の数と分画細胞。イニシエーションを非同期考慮するとき A > 0.1 。
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Representative Results
南しみはDARS2がトランスポゾン ライブラリでは染色体の中でランダムに配布されたことを確認する行われていた (t = 0) と適者生存のクローンを時間をかけて永続化でしょう。南しみは初期トランスポゾン プールから抽出した DNA を行った (t = 0) と (図 3) の競争の 700 世代からすべての推定 100。ここでは、それぞれの時点から全細胞 DNA はトランスポゾン NKBOR を削減する知られている制限酵素にPvuと消化::DARS2一度プローブによってカバーされない領域でのみ。南しみは、NKBOR の一部に相補的な放射能によって分類された DNA 断片をプローブだった。図 3、初期のDARS2プールから見た (t = 0) 欠けていたは明瞭なバンド、 DARS2が染色体全体にランダムに挿入されたことを示しています。時間をかけて、パターン登場DARS2クローンの初期の大規模なプールが 1 つまたはいくつかの永続的DARS2クローンに開発 (図 3; t = 0 t から = 700)。
例で示すように、競争の実験からDARS2挿入サイトは WGS および簡単な遺伝子ウォーキングを使用して識別されました。ここ、WGS はスタート プールから挿入サイトを識別するために使用された (t = 0) と 300、400、700 世代の競争の後。現在のディープ シーケンスの報道だった t で挿入サイトの完全なマッピングのために十分であることに注意 = 0;しかし、挿入の総数の代表的なサブセットを与えます。WGS 確認南しみの結果 (すなわち、適者生存のDARS2クローンの選択) は、すべてDARS2の約 98% で終わる、またはDARS2染色体位置 (DARS2の近くに挿入IR クローンとクローン ・ rppH)、残りの 2% が染色体 (図 4) の他の場所。これは強く野生型位置はDARS2関数の最適を提案します。T = 400、反対側のレプリケーション腕にほぼ同じ距離で挿入が見つかりましたoriCまたはDARS2として位置 (図 4)、しかしこの挿入は回復されませんでした 700 世代後。したがって、複製関連遺伝子投与量は最適な位置の単一の決定をすることはできません。
歩いて簡単な遺伝子は、競争の 700 の推定世代後分離された単一のクローンのDARS2挿入サイトを識別するために使用されました。ここでは、(クローンDARS2クローン IR rppH) 上記 2 つのDARS2挿入サイトは識別されました。歩いて簡単な遺伝子は、20 クローンのみ行われ、これは WGS でマップされているサイトがすべてのDARS2挿入が識別される理由について説明します。DARS2-欠損細胞は非同期で複製を開始する示されていた以前と野生型を基準にして原点濃度の減少を持っている細胞4,16,17, 18. 我々 したがって、DNA 複製と細胞起源コンテンツ 2 菌株 (DARS2クローン IR とクローン ・ rppH) が、両方のケースでは、野生型に復元のための開始に同期を解決するフローサイトメトリーを使用レベル (図 5)。末端に位置するDARS2の単一のコピーを持つ系統の代表的な例 (図 5E) を示します。ここでは、末端のDARS2要素の存在は復元されません同期または細胞の起源コンテンツなしの野生型のレベルに IR クローンを選択したDARS2とrppHを行います。
図 1: 方法論の概要。方法論の図式。染色体のDARS2領域がミニTn10 pNKBOR の pJFM1 の作成に複製されます。pJFM1 はエシェリヒア属大腸菌MG1655 変身TnMG1655エシェリヒア属大腸菌の染色体に 10 に ΔDARS2、 DARS2のランダムな挿入をトリガーするリンク ΔDARS2。それぞれ別の染色体DARS2の挿入を含むおよそ 70,000 のクローン プールし、そして流体培養基 LB の 37 ° c で互いに対して直接出場流体培養基 LB の直接競争実験行ったの推定 700 世代のサンプルが直接競争の各 100 世代の分離された場所。総 DNA は各分離のサンプルから抽出され、WGS で南にしみが付くことおよびDARS2の挿入の id に使用されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 簡単な遺伝子の歩行グラフィック プレゼンテーション。この図は、任意プライマーおよびネストされたプライマー 1、2、および 3 のための起爆剤のサイトで知られていたシーケンスに隣接する未知の DNA シーケンスのゲノム DNA のテンプレートを示しています。3 つの設計の入り込まれたプライマーを用いて 3 連続増幅の結果を以下に示します。(ラウンド 3 から) 最終製品はプライマー 3 のネストを使用してシーケンスに配置します。この図は、ハリソンらから適応されました。27.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: NKBOR を探るを受けて南しみ。DARS2挿入DARS2の南しみ分析-欠乏のひずみ。抽出したゲノム DNA t から始まる、直接の競争相手のすべて ~ 100 世代から = 0 とした 700 世代で終了、私Pvuと消化され、ゲル分画されました。しみは、NKBOR とハイブリダイズされたプローブ (プロトコルを参照してください)。t は、競争の世代の数を示します。この図は Frimodt Møllerらから適応されました。4. 高分子と低分子、高分子量および低分子量 DNA、それぞれ。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: Resolv のグラフィック表現ed トランスポゾン挿入サイトΔでDARS2。位置oriC、データ DARS1、DARS2、および陸に示されています。Δ のDARS2挿入サイトDARS2で t = 0 (黒いバー)、t = 400 (水色のバー)、t = 500 (赤い棒) と t = 700 (緑色のバー)、全ゲノム塩基配列解読によって解決。この図は DNAPlotter33を使用してなされ、Frimodt Møllerらから適応されました。4.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 簡単な遺伝子を歩いて見つけたトランスポゾン サイトの代表的な流れ cytometry ヒストグラム t = 700 。細胞がグルコース 0.2%、10 μ G/ml チアミン、37 ° C で 0.5% カザミノ酸と AB 最小培で栽培されました。野生型と ΔDARS2が表示されます A と B、それぞれ。元の軌跡と解決トランスポゾン サイトrrpH IR でDARS2とターミナス (陸) のコピーを運ぶ代わりに、 DARS2を欠いている野生型株 MG1655 の誘導体は、C、D、および E に示すようにそれぞれ。この図は Frimodt Møllerらから適応されました。その結果細胞周期異常 (陸)、またはなしの野生型表現型を復元するDARS2場所を見るには4 (rrpH、 IR)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
ここで使用した方法論は、技術遺伝的要素の最適な genomic 位置に関する難しい質問に答えるための活用します。(トランスポゾンを介した) 遺伝的要素のランダムな挿入、お互いの調査遺伝的要素の最適な位置を選択するに対抗するために作ることができるクローンの何千もの迅速かつ簡単のコレクションを有効に (すなわち、適者生存のクローン)。
ここでは、 DARS2は、ミニ Tn10挿入された-NKBOR トランスポゾンを用いた。トランスポゾンの挿入サイトの下流の分析に重要です。いくつかの異なるトランスポゾンはミニ Tn5Km234より普及した選択、キャラクターなどの監督のトランスポゾンの挿入部位配列 (TraDIS) 実験で使用されている私はマリナートランスポゾン35, 36 (これの最近の検討、ヴァン Opijnen とカミリ36を参照してください)。目的とするDARS2、 DARS2挿入約を与えるの 70,000 の初期ランダム挿入片脚 65 の MG1655 ゲノムで bp。これは、減少または収集のコロニーの最初のプールを増やすことによって簡単に調整できます。
LB 培養連続転送しましたが、別の媒体でまたはケモスタット37を使用するなど、さまざまな条件の下で、競争の実験を実行することも。さらに、酸化、浸透圧、または抗生物質のストレスなど様々 なストレスをはじめ、様々 な条件に合わせて手順を変更できます。時間をかけて保存するクローンの存在を確認する 1 つは、少なくとも 3 つのことを行うことができます: WGS;トランスポゾン配列 (Tn Seq);または、ここで南しみ。最後に、歩きやすい遺伝子いくつかのクローンは、特定の挿入部位の影響を表現型解析するよう、トランスポゾン挿入サイトに単一クローンの識別できるそれ以上の利点を行うことができます。
競争実験の結果を評価する表現型分析の選択は調査の地域によって異なります。細菌の細胞周期のパラメーターを測定する強力な方法である、フローサイトメトリーを使用しました。ここでは、cytometry 流れをDARS2、 (すなわち、 DARS2挿入なしの野生型DARS2位置に近い) の選択した染色体位置がレプリケーション開始 (正しい規制の結果を明らかにしました。すなわち同期と DNA 濃度)。DARS2の最適な染色体の位置は、適切なレプリケーション関連遺伝子投与量により、一部はDARS2関数4にとって重要な有利なローカル ゲノム環境により一部で選ばれました。
ここでは、非コーディング DNA 要素が調べたが、これは選択の任意のコーディング領域に拡張されるかもしれません。最近の研究は、遺伝子発現のレベルが変化することを発見 〜 300、染色体上の位置に応じてなし複製関連遺伝子投与量38に相関をクリアします。ここで説明している方法は、特定の遺伝子、その転写活性および関連付けられているフィットネスの利点のゲノムの位置間の関係の重要な洞察を与えることができます。これは、助けることができる理論に強い順番組換えタンパク質生産のエンジニア リングの新しい、改良された系統に興味があるでしょうある特定の遺伝子発現につながるゲノムの位置の選択。
大腸菌では、限られた遺伝子間領域39含まれている、ためには、ほとんどの場合、トランスポゾン挿入遺伝子が中断します。これは時折、問題の偽陽性染色体位置の最適化遺伝的要素による適者生存のクローンが選択されていないを作成ことがありますが、遺伝子が中断されるのではなく、他の方法で提供するフィットネス利用中に、競争実験4。
任意選択の領域がすることができます簡単に使用できるトランスポゾン システムのこの方法論の活用は場所をランダムに統合されています。ここで見られるように、純粋な成長以外選択力の任意の数を含むように設計された競争実験を変更できます。セットアップは、Tn-Seq、挿入サイトの大きい配列解像度 WG、ここで使用されるよりも利回りに基づく純粋な変更もできます。この公平な方法は真正細菌の染色体の組織に共通の傾向が存在する可能性があります表示され、これまでの未同定生物のエキサイティングな新機能を解明するために使わなければなりません。
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Disclosures
著者は競合する財務持分を有していません。
Acknowledgments
著者は、細菌のストレス応答と永続性 (BASP) ノボ ノルディスク財団とルンドベック財団、中心を通ってデンマークの国立研究財団 (DNRF120) からの助成金で賄われました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclaved Mili-Q water | None | ||
| Electroporation Cuvettes, 0.1 cm | Thermo Fisher Scientific | P41050 | |
| Bio-Rad MicroPulser Electroporation System | Bio-Rad | 165-2100 | |
| LB Broth | Thermo Fisher Scientific | 12780029 | |
| LB Agar, powder (Lennox L agar) | Thermo Fisher Scientific | 22700025 | |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | 17904 | |
| Fisherbrand Plastic Petri Dishes | Fisher Scientific | S33580A | |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Nunc CryoTubes | Sigma-Aldrich | V7634 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/µL) | Thermo Fisher Scientific | F530S | |
| dATP, [α-32P]- 3000Ci/mmol 10mCi/ml, 250 µCi | PerkinElmer | BLU012H250UC | |
| DECAprime II DNA Labeling Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1455 | |
| Spectrophotometer SF/MBV/03.32 | Pharmacia | ||
| Hermle Centrifuge SF/MBV/03.46 | Hermle | ||
| Ole Dich Centrifuge SF/MBV/03.29 | Ole Dich | ||
| Eppendorftubes 1.5 mL | Sigma-Aldrich | T9661 | |
| Eppendorftubes 2.0 mL | Sigma-Aldrich | T2795 | |
| Sodium Chloride | Merck | 6404 | |
| 96% Ethanol | Sigma-Aldrich | 16368 | |
| Trizma HCl | Sigma-Aldrich | T-3253 | |
| Phenol Ultra Pure | BRL | 5509UA | |
| Chloroform | Merck | 2445 | |
| Ribonuclease A type II A | Sigma-Aldrich | R5000 | |
| Sodiumdodecylsulphate (SDS) | Merck | 13760 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L 6876 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 405-7 | |
| 0.5M Na-EDTA pH 8.0 | BRL | 5575 UA | |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 10106801001 | |
| PvuI (10 U/µL) | Thermo Fisher Scientific | ER0621 | |
| UltraPure Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16500500 | |
| DNA Gel Loading Dye (6X) | Thermo Fisher Scientific | R0611 | |
| Tris-Borate-EDTA buffer | Sigma-Aldrich | T4415 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E7637 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 433160 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 71687 | |
| Whatman 3MM papers | Sigma-Aldrich | WHA3030931 | |
| SSC Buffer 20× Concentrate | Sigma-Aldrich | S6639 | |
| Amersham Hybond-N+ | GE Healthcare | RPN119B | |
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F8016 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | PVP40 | |
| Bovine Serum Albumin - Fraction V | Sigma-Aldrich | 85040C | |
| Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes | Sigma-Aldrich | D1626 | |
| Carestream Kodak BioMax light film | Sigma-Aldrich | Z373494 | |
| GenElute Gel Extraction Kit | Sigma-Aldrich | NA1111 | |
| GenElute PCR Clean-Up Kit | Sigma-Aldrich | NA1020 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | ||
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | ||
| Rifampicin | Serva | 34514.01 | |
| Cephalexin | Sigma-Aldrich | C4895 | |
| Mithramycin | Serva | 29803.02 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 246964 | |
| Apogee A10 instrument | Apogee |
References
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