Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

En iyi kromozom Location(s) belirlenmesi için yeni bir Transposon-aracılı yaklaşımın kullanarak Escherichia coli DNA öğesinde

Published: September 11, 2017 doi: 10.3791/55946
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Biology, Section for Functional Genomics and Center for Bacterial Stress Response and Persistence (BASP), University of Copenhagen, 2Department of Microbiology and Infection Control, Statens Serum Institut

Summary

Burada, bir transposon-aracılı rasgele ekleme kodlamayan DNA öğesinin gücünü en iyi kromozom konumunu gidermek için kullanıldı.

Abstract

Belirli bir DNA öğeyi en iyi kromozom pozisyon(lar)/rasgele ekleme transposon-aracılı fitness seçime göre takip tarafından belirlendi. Bakterilerde genetik bir öğe işlev genetik içeriğine etkisini değerlendirmek zor olabilir. Topolojik etkileri, komşu genler ve/veya çoğaltma ilişkili gen dozaj, transkripsiyon müdahalelerden de dahil olmak üzere çeşitli mekanizmalar belirli bir genetik öğeyi işlevini etkileyebilir. Burada, kromozom Escherichia coli ve basit büyüme rekabet kullanarak en uygun konumları deneme Seç rasgele entegrasyonu, bir DNA öğesi izin veren bir yöntem açıklanmaktadır. Yöntem rasgele ekleme, büyüme avantajı, deneysel ihtiyaçlarına kolayca ayarlanabilir bir yordam tarafından fittest clone(s) bir seçim ile birleştiğinde iyi tarif bir transposon tabanlı sistem yararlanır. Fittest clone(s) doğası karmaşık bir çok klonal nüfusun bütün-genom sıralama veya seçili klonlar hızlı tanımlanması için yürüyüş kolay gen tarafından belirlenebilir. Burada, kodlamayan DNA bölge E. colikromozom çoğaltması başlatma kontrol, DARS2, örnek olarak kullanılmıştır. DARS2 fonksiyonu çoğaltma ilişkili gen dozaj tarafından etkilendiği bilinmektedir; daha yakın DARS2 DNA ikileşmesi, kökeni daha etkin hale gelir alır. DARS2 rasgele bir DARS2kromozom eklenen-zorlanma silinmiş. Bireysel eklemeler içeren sonuç klonlar havuza alınmış ve birbirlerine karşı yüzlerce nesiller için yarıştı. Son olarak, fittest klonlar ile karakterize ve yakın özgün DARS2 konumuna eklenen DARS2 içerecek şekilde bulundu.

Introduction

Genetik herhangi bir öğe işlev genom konumunda etkilenebilir. Bakterilerde bu esas olarak müdahalelerden komşu genler, yerel DNA topoloji ve/veya çoğaltma ilişkili gen dozaj transkripsiyon tarafından neden olur. Özellikle, DNA ikileşmesi ve segregasyon süreçleri, en azından bölümünde kontrol edilir, kromozom bölgeleri kodlamayan1ve bu bölgeler düzgün genomik konumu/içeriğine bağlıdır. E.coliiçinde kardeşi için gerekli DIF site örnekler kromozom çözüm2; Kromozom segregasyon3için gereken KOPS serilerini; ve veri, DARS1ve DARS2 bölgeleri, uygun kromozom çoğaltma denetimi (aşağıda; için gerekli 4). biz izin rasgele tehcir, seçim ve genetik verilen herhangi bir öğe, en uygun genetik bağlamında belirlenmesi için örneği burada kodlamayan DARS2 bölgesinin çalışma odasına bir yöntem mevcut.

E. coli, DnaA başlatıcı protein DNA dizisi tek çoğaltma kökenoriCaçılış ve helikaz DnaB5,6,7alımı sorumludur. AAA+ (Yani, çeşitli aktiviteler ile ilişkili ATPases) kime ait DnaA proteinler ve ATP ve ADP ile benzer yüksek bağlayabilirsiniz benzeşim5. DnaAATP düzeyini doruklarına başlatma8nerede DnaAATP oluşturan bir multimer üzerinde oriC DNA çift yönlü açılış9tetikler. Başlatma sonra oriC bağlama hemimethylated için SeqA protein içeren bir mekanizma geçici olarak kullanım dışı haciz nedeniyle yeniden başlatma için yapılır oriC10,11. Haciz sırasında en az iki mekanizma ile DnaAATP düzeyi azalır: DnaA (RIDA)12,13 ve veridüzenleme inactivation-bağımlı DnaAATP hidroliz (DDAH)14 ,15. RIDA ve DDAH DnaAATP dönüştürmeye DnaAADPtanıtmak. Önce yeni bir tur başlatma DnaAADP DnaAATP belirli DnaA yeniden etkinleştirme dizileri (DARS) yeniden aktif: DARS1 ve DARS216,17. Kromozom veri, DARS1ve DARS2 bölgeleri kodlamayan ve hareket DnaAATPmodüle için bir refakatçi benzeri şekilde /DnaAADP şekilde. Çoğaltma, kökeni dışında yer alan bu bölgeler, karmaşık bir DnaA Meclisi etkinleştirmek için de inactivation (veri; 14) ya da harekete geçirmek (DARS1 ve DARS2; 17), DnaA. DARS2 hücrede silme kitle katlama zaman ama sonuçları zaman uyumsuz çoğaltma başlatma15,16,18değiştirmez. Ancak, DARS2-eksik hücrelerin bir fitness var aksi halde isogenic bir wildtype için her iki sürekli büyüme rekabet zengin Orta veya fare bağırsak18kolonizasyon kurulması sırasında karşılaştırıldığında maliyet. Bu eşzamansız/kökenli konsantrasyon bile küçük değişiklikler bakteriyel fitness üzerinde olumsuz bir etkisi gösterir. E. coli, kromozom simetri (Yani, iki neredeyse eşit uzunlukta çoğaltma kol)19korumak için seçici bir basınç vardır. Veri, DARS1ve DARS2 bölgeleri aynı göreli uzaklık var oriC içinde tüm E. coli suşları18, kromozom boyutu büyük değişimler rağmen sıralı.

Burada, kromozom pozisyon(lar) için işlevini en iyi tanımlanması için bir örnek olarak E. coli DARS2 bölge kullanırız. DARS2 NKBOR transposon ve sonuç NKBOR içine eklenen:: daha sonra rastgele MG1655 genom eklenenDARS2 transposon ΔDARS2. Böylece hücre koleksiyonu üretilen, kromozom üzerinde farklı bir yerde her sahip DARS2 yerleştirilir. Nerede koleksiyondaki tüm hücreleri havuza alınmış ve birbirlerine karşı sırasında LB sürekli büyüme tahmini 700 nesiller için yarıştı, vitro rekabet deney, gerçekleştirildi. Rekabet denemenin sonucu izlenen/Southern blot, kolay gen yürüyüş ve bütün-genom sıralama (WGS; kullanarak tespit edildi Şekil 1). Kolay gen yürüyerek çözüldü son nokta klonlar hücre döngüsü parametreleri değerlendirmek için Akış Sitometresi tarafından karakterize. Bir akış sitometrik analizinde çok sayıda hücre için hücre boyutu, DNA içeriği ve inisiyasyon senkronizasyonu ölçülebilir. Akış Sitometresi sırasında bir akış tek hücre sonra aynı anda verilmiş Floresans DNA içeriği, bir ölçü birimi toplamak photomultipliers tarafından sağlanan kayıtlı lekeli DNA heyecanlandırmak için uygun dalga boyu bir ışık huzmesi geçer. hücreleri DNA için lekeli. İleri dağınık ışık hücre kitle20ölçüsüdür.

Burada mevcut vitro rekabet deney kromozom pozisyon ve genomik genetik öğesi bağlamında önemi ile ilgili soruları gidermek için kullanılır. Tarafsız ve kolay yöntemdir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Transposon Kütüphane koleksiyonu

Not: kromozom DARS2 odağı mini Tn 10 klonlanmış-transposon, NKBOR (pNKBOR üzerinde) 21 sonuçlanan, temel NKBOR:: DARS2 (pJFM1). pNKBOR online 22 elde edilebilir. pNKBOR çoğaltma 23 için başlatıcı protein π gerektirir bir intihar R6K tabanlı vektörü olduğu. Plazmid pJFM1 bu nedenle pir geni kromozom bir kopyasını içeren bir E. coli zorlanma içinde (Örneğin, Dh5α λ pir) çoğaltabilir. Ne zaman pJFM1 Pir-eksik wildtype MG1655 aktarılır, ancak, pJFM1, sefaloridin dayanıklı klonlar NKBOR rasgele eklemeleri tarafından oluşturulan seçim için önde gelen çoğaltamaz:: DARS2 bakteriyel kromozom içine. Kolaylık olması için bunlar DARS2 eklemeleri adlandırılır. Metodoloji şematik bir sunum için bkz: şekil 1.

  1. Etkin bir şekilde büyümesini DARS2 hazırla electrocompetent MG1655 Δ hücreleri içinde 37 ° C 24, yetiştirilen Lysogeny suyu (LB).
  2. Electroporate pJFM1 electrocompetent MG1655 Δ içine DARS2, göre Gonzales vd. 24
    1. (içinde su 1 µL) pJFM1 40 eklemek 1 µg µL electrocompetent E. coli MG1655 Δ, DARS2 ve bu karışım önceden soğutulmuş, steril 0,2 cm boşluk küvet için transfer. Küvet elektroporasyon odanın içine yerleştirin. Electroporate 18 kV, 500 Ω ve 25 µF; Saat sabit ~5.0 ms olmalıdır ve hiçbir arcing olmamalıdır.
    2. Bakteriyel süspansiyon Önceden ısıtılmış LB suyu ve 15 mL tüp bebek transfer 1 ml resuspending tarafından hızlı bir şekilde kurtarmak.
    3. İçin antibiyotik seçimi olmadan 30 dk 37 ° C'de gaz büyüme koşullar altında kuluçka kurtarmak hücreleri izin. Bakteri 50µg/mL sefaloridin ile desteklenmiş LB Ağar kaplamalar üzerine plaka ve 37 ° C'de gecede kuluçkaya.
  3. Kimden adım kolonileri saymak: bir koloni olarak kabul edilir bir kromozom transposon ekleme için eşit.
    Not: Kolonileri göz veya bir koloni sayaç ile sayılabilir. Koloniler her klon kromozom içinde bulunan Transpozonlar ayıran ortalama mesafe ters orantılı numarasıdır.
  4. Ekleyin 1 mL LB suyu her plaka ve tüm kolonileri yıkayın; 1 mL LB suyu ~ 100.000 kolonileri yıkamak için yeterli olmalıdır. Aynı 1 mL LB suyu bakteri konsantrasyonu artırmak için yeniden kullanın. Aynı 50 mL tüp bütün kolonilerde havuz.
  5. Girdap tüp ve başlangıç malzeme dondurma (t = 0). Onu dondurmak için hücre süspansiyon 1 mL 1 mL % 50 gliserol buzda karıştırın. Tüplere 10 min için Buz Makinası aktarın. Kültürler dondurulur sonra onları bir-80 ° C dondurucu transfer.
    Not: Bu adımda bir hücre konsantrasyonu en az 50.000 CFU/mL bekleniyor.

2. LB deneyde rekabet

  1. tezcan-80 ° C buz transposon kitaplığından. Pipetting tarafından Mix.
  2. Transfer 100 µL 15 mL tüp 10 mL lb için transposon Kütüphanesi.
  3. 37 ° c durağan faz ile 8 h için sürekli (250 d/d), sallayarak gazlı hücreleri büyümek (Yani, OD 600 ~ 4.0 =). Bu parametreler farklı büyüme koşullarına, istediğiniz gibi ayarlayın.
  4. Bakteriyel nüfus her ~ 10 nesiller tarafından sürekli transferler taze prewarmed orta içine yayın. Bunu önceki durağan faz kültürünün 10 µL 10 mL taze lb aktarıp, durağan faz için başka bir 8 h büyüyen yapmak (Yani, OD 600 ~ 4.0 =).
    Not: aynı başlangıç ve bitiş optik yoğunluk olduğu gibi 1000 kat seyreltme için ~ 10 nesil büyüme karşılık gelen (2 10 1024 =). Bakteriyel nüfus doğrudan taze prewarmed orta yayılır veya 0-4'te kaydedilen ° C (buzda) ve ertesi gün yayılır. LB burada kısa bir süre (22 dk yakın bir katlama zaman) olabildiğince çok hücresel doublings içinde emin olmak için kullanıldı.
  5. Kurtarmak rekabetin her 100 nesiller sonra beş 1 mL örnek-80 ° c (3.3 adımda anlatıldığı gibi).
  6. Bireysel transposon eklemeler içeren hücreler arasındaki fitness farklar küçük olması bekleniyor, yarışma süresi uzun; burada, 700 nesiller tutmak (t 700 =) kullanıldı.

3. Güney leke yere rekabet deney zaman izlemek için analiz

  1. sonda Güney için belirli primerler kullanılarak Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) amplifikasyon gerçekleştirerek leke (NKBOR bölümünde 1-kb) hazırlamak: NKBOR_Probe_FW : gatgttggacgagtcggaat ve NKBOR_Probe_RV: cgttacatccctggcttgtt.
    1. Incubate 30 98 ° C'de s ilk denatürasyon için. Sonra 10 için 98 ° C'de 35 döngü gerçekleştirin s, 30 60 ° C s ve 45 72 ° C s. Son uzantısı için 10 dk. 72 ° C kullanın
      Not: Şablon PCR reaksiyon için saf pNKBOR plazmid 21 oldu.
    2. Sonuç PCR parçası rasgele astar sistemi kullanarak [α - 32 P] dATP ile Smith 25 göre etiketlemek.
  2. Løbner-Olesen ve von Freiesleben 26 göre toplam hücresel DNA t için hazırlamak kadar t = 0 ve seçili zaman Puan nesiller rekabet tahmini 700 =.
  3. ben bu ilgi bir kez sadece bir bölge bölge içeren değil NKBOR kesim yoklama ile kaplı Pvu ile toplam hücresel DNA sindirmek; 1 adet Pvu ben kullanılabilir için tamamen µg Özet 1, substrat DNA'sı.
    Not: Sonda ile birlikte ekleme sitesi bağlı olarak çeşitli uzunlukları kromozom DNA transposon içeren parçaları tanıyacak.
  4. Løbner-Olesen ve von Freiesleben 26 göre % 0.7 özel jel kullanarak bir Southern blot gerçekleştirmek.

4. Kimlik Fittest klon

  1. kullanımı kolay gen yürümeye, Harrison ve ark. tarafından açıklandığı gibi DARS2 ekleme sitelerinden tek klonlar (LB Tabaklarda izole) rekabet 700 tahmini nesiller sonra tanımlamak için 27, daha fazla grup Güney leke daha fazla yalıtır tüm transposon eklemeleri karşılamak için gerekli.
    1. İzole etmek genomik DNA PCR şablonu için. 50 µg/mL sefaloridin içeren LB agar plaka üzerinde bakteri yaymak ve 37 ° C'de gecede kuluçkaya. Tek kolonilerde gecede LB suyu 37 ° C'de büyümek ve daha sonra 20 µL distile su autoclaved 200 µL aktarmak (veya DNA arıtma, adım 3.2 olduğu gibi kullanın).
      1. Girdap karıştırmak için. 10 min ve max hızda santrifüj 5 dakika süreyle hücre lysate-20 ° c ileride kullanmak üzere kaydetmek için mix 100 ° c ısı.
    2. Seçim transposon içinde tavlamak için üç iç içe astar tasarım (PCR strateji grafik gösterimi için bkz: Şekil 2).
      Not: İç içe astar tasarımı iç içe astar 3 bilinen 5'e yakın yatıyor sağlamalıdır ' ardından iç içe astar 2 ve 1 transposon DNA, sonu. İç içe astar 3 ile 5 arasındaki boşluğu ' bilinen t sonuransposon DNA (belirli kromozom transposon ekleme site bulmak için) bilinmeyen DNA için bilinen DNA bir sıra okuma yoluyla için yeterli olmalıdır. NKBOR için aşağıdaki iç içe astar kullanılmıştır: pNKBOR_Nested3_RV: gcagggctttattgattcca, pNKBOR_Nested2_RV: tcagcaacaccttcttcacg ve pNKBOR_Nested1_RV: actttctggctggatgatgg. Bilinen enzimleri tanıma siteleri içeren rasgele Astar boyaları da kullanılır. Bir sonuç sağlamak için en az iki farklı rasgele astar kullanmanız gerekir. Kısıtlama siteleri enzimleri (e.g.,Sau 3AI ve Hin DIII) için saat 3'te bulunacağını ' sonu ve on rasgele bazlar tarafından bu kadar öncesinde 5 ' - NNNNNNNNNNGATC - 3 ' ve 5 ' - NNNNNNNNNNAAGCTT - 3 ' astar vardır Sau 3AI sitesi (GATC) ve Hin DIII sitesi (AAGCTT), sırasıyla içeren nerede N = A, T, G veya C.
    3. Kullanım 200 ng genomik DNA bir 20 µL PCR reaksiyon. 30 98 ° C'de kuluçkaya s ilk denatürasyon için. 25 döngüleri 98 ° C'de 30 için gerçekleştirmek s, 50 ° C 15 s ve 72 ° C 4 dk için. Son uzantısı için 72 ° C için 10 dk. kullanım astar çiftleri oluşan iç içe astar 1 ve rasgele astar birini kullanın.
    4. Oluşan iç içe astar 2 ve ikinci amplifikasyon üzerinden aynı rasgele astar astar çiftleri onun önceki tepki 1 µL şablon olarak kullanıp kullanın.
    5. Tekrarlama adım 4.1.4 oluşan iç içe astar 3 ve aynı rasgele astar astar çiftleriyle.
    6. Ürünleri son PCR reaksiyon gelen % 1.5 özel jel ve leke etidyum bromür ile çalıştırın. Kesip bir bant aralığı 100-800 bp ve herhangi bir ticari DNA jel seti üreticiye göre açılan kullanarak DNA izole ' yönünde. DNA içinde su 15 µL resuspend.
      Not: dikkat. Etidyum bromür toksik ve bakımı ile ele alınması gerekir.
    7. Önceki adımda (Adım 4.1.6), iç içe astar 3 Sanger kullanarak sıralama astar, izole bant sıra ticari sağlayıcısındaki sıralama.
  2. WGS gerçekleştirmek.
    1. Gerçekleştirmek WGS DNA çıkarılan toplam Seçili yarışma deneme sırasında toplanan örnekleri Frimodt-Møller ve ark 4 tarafından açıklandığı gibi.
  3. Sıralama çözümlemesi yapma.
    1. Hizala eşleştirilmiş uç okur 150 Ns NKBOR, AF310136.1 1,904 bitişik … tohum alt dizeleri (S, 1, 1,15) ve belirsiz karakter (L, 0, 0,9) en fazla sayısı arasında bir süre ile Bowtie2 28 kullanarak 2,204.
    2. Hizalanmış okuma seçin ve her iki MG1655 ref yeniden hizalamak | NC_000913.3 ve NKBOR gb | AF310136 blastN 29 kullanarak
    3. transpozisyonu kavşak MG1655-NKBOR ekleme pozisyonlarında atama.

5. Akış Sitometresi

  1. toplamak için Akış Sitometresi örneği. En az 10 nesiller için üstel büyüme aşamasında Bakımı tarafından
    1. denge her kültür. OD 600 kontrol edin ve asla 0,3 aştığını olun.
    2. İki tür akış örnekleri toplamak.
      1. Gezinti RIF-boşluğu, kültür 1 mL 30 µL RIF-CEF (300 µg/mL Rifampisin ve 36 µg/mL sefaleksin 12,5 mM NaOH çözünmüş) içeren bir 15 mL tüp aktarın. Sallayarak 4 h en az 37 ° C'de bırakın.
        Not: Rifampisin dolaylı olarak kromozom çoğaltma çoğaltma devam eden tur için fesih için devam etmek için izin verirken başlatılmasını engeller. Sefaleksin çoğaltma gezinti boşluğu (RIF gezinti boşluğu) ve tam olarak çoğaltılmış kromozom içeren hücreleri birikimi hücre bölünmesini önler. Tam olarak çoğaltılmış kromozom sayısı Rifampisin ve sefaleksin 20 ile tedavi esnasında kökenleri sayıya eşittir.
      2. EXP-örnek, transfer katlanarak büyüyen kültür buz bir 1.5 mL tüp için 1 mL için
  2. Hücreleri aşağıdaki gibi düzeltin. 15.000 x g 5 min için de aralıklarla 4 tarafından hücreleri hasat ° C. Pelet buz gibi 10 mM Tris pH 7.5 100 µL içinde Resuspend ve buz gibi % 77 etanol 1 mL ekleyin. 4 ° C'de örnekleri kullanmak kadar saklamak.
  3. Hücreleri aşağıdaki gibi leke. 15.000 x g 15 dk. çıkarmak için de Santrifüjü tarafından 100-300 µL sabit hücre süpernatant hasat ve Pelet 130 µL resuspend " çözüm DNA boyama " (90 µg/mL mithramycin, 20 µg/mL arasında etidyum bromür, 10 mM MgCl 2 ve 10 mM Tris pH 7.5). Örnekleri buz ve karanlıkta koymak; örnekleri 10 dk. sonra Akış Sitometresi Analizi için hazır
    Not: Diğer DNA etidyum bromür lekeleri ve mithramycin de kullanılan 30 , 31 olabilir.
  4. Kökenli başına hücre, göreli hücre kütlesi ve göreli DNA içeriği Akış Sitometresi Analizi ile belirlemek.
    1. Gerçekleştir Akış Sitometresi, 32 daha önce açıklandığı gibi. RIF gezinti boşluğu ve EXP-Akış Sitometresi üretici kullanarak örnekleri çalıştırmak ' s talimatları . Mithramycin - ve etidyum bromür lekeli hücrelerin uyarma dalga boylarında 395 ve 440 nm kullanın ve floresan 565 yukarıda toplamak nm. Mutlak ve göreceli kitle ve göreli DNA içeriği, belirlemek çalıştırmak için tek parametreli ileri-ışık saçılma karşı hücre sayı çubuk grafikler ve hücre sayı çubuk grafikler en az 30.000 olayların karşı floresan yoğunluğu elde etmek için EXP örnekleri
      1. hücre sinyal için karşılık gelen.
      2. Ortalama göreli ölçmek için kullanım ileri dağınık ışık tek parametre dağıtım hücre Mass
        Not: İleri dağınık ışık ortalama hücre kitle 20 ölçüsüdür.
      3. Kullanım floresan yoğunluğu tek parametreli dağıtımları ortalama DNA ölçmek için içerik 20.
      4. Ortalama DNA içeriği ortalama hücre kitle 20 DNA konsantrasyon oranı olarak elde edilir.
    2. Kökenleri hücre başına sayısını belirleyin.
      1. Karşı tek parametreli floresan yoğunluğu elde etmek için Çalıştır RIF gezinti boşluğu örnekleri en az 30.000 olayların hücre sinyal için karşılık gelen sayı çubuk grafikler hücre.
      2. Kullanım floresan yoğunluğu tek parametreli dağılımları her kromozom sayısını belirlemek için hücre 20.
  5. Eşzamansız Endeksi (AI) hesaplanır.
    1. Hesaplama Løbner-Olesen vd tarafından açıklandığı gibi Ai 32 RIF gezinti boşluğu örnekleri ve formül AI floresan yoğunluğu tek parametre dağılımları kullanarak, = (f3 + f5 + f6 + f7) / (f2 + f4 + f8), fx x tam olarak çoğaltılmış kromozom sayısı kesir hücrelerle nerede. Girişimlerine ne zaman zaman uyumsuz düşünün A > 0,1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Southern blot DARS2 kromozom transposon kütüphanede boyunca rasgele dağıtılan doğrulamak için yapılır (t = 0) ve fittest klonlar zamanla kalıcı. Southern blot ilk transposon havuzundan çıkarılan DNA üzerinde gerçekleştirildi (t = 0) ve rekabet (şekil 3) 700 nesiller dışarı tahmin edilen her 100. Burada, her zaman noktasından toplam hücresel DNA'sı sindirilmiş ile Pvuben restriksiyon enzimi, transposon NKBOR kesmek için bilinen::DARS2 bir kez sadece sondası tarafından kapsanmayan bölge. Southern blot radioactively etiketli bir DNA parçası NKBOR bir parçası için tamamlayıcı ile sondaj. Şekil 3, ilk DARS2 havuzu görüldüğü gibi (t = 0) DARS2 rasgele kromozom eklenmiş gösterir yoksun farklı bantları. Zaman içinde nerede ilk büyük havuzun DARS2 klon yalnızca bir veya birkaç Oturumlarýnda kalýcý olan DARS2 klonlar geliştirilen bir model ortaya (şekil 3; t = 0 t 700 =).

Gösterilen örnekte DARS2 ekleme siteleri yarışma deneme WGS ve kolay gen yürüyüş kullanarak tespit edilmiştir. Burada, WGS başlangıç Havuzu ekleme siteleri tanımlamak için kullanılan (t = 0) ve 300, 400 ve 700 nesiller rekabet sonra. Mevcut derin sıralama kapsamında, t ekleme sitelerin tam bir eşleme için yetersiz Not = 0; Ancak, bu eklemeler toplam sayısı temsilcisi kümesini verir. WGS Southern blot sonuç (Yani, seçim fittest DARS2 klon) doğruladı, tüm DARS2 yaklaşık % 98 ile biten eklemeler wildtype DARS2 kromozom konumu (DARS2 yakın Klon IR ve klon rppH), kalan %2 (şekil 4) kromozom üzerinde başka bir yerde iken. Bu güçlü wildtype konumu DARS2 fonksiyonu için en uygun olduğunu göstermektedir. T = 400, bir ekleme için hemen hemen aynı bir mesafe ile ters çoğaltma kolundaki bulundu oriC wildtype DARS2 pozisyon (şekil 4) ama bu ekleme değil kurtarıldı sonra 700 nesiller. Bu nedenle, çoğaltma ilişkili gen dozu en uygun pozisyon için tek belirleyici olamaz.

Kolay gen yürüme DARS2 eklemeleri siteleri tek klonlar rekabet 700 tahmini nesiller sonra izole içinde tanımlamak için kullanıldı. Burada, iki DARS2 ekleme site (DARS2 klon IR ve klon rppH) belirtildiği tespit edilmiştir. Kolay gen yürüyüş sadece 20 klonlar yapıldı ve bu neden WGS içinde eşleştirilmiş siteler değildi tüm DARS2 eklemeleri tespit açıklar. DARS2-eksik hücrelerin daha önce eşzamansız çoğaltması başlatmak için gösterildi ve hücreleri4,16,17, kökenli konsantrasyon wildtype göre bir düşüş var için 18. bu nedenle olan, her iki durumda da, wildtype için geri yüklenmiş iki seçilen suşların (DARS2 klon IR ve klon rppH) DNA çoğaltma ve hücresel kökeni içeriği inisiyasyon senkronizasyonu çözümlemek için Akış Sitometresi kullanılan düzeyleri (şekil 5). Terminus içinde bulunan DARS2 tek bir kopyasına sahip olmak büyük bir yük temsil edici bir örnek (şekil 5E) gösterilir. Burada, terminus DARS2 öğesinde varlığı senkronizasyonu veya hücresel kökenli içerik wildtype düzeyleri için seçilen DARS2 IR klonlar ve rppH yapmak geri yüklemez.

Figure 1
Resim 1 : Metodolojisi genel bakış. Metodoloji şematik tanıtımı. Kromozom DARS2 bölge pJFM1 oluşturma Tn10 pNKBOR üzerinde mini klonlanmış. pJFM1 E. coli MG1655 dönüştürülmüş Δ DARS2 rasgele bir ekleme tetiklerDARS2, bağlantılı Tn10 E. coli MG1655 kromozom üzerine ΔDARS2. Her bir farklı kromozom DARS2 ekleme içeren yaklaşık 70.000 klonlar havuza alınmış ve 37 ° C'de LB suyu içinde birbirleriyle doğrudan yarıştı LB suyu yolu tarif etmek yarışma deneyde bir tahmini 700 nesiller, nerede bir örnek her 100 nesil için yolu tarif etmek yarışma izole edildi kez yapıldı. Toplam DNA izole her örneğinden ayıklanmış ve Southern Blot ve DARS2 eklemeleri tanımlaması için WGS tarafından kullanılan. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 : Kolay gen yürüme grafik sunum. Bu şekilde bir bilinmeyen DNA dizisi bilinen bir dizi rasgele astar ve Nested astar 1, 2 ve 3 için astar sitelerle bitişik genomik DNA şablonu gösterilmektedir. Üç tasarlanmış iç içe primerler kullanılarak gerçekleştirilen üç ardışık Arttırımlar sonuçlarını aşağıda gösterilmiştir. (Round 3) üzerinden nihai ürün iç içe astar 3 kullanarak sıralı. Bu rakam Harrison ve ark. adapte oldu 27. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : Southern blot probed için NKBOR. Bir DARS2içine DARS2 eklemeleri Southern blot analizi-eksik zorlanma. Genomik DNA elde t başlayan doğrudan rekabetin her ~ 100 nesilden = 0 ve 700 nesiller bitiş, olduğunu Pvuile sindirmek ve jel şeker. Leke NKBOR ile melezleşmiştir ( iletişim kuralıbkz:) sonda. t nesil rekabet sayısı gösterir. Bu rakam Frimodt-Møller vd adapte oldu 4. HMW ve LMW are yüksek moleküler ağırlık ve düşük molekül ağırlığı DNA, anılan sıraya göre. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4 : Resolv grafik gösterimiEd transposon eklemeleri siteler ΔDARS2. Konumlarını oriC, veri, DARS1, DARS2 ve terC belirtilir. DARS2 ekleme siteleri ΔDARS2 t = 0 (siyah çubuklar), t = 400 (ışık mavi Bar), t = 500 (kırmızı Bar) ve t 700 (yeşil çubuklar), tam-genom sıralama tarafından çözüldü =. Bu rakam DNAPlotter33 kullanılarak yapıldı ve Frimodt-Møller vd uyarlanmıştır 4. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5 : Temsilcisi Akış Sitometresi histogramlar kolay gen tarafından bulduysam transposon sitelerin t 700 =. Hücreleri AB en az orta % 0,2 glikoz, 10 µg/mL tiamin ve 37 ° C'de % 0.5 casamino asitler ile takıma yetiştirilmiştir Wildtype ve ΔDARS2 içinde gösterilir A ve B, anılan sıraya göre. Türevleri DARS2 orijinal odağı ve bunun yerine bir kopyasını DARS2 , çözümlenmiş transposon sitesi rrpH, IR ve terminus (terC) taşıyan yoksun wildtype baskı MG1655 C, D ve E gösterilir, anılan sıraya göre. Bu rakam Frimodt-Møller vd adapte oldu bir hücre döngüsü anomali (terC) sonuçları veya wildtype fenotip geri yükler DARS2 konumunu göstermek için 4 (rrpH, IR). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada kullanılan metodoloji ile ilgili genetik bir öğenin en uygun genomik konumunu zor bir soruyu cevaplamak için state-of--art teknikleri yararlanır. (Transposon tarafından aracılı) genetik öğesi rasgele yerleştirilmesi için incelenen genetik öğesinin konumu en iyi seçmek için birbirlerine karşı rekabet yapılabilir klonlar binlerce hızlı ve kolay toplama sağlar (Yani fittest klon).

Burada, DARS2 mini-Tn10eklenmiş-transposon, NKBOR dayalı. Transposon eklemeleri siteleri aşağı akım analizi için önemli bir seçimdir. Birkaç farklı Transpozonlar mini-Tn5Km234 ve daha popüler bir seçim, Himar gibi transposon Yönetmen: ekleme-site sıralama (TraDIS) deneylerde kullanılan ben Mariner transposon35, 36 (Bu bir son reklam için bkz: van Opijnen ve Camilli36). Yaklaşık DARS2 ekleme veren DARS2, 70.000 ilk rasgele eklemeleri 65 çıkar için biz amaçlı MG1655 genom kan basıncı. Bu, azalan veya artan toplanan kolonileri ilk havuzu tarafından kolaylıkla ayarlanabilir.

Burada, LB toplu kültürlerde sürekli transferler için tercih, ama yarışma deneme da farklı bir ortamda veya bir chemostat37kullanımı dahil olmak üzere çeşitli koşullarda gerçekleştirilir. Ayrıca, yordam seçim, oksidatif, ozmotik veya antibiyotik stres gibi çeşitli gerilmeler de dahil olmak üzere herhangi bir şartları karşılamak için değiştirilebilir. Zaman içinde Oturumlarýnda kalýcý olan klonlar varlığını doğrulamak için aşağıdakilerden en az üç şey yapabilirsiniz: WGS; transposon sıralama (Tn-Seq); ya da burada, bir Southern Blot olarak. Son olarak, kolay gen yürüyüş birkaç klonlar, öyle ki belirli ekleme sitesi etkisini phenotypically için analiz edilebilir transposon ekleme siteleri tek klonlar içinde tanımlanan daha fazla avantajı ile yapılabilir.

Rekabet denemenin sonucu değerlendirmek için seçim fenotipik testin incelenen bölge üzerinde bağlıdır. Kullandığımız Akış Sitometresi, hangi bakteri hücre döngüsü parametrelerini ölçmek için güçlü bir yöntemdir. Burada, DARS2, ( DARS2 eklemeleri için wildtype DARS2 pozisyonu kapatmaYani ) seçili kromozom pozisyon(lar) çoğaltma başlatma (doğru yönetmelikte sonuçlandı Akış Sitometresi ortaya Yani, senkronizasyonu ve DNA toplama). DARS2 için en uygun kromozom pozisyon(lar) kısmen uygun çoğaltma ilişkili gen dozajı nedeniyle ve kısmen DARS2 işlev4için önemlidir olumlu yerel genomik ortam nedeniyle seçildi.

Burada, kodlamayan DNA elementini araştırıldı ancak bu seçim herhangi bir kodlayıcı bölge için gelişmiş. Gen ifadesinin düzeyde farklı bir çalışmada bulundu ~ 300-fold, kromozom üzerinde konumuna bağlı olarak, korelasyon çoğaltma ilişkili gen dozaj38olmadan temizleyin. Burada açıklanan yaklaşım belirli bir gen, transkripsiyon faaliyet ve ilişkili fitness avantaj genomik konumunu ilişki içine önemli fikir verebilir. Bu sırayla rekombinant protein üretimi için mühendislik yeni, Gelişmiş suşları için ilgi olabilir belirli bir gen daha güçlü ifade önde gelen genomik pozisyonlar seçim ile teorik olarak yardımcı olabilir.

E. coli sınırlı intergenic bölgeler39içerdiğinden, transposon eklemeleri çoğu durumda, gene(s) bölebilir. Bu zaman zaman yanlış pozitif nerede fittest clone(s) seçili genetik öğesinin kromozom en uygun konumu nedeniyle söz konusu yaratabilir, ama daha ziyade bir gen bozulur çünkü -, başka yollarla sağlayan bir fitness avantaj sırasında yarışma deneme4.

Bu metodoloji yararlanır nerede herhangi bir bölgesi tercih olabilir bir kullanımı kolay transposon sistem rasgele yerlerde entegre. Tasarlanmış rekabet deneme burada görüldüğü gibi seçim Kuvvetleri saf büyüme dışında herhangi bir sayıda içerecek şekilde değiştirilmiş. Kurulum tamamen eklemeleri siteleri daha fazla sıralama çözünürlüğe WGS, burada kullanılan daha verimleri Tn-Seq dayanması için de değiştirilebilir. Bu tarafsız yaklaşım ortak eğilimler Eubacteria kromozom kuruluşta var olduğunu göstermek olabilir böylece uzak uncharacterized organizmalarda heyecan verici yeni özellikler aydınlatmak için kullanılmalıdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar rakip mali ilgilenmiyorum.

Acknowledgments

Yazarlar Novo Nordisk Vakfı, Lundbeck Vakfı ve Danimarka Ulusal Araştırma Vakfı (DNRF120) Merkezi aracılığıyla gelen hibe tarafından bakteriyel stres tepkisi ve sebat (BASP) için finanse edilmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Autoclaved Mili-Q water None
Electroporation Cuvettes, 0.1 cm Thermo Fisher Scientific P41050
Bio-Rad MicroPulser Electroporation System Bio-Rad 165-2100
LB Broth Thermo Fisher Scientific 12780029 
LB Agar, powder (Lennox L agar) Thermo Fisher Scientific 22700025
Glycerol Thermo Fisher Scientific 17904
Fisherbrand Plastic Petri Dishes Fisher Scientific S33580A
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-432-22
Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-959-53A
Nunc CryoTubes Sigma-Aldrich V7634 
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/µL) Thermo Fisher Scientific F530S
dATP, [α-32P]- 3000Ci/mmol 10mCi/ml, 250 µCi PerkinElmer BLU012H250UC
DECAprime II DNA Labeling Kit Thermo Fisher Scientific AM1455
Spectrophotometer  SF/MBV/03.32 Pharmacia
Hermle Centrifuge    SF/MBV/03.46 Hermle
Ole Dich Centrifuge  SF/MBV/03.29 Ole Dich
Eppendorftubes 1.5 mL Sigma-Aldrich T9661
Eppendorftubes 2.0 mL Sigma-Aldrich T2795
Sodium Chloride Merck 6404
96% Ethanol Sigma-Aldrich 16368
Trizma HCl Sigma-Aldrich T-3253
Phenol Ultra Pure BRL 5509UA
Chloroform Merck 2445
Ribonuclease A type II A Sigma-Aldrich R5000
Sodiumdodecylsulphate (SDS) Merck 13760
Lysozyme Sigma-Aldrich L 6876
Isopropanol Sigma-Aldrich 405-7
0.5M Na-EDTA pH 8.0 BRL 5575 UA
Kanamycin sulfate Sigma-Aldrich 10106801001
PvuI (10 U/µL) Thermo Fisher Scientific ER0621
UltraPure Agarose Thermo Fisher Scientific 16500500
DNA Gel Loading Dye (6X) Thermo Fisher Scientific R0611
Tris-Borate-EDTA buffer Sigma-Aldrich T4415
Ethidium bromide Sigma-Aldrich E7637
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 433160
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich 71687
Whatman 3MM papers Sigma-Aldrich WHA3030931
SSC Buffer 20× Concentrate Sigma-Aldrich S6639
Amersham Hybond-N+ GE Healthcare RPN119B
Ficoll 400 Sigma-Aldrich F8016
Polyvinylpyrrolidone Sigma-Aldrich PVP40
Bovine Serum Albumin - Fraction V Sigma-Aldrich 85040C
Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes Sigma-Aldrich D1626
Carestream Kodak  BioMax  light film Sigma-Aldrich Z373494
GenElute  Gel Extraction Kit Sigma-Aldrich NA1111 
GenElute  PCR Clean-Up Kit Sigma-Aldrich NA1020
T100  Thermal Cycler Bio-Rad
SmartSpec Plus Spectrophotometer Bio-Rad
Rifampicin Serva 34514.01
Cephalexin Sigma-Aldrich C4895
Mithramycin Serva 29803.02
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich 246964
Apogee A10 instrument Apogee

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frimodt-Moller, J., Charbon, G., Lobner-Olesen, A. Control of bacterial chromosome replication by non-coding regions outside the origin. Curr Genet. , (2016).
  2. Sherratt, D. J., et al. Recombination and chromosome segregation. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 359 (1441), 61-69 (2004).
  3. Bigot, S., et al. DNA motifs that control E. coli chromosome segregation by orienting the FtsK translocase. EMBO J. 24 (21), 3770-3780 (2005).
  4. Frimodt-Moller, J., Charbon, G., Krogfelt, K. A., Lobner-Olesen, A. DNA Replication Control Is Linked to Genomic Positioning of Control Regions in Escherichia coli. PLoS Genet. 12 (9), 1006286 (2016).
  5. Kornberg, A., Baker, T. A. DNA Replication, Second Edition. , University Science Books. (1992).
  6. Kaguni, J. M. Replication initiation at the Escherichia coli chromosomal origin. Curr Opin Chem Biol. 15 (5), 606-613 (2011).
  7. Leonard, A. C., Grimwade, J. E. Regulation of DnaA assembly and activity: taking directions from the genome. Annu Rev Microbiol. 65, 19-35 (2011).
  8. Kurokawa, K., Nishida, S., Emoto, A., Sekimizu, K., Katayama, T. Replication cycle-coordinated change of the adenine nucleotide-bound forms of DnaA protein in Escherichia coli. EMBO J. 18 (23), 6642-6652 (1999).
  9. Sekimizu, K., Bramhill, D., Kornberg, A. ATP activates dnaA protein in initiating replication of plasmids bearing the origin of the E. coli chromosome. Cell. 50 (2), 259-265 (1987).
  10. Brendler, T., Austin, S. Binding of SeqA protein to DNA requires interaction between two or more complexes bound to separate hemimethylated GATC sequences. EMBO J. 18 (8), 2304-2310 (1999).
  11. Lu, M., Campbell, J. L., Boye, E., Kleckner, N. SeqA: a negative modulator of replication initiation in E. coli. Cell. 77 (3), 413-426 (1994).
  12. Katayama, T., Kubota, T., Kurokawa, K., Crooke, E., Sekimizu, K. The initiator function of DnaA protein is negatively regulated by the sliding clamp of the E. coli chromosomal replicase. Cell. 94 (1), 61-71 (1998).
  13. Kato, J., Katayama, T. Hda, a novel DnaA-related protein, regulates the replication cycle in Escherichia coli. EMBO J. 20 (15), 4253-4262 (2001).
  14. Kasho, K., Katayama, T. DnaA binding locus datA promotes DnaA-ATP hydrolysis to enable cell cycle-coordinated replication initiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (3), 936-941 (2013).
  15. Kitagawa, R., Ozaki, T., Moriya, S., Ogawa, T. Negative control of replication initiation by a novel chromosomal locus exhibiting exceptional affinity for Escherichia coli DnaA protein. Genes Dev. 12 (19), 3032-3043 (1998).
  16. Fujimitsu, K., Senriuchi, T., Katayama, T. Specific genomic sequences of E. coli promote replicational initiation by directly reactivating ADP-DnaA. Genes Dev. 23 (10), 1221-1233 (2009).
  17. Kasho, K., Fujimitsu, K., Matoba, T., Oshima, T., Katayama, T. Timely binding of IHF and Fis to DARS2 regulates ATP-DnaA production and replication initiation. Nucleic Acids Res. 42 (21), 13134-13149 (2014).
  18. Frimodt-Moller, J., Charbon, G., Krogfelt, K. A., Lobner-Olesen, A. Control regions for chromosome replication are conserved with respect to sequence and location among Escherichia coli strains. Front Microbiol. 6, 1011 (2015).
  19. Bergthorsson, U., Ochman, H. Distribution of chromosome length variation in natural isolates of Escherichia coli. Mol Biol Evol. 15 (1), 6-16 (1998).
  20. Boye, E., Steen, H. B., Skarstad, K. Flow cytometry of bacteria: a promising tool in experimental and clinical microbiology. J Gen Microbiol. 129 (4), 973-980 (1983).
  21. Rossignol, M., Basset, A., Espeli, O., Boccard, F. NKBOR, a mini-Tn10-based transposon for random insertion in the chromosome of Gram-negative bacteria and the rapid recovery of sequences flanking the insertion sites in Escherichia coli. Res Microbiol. 152 (5), 481-485 (2001).
  22. SHIGEN. , Available from: http://shigen.nig.ac.jp (2017).
  23. Shafferman, A., Helinski, D. R. Structural properties of the beta origin of replication of plasmid R6K. J Biol Chem. 258 (7), 4083-4090 (1983).
  24. Gonzales, M. F., Brooks, T., Pukatzki, S. U., Provenzano, D. Rapid protocol for preparation of electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae. J Vis Exp. (80), (2013).
  25. Smith, D. R. Random primed labeling of DNA. Methods Mol Biol. 18, 445-447 (1993).
  26. Lobner-Olesen, A., von Freiesleben, U. Chromosomal replication incompatibility in Dam methyltransferase deficient Escherichia coli cells. EMBO J. 15 (21), 5999-6008 (1996).
  27. Harrison, R. W., Miller, J. C., D'Souza, M. J., Kampo, G. Easy gene walking. Biotechniques. 22 (4), 650-653 (1997).
  28. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  29. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 215 (3), 403-410 (1990).
  30. Stepankiw, N., Kaidow, A., Boye, E., Bates, D. The right half of the Escherichia coli replication origin is not essential for viability, but facilitates multi-forked replication. Mol Microbiol. 74 (2), 467-479 (2009).
  31. Lobner-Olesen, A. Distribution of minichromosomes in individual Escherichia coli cells: implications for replication control. EMBO J. 18 (6), 1712-1721 (1999).
  32. Lobner-Olesen, A., Skarstad, K., Hansen, F. G., von Meyenburg, K., Boye, E. The DnaA protein determines the initiation mass of Escherichia coli K-12. Cell. 57 (5), 881-889 (1989).
  33. Carver, T., Thomson, N., Bleasby, A., Berriman, M., Parkhill, J. DNAPlotter: circular and linear interactive genome visualization. Bioinformatics. 25 (1), 119-120 (2009).
  34. Eckert, S. E., et al. Retrospective application of transposon-directed insertion site sequencing to a library of signature-tagged mini-Tn5Km2 mutants of Escherichia coli O157:H7 screened in cattle. J Bacteriol. 193 (7), 1771-1776 (2011).
  35. van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms. Nat Methods. 6 (10), 767-772 (2009).
  36. van Opijnen, T., Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nat Rev Microbiol. 11 (7), 435-442 (2013).
  37. Jeong, H., Lee, S. J., Kim, P. Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat. J Vis Exp. (115), (2016).
  38. Bryant, J. A., Sellars, L. E., Busby, S. J., Lee, D. J. Chromosome position effects on gene expression in Escherichia coli K-12. Nucleic Acids Res. 42 (18), 11383-11392 (2014).
  39. Blattner, F. R., et al. The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).

Tags

Genetik sayı: 127 Random transposon ekleme Havuzu kültür Yarışması en uygun genomik bağlam Bütün-genom sıralama yürüme hücre döngüsü analizi Akış Sitometresi tarafından kolay gen
En iyi kromozom Location(s) belirlenmesi için yeni bir Transposon-aracılı yaklaşımın kullanarak <em>Escherichia coli</em> DNA öğesinde
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Frimodt-Møller, J., Charbon,… More

Frimodt-Møller, J., Charbon, G., Krogfelt, K. A., Løbner-Olesen, A. Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach. J. Vis. Exp. (127), e55946, doi:10.3791/55946 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter