Summary
这份手稿描述了一个体外胚珠培养方法, 使受精卵和胚胎的活细胞成像的拟南芥。该方法用于在受精卵分化过程中对细胞内动力学进行可视化, 并对发育中的胚胎的胞命运规范进行研究。
Abstract
在大多数开花植物中, 受精卵和胚都深藏在母体组织中, 因此长期以来一直是它们动态发展的奥秘;例如, 受精卵对立如何建立体轴, 以及胚胎在器官形成过程中如何指定各种细胞的命运。这份手稿描述了一个体外胚珠培养方法, 以执行受精卵和胚胎的活体细胞成像的拟南芥。优化的培养基允许受精卵或早期胚胎长成肥沃的植物。将其与聚 (烷) micropillar 阵列器件相结合, 在同一位置的液体介质中保存胚珠。这种固定是至关重要的观察相同的胚珠在显微镜下数天, 从合分裂到晚期胚胎阶段。由此产生的活细胞成像可用于监测受精卵极化的 real-time 动力学, 如细胞核迁移和细胞骨架重排, 以及胚胎模式中的细胞分裂时序和电池命运规范。此外, 这种胚珠培养系统可以与抑制剂结合, 分析各种因素对胚胎发育的影响, 并与光学操作, 如激光干扰, 以检查细胞通讯的作用。
Introduction
生物体的基本身体计划由单细胞受精卵发育而来。在大多数开花植物中, 合分裂产生一个顶端和一个基底细胞, 分别发育成芽和根,1。因此, 了解植物体在胚胎发生过程中是如何形成的是很重要的, 但是没有一个有效的工具可以直接观察受精卵和胚胎的动态, 因为它们在花朵深处发育。在一些单子叶植物种, 如玉米和大米, 一个体外受精方法已经建立2,3。在这种方法中, 分离的精子和卵细胞被电或化学熔化, 生成的细胞可以发展成一个肥沃的植物。然而, 在双子植物, 没有体外受精方法, 可以产生适当的胚胎, 大概是由于同步细胞周期状态的男性和女性的配子4,5。此外, 胚周围组织 (胚乳) 在胚胎发育中起重要作用6。
在一个模型双子物种,一. 南芥, 一个体外培养方法是通过专注于整个胚珠, 其中包含胚胎和胚乳的7。该系统成功地用于分析各种化学试剂对胚胎发生的影响, 但由于其存活率低, 不宜用于延时成像。因此, 开发了一种新的体外胚珠培养体系, 以便早于合子阶段开始, 并在高比例的8中产生肥沃的植株。经多次试验, 发现 Nitsch 培养基和海藻糖对胚珠的存活率有显著提高8。此外, 由于胚珠随着它的生长而扩展, 因此经常从显微镜的观察场移开, 因此开发了一种用于在培养基9中固定胚珠的硅橡胶装置。该设备使长期成像 3-4 天, 这是足够的跟踪发展从受精卵到心脏阶段的胚胎。使用这种方法, 不仅在正常条件下, 而且在化学抑制剂或各种突变体背景下, 也可以可视化受精卵极化和胚模式的动态,8,10 ,11。
图 1: 用于显示受精卵和胚胎通过胚珠的特定荧光标记的原理图。
拟南芥受精卵发育成胚珠中的胚, 这是在花深处产生的。在这个体外培养系统中, 通过胚珠观察受精卵和胚胎, 因此使用其他胚珠组织中没有表达的特定荧光标记是很重要的。 请单击此处查看此图的较大版本.
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Protocol
1. 制备 体外 胚珠培养基
- 为 体外培养的液体培养基 (和 #34; N5T 培养基和 #34;) 含有 1x Nitsch 基盐混合物, 5% (w/v) 海藻糖二水合物, 0.05% (w/v) 2-(n-吗) 磺酸 (MES)-KOH (pH 5.8) 和 1x Gamborg 和 #39; s 维生素溶液.
- 使用 KOH 调整 pH 值为 5.8.
- 通过灭菌 (121 和 #176; C, 20 min) 对介质进行消毒, 或者通过0.22 和 #181; m 过滤器过滤.
注: 灭菌介质可存储在4和 #176; C 为 2-3 月.
2。Micropillar 阵列设备的制备
- 用刀、刀片或剪刀将 Micropillar 设备切割成玻璃部分 (14 毫米和 #966;) 35 mm 的玻璃底盘.
注: 在以前的论文 8 , 9 中描述了该设备构造的完整过程, 因此此处省略了详细信息。玻璃底盘的体积较小, 如4井或96井板, 可用于短期成像而不使用该设备. - 在紫外线照射下, 在15分钟内对硅橡胶设备的上部进行消毒.
- 使用方形尖端镊子将该设备翻转过来, 并将其置于 UV 光下15分钟以消毒底部.
- 将灭菌的硅橡胶设备转移到 35 mm 培养皿中, 添加 N5T 介质, 直到设备完全浸泡在介质中 (约 5-7 毫升).
- 把盘子放进真空室, 减少对德加的压力。将吸尘器保持3小时至一夜, 直到设备中的空气被介质取代.
注: 该装置可在强真空下通过气泡分离. - 将该设备从盘中取出, 用方形尖端镊子将其放在纸巾上, 将多余的介质放在侧面和底部.
注意: micropillar 阵列上的介质 (上表面) 不应被移除, 因为这将用于胚珠的培养. - 将设备传输到 76 mm x 26 mm 的滑动玻璃上, 确保将 micropillar 部分保持为上部, 并将设备与 35 mm 培养皿盖盖在一起, 以防止在下列胚珠萃取过程中干燥.
3。丝解剖和胚珠提取
- 用70% 乙醇擦拭针 (0.40 mm) 和细镊子。针很容易通过将它附着在注射器或木棍上来处理.
- 检查植物的花序, 并选择合适的角果进行实验。大约5毫米角果包含受精卵, 并且 8-10 毫米角果包括幼小球状胚胎.
- 使用镊子将角果, 并将其放在 76 x 26 mm 滑动玻璃上的双面胶带上。一个丝包含约 40-60 胚珠, 和 3-4 角果 ( 即 , 120-240 胚珠) 是足够的一个设备.
- 打开丝 (子房壁) 以在显微镜下使用灭菌针和镊子查看胚珠。仅切割子房壁, 使胚珠未损坏.
- 将打开的丝转到 N5T 的设备上 (在步骤2.7 中准备), 然后用针或镊子将胚珠释放到介质中.
- 将一个小盖玻璃 (18 mm x 18 mm) 放到该设备上, 将胚珠推入 micropillar 阵列中的空间.
- 通过用镊子或手指水平拉动盖子玻璃以去除多余的介质.
- 将该设备倒置, 将其放入 35 mm 的玻璃底盘中, 并通过使用方形尖端镊子将其粘贴到玻璃上, 轻轻按压该设备.
- 将 N5T 介质轻轻地倒入玻璃底盘中, 迁中瓶, 直到将其完全浸泡在介质中, 然后用石蜡膜封住盘.
注: 该设备可以回收, 但太旧的设备很容易脱离玻璃底部。此外, 如果在步骤2.5 中未完全脱, 则该设备可能会浮动, 或者介质被浇得太快.
图 2: 示例准备的示意图程序.
此示意图流对应于步骤3.5 到4.1。 请单击此处查看此图的较大版本.
4. 延时成像
- 将在步骤3.9 中准备的玻璃底盘放在倒置显微镜下, 并选择合适的胚珠来聚焦。 注意: 由于胚珠在舞台、位置和方向上各不相同, 因此应通过检查其标记荧光来找到合适的胚珠.
- 根据显微镜系统的制造商和 #39 的指示启动实时成像.
注意: 显微镜设备和参数是多种多样的, 因此用户应该选择适合实验目的的合适设置。例如, 此手稿中使用的设置在 表 1 中列出.
| 设备/设置 | 图 3 (A) 和补充视频1和 4 | 图 3 (B) 和补充视频 2 | 辅助视频 3 |
| 激光扫描倒置显微镜 (A1R MP) | 旋转盘共聚焦倒置显微镜 (CSU-W1) | 箱式倒置共焦显微镜系统具有稳定的孵化室 (CV1000) | |
| 激光 | 钛: 蓝宝石飞秒脉冲激光 | 488 nm 和 561 nm ld 激光器 | 488 nm 和 561 nm ld 激光器 |
| O目的透镜和 #160; | 40X 浸水物镜 (na = 1.15) 与浸没介质 | 60X 硅油浸泡物镜 (na = 1.30), 安装在压电聚焦驱动器 | 40X 物镜 (na = 0.95) |
| 检测或 | 外部 non-descanned GaAsP PMT 探测器 | EMCCD 摄像机 | EMCCD 摄像机 |
| 分色镜像 | DM495 和 DM560 | DM488/561 | DM400-410/488/561 |
| > 带通滤波器;534/30 nm 和 578/105 nm | 带通滤波器; 520/35 nm 和 593/46 nm | 带通滤波器; 520/50 nm 和 617/73 nm | |
| 切片沿 z-axis | 31 z 堆栈与1和 #181; m 间隔时间 | 17 z 堆栈与3和 #181; m 间vals | 7 z 堆栈, 具有5和 #181; m 间隔时间 |
| 时间间隔 | 20 分钟 | 5 分钟 | 10 分钟 |
表 1:本手稿中使用的显微镜系统和设置.
显微镜和参数是多种多样的, 因此每个用户都应该选择合适的实验系统.
- 检查获取的图像序列, 并将其转换为常规电影格式, 如. avi 或。 注意: 如果显微镜软件无法将图像输出为电影格式, 则可以将图像保存为. tif, 然后在 ImageJ 中打开它们, 这是一个由 NIH 图像启发的开源程序, 用于更改文件类型。ImageJ 提供: https://imagej.nih.gov/ij/。ImageJ 也可以用来做一个 Z s塔克电影, 如最大强度投影, 如所述: https://imagej.net/Z-functions.
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Representative Results
利用这种胚珠培养体系, 可以跟踪受精卵极化和胚模式的生存动力学。这是一个成就, 因为以前没有技术来可视化的 real-time 行为的受精卵和胚胎, 这是隐藏在母亲的组织深处。图 3A和补充视频 1显示年轻合子中的微管 (MTs) 在尖端区域10中累计为一个横向环。这 MT 圆环被维护, 当受精卵拉长在顶端方向。在完成合子伸长和核迁移到顶端区域后, MT 环消失, MTs 形成一个纺锤体来分离 DNA。图 3B和补充视频 2显示胚胎细胞协调分裂形成一个径向对称的球状形状8。本方法适用于药理实验。例如, 在应用了肌动蛋白聚合抑制剂 (latrunculin B;B) 进入培养受精卵的液体培养基中, 极性核迁移被抑制, 从而使受精卵以更对称的方式分裂, 表明肌动蛋白长丝在受精卵极化中的作用 (补充视频 3)10。胚胎发育的长期成像能够追踪单个细胞分裂的方向和时间, 这意味着可以统计地分析几何和细胞周期的持续时间。事实上, 我们以前表明, 顶端细胞谱系的细胞分裂比基底细胞区域8快。
图 3: 受精卵极化和胚模式的活体成像。
(a) 对核表达特定标记的受精卵 (组蛋白 2 b-tdTomato; 洋红) 和微管 (MTs、Clover-TUA6; 绿色) 的时间推移观察。利用激光扫描倒置显微镜 (A1R MP) 获取图像。(b) 对细胞核 (组蛋白 2 B-sGFP; 绿色) 和等离子膜 (PM、tdTomato-LTI6b、洋红) 的胚胎进行时间推移观察。利用旋转圆盘共聚焦倒置显微镜 (CSU-W1) 获取图像。图像显示为最大强度投影图像, 数字表示从第一帧开始的时间 (h: min)。箭头和黄色括号分别显示核和横向 MT 环。青色括号表示主轴 (A) 和分核 (B)。缩放条形图:10 µm (A) 和30µm (B)。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
这份手稿介绍了一个简单的体外胚珠培养协议, 这是有效的使用在活细胞成像的发展受精卵和胚胎。
根据胚阶段的需要, 对该装置的设计进行优化。第一个被开发的设备是一个 microcage 阵列调整方向和固定胚珠9的位置, 然后构造一个 micropillar 设备来更有效地捕获胚珠8。此外, micropillars 比 microcage 更薄、更柔软, 因此不会在长期观察中防止胚珠膨胀。这个 micropillar 装置可以保存一个胚珠数天, 从合阶段直到胚胎心脏阶段8。然而, 最终, 完全膨胀的胚珠的高度超过了 micropillar 的高度, 因此它将设备推开。因此, micropillars 的高度和间距应调整, 如果后阶段的胚胎是重点。
由于胚珠位于盘底, 必须使用倒置显微镜。共焦显微镜足以监测图 3B中所示的单元划分模式,补充视频2和 38,11, 而旋转盘共聚焦显微镜对于执行长期没有细胞损伤的成像。相比之下, 一个双光子激发显微镜, 这是适用于深成像的活生物体12, 是必要的形象化的细胞内动力学的受精卵 (图 3A和补充视频 1)10。因此, 使用合适的显微镜系统进行实验是至关重要的。
如简介和代表性结果中所述, 目前还没有能够监测受精卵和胚发育的生存动力学的方法。因此, 利用这种胚珠培养方法, 首次阐明了受精卵极化和胚模式的细节。
此方法适用于药理实验, 如补充视频 3所示。此外, 该成像系统被用来评价新合成的化合物对胚胎细胞分裂的影响11。它还成功地结合了激光干扰, 从而揭示了当顶端细胞受到伤害时, 基底细胞衍生物改变其细胞的命运, 产生一个新的顶端细胞8。因此, 将此方法应用于各种材料和技术, 将为了解胚胎发生的分子机制提供有力的工具。
要用这种方法进行长期成像, 关键的步骤是准备一个特定的和明亮的荧光标记, 标签的目标组织和/或结构。由于受精卵和胚胎是通过胚珠观察的, 如图 1所示, 胚乳和其他胚珠组织中的背景信号可以掩盖胚胎中的真实信号 (图 4)。此外, 为了检测微弱的信号, 需要增加显微镜的激光功率, 但这会在长期观察时对胚珠造成伤害。补充视频 4表明, 高激光功率增加了胚珠中的荧光, 最终缩小了受精卵, 其中合子被粉碎。因此, 在开始实验之前, 应该建立一个明确的、明亮的标记线。相对于更高的亮度, tdTomato 和三叶草分别优于 RFP 和 GFP。
图 4: 胚珠中的背景荧光信号掩盖了胚胎信号。
表达胚核标记的胚珠 (组蛋白 2 b-tdTomato; 洋红) 和表皮核 (组蛋白 2 b-三叶草; 绿色) 的图像。整体胚珠和切除胚分别显示在上部和下部板上。箭头指向胚胎的位置。组蛋白 2 b-三叶草不仅在胚胎中, 而且在整个胚珠中表达, 因此很难通过胚珠找到胚胎信号。缩放条形图:50 µm (A) 和10µm (B)。请单击此处查看此图的较大版本.
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作的显微镜是在名古屋大学的变革性生物分子 (ITbM) 研究所进行的, 并得到日本先进植物科学网的支持。这项工作得到了日本科学技术局 (ERATO 项目到骅和 M.U.) 和日本促进科学协会的赠款的支持: 创新领域科学研究补助金 (Nos。JP24113514, JP26113710, JP15H05962, JP15H05955 M.U., Nos。JP16H06465, JP16H06464 和 JP16K21727 为 H), 补助金为年轻科学家 (B, Nos。JP24770045 和 JP26840093 为 M.U.), 和补助金挑战探索性研究 (No。JP16K14753 为 M.U.)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nitsch basal salt mixture | Duchefa | N0223 | |
| trehalose dihydrate | Wako Pure Chemical | 206-18455 | |
| MES | Dojindo | 345-01625 | |
| Gamborg’s vitamin solution | Sigma-Aldrich | G1019 | |
| 35-mm glass-bottom dish | Matsunami Glass | D111300 | |
| 35 mm culture dish | Corning | 430588 | |
| PDMS | Dow Corning Co. | Sylgard184 | |
| 76 × 26 mm slide glass | Matsunami Glass | S1225 | |
| 18 × 18 mm slide glass | Matsunami Glass | C018181 | |
| needle (gauge 0.40 mm) | Terumo | NN-2719S | |
| Immersion medium Immersol W 2010 | Zeiss | 444969-0000-000 | |
| A1R MP | Nikon | A1RsiMP(1080) Ti-E-TIRF | |
| CSU-W1 | Yokogawa Electric | It is a customized equipment, and thus Catalog Number is not avairable. | |
| CV1000 | Yokogawa Electric | CV1000-SP84 |
References
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