Summary
Dit manuscript beschrijft een in vitro zaadknop cultivatiemethode die het mogelijk live-cel beeldvorming van Arabidopsis zygoten en embryo's maakt. Deze methode wordt gebruikt om te visualiseren de intracellulaire dynamiek tijdens de zygote polarisatie en de cel lot specificatie bij de ontwikkeling van de embryo's.
Abstract
In de meeste bedektzadigen, de zygote en embryo zijn diep verborgen in het weefsel van de moeder, en dus het is al lang een mysterie van hoe ze de ontwikkeling van dynamisch; bijvoorbeeld, hoe de zygote polariseert de as van het lichaam en hoe het embryo geeft verschillende cel lot tijdens orgel vorming vast te stellen. Dit manuscript een in vitro zaadknop cultuur wordt methode beschreven voor het uitvoeren van live-cel beeldvorming van het ontwikkelen van zygoten en embryo's van Arabidopsis thaliana. Het medium van de geoptimaliseerde teelt kan zygoten of vroege embryo's uitgroeien tot vruchtbare planten. Door het te combineren met een poly(dimethylsiloxane) (PDMS) apparaat voor de matrix van de micropillar, wordt de zaadknop gehouden in de vloeistof in dezelfde positie. Deze fixatie is cruciaal voor het observeren van de dezelfde zaadknop onder een Microscoop voor verscheidene dagen vanaf de zygotic divisie tot het late stadium van het embryo. De resulterende beeldvorming van de live-cel kan worden gebruikt om te controleren de real-time dynamiek van zygote polarisatie, zoals nucleaire migratie cytoskelet omlegging, en ook de timing van de celdeling en cel lot specificatie tijdens embryo patronen. Bovendien, deze zaadknop Cultuurstelsel kan worden gecombineerd met remmer behandelingen voor het analyseren van de gevolgen van verschillende factoren op embryo-ontwikkeling, en met optische manipulaties zoals laser verstoring te onderzoeken van de rol van cel-cel communicatie.
Introduction
Het plan van de basis lichaam van een organisme evolueert van een eencellige zygote. In de meeste bedektzadigen, zygotic divisie genereert een apicale en een basale cel, die uitgroeien tot de spruit en wortel, respectievelijk1. Daarom is het belangrijk om te begrijpen hoe het lichaam van de plant wordt gevormd tijdens de embryogenese, maar er is niet een doeltreffend instrument te observeren direct de dynamiek van levende zygoten en embryo's, omdat ze de ontwikkeling van diep in de bloem. In verschillende soorten monocot, zoals maïs en rijst, is een in vitro bevruchting methode gevestigde2,3. In deze methode, geïsoleerde zaadcellen en eicellen worden gesmolten elektrisch of chemisch en de gegenereerde cel kan uitgroeien tot een vruchtbare plant. In dicot planten is er echter geen in vitro bevruchting methode die goede embryo's, vermoedelijk vanwege de niet-gesynchroniseerde celcyclus staat voor mannelijke en vrouwelijke gameten4,5 produceren kan. Daarnaast speelt het embryo-omringende weefsel (endosperm) belangrijke rollen in de embryonale ontwikkeling6.
In een model dicot soorten, A. thaliana, werd een cultivatiemethode in vitro ontwikkeld door te focussen op de hele zaadknop, waarin zowel de embryo en endosperm7. Dit systeem werd met succes gebruikt voor het analyseren van de gevolgen van verschillende chemische reagentia voor embryogenese, maar het is niet geschikt voor time-lapse denkbaar, omdat er een laag overlevingspercentage. Dus, een roman in vitro zaadknop Cultuurstelsel werd ontwikkeld om te beginnen zo vroeg als de zygote fase en produceren van vruchtbare planten op een hoge verhouding8. Na verschillende proeven, bleek dat Nitsch medium en trehalose aanzienlijk verbeterd de overlevingskans van zaadknoppen8. Bovendien, omdat de zaadknop groeit als het groeit en dus vaak uit de buurt van het gebied van de observatie van de Microscoop beweegt, werd een PDMS apparaat ontwikkeld om op te lossen de zaadknop in de middelgrote9. Het PDMS apparaat ingeschakeld de langdurige beeldvorming voor 3-4 dagen, die voldoende is om te traceren van de ontwikkeling van een zygote tot een hart-fase embryo. Met deze methode wordt het mogelijk om te visualiseren van de dynamiek van zygote polarisatie en embryo patronen, niet alleen onder normale omstandigheden, maar ook in de aanwezigheid van chemische inhibitoren of in verschillende mutant achtergronden8,,10 ,11.
Figuur 1: Schematisch Diagram van de specifieke fluorescente markeringen gebruikt om te visualiseren zygoten en embryo's via de zaadknop.
De Arabidopsis zygote ontwikkelt zich tot een embryo in de zaadknop, die diep in de bloem wordt gegenereerd. De zygote en embryo worden waargenomen door de zaadknop in deze in vitro teelt systeem, en het is dus belangrijk te gebruiken specifieke fluorescente markeringen die niet in andere weefsels zaadknop worden uitgedrukt. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. voorbereiding van de In Vitro Ovule kweekmedium
- maken de vloeistof voor de in-vitro zaadknop cultuur (" N5T medium ") met 1 x Nitsch basale zout mengsel, 5% (m/v) trehalose dihydraat, 0.05 % (m/v) 2-(N-morfolino) ethanesulfonic zuur (MES)-KOH (pH 5,8), en 1 x Gamborg ' s vitamine oplossing.
- Breng de pH op 5.8 met KOH.
- Het medium steriliseren in autoclaaf (121 ° C, 20 min) of filter het door een filter van 0.22-µm.
Opmerking: Het gesteriliseerde medium kan worden achtergelaten bij 4 ° C voor 2-3 maanden.
2. Voorbereiding van het PDMS apparaat voor de matrix van de Micropillar
- het PDMS micropillar apparaat door een mes, een scheermesje of een schaar om te passen in het glazen gedeelte (14 mm φ) van een 35 mm glazen-bodem schotel gesneden.
Opmerking: De volledige procedure voor de bouw van het PDMS apparaat wordt beschreven in de vorige artikelen 8 , 9, en dus de details hier worden weggelaten. Glazen-bodem gerechten met een kleinere omvang, zoals 4-well of 96-wells-platen, kunnen worden gebruikt voor korte termijn imaging zonder het apparaat. - Sterilize de bovenzijde van het PDMS apparaat onder UV-licht gedurende 15 minuten
- Zet het PDMS apparaat overgenomen door met behulp van vierkante uiteinde pincet, en houd het onder UV-licht voor 15 min te steriliseren onder.
- De gesteriliseerde PDMS apparaat overbrengen in een 35 mm cultuur schotel en het N5T medium toe te voegen totdat het apparaat volledig is gedrenkt in het medium (ongeveer 5-7 mL).
- Zet de schotel in een vacuuemcel, en verminderen de druk ontgas. Gedurende 3 uur naar girale totdat de lucht in het apparaat wordt vervangen door de middellange houden stofzuigen.
Opmerking: Het apparaat kan worden losgemaakt door luchtbellen onder een sterke vacuüm. - Het apparaat van de schotel positie houden met vierkant uiteinde pincet en leg het op een papieren handdoek te verwijderen van het extra medium op de zijkant en onderkant.
Opmerking: het medium op de micropillar array (bovenoppervlak) moet niet worden verwijderd omdat dit zal worden gebruikt voor de teelt van de zaadknop. - Overbrengen van het apparaat op een 76 x 26 mm dia glas, ervoor te zorgen, zodat het deel van de micropillar als de bovenzijde, en betrekking hebben op het apparaat met 35 mm de deksel van de schotel van de cultuur om te voorkomen dat het medium uitdroogt tijdens de volgende extractie van de zaadknop.
3. Hauw dissectie en Ovule winning
- steriliseren een naald (0,40 mm G) en de fijne pincet door af te vegen met 70% ethanol. De naald is gemakkelijk behandeld door het aansluiten van een spuit of hout stok.
- Vink van de bloeiwijze van de plant, en selecteer de juiste siliques voor het experiment. De ongeveer 5 mm siliques bevatten zygoten, en de 8-10 mm-siliques omvatten jonge embryo bolvormige's.
- De siliques met behulp van pincet accijnzen, en leg ze op dubbelzijdige tape op een 76 x 26 mm dia glas. Één Hauw bevat over 40-60 zaadknoppen en 3-4 siliques (d.w.z., 120-240 zaadknoppen) zijn voldoende voor één apparaat.
- Open de Hauw (ovarium muur) om te zien de zaadknoppen binnen met de gesteriliseerde naald en pincet onder een stereomicroscoop. Knip alleen de eierstok muur zodat de zaadknoppen worden niet beschadigd.
- De geopende Hauw overboeken naar het medium van de N5T op het apparaat van de PDMS (bereid in stap 2.7), en de zaadknoppen release in het medium met de naald of pincet.
- Zetten een klein cover glas (18 mm x 18 mm) op het PDMS apparaat om te duwen de zaadknoppen in de ruimten in de matrix micropillar.
- De cover glas opstijgen door te trekken horizontaal met behulp van pincet of vingers om extra medium.
- Ondersteboven het PDMS apparaat, plaatst u deze in een 35 mm glazen-bodem schotel en iets druk op het apparaat door het indrukken van de vierkante uiteinde pincet met vasthouden aan het glas.
- Pour N5T medium voorzichtig in de glazen-bodem schotel door decanteren van de middellange fles totdat het PDMS-apparaat volledig is gedrenkt in het medium, en verzegel de schotel met paraffine film.
Opmerking: Het PDMS-apparaat kan worden gerecycled, maar apparaten die te oud zijn gemakkelijk losgemaakt van de glazen bodem. Bovendien, het apparaat kan zweven als het niet volledig in stap 2.5 ontgast is of het medium wordt te snel gegoten.
Figuur 2: schematische Procedure voor monstervoorbereiding.
Deze schematische stroom komt overeen met stappen 3.5 naar 4.1. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
4. tijd-tijdspanne Imaging
- plaats van de glazen-bodem schotel die bereid was in stap 3.9 op een omgekeerde Microscoop, en selecteer geschikt zaadknoppen te concentreren op.
Opmerking: Omdat de zaadknoppen in fase, positie en richting variëren, moeten de geschikte zaadknoppen worden gevonden door te controleren hun marker fluorescentie. - Start de live-imaging volgens de fabrikant ' s instructies van het systeem van Microscoop.
Opmerking: De Microscoop apparatuur en parameters zijn divers, en dus de gebruikers de juiste instellingen die bij het doel van het experiment passen moeten kiezen. Als voorbeeld, de instellingen in dit manuscript zijn vermeld in tabel 1.
| apparatuur/instelling | Figuur 3 (A) en aanvullende video's 1 en 4 | Figuur 3 (B) en aanvullende Video 2 | aanvullende Video 3 |
| Microscoop | Microscoop (A1R MP) laser-scannen omgekeerd | draaiende schijf confocal omgekeerde Microscoop (CSU-W1) | vak-type omgekeerde confocal microscoop systeem met een stabiele incubatie kamer (CV1000) |
| Laser | Ti:sapphire femtoseconde pulse laser | 488-nm en 561-nm LD lasers | 488-nm en 561-nm LD laser |
| O bjective lens | 40 X water-immersie objectief (NB = 1.15) met onderdompeling medium | 60 X silicone olie-immersie objectief (NB = 1.30), gemonteerd op een Piezo focus station | 40 X objectief (NB = 0.95) |
| analyse of | externe niet-descanned GaAsP PMT detector | EMCCD camera | EMCCD camera |
| Dichroic spiegel | DM495 en DM560 | DM488/561 | DM400-410/488/561 |
| Filter | < td > band pass filters; 534/30 nm en 578/105 nmband pass filters; 520/35 nm, en 593/46 nm | band pass filters; 520/50 nm en 617/73 nm | |
| segment langs de z-as | 31 z-stacks met intervallen van 1-µm | 17 z-stacks met 3-µm inter vals | 7 z-stacks met 5-µm intervallen |
| tijdsinterval | 20 min | 5 min | 10 min |
tabel 1: de Microscoop systemen en instellingen die worden gebruikt in dit Manuscript.
De microscopen en parameters zijn divers, en dus elke gebruiker het geschikt systeem voor het experiment moet kiezen.
- de verworven beeld volgorde controleren, en te converteren naar de algemene filmindeling, zoals .avi of .mov voor presentatie.
Opmerking: Als de Microscoop software niet de beelden als een film formaat uitvoeren, is het mogelijk de afbeeldingen opslaan als .tif en ze vervolgens te openen in ImageJ, een open source programma geïnspireerd door NIH Image, het bestandstype wilt wijzigen. ImageJ vindt u op: https://imagej.nih.gov/ij/. ImageJ kan ook worden gebruikt voor het maken van een Z-splooi film, zoals de maximale intensiteit projectie, zoals wordt beschreven op: https://imagej.net/Z-functions.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van deze zaadknop Cultuurstelsel, kan deze methode de levende dynamiek van zygote polarisatie en embryo patronen traceren. Dit is een prestatie, want eerder er geen techniek was te visualiseren het real-time gedrag van de zygote en embryo, die diep in het weefsel van de moeder zijn verborgen. Figuur 3A en aanvullende Video 1 blijkt dat de microtubuli (MTs) in de jonge zygote zich als een transversale ring in de subapical regio10 ophopen. Deze ring MT wordt onderhouden terwijl de zygote kieuwopeningenvorm in de apicale richting. Na de voltooiing van zygote rek en nucleaire migratie naar het apicale gebied, de MT-ring verdwijnt en de MTs vormen een spindel om te scheiden van het DNA. Figuur 3B en aanvullende Video 2 tonen aan dat embryonale cellen betekenisdragers verdelen om te vormen van een radially symmetrisch bolvormige vorm8. Deze methode is toepasselijk voor farmacologische experimenten. Bijvoorbeeld na de toepassing van een actine polymerisatie-remmer (latrunculin B; Lat B) in de vloeistof de zygote-bevattende zaadknoppen kweken, de polar nucleaire migratie was geremd en dus de zygote verdeeld in een meer symmetrische wijze, met vermelding van de rol van actine-filament op de zygote polarisatie (aanvullende Video 3 )10. Op lange termijn beeldvorming van embryo-ontwikkeling stelt het traceren van de richting en de timing van afzonderlijke celdelingen, wat betekent dat de duur van de meetkunde en de celcyclus kan statistisch worden geanalyseerd. Inderdaad, we eerder toonde aan dat de celdeling van de apicale cel overdrachtslijn sneller dan die van de basale cel region8.
Figuur 3: Live-imaging van Zygote polarisatie en Embryo patronen.
(A) Time-lapse observatie van een zygote uiting van specifieke markers voor de nucleus (Histon 2B-tdTomato; magenta) en de microtubuli (MTs klaver-TUA6, groen). De beelden werden verkregen met behulp van een laser-scanner omgekeerde Microscoop (A1R MP). (B) Time-lapse observatie van een embryo uiten markers voor de nucleus (Histon 2B-sGFP; groen) en het plasma membraan (PM, tdTomato-LTI6b; magenta). De beelden werden verkregen met behulp van een omgekeerde confocal microscoop draaiende schijf (CSU-W1). De beelden werden getoond als maximale intensiteit projectie beelden, en de aantallen wijzen op de tijd (h:min) van het eerste frame. Pijlpunten en gele haakjes tonen de celkern en de dwarse MT ring, respectievelijk. Cyaan haakjes duiden de spindel (A) en de scheidslijn nucleus (B). Schaal bars: 10 µm (A) en 30 µm (B). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit manuscript introduceert een eenvoudige in vitro zaadknop teelt protocol dat is efficiënt voor gebruik in de beeldvorming van de live-cel zygoten en embryo's te ontwikkelen.
Het ontwerp van het PDMS apparaat wellicht optimalisatie volgens de fase embryo. Het eerste ontwikkelde apparaat was een microcage matrix aan te passen de oriëntatie en de positie van de zaadknoppen9vast te stellen, en vervolgens een micropillar apparaat werd gebouwd voor het overvullen van zaadknoppen efficiënter8. Bovendien, de micropillars zijn dunner en zachter dan een microcage, en dus niet hinderen zaadknop expansie tijdens langdurige waarneming. Dit micropillar apparaat kan een zaadknop bewaren voor enkele dagen, vanaf de zygotic stadium tot het stadium van embryonale hart8. Uiteindelijk echter, de hoogte van het volledig uitgevouwen zaadknop groter is dan de hoogte van de micropillar, en dus het duwt het apparaat weg. Dus, de hoogte en afstand van de micropillars moeten worden aangepast als latere-fase embryo's de focus zijn.
Omdat de zaadknop is gepositioneerd aan de onderkant van de schotel, moet een omgekeerde Microscoop worden gebruikt. Een confocal microscoop is voldoende om te controleren de celdeling patroon zoals weergegeven in figuur 3B en aanvullende video's 2 en 3van de8,11, en een draaiende schijf confocal microscoop is belangrijk om uit te voeren op lange termijn Imaging zonder celbeschadiging. In contrast, een twee-foton excitatie microscopie, die is geschikt voor diepe beeldvorming van levende organismen12, is nodig om te visualiseren de intracellulaire dynamiek van de zygote (figuur 3A en aanvullende Video 1)10. Het is daarom van cruciaal belang de geschikte Microscoop om systeem te gebruiken voor de experimenten.
Zoals beschreven in de Introductie en de Resultaten van de vertegenwoordiger, waren er geen bestaande methoden die de levende dynamiek van de zygote en embryo in de zaadknop ontwikkelt kunnen controleren. Dus, met behulp van deze zaadknop cultivatiemethode, de details van de zygote polarisatie en embryo patronen hebben verduidelijkt voor de eerste keer.
Deze methode is toepasselijk voor farmacologische experimenten, zoals blijkt uit aanvullende Video 3. Bovendien, deze imaging systeem werd gebruikt voor het evalueren van de effecten van nieuw samengestelde verbindingen op embryonale celdeling11. Het was ook geslaagd te combineren met een onderbreking van de laser, en zo bleek dat wanneer de apicale cel is geschaad, de derivaten basale cel hun lot van de cel veranderen voor de productie van een nieuwe apicale cel8. Dus verdere zorgt toepassing van deze methode op diverse materialen en technieken voor krachtige tools om te begrijpen van de moleculaire mechanismen van embryogenese.
Als u wilt uitvoeren op de lange termijn imaging met deze methode, is de cruciale stap het voorbereiden van een specifieke en helder fluorescerende marker labels van de onderzoeken weefsels en/of structuren. Omdat de zygote en embryo worden waargenomen door de zaadknop zoals afgebeeld in Figuur 1, achtergrond signalen in het endosperm en andere weefsels zaadknop kunnen maskeren de ware signaal in het embryo (Figuur 4). Bovendien, om te ontdekken een zwak signaal, de kracht van de laser van de Microscoop moet worden verhoogd, maar dit kan schade toebrengen aan de zaadknop tijdens langdurige waarneming. Aanvullende Video 4 blijkt dat de laser van de hoge macht auto-fluorescentie in de zaadknop verhoogd, en ten slotte de embryo-zak gekrompen, waarin de zygote werd neergeslagen. Daarom moet een markering van de specifieke en heldere lijn worden vastgesteld voordat het experiment. Met betrekking tot hogere helderheid, tdTomato en klaver zijn beter dan RFP en GFP, respectievelijk.
Figuur 4: Achtergrond Fluorescent signaal in Ovule maskers embryonale signaal.
Afbeelding van de zaadknop uitdrukken van de markers van de embryonale celkern (Histon 2B-tdTomato; magenta) en de epidermale kern (Histon 2B-klaver; groen). Hele zaadknop verwijderde embryo worden weergegeven in de bovenste en onderste panelen, respectievelijk. Pijlen wijzen naar de positie van het embryo. De Histon 2B-Klaver uit zich niet alleen in embryo's, maar ook in de gehele zaadknop, en is daarom moeilijk te vinden de embryonale signaal via de zaadknop. Schaal bars: 50 µm (A) en 10 µm (B). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Microscopie in dit werk werd uitgevoerd bij het Instituut van transformatieve Bio-moleculen (WPI-ITbM) van Nagoya University en gesteund door de Japan geavanceerde Plant Science Network. Dit werk werd gesteund door subsidies van de Japan Science and Technology Agency (ERATO project T.H. en M.U.) en van de Society van Japan voor de promotie van wetenschap: een Grant-in-Aid voor wetenschappelijkonderzoek op innovatieve gebieden (Nos. JP24113514, JP26113710, JP15H05962 en JP15H05955 voor M.U. en amendementen. JP16H06465, JP16H06464 en JP16K21727 voor th), een Grant-in-Aid voor jonge wetenschappers (B, amendementen. JP24770045 en JP26840093 voor M.U.), en een Grant-in-Aid voor uitdagende verkennend onderzoek (nr. JP16K14753 voor M.U.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nitsch basal salt mixture | Duchefa | N0223 | |
| trehalose dihydrate | Wako Pure Chemical | 206-18455 | |
| MES | Dojindo | 345-01625 | |
| Gamborg’s vitamin solution | Sigma-Aldrich | G1019 | |
| 35-mm glass-bottom dish | Matsunami Glass | D111300 | |
| 35 mm culture dish | Corning | 430588 | |
| PDMS | Dow Corning Co. | Sylgard184 | |
| 76 × 26 mm slide glass | Matsunami Glass | S1225 | |
| 18 × 18 mm slide glass | Matsunami Glass | C018181 | |
| needle (gauge 0.40 mm) | Terumo | NN-2719S | |
| Immersion medium Immersol W 2010 | Zeiss | 444969-0000-000 | |
| A1R MP | Nikon | A1RsiMP(1080) Ti-E-TIRF | |
| CSU-W1 | Yokogawa Electric | It is a customized equipment, and thus Catalog Number is not avairable. | |
| CV1000 | Yokogawa Electric | CV1000-SP84 |
References
- Natesh, S., Rau, M. A. Embryology of Angiosperms. Johri, B. M. , Springer. Berlin Heidelberg. 377-443 (1984).
- Kranz, E., Lorz, H. In vitro fertilisation of maize by single egg and sperm cell protoplast fusion mediated by high calcium and high pH. Zygote. 2 (2), 125-128 (1994).
- Uchiumi, T., Uemura, I., Okamoto, T. Establishment of an in vitro fertilization system in rice (Oryza sativa L.). Planta. 226 (3), 581-589 (2007).
- Sun, M. X., Moscatelli, A., Yang, H. Y., Cresti, M. In vitro double fertilization in Nicotiana tabacum (L.): the role of cell volume in cell fusion. Sex Plant Rep. 13 (4), 225-229 (2001).
- Tian, H. Q., Yuan, T., Russell, S. D. Relationship between double fertilization and the cell cycle in male and female gametes of tobacco. Sex Plant Rep. 17 (5), 243-252 (2004).
- Costa, L. M., et al. Central cell-derived peptides regulate early embryo patterning in flowering plants. Science. 344 (6180), 168-172 (2014).
- Sauer, M., Friml, J. In vitro culture of Arabidopsis embryos within their ovules. Plant J. 40 (5), 835-843 (2004).
- Gooh, K., et al. Live-cell imaging and optical manipulation of Arabidopsis early embryogenesis. Dev Cell. 34 (2), 242-251 (2015).
- Park, J., Kurihara, D., Higashiyama, T., Arata, H. Fabrication of microcage arrays to fix plant ovules for long-term live imaging and observation. Sens Act B-Chem. 191, 178-185 (2014).
- Kimata, Y., et al. Cytoskeleton dynamics control the first asymmetric cell division in Arabidopsis zygote. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (49), 14157-14162 (2016).
- Nambo, M., et al. Combination of Synthetic Chemistry and Live-Cell Imaging Identified a Rapid Cell Division Inhibitor in Tobacco and Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol. 57 (11), 2255-2268 (2016).
- Mizuta, Y., Kurihara, D., Higashiyama, T. Two-photon imaging with longer wavelength excitation in intact Arabidopsis tissues. Protoplasma. 252 (5), 1231-1240 (2015).
