Summary
Detta manuskript beskriver en in vitro- fröämnet odlingmetod som gör live-cell avbildning av Arabidopsis zygoter och embryon. Denna metod används för att visualisera den intracellulära dynamiken under zygot polarisering och specifikationen cell öde i utvecklingen av embryon.
Abstract
I de flesta blommande växter, det zygote och embryo är gömda djupt i mor vävnaden, och därmed har det länge varit ett mysterium hur de utvecklas dynamiskt; exempelvis hur zygoten polariserar för att fastställa kropp axeln och hur embryot anger olika cell öden under organ kan bildas. Detta manuskript beskriver en in vitro- fröämnet kultur metod att utföra live-cell imaging att utveckla zygoter och embryon från Arabidopsis thaliana. Det optimera odling mediet tillåter zygoter eller tidiga embryon att växa till bördiga växter. Genom att kombinera det med en poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar array enhet, hålls ägget i det flytande mediet i samma position. Denna fixering är avgörande att iaktta samma ägget under ett mikroskop för flera dagar från zygotic avdelningen att sena fosterstadiet. Den resulterande live-cell imaging kan användas för att övervaka i realtid dynamiken i zygot polarisering, såsom kärnkraft migration och cytoskelettet ombildning, och också celldelning tidpunkten och cell öde specifikation under embryo mallning. Detta fröämnet odling system kan dessutom kombineras med hämmare behandlingar att analysera effekterna av olika faktorer på embryots utveckling och med optisk manipulationer såsom laser störningar att undersöka rollen som cell-cell kommunikation.
Introduction
Den grundläggande kropp planen av en organism utvecklas från en encellig zygot. I de flesta blommande växter genererar zygotic division en apikala och en basalcellscancer, som utvecklas till den skjuta och rot, respektive1. Därför är det viktigt att förstå hur växten kroppen bildas under embryogenes, men det har inte varit ett effektivt verktyg att direkt observera dynamiken i levande zygoter och embryon eftersom de utvecklas djupt i blomman. I flera enhjärtbladiga arter, såsom majs och ris, varit en in vitro- fertilisering metod etablerade2,3. I denna metod, isolerade spermier och äggceller är smält elektriskt eller kemiskt, och genererade cellen kan utvecklas till en bördig växt. Dock i Dikotyledon växter finns det ingen in vitro- fertilisering metod som kan producera korrekt embryon, förmodligen på grund av icke-synkroniserade cellcykeln staten av manliga och kvinnliga könsceller4,5. Dessutom spelar den embryo-omgivande vävnaden (frövita) viktiga roller i embryots utveckling6.
I en modell Dikotyledon art, A. thaliana, utvecklades en in vitro- odling metoden genom att fokusera på hela ägget, som innehåller både embryot och frövitan7. Detta system har framgångsrikt använts för att analysera effekterna av olika kemiska reagenser på embryogenes, men det passar inte för time-lapse imaging eftersom den har en låg överlevnad. Därför, en roman i vitro fröämnet odling utvecklades för att börja så tidigt som zygot scenen och producera fertila plantor på en hög andel8. Efter olika prövningar, konstaterades att Nitsch medium och trehalos avsevärt förbättrat överlevnaden av fröämnen8. Dessutom eftersom ägget expanderar när den växer och därmed ofta rör sig bort från fältet observation av Mikroskop, utvecklades en PDMS-enhet för att fixa ägget i medium9. PDMS enheten aktiverad av långsiktiga imaging för 3-4 dagar, vilket är tillräckligt för att spåra utvecklingen från en zygot till ett hjärta-scenen embryo. Med den här metoden blir det möjligt att visualisera dynamiken i zygot polarisering och embryo mönstring, inte bara under normala förhållanden, men också i närvaro av kemiska hämmare eller i olika muterade bakgrunder8,10 ,11.
Figur 1: Schematisk bild av de specifika fluorescerande markörer används för att visualisera zygoter och embryon genom the fröämnet.
Arabidopsis zygoten utvecklas till ett embryo i ägget, som genereras djupt inne i blomman. Det zygote och embryo observeras genom ägget i in vitro- odling systemet, och därför är det viktigt att använda specifika fluorescerande markörer som inte uttrycks i andra fröämnet vävnader. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning av odlingssubstratet In Vitro fröämnet
- göra det flytande mediet för den in vitro- fröämnet kultur (" N5T medium ") som innehåller 1 x Nitsch basala salt blandning, 5% (w/v) trehalosdihydrat, 0,05 % (w/v) 2-(N-morpholino) ethanesulfonic syra (MES)-KOH (pH 5.8), och 1 x Gamborg ' s vitamin lösning.
- Justera pH-värdet till 5,8 med KOH.
- Sterilisera mediet i autoklav (121 ° C, 20 min) eller filtrera det genom ett filter med 0,22 µm.
Obs: Steriliserad mediet kan lagras vid 4 ° C i 2-3 månader.
2. Beredning av PDMS Micropillar Array enheten
- skär PDMS micropillar enheten genom en kniv, rakblad eller sax för att passa in i glaset en del (14 mm φ) av en 35 mm glasbotten maträtt.
Obs: Den full av PDMS enhet konstruktion beskrivs i tidigare papper 8 , 9, och således information utelämnas här. Glasbotten rätter med mindre volymer, såsom 4-väl eller 96 brunnar tallrikar, kan användas för kortsiktiga avbildning utan enheten. - Sterilize på ovansidan av PDMS enheten under UV-ljus för 15 min.
- Vrid PDMS enheten över av använder fyrkantig spets pincett, och hålla det i UV-ljus för 15 min till sterilisera botten.
- Överför steriliserad PDMS enheten i en 35 mm kultur skålen och tillsätt N5T medlet tills enheten är helt indränkt i mediet (cirka 5-7 mL).
- Sätta skålen i en vakuumkammare och minska trycket att degas. Hålla dammsugning för 3 h till över natten tills luften i enheten ersättas med medium.
Obs: Enheten kan tas bort av luftbubblor under en stark vakuum. - Ta enheten från skålen genom att hålla den med fyrkantig spets pincett och lägga den på en pappershandduk för att ta bort det extra mediet på sida och botten.
Obs: medium på micropillar matrisen (övre yta) bör inte tas bort eftersom detta kommer att användas för fröämnet odling. - Överföra enheten på en 76 x 26 mm bild glas, se till att hålla den micropillar delen som övre sida, och täcka enheten med 35 mm kultur maträtt lock för att förhindra att medlet torkar ut under följande fröämnet utvinning.
3. Skida dissektion och fröämnet utvinning
- sterilisera en nål (0.40 mm G) och fin pincett genom att torka med 70% etanol. Nålen hanteras enkelt genom att bifoga det till en spruta eller trä pinne.
- Kontrollera Blomställningen av växten, och välj de korrekt siliques för experimentet. De ca 5 mm siliques zygoter, och de 8-10 mm siliques innehåller unga klotformiga embryon.
- Punktskatter på siliques med hjälp av pincett, och placera dem på dubbelhäftande tejp på en 76 x 26 mm bild glas. En skida innehåller ungefär 40-60 fröämnen, och 3-4 siliques (dvs., 120-240 fröämnen) är tillräcklig för en enhet.
- Öppna den skida (äggstock väggen) för att se fröämnen inuti med hjälp av steriliserad nål och pincett under ett stereomikroskop. Klipp bara äggstock väggen så att fröämnen inte skadas.
- Överföra den öppnade skida till N5T medium på PDMS enheten (bereddes i steg 2,7) och släppa fröämnen i mediet med nål eller pincett.
- Sätta ett litet lock glas (18 x 18 mm) på PDMS enheten att driva fröämnen i blankstegen i arrayen micropillar.
- Lyfta skyddsglaset genom att dra den horisontellt med pincett eller fingrarna för att ta bort extra medium.
- Vänd PDMS enheten upp och ned och placera det i en 35 mm glasbotten maträtt något tryck på enheten genom att trycka med fyrkantig spets pincetten för att hålla det till glaset.
- Häll N5T medium försiktigt i glas-botten maträtt genom dekantering medium flaskan tills PDMS enheten är helt indränkt i mediet och försegla skålen med paraffin filma.
Obs: PDMS enheten kan återvinnas, men enheter som är för gammal är enkelt fristående från glas botten. Dessutom enheten kan flyta om det inte är helt avgasas i steg 2.5 eller alltför snabbt hälls på medellång.
figur 2: Schematisk förfarande för provberedning.
Detta schematiska flöde motsvarar steg 3.5 till 4.1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
4. time-lapse Imaging
- Placera glasbotten skålen som förbereddes i steg 3,9 på en inverterade Mikroskop och välj lämplig fröämnen att fokusera på.
Obs: Eftersom fröämnen varierar i scenen, position och riktning, lämplig fröämnen bör hittas genom att kontrollera deras markör fluorescens. - Starta live-bildtagning enligt tillverkaren ' anvisningar av mikroskopet systemet.
Obs: Mikroskop utrustning och parametrar är olika, och således användarna ska välja rätt inställningar som passar till syftet experiment. Som ett exempel, inställningarna som används i detta manuskript är listade i tabell 1.
| utrustning/inställning | figur 3 (A) och kompletterande videor 1 och 4 | Figur 3 (B) och kompletterande Video 2 | kompletterande Video 3 |
| Mikroskop | laserskanning inverterade Mikroskop (A1R MP) | spinning-disk confocal inverterade Mikroskop (CSU-W1) | Box-typ inverterad confocal Mikroskop system med en stabil inkubation kammare (CV1000) |
| Laser | femtosekund puls safirlaser | 488-nm och 561-nm LD lasrar | 488-nm och 561-nm LD laser |
| O bjective lins | 40 X nedsänkning i vatten objektiv (NA 1,15) med nedsänkning medium | 60 X silikon olja nedsänkning objektiv (NA = 1,30), monterad på en Piezo fokuseringsdrevets | 40 X-objektiv (NA = 0,95) |
| identifiera eller | externa icke-descanned GaAsP PMT detektor | elektrisk kamera | elektrisk kamera |
| kalljusreflektor spegel | DM495 och DM560 | DM488/561 | DM400-410/488/561 |
| Filter | < td > band-passera filter; 534/30 nm och 578/105 nmband-passera filter; 520/35 nm och 593/46 nm | band-passera filter; 520/50 nm och 617/73 nm | |
| bit längs z-axeln | 31 z-stackar med 1 µm mellanrum | 17 z-stackar med 3 µm inter vals | 7 z-stackar med 5 µm mellanrum |
| tidsintervall | 20 min | 5 min | 10 min |
tabell 1: de Mikroskop system och inställningar som används i detta manuskript.
Den Mikroskop och parametrar är olika, och således varje användare bör välja lämpliga system för experimentet.
- Kontrollera den förvärvade bildsekvens och konvertera den till filmformatet allmänt, såsom AVI eller MOV för presentation.
Obs: Om Mikroskop mjukvaran inte kan mata ut bilderna som ett filmformat, är det möjligt att spara bilderna som .tif och sedan öppna dem i ImageJ, ett open source program inspirerade av NIH bild, ändra filtypen. ImageJ finns på: https://imagej.nih.gov/ij/. ImageJ kan också användas för att göra en Z-sstoppa filmen, såsom maximal intensitet projektionen, som beskrivs på: https://imagej.net/Z-functions.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Genom att använda detta system för odling av ägget, kan denna metod spåra levande dynamik zygot polarisering och embryo mallning. Detta är en prestation eftersom tidigare fanns det ingen teknik för att visualisera realtid beteende det zygote och embryot, som är gömda djupt i mor vävnaden. Figur 3A och kompletterande Video 1 visar att mitotiska (MTs) i unga zygoten ackumuleras som en tvärgående ring i trattformade region10. Denna MT ring bibehålls medan zygoten förlänger i apikal riktning. Efter slutförandet av zygot töjning och nukleära migration till apikala regionen, MT ringen försvinner och MTs bildar en spindel för att separera DNA. Figur 3B och kompletterande Video 2 visar att embryonala celler coordinately delar för att bilda en radially symmetrisk klotformiga form8. Denna metod är tillämplig för farmakologiska experiment. Exempelvis efter tillämpningen av aktin polymerisation hämmare (latrunculin B; Lat B) i den flytande medium odling de zygote-innehållande fröämnen, polar nukleära migreringen hämmades och således zygoten indelad i en mer symmetrisk sätt, som anger rollen av aktin filament på zygot polarisation (kompletterande Video 3 )10. Långsiktiga avbildning av embryots utveckling möjliggör spårning av riktning och tidpunkten för enskilda celldelningar, vilket innebär att geometri och cellcykelns längd kan analyseras statistiskt. Faktiskt har vi tidigare visade att celldelningen av apikala cell härstamning är snabbare än som av basalcellscancer region8.
Figur 3: Live-avbildning av zygot polarisering och Embryo mallning.
(A) Time-lapse observation av en zygot uttrycker specifika markörer för kärnan (Histon 2B-tdTomato, magenta) och mikrotubuli (MTs, klöver-TUA6, grön). Bilderna förvärvades med laserskanning inverterade Mikroskop (A1R MP). (B), Time-lapse observation av ett embryo som uttrycker markörer för kärnan (Histon 2B-sGFP; grön) och plasmamembran (PM, tdTomato-LTI6b; magenta). Bilderna förvärvades med spinning-disk confocal inverterade Mikroskop (CSU-W1). Bilderna visades som maximal intensitet projektion bilder och siffrorna anger tiden (h:min) från den första bildrutan. Pilspetsar och gula parentes visar kärnan och tvärgående MT ringen, respektive. Cyan parentes indikerar spindel (A) och dela kärnan (B). Skala barer: 10 µm (A) och 30 µm (B). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta manuskript introducerar ett enkelt in vitro- fröämnet odling protokoll som är effektiv för användning i av live-cell imaging att utveckla zygoter och embryon.
Utformningen av PDMS enheten behöva optimering enligt embryostadiet. Den första utveckla enheten var en microcage matris Justera orienteringen och fixar ståndpunkten av fröämnen9, och sedan en micropillar enhet konstruerades för att fälla fröämnen effektivare8. Dessutom micropillars är tunnare och mjukare än en microcage, och därmed hindrar inte fröämnet expansion under långsiktig observation. Denna micropillar enhet rymmer en fröämnet i flera dagar, från zygotic scenen tills den embryonala hjärta etapp8. I slutändan dock höjden av fullständigt expanderad ägget överskrider micropillar höjd och därmed skjuter enheten bort. Höjd och avståndet mellan micropillars bör därför justeras om senare skeden embryon är i fokus.
Eftersom ägget är placerad på botten av skålen, måste en inverterade mikroskopet användas. Confocal Mikroskop är tillräcklig för att övervaka celldelning mönstret som visas i figur 3B och kompletterande videor 2 och 38,11, och spinning-disk confocal Mikroskop är viktigt att utföra långsiktiga Imaging utan cellskador. I kontrast, en två-photon excitation mikroskopi, som är lämplig för djupa avbildning av levande organismer12, är nödvändigt att visualisera intracellulära dynamiken av zygoten (figur 3A och kompletterande Video 1)10. Därför är det viktigt att använda lämpliga Mikroskop för experimenten.
Som beskrivs i inledningen och Representativa resultat, fanns det inga befintliga metoder som kan övervaka levande dynamik zygot och embryot utvecklas i ägget. Därför, genom att använda denna fröämnet odlingmetod, detaljerna zygot polarisering och embryo mallning har klargjorts för första gången.
Denna metod är tillämplig för farmakologiska experiment som visas i kompletterande Video 3. Dessutom användes detta imaging system för att utvärdera effekterna av nyligen syntetiserade föreningar på embryonal cell division11. Det var också framgångsrikt kombineras med laser störningar, och därmed visade att när cellen apikala skadas, basalcellscancer derivat ändra deras cell öde för att producera en ny apikala cell8. Därför kommer att ytterligare tillämpning av denna metod till olika material och tekniker ge kraftfulla verktyg för att förstå de molekylära mekanismerna av embryogenes.
För att utföra långsiktiga imaging med denna metod, är det avgörande steget att förbereda en specifik och ljusa fluorescerande markör som etiketter i målvävnaderna eller strukturer. Eftersom de zygot och embryo observeras genom ägget som visas i figur 1, bakgrunden signaler i majsets och andra fröämnet vävnader kan maskera den sanna signalen i embryot (figur 4). Dessutom, för att upptäcka en svag signal, laser kraften i mikroskopet måste utökas, men detta kan skada ägget under långsiktig observation. Kompletterande Video 4 visar att den höga lasereffekten ökade auto-fluorescens i ägget, och slutligen krympt embryo sac, där zygoten krossades. En specifik och ljusa markör linje bör därför fastställas innan experimentet. När det gäller högre ljusstyrka är tdTomato och klöver bättre än RFP och GFP, respektive.
Figur 4: Bakgrund fluorescerande Signal i fröämnet maskerar embryonala Signal.
Bild av ägget uttrycker markörerna för embryonala kärnan (Histon 2B-tdTomato, magenta) och epidermal kärnan (Histon 2B-klöver; Grön). Hela fröämnet och exciderad embryo visas i övre och nedre panelerna, respektive. Pilarna pekar på placeringen av embryot. Histon 2B-Klövern uttrycks inte bara i embryot, men också i hela ägget, och därför är det svårt att hitta embryonala signalen via ägget. Skala barer: 50 µm (A) och 10 µm (B). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Mikroskopi i detta arbete utfördes på institutet av omvälvande Bio-molekyler (WPI-ITbM) Nagoya University och stöds av Japan avancerade Plant Science nätverket. Detta arbete stöds av bidrag från Japan Science och Technology Agency (ERATO projekt att T.H. och M.U.) och från Japan Society för främjande av vetenskap: ett bidrag för vetenskaplig forskning på innovativa områden (Nos. JP24113514, JP26113710, JP15H05962 och JP15H05955 för M.U. och Nos. JP16H06465, JP16H06464 och JP16K21727 för T.H), ett bidrag för unga forskare (B, Nos. JP24770045 och JP26840093 för M.U.), och ett bidrag för utmanande utforskande forskning (nr. JP16K14753 för M.U.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nitsch basal salt mixture | Duchefa | N0223 | |
| trehalose dihydrate | Wako Pure Chemical | 206-18455 | |
| MES | Dojindo | 345-01625 | |
| Gamborg’s vitamin solution | Sigma-Aldrich | G1019 | |
| 35-mm glass-bottom dish | Matsunami Glass | D111300 | |
| 35 mm culture dish | Corning | 430588 | |
| PDMS | Dow Corning Co. | Sylgard184 | |
| 76 × 26 mm slide glass | Matsunami Glass | S1225 | |
| 18 × 18 mm slide glass | Matsunami Glass | C018181 | |
| needle (gauge 0.40 mm) | Terumo | NN-2719S | |
| Immersion medium Immersol W 2010 | Zeiss | 444969-0000-000 | |
| A1R MP | Nikon | A1RsiMP(1080) Ti-E-TIRF | |
| CSU-W1 | Yokogawa Electric | It is a customized equipment, and thus Catalog Number is not avairable. | |
| CV1000 | Yokogawa Electric | CV1000-SP84 |
References
- Natesh, S., Rau, M. A. Embryology of Angiosperms. Johri, B. M. , Springer. Berlin Heidelberg. 377-443 (1984).
- Kranz, E., Lorz, H. In vitro fertilisation of maize by single egg and sperm cell protoplast fusion mediated by high calcium and high pH. Zygote. 2 (2), 125-128 (1994).
- Uchiumi, T., Uemura, I., Okamoto, T. Establishment of an in vitro fertilization system in rice (Oryza sativa L.). Planta. 226 (3), 581-589 (2007).
- Sun, M. X., Moscatelli, A., Yang, H. Y., Cresti, M. In vitro double fertilization in Nicotiana tabacum (L.): the role of cell volume in cell fusion. Sex Plant Rep. 13 (4), 225-229 (2001).
- Tian, H. Q., Yuan, T., Russell, S. D. Relationship between double fertilization and the cell cycle in male and female gametes of tobacco. Sex Plant Rep. 17 (5), 243-252 (2004).
- Costa, L. M., et al. Central cell-derived peptides regulate early embryo patterning in flowering plants. Science. 344 (6180), 168-172 (2014).
- Sauer, M., Friml, J. In vitro culture of Arabidopsis embryos within their ovules. Plant J. 40 (5), 835-843 (2004).
- Gooh, K., et al. Live-cell imaging and optical manipulation of Arabidopsis early embryogenesis. Dev Cell. 34 (2), 242-251 (2015).
- Park, J., Kurihara, D., Higashiyama, T., Arata, H. Fabrication of microcage arrays to fix plant ovules for long-term live imaging and observation. Sens Act B-Chem. 191, 178-185 (2014).
- Kimata, Y., et al. Cytoskeleton dynamics control the first asymmetric cell division in Arabidopsis zygote. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (49), 14157-14162 (2016).
- Nambo, M., et al. Combination of Synthetic Chemistry and Live-Cell Imaging Identified a Rapid Cell Division Inhibitor in Tobacco and Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol. 57 (11), 2255-2268 (2016).
- Mizuta, Y., Kurihara, D., Higashiyama, T. Two-photon imaging with longer wavelength excitation in intact Arabidopsis tissues. Protoplasma. 252 (5), 1231-1240 (2015).
